JPH10155493A - アスペルギルス属由来のホスホリパーゼａ１をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryz
ae）由来のホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）をコードす
る遺伝子、および該遺伝子で形質転換された宿主を培養
することによる組換えＰＬＡ１の製造方法を提供する。 【解決手段】 配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜
２６９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドま
たはその改変体をコードする遺伝子、該遺伝子を含むこ
とからなるベクターおよび該ベクターで形質転換された
宿主細胞。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】 本発明は、麹菌アスペルギ
ルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のホスホリパーゼ
Ａ１をコードする遺伝子、該遺伝子を含むことからなる
組換えＤＮＡベクター、該ベクターで形質転換させた宿
主細胞および該宿主細胞を用いた組換えホスホリパーゼ
Ａ１の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】 レシチンは界面活性作用、酸化防止作
用、生理活性作用等を有するリン脂質で、食品工業用、
飼料用、医薬品用と幅広く使用されている。レシチンの
界面活性作用は、他の食品界面活性剤に比べ、乳化安定
性に劣るため、酵素分解を用いて、乳化安定性を改善す
る研究がなされている。リゾリン脂質は、リン脂質のグ
リセリン残基にエステル結合した脂肪酸の一部を加水分
解して得られる部分分解リン脂質であり、リン脂質に比
べて水溶性が増すことに伴い、乳化性が増強し、乳化力
を発揮する温度領域が拡大して、油または水系のいずれ
に添加しても乳化力を発揮すること、カルシウム、マグ
ネシウム等の金属イオンが高濃度で共存しても乳化力が
低下しないこと、酸性下での乳化安定性が良いこと等の
特性が付与されると報告されている［Yamano, Y. and G
ohtani, S. (1996)Abstract of 4th World Surfactants
Congress P-84 参照］。

【０００３】現在、酵素を利用してリン脂質を分解した
リゾリン脂質が市販されているが、これはブタ肝臓から
調製された酵素剤パンクレアチンに含まれるホスホリパ
ーゼＡ２活性を用いたものであり、この酵素剤には臓器
特有の臭みがあったり、供給量に制限があり価格が高い
こと等が問題とされ、パンクレアチンに代わるホスホリ
パーゼＡの給源が求められている。また、既にいくつか
の微生物が生産するホスホリパーゼＡ［特開昭５８−２
１２７８３参照］やリパーゼ類［特開昭６３−４２６９
１参照］を利用したリン脂質の分解方法が示され、ま
た、「酵素の宝庫」と呼ばれている麹カビ、アスペルギ
ルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）起源のタカヂアス
ターゼ（登録商標）にも、古くから、リン脂質分解活性
を含むリパーゼの存在が知られていた［Contardi, A. a
nd Ercoli, A. (1933) Biochem. Z.261, 275-302 およ
び Blain, J. A., et al. (1978) FEMS Microbiology L
etters 3, 85-87 参照］が、これらの酵素を用いる方法
は、酵素活性がパンクレアチンに比べて低かったり、基
質特異性に劣る酵素を利用した場合には、リゾリン脂質
の収量が悪化したり、副生物の共存によるリゾリン脂質
の品質の低下を招く等の欠点がある。従って、上記の問
題点、欠点を克服するため、優れた活性および選択性を
有し、安価に定常的に供給できる酵素の開発が望まれて
いた。服部らは、アスペルギルス（Aspergillus ）属の
糸状菌が生産するホスホリパーゼを単離精製して、優れ
た活性および選択性を有する、高度に精製されたホスホ
リパーゼＡ１を見いだしている［特開平６−６２８５０
参照］。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】 ホスホリパーゼＡ１
をコードする遺伝子をクローニングし、他の宿主細胞で
大量発現させることが可能になれば、該酵素の生産効率
の大幅な向上が期待できる。

【０００５】すなわち、本発明の目的は、アスペルギル
ス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のホスホリパーゼＡ
１をコードする遺伝子、該遺伝子を含むことからなる組
換えＤＮＡベクター、該ベクターで形質転換された宿主
細胞および該宿主細胞を用いた組換えホスホリパーゼＡ
１の製造方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】 本発明は、（１） 配
列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜２６９で示される
アミノ酸配列を含むことからなり、ホスホリパーゼ活性
を有するポリペプチド、または配列表の配列番号２のア
ミノ酸番号１〜２６９で示されるアミノ酸配列中の１つ
もしくは２つ以上の部位において１つもしくは２つ以上
のアミノ酸が置換、欠失または挿入されているアミノ酸
配列からなり、ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ、（２） 配列表の配列番号２の
アミノ酸番号１〜２６９で示されるアミノ酸配列を含む
ことからなり、ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ、（３） 配列表の配列番号１の
ヌクレオチド番号１〜８８５で示されるヌクレオチド配
列を含むことからなるＤＮＡ、（４） （３）に記載の
ＤＮＡとハイブリダイズし、ホスホリパーゼ活性を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡ、（５） （３）に
記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ、（６） （３）に記載のＤＮＡと６×
ＳＳＣ、６０〜７０℃の条件でハイブリダイズし、ホス
ホリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、（７） （１）〜（６）のいずれか１つに記載のＤ
ＮＡを含むことからなる組換えＤＮＡベクター、（８）
プラスミド ｐＣＹ３３９である、（７）記載の組換
えＤＮＡベクター、（９） プラスミド ｐＡＡＰであ
る、（７）記載の組換えＤＮＡベクター、（１０）
（７）乃至（９）のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ
ベクターで形質転換された宿主細胞、（１１） サッカ
ロミセス・セレビジエ ＫＳ５８−２Ｄ／ｐＣＹ３３９
である、（１０）記載の宿主細胞、（１２） アスペル
ギルス・オリゼ Ｍ−２−３／ｐＡＡＰである、（１
０）記載の宿主細胞、（１３） 遺伝子操作によって得
られ、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜２６９で
示されるアミノ酸配列を含むことからなり、ホスホリパ
ーゼ活性を有するポリペプチド、または配列表の配列番
号２のアミノ酸番号１〜２６９で示されるアミノ酸配列
中の１つもしくは２つ以上の部位において１つもしくは
２つ以上のアミノ酸が置換、欠失または挿入されている
アミノ酸配列からなり、ホスホリパーゼ活性を有するポ
リペプチド、（１４） 遺伝子操作によって得られ、配
列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜２６９で示される
アミノ酸配列を含むことからなり、ホスホリパーゼ活性
を有するポリペプチド、（１５） （１０）乃至（１
２）のいずれか１つに記載の宿主細胞を、ホスホリパー
ゼの産生可能な条件下で培養し、次いで、該培養物から
ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドを回収するこ
とを特徴とする、該ポリペプチドの製造方法、に関する
ものである。

【０００７】本発明者らは、麹菌アスペルギルス・オリ
ゼ（Aspergillus oryzae）からホスホリパーゼＡ１（以
下「ＰＬＡ１」という）をコードする遺伝子をクローニ
ングし、さらに該遺伝子を培養細胞、酵母および麹菌に
導入して発現させることに成功して、本発明を完成させ
た。

【０００８】本発明において、「ホスホリパーゼ活性」
とは、レシチンまたはリゾレシチンから、遊離脂肪酸を
放出する活性をいう［酵素ハンドブック（1982年版；朝
倉書店刊）p427参照］。

【０００９】また、本発明において、「組換えＰＬＡ
１」とは、遺伝子操作によって得られ、配列表の配列番
号２のアミノ酸番号１〜２６９で示されるアミノ酸配
列、または配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜２６
９で示されるアミノ酸配列中の１つもしくは２つ以上の
部位において、１つもしくは２つ以上のアミノ酸が置
換、欠失または挿入されているアミノ酸配列を含むこと
からなり、ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドを
いう。本発明の組換えＰＬＡ１として特に好適なものと
しては、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜２６９
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを挙げる
ことができる。

【００１０】さらに、本発明のＤＮＡとしては、配列表
の配列番号２のアミノ酸番号１〜２６９で示されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが好
適である。より好適には、配列表の配列番号１のヌクレ
オチド番号１〜８８８で示されるヌクレオチド配列を有
するＤＮＡを挙げることができるが、これに限定されな
い。

【００１１】

【発明の実施の形態】 本発明のＤＮＡは、例えば、Ｐ
ＬＡ１ポリペプチドを産生する微生物からＰＬＡ１ポリ
ペプチドをコードするｍＲＮＡを調製した後、既知の方
法により該ｍＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換することによ
って得ることができる。前記ｍＲＮＡの供給源となり得
る微生物としては、本発明においては、麹菌アスペルギ
ルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）が好適であり、さ
らにAspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn SANK 11870
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８８７）株が好適である。

【００１２】ｍＲＮＡの抽出にあたっては、グアニジン
・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン
・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等も採用し得る
が、グアニジン・チオシアネート・塩化セシウム法が好
適である。

【００１３】上記のごとくして得られたｍＲＮＡがＰＬ
Ａ１ポリペプチドをコードするものであることを確認す
るためには、ｍＲＮＡを翻訳させ生理活性を調べるか、
該タンパク質に特異的な抗体を用いてそのタンパク質を
同定する等の方法を用いることができる。例えば、アフ
リカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞にｍＲＮ
Ａを注入して翻訳させたり［Gurdon, J. B., et al. (1
972) Nature 233, 177-182参照］、あるいはウサギ網状
赤血球系や小麦胚芽系を利用した翻訳反応が行われてい
る［Schleif, R. F. and Wensink, P. C. (1981) "Prac
tical Methodsin Molecular Biology" Springer Verla
g, NY 参照］。

【００１４】前述のごとき方法で得たｍＲＮＡを鋳型と
して逆転写酵素を用いて一本鎖ＤＮＡを合成した後、こ
の一本鎖ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを合成するが、その方
法としてはＳ１ヌクレアーゼ法［Efstratiadis, A., et
al. (1976) Cell 7, 279-288 参照］、ランド法［Lan
d, H., et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 2251-22
66 参照］、O. Joon Yoo 法［Yoo, O. J., et al. (198
3) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 79, 1049-1053参照］等
も採用し得るが、本発明の目的にはオカヤマ−バーグ法
［Okayama, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol.
2, 161-170 参照］が好適である。

【００１５】次に、得られた組換えプラスミドを大腸菌
等の微生物に導入して形質転換させて、テトラサイクリ
ン耐性あるいはアンピシリン耐性を指標として組換え体
を選択することができる。宿主細胞の形質転換は、ハナ
ハンの方法［Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166,
557-580 参照］、すなわち塩化カルシウムや塩化マグネ
シウムまたは塩化ルビジウムを共存させて調製したコン
ピテント細胞に該組換えＤＮＡを加える方法により実施
することができる。なお、ベクターとしてはプラスミド
以外にもラムダ系などのファージベクターも用いること
ができる。

【００１６】上記により得られる形質転換体から、目的
のＰＬＡ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを有する株
を選択する方法としては、例えば以下に示す各種方法を
用いることができる。

【００１７】〔１〕合成オリゴヌクレオチドプローブを
用いるスクリーニング法 目的とするタンパク質のアミノ酸配列の全部または一部
が解明された場合（該配列は、複数個連続した特異的配
列であれば、目的とするタンパク質のどの領域のもので
もよい）、該アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチ
ドを合成し（この場合コドン使用頻度を用いて導いたヌ
クレオチド配列または考えられるヌクレオチド配列を組
み合わせた複数個のヌクレオチド配列のどちらでもよ
く、また後者の場合、イノシンを含ませてその種類を減
らすこともできる）、これをプローブ（³²Ｐ等の放射性
同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン等で標識する）と
して、ニトロセルロースフィルターあるいはナイロンフ
ィルター上に固定された形質転換株のＤＮＡとハイブリ
ダイズさせ、プローブの標識法に応じた方法でポジティ
ブ株を検索して、これを選択する。

【００１８】〔２〕ポリメラーゼ連鎖反応により作成し
たプローブを用いるスクリーニング法 目的とするタンパク質のアミノ酸配列の全部または一部
が解明されている場合、該アミノ酸配列の一部に対応す
るセンスストランドとアンチセンスストランドのオリゴ
ヌクレオチドを合成し、これらを組み合わせてポリメラ
ーゼ連鎖反応［Saiki, R. K., et al. (1988) Science
239, 487-491参照］を行い、目的のＰＬＡ１ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳
型ＤＮＡとしては、ＰＬＡ１ポリペプチドを産生する細
胞のｍＲＮＡより逆転写反応により合成されたｃＤＮ
Ａ、またはゲノムＤＮＡを用いることができる。このよ
うにして調製したＤＮＡ断片を上記〔１〕のごとく標識
し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイ
ゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションを行
うことにより目的のクローンを選択する。

【００１９】〔３〕ＰＬＡ１ポリペプチドに対する抗体
を用いて選択する方法 予め、ｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、形質転換株
内でタンパク質を産生させ、ＰＬＡ１ポリペプチドに対
する抗体および該抗体に対する二次抗体を用いて、所望
のＰＬＡ１ポリペプチド産生株を検出し、目的の株を選
択する。

【００２０】〔４〕セレクティブ・ハイブリダイゼーシ
ョン・トランスレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロース
フィルター等にブロットし、ＰＬＡ１ポリペプチド産生
細胞からのｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮ
Ａに結合したｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収され
たｍＲＮＡをタンパク質翻訳系、例えばアフリカツメガ
エルの卵母細胞への注入や、ウサギ網状赤血球ライゼー
トや小麦胚芽等の無細胞系でタンパク質に翻訳させ、そ
のタンパク質のＰＬＡ１活性を調べるか、またはＰＬＡ
１ポリペプチドに対する抗体を用いて検出して、目的の
株を選択する。

【００２１】以上記載したｍＲＮＡを材料としてｃＤＮ
Ａを作製する方法の他に、一般にある酵素をコードする
ＤＮＡ断片の調製は、その酵素に対応したヌクレオチド
配列を含むＤＮＡを供与体細胞から取り出し、制限酵素
等で処理することにより行うことができる。

【００２２】すなわち、本発明の麹菌アスペルギルス・
オリゼのＰＬＡ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを採
取する方法は、公知の方法［Maniatis, T., et al. (19
82)"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold S
pring Harbor Laboratory,NY参照］に従い実施できる。
例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分
離し、該プラスミドＤＮＡより該ポリペプチドをコード
するＤＮＡ領域を切り出すことにより行い得る。

【００２３】一般に、真核生物の遺伝子は、インターフ
ェロン遺伝子等で知られているように、多型現象（poly
morphism）を示すと考えられ［例えば、Nishi, T., et
al.(1985) J. Biochem. 97, 153-159参照］、この多型
現象によって１個またはそれ以上のアミノ酸が置換され
る場合もあれば、ヌクレオチド配列の変化はあってもア
ミノ酸は全く変わらない場合もある。配列表の配列番号
２で示されるアミノ酸番号１〜２６９からなるＰＬＡ１
ポリペプチドのアミノ酸配列の中の、一つもしくは二つ
以上の部位において、一つもしくは二つ以上のアミノ酸
残基が欠失、挿入もしくは置換されているタンパク質で
も、ＰＬＡ１活性を有することがある。本発明において
は、これらのタンパク質をＰＬＡ１の同効物と呼ぶ。

【００２４】例えばインターロイキン２（ＩＬ−２）遺
伝子のシステインに相当するヌクレオチド配列をセリン
に相当するヌクレオチド配列に変換して得られたタンパ
ク質がＩＬ−２活性を保持することも既に公知となって
いる［Wang, A., et al. (1984) Science 224, 1431-14
33参照］。それゆえ、それら天然に存在するかあるいは
人工合成されたタンパク質がＰＬＡ１活性を有する限
り、それらのタンパク質をコードする、同効のヌクレオ
チド配列からなるＤＮＡもすべて本発明に含まれる。

【００２５】このような各種の本発明のＤＮＡは、上記
ＰＬＡ１ポリペプチドの情報に基づいて、例えばホスフ
ァイト・トリエステル法［Hunkapiller, M., et al. (1
984)Nature 310, 105-111参照］等の常法に従い、核酸
の化学合成により製造することもできる。

【００２６】なお、所望のアミノ酸配列に対するコドン
はそれ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば
利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決
定できる［Grantham, R., et al. (1981) Nucleic Acid
s Res. 9, r43-r74 参照］。さらに、これらヌクレオチ
ド配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変
をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマ
ーを利用したサイトスペシフィック・ミュータジェネシ
ス（site specific mutagenesis ）［Mark, D.F., et a
l. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666
参照］等に従うことができる。

【００２７】また、あるＤＮＡが本発明の（３）のＤＮ
Ａとハイブリダイズするか否かは、以下のようにして調
べることができる。すなわち、まず被検検体のＤＮＡを
必要に応じてアガロースゲル電気泳動した後、ニトロセ
ルロースまたはナイロン等の膜にブロットし、吸着した
ＤＮＡを熱処理や紫外線照射等により膜に固定する。本
発明の（３）のＤＮＡを、ランダムプライマー法［Fein
berg, A. P., et al.(1983) Anal. Biochem., 132, 6-1
3参照］、ニックトランスレーション法［Maniatis, T.,
et al. (1982) "Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual" Cold Spring Harbor Laboratory, New York参
照］等に従って、³²Ｐ等の放射性同位元素、ビオチン、
ジゴキシゲニンまたは酵素等で標識したプローブを作製
する。該プローブを含むハイブリダイゼーション溶液中
に膜を浸して、所定の温度でインキュベーションした
後、膜を洗浄し、それぞれの標識に即した方法によりプ
ローブを検出する。

【００２８】ハイブリダイゼーション溶液中に含まれる
ＳＳＣ（salined-sodium citrate：「クエン酸ナトリウ
ム−生理食塩液」；１×ＳＳＣは０．１５Ｍの塩化ナト
リウム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む）の濃度
は好適には４乃至８×ＳＳＣである。また、インキュベ
ーション温度は好適には３０乃至７０℃である。本発明
においては、上記の範囲のＳＳＣ濃度およびインキュベ
ーション温度の組み合わせを「ストリンジェントな条
件」という。そのような条件としては、特に６×ＳＳ
Ｃ、６０℃の条件が最も好適である。

【００２９】上記の方法を利用することにより、本発明
の（３）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを、種々
のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーから
クローニングすることができる。

【００３０】このようにして得られる本発明のＤＮＡの
ヌクレオチド配列決定は、例えばマキサム−ギルバート
の化学修飾法［Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980)
Methods in Enzymology 65, 499-559 参照］や、Ｍ１３
ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法［Me
ssing, J. and Vieira J. (1982) Gene 19, 269-276参
照］等により行うことができる。

【００３１】クローン化されたＰＬＡ１ポリペプチドを
コードする遺伝子を含む断片は、適当なベクターＤＮＡ
に再び組み込むことにより、他の原核生物または真核生
物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、
これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現
にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主
細胞において遺伝子を発現させることが可能である。

【００３２】原核細胞の宿主としては、例えばストレプ
トミセス・リビダンス（Streptomyces lividans ）、大
腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtili
s ）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞
内で形質発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレ
プリコン、すなわち複製起点および調節配列を含んでい
るプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させればよ
い。またベクターは形質転換細胞に表現形質（表現型）
の選択性を付与し得る配列を有するものが好ましい。

【００３３】ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２やｐ
ＵＣ系のプラスミドがよく用いられるが、これに限定さ
れず、公知の各種の菌株およびベクターがいずれも利用
できる。プロモーターとしては、大腸菌においてはトリ
プトファン（ｔｒｆ）プロモーター、ラクトース（ｌａ
ｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａ
ｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモー
ター、バクテリオファージ由来のラムダ（λ）Ｐ_L プロ
モーター、ポリペプチド鎖伸長因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プ
ロモーター等が挙げられる。

【００３４】また真核微生物としては酵母やアスペルギ
ルス・オリゼが一般に良く用いられ、その中でもサッカ
ロミセス属酵母、例えばサッカロミセス・セレビジエ
（Saccharomyces cerevisiae）、またはアスペルギルス
・オリゼが好ましい。該酵母等の真核微生物の発現ベク
ターの調製に際しては、例えばアルコール脱水素酵素遺
伝子のプロモーター［Bennetzen, J. L. and Hall, B.
D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025 参照］や酸
性ホスファターゼ遺伝子のプロモーター［Miyanohara,
A., et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1
-5参照］等を好ましく利用できる。またアスペルギルス
・オリゼ用の発現ベクターとしては、ｐＴＡｅｘ３［Fu
jii, T., et al. (1995) Biosci. Biotech. Biochem. 5
9, 1869-1874参照］が好適である。

【００３５】このようにして得られる本発明の形質転換
細胞としては、サッカロミセス・セレビジエ ＫＳ５８
−２Ｄ／ｐＣＹ３３９株またはアスペルギルス・オリゼ
Ｍ−２−３／ｐＡＡＰ株が好適である。

【００３６】上記で得られる所望の形質転換細胞は、常
法に従い培養することができ、該培養により細胞内また
は細胞外に組換えＰＬＡ１ポリペプチドが生産される。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に
応じて慣用される各種のものを適宜選択できる。

【００３７】例えば、大腸菌を宿主として用いる場合、
培地としてはＬＢ培地、２×ＹＴ培地、Ｌ培地、肉汁培
地、Ｍ９最小培地等、当業者に周知のものをいずれも使
用することができる。また、培養温度は好ましくは１５
乃至４０℃であり、より好適には２５乃至３７℃であ
る。培養に要する時間は、嫌気性または好気性条件下で
通常１０日間以内、好適には８時間乃至３日間である。

【００３８】また、酵母を宿主として用いる場合、培地
としてはＹＰＤ培地、ＭＹ培地、麦芽エキス培地、合成
最小培地等、当業者に周知のものをいずれも使用するこ
とができる。また、培養温度は好ましくは１５乃至４０
℃であり、より好適には２０乃至３０℃である。培養に
要する時間は、嫌気性または好気性条件下で通常２０日
間以内、好適には３乃至７日間である。

【００３９】さらに、ＣＯＳ−１細胞を宿主として用い
る場合、培地としては最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベ
ッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムのＦ１２培
地、ＲＰＭＩ１６４０培地等が使用され得る。培養温度
は好ましくは３０乃至３７℃であり、最も好適には３７
℃である。また、培養機内の空気の炭酸ガス濃度は５乃
至１０％、最も好適には５％に調節されていることが望
ましい。

【００４０】その他、使用する宿主細胞に応じて、該宿
主細胞の生育および蛋白質生産が可能な培地および培養
条件を用いることができる。

【００４１】上記方法により、形質転換体の細胞内また
は細胞外に生産されるＰＬＡ１ポリペプチドは、該ＰＬ
Ａ１ポリペプチドの物理学的性質や化学的性質等を利用
した各種の公知の分離操作法により、それらより分離・
精製することができる。該方法としては、具体的には例
えば通常のタンパク質沈澱剤による処理、限外濾過、分
子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析
法、これらの組み合わせ等を例示できる。

【００４２】本発明により得られる組換えＰＬＡ１ポリ
ペプチドがホスホリパーゼ活性を有するか否かは、例え
ば以下に記載する方法で確認することができる。

【００４３】〔１〕レシチンを基質として、遊離脂肪酸
を定量する方法［特開平６−６２８５０参照］； 〔２〕１−［１−¹⁴Ｃ］オレオイルグリセロールまたは
１−［１−¹⁴Ｃ］パルミトイル−２−アシル−ｓｎ−グ
リセロ−３−ホスホエタノールアミンを基質とし、遊離
脂肪酸の放射能を測定する方法［Waite, M., et al. (1
974) J. Biol. Chem. 249, 6401-6405参照］。

【００４４】上記方法により、容易に高収率、高純度で
所望の組換えＰＬＡ１ポリペプチドを工業的規模で製造
できる。このようにして得られる本発明の組換えＰＬＡ
１ポリペプチドの諸性質は既に文献に記載された天然の
ＰＬＡ１［特開平６−６２８５０参照］の諸性質と共通
しており、その生物活性により、食品工業、飼料工業、
医薬品工業当の分野で主としてリゾリン脂質生産のため
に幅広く使用され得る。

【００４５】本発明の組換えＰＬＡ１は、優れた活性お
よび選択性を有し、大量かつ安価に定常的に供給可能
な、極めて有用なホスホリパーゼである。本酵素を用い
てリン脂質を分解させる酵素反応は、酵素と基質を、水
性溶媒中または湿潤状態で接触させることにより行われ
る。使用される基質は、例えば、小麦粉、大豆、卵黄等
のレシチンであり、その濃度は、好適には、１乃至５０
重量％である。使用する水は、井戸水または水道水がそ
のまま使用できるが、より効率的な酵素反応のために、
酸（例えば酢酸）、アルカリ（例えば水酸化ナトリウ
ム）あるいは緩衝液（例えば酢酸緩衝液）を加えて、ｐ
Ｈを３乃至７（特に好適には、３．５乃至５．５）に調
整して用いることもできる。反応温度は、１０℃乃至７
０℃（好適には２０℃乃至６５℃、特に好適には３０℃
乃至６０℃）であり、反応に要する時間は、基質、反応
温度、ｐＨ等により異なるが、通常１０分間乃至１０日
間（好適には、１時間乃至２日間）である。

【００４６】酵素反応終了後、得られたリゾリン脂質
は、分離することなく直接加工処理に使用できる。ま
た、常法により不溶物を濾別し、直接使用するか、濃縮
により適当なリゾリン脂質を得ることもできる。さら
に、必要に応じて、水を加えて、水不混和性有機溶剤で
抽出し、抽出溶剤を留去することにより得ることもでき
る。また、必要に応じて、常法、例えば、カラムクロマ
トグラフィー、再結晶法等によりさらに精製することも
できる。

【００４７】

【実施例】 以下に実施例を挙げ、本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００４８】実施例１． ＰＬＡ１の部分アミノ酸配列
の決定 ＰＬＡ１は、Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn SANK
11870（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８８７）株（以下「ＳＡＮ
Ｋ １１８７０株」という）から、服部らの方法［特開
平６−６２５８０参照］により精製した。ドデシル硫酸
ナトリウム（以下「ＳＤＳ」という）存在下でのポリア
クリルアミドゲル電気泳動により算出した分子量が３７
０００に相当するＰＬＡ１ａ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の２
０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）０．４５ｍ
ｌに、０．４％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸（シグマ社
製）を含むトリクロロ酢酸４５μｌを添加し、１０００
０ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。沈澱に対して
０．６８ｍｌの冷却アセトンを添加し、１００００ｒｐ
ｍ、４℃で１０分間遠心分離し、沈澱を減圧乾燥した。
この沈澱を、トリス−グアニジン溶液［６Ｍ 塩酸グア
ニジンを含む０．５Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）］９０μｌに溶解し、窒素ガスを１分間吹き込ん
だ。これに、１００ｍＭ ジチオスレイトールを含むト
リス−グアニジン溶液４．５μｌを添加し、再び窒素ガ
スを２分間吹き込んだ。室温で２時間静置後、１００ｍ
Ｍ ヨードアセトアミド溶液を９μｌ添加し、室温で３
０分間静置した。この溶液を、蒸留水に対して、４℃で
一晩透析し、減圧乾燥した。これに８Ｍ 尿素を３０μ
ｌ添加し、３７℃で１時間保温した。これにダイジェス
ション緩衝液（ＣＴＦＦキット、島津製作所（株）社
製）を４３μｌ添加し、さらに１０ｍｇ／ｍｌのリシル
エンドペプチダーゼを１３μｌ添加して、３７℃で一晩
保温した。

【００４９】次いで、この反応液に０．１％（ｖ／ｖ）
トリフルオロ酢酸を０．３ｍｌ添加し、その全量を逆相
ＨＰＬＣで分画した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであ
った。

【００５０】カラム：コスモシール５Ｃ８−ＡＲ−３０
０（サイズ４．６×１０ｍｍ、ナカライテスク社製）； 流速：０．５ｍｌ／分； 移動相：０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を用い、
アセトニトリルの濃度を初期濃度５％（ｖ／ｖ）、最終
濃度８０％（ｖ／ｖ）とし、１５分間のグラジエントを
かけて溶出； 検出波長：２１０ｎｍ。

【００５１】上記の条件で溶出時間５．２分、６．８
分、８．０分、９．２分および９．８分のピークを分画
し、各ピークについて、気相式プロテインシークエンサ
ー（モデルＰＰＳＱ−１０；島津製作所（株）社製）を
用いて、自動エドマン法［Edman, P., et al. (1967) E
ur. J. Biochem. 1, 80 参照］によりアミノ酸配列を解
析した。上記各ピークのアミノ酸配列は以下に記載する
通りであった： 溶出時間（分） 配列 ５．２ 配列表の配列番号３ ６．８ 配列表の配列番号４ ８．０ 配列表の配列番号５ ９．２ 配列表の配列番号６ ９．８ 配列表の配列番号７。

【００５２】実施例２． アスペルギルス・オリゼのｍ
ＲＮＡの調製 ＳＡＮＫ １１８７０株を培地（１％（ｗ／ｖ）ポリペ
プトン（日本製薬（株）社製）、５％（ｗ／ｖ）ショ
糖、０．５％（ｗ／ｖ）イーストエキストラクト（ディ
フコ社製）、０．１％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７
水和物、０．５％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウム、０．８％
（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０（第一化学薬品（株）社
製）、０．５％（ｗ／ｖ）グルタミン酸ナトリウム、１
％（ｗ／ｖ）レシチン（豊年（株）社製）、０．２５％
（ｗ／ｖ）リン酸水素二カリウム−０．２５％（ｗ／
ｖ）リン酸二水素カリウム緩衝液（ｐＨ６．６））１０
０ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２６
℃、２１０ｒｐｍで培養した。３日間、５日間および７
日間培養後の菌体を集菌し、直ちに液体窒素で凍結させ
てから、−８０℃で保存した。

【００５３】次に、予めドライアイス上で冷却した乳鉢
中で、凍結保存菌体３ｇを粉状になるまで破砕した。こ
れをグアニジンチオシアネート溶液（４Ｍ グアニジン
チオシアネート（フルカ社製）、４％（ｗ／ｖ）ザルコ
シル（シグマ社製）、０．１％（ｗ／ｖ）アンチフォー
ムＡ（シグマ社製）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、４
ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび２５ｍＭクエン
酸三ナトリウム（ｐＨ７．０））１５ｍｌで満たしてお
いた遠心管に移し、激しく攪拌後、ポリトロンホモジナ
イザーを用いて３０秒間菌体を破砕した。これを９００
０ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心分離し、上清を再び９
０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。上清７ｍ
ｌを、予め３ｍｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む
５．７Ｍ塩化セシウム溶液を入れておいた超遠心管（１
３ＰＡ：日立（株）社製）に静かに重層し、３００００
ｒｐｍ、４℃で１５時間遠心した。遠心分離後、沈澱を
０．３ｍｌの１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下「ＴＥ」と
いう）に溶解した。これに３０μｌの３Ｍ 酢酸−酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）、および１ｍｌのエタ
ノールを添加した。これを１４５００ｒｐｍ、４℃で１
０分間遠心分離し、沈澱に８０％（ｖ／ｖ）エタノール
を添加し、再び１４５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分
離した。沈澱を減圧乾燥後、４０μｌのＴＥに溶解した
ものを全ＲＮＡ試料とした。

【００５４】このようにして得られた全ＲＮＡを、オリ
ゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフィーを行う
ことにより、ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを精製した。すなわ
ち、全ＲＮＡ（５４０μｇ）を吸着緩衝液（０．５Ｍ
塩化ナトリウム、２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．
５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）
に溶解し、６５℃で５分間加熱した後、吸着緩衝液にて
充填されたオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（Ｔｙｐｅ
７；ファルマシア社製）に供与し、溶出溶液（１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．０５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）でポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを
溶出し、回収した。このような操作により、２０μｇの
ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを得た。

【００５５】実施例３． アスペルギルス・オリゼのｃ
ＤＮＡライブラリーの調製 実施例２で得られたＳＡＮＫ １１８７０株のｍＲＮＡ
（３μｇ）を、５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）１５μｌに溶解した。これを６５℃、５分間加温
後、３７℃まで冷却し、１０倍濃度の逆転写酵素緩衝液
（８０ｍＭ 塩化マグネシウム、３００ｍＭ 塩化カリ
ウム、３ｍＭ ジチオスレイトールを含むトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８．５））３μｌ、２０ｍＭ ｄＡＴＰ、
２０ｍＭｄＣＴＰ、２０ｍＭ ｄＧＴＰおよび２０ｍＭ
ｄＴＴＰの混合溶液３μｌ、０．５μｇ／μｌのベク
タープライマー（ｐＣＤＶ１ オリゴ（ｄＴ）テイルド
・プラスミド；ファルマシア社製）を３μｌ、２７単位
／μｌ 逆転写酵素（トリ骨髄芽球症ウイルス（avian
myeloblastosis virus）由来；生化学工業 (株) 社製）
１．７μｌ、蒸留水４．３μｌを添加し、３７℃で３０
分間保温した。

【００５６】反応液に１／２容量のＴＥ飽和フェノール
および１／２容量のクロロホルムを加え、激しくふり混
ぜた後、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。水層
を回収し、これに１／２容量のＴＥ飽和フェノール、お
よび１／２容量のクロロホルムを加え、激しくふり混ぜ
た後、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。再び水
層を回収し、これに同量のクロロホルムを加え、激しく
ふり混ぜた後、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、
水層を回収した（以下、この操作を「フェノール・クロ
ロホルム抽出」という）。

【００５７】回収した水層に、１／１０容量の３Ｍ酢酸
−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）および２．５倍
量のエタノールを加え、−８０℃で１５分間冷却後、１
００００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。沈澱を８０％
（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄後、減圧乾燥した（以下、
この操作を「エタノール沈澱」という）。

【００５８】この沈澱に１３μｌの蒸留水、２μｌの１
０倍濃度のターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フェラーゼ反応用緩衝液（１．４Ｍ カコジル酸ナトリ
ウム、１０ｍＭ 塩化コバルトを含む０．３Ｍ トリス
−塩酸（ｐＨ７．６））、２μｌのポリ（Ａ）、１μｌ
の２ｍＭ ジチオスレイトール、０．６μｌの２ｍＭｄ
ＡＴＰ、２ｍＭ ｄＣＴＰ、２ｍＭ ｄＧＴＰおよび２
ｍＭ ｄＴＴＰの混合溶液および２１単位／μｌのター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（フ
ァルマシア社製）を０．５μｌ加え、３７℃で５分間保
温した。反応液をフェノール・クロロホルム抽出し、エ
タノール沈澱した後、得られた沈澱を２４μｌのＴＥに
溶解し、３０単位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを加えて３
７℃で一晩保温した。反応液をフェノール・クロロホル
ム抽出し、エタノール沈澱した後、沈澱を１０μｌのＴ
Ｅに溶解したものを、アスペルギルス・オリゼｃＤＮＡ
試料とした。

【００５９】一方、プラスミドベクターｐｃＤＬ−ＳＲ
α２９６［武部ら、(1989) 実験医学 ７巻、９５−９
９参照］を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、さらにその３’
末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼ（ファルマシア社製）によりｄＧＴＰを付加させ
た。次いで、このものを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化
することにより、ＳＲαプロモーターにオリゴ（ｄＧ）
が付加されたオリゴ（ｄＧ）付きリンカーＤＮＡを作製
した。

【００６０】上記アスペルギルス・オリゼｃＤＮＡ試料
１μｌに、０．５μｌの上記オリゴ（ｄＧ）付きリンカ
ーＤＮＡ（０．０８ｐｍｏｌ相当）、２μｌの５倍濃度
ハイブリダイゼーション緩衝液（５ｍＭ ＥＤＴＡ、５
００ｍＭ 塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５））、および６．５μｌの蒸留水
を加え、６５℃で５分間加温した後、４３℃で３０分間
保温した。これに９μｌの１０倍濃度のライゲーション
緩衝液（アマシャム社製）、６８μｌの蒸留水および１
μｌの１０ｍＭ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（ベーリンガーマンハイム社製）を加え、氷上で
１０分間冷却後、２μｌの０．２８μｇ／μｌのＤＮＡ
リガーゼ（ファルマシア社製）を添加し、１２℃で一晩
保温した。この反応液に、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ
ｄＣＴＰ、２ｍＭ ｄＧＴＰおよび２ｍＭ ｄＴＴＰの
混合溶液２μｌ、１０ｍＭ β−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド０．５μｌ、０．２８μｇ／μｌのＤ
ＮＡリガーゼ（大腸菌由来；ファルマシア社製）１．５
μｌ、４単位／μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ（ファルマ
シア社製）１μｌおよび１単位／μｌのリボヌクレアー
ゼＨ（ファルマシア社製）４μｌを加え、１２℃で１時
間保温した。反応液をフェノール・クロロホルム抽出
し、エタノール沈澱した後、沈澱を１００μｌの蒸留水
に溶解した。

【００６１】実施例４． アスペルギルス・オリゼの染
色体ＤＮＡライブラリーの作製 実施例２に記載した方法により培養し、−８０℃で凍結
保存したＳＡＮＫ １１８７０株の菌体３ｇを、ドライ
アイスで冷却した乳鉢上で粉状になるまで破砕した。破
砕した菌体を、あらかじめ２０ｍｌの６２．５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ・２Ｎａ、５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で満たしておいた遠心管
に移し、激しく攪拌後、氷上で１．５時間静置した。こ
れにＴＥ飽和フェノール１０ｍｌを加え、５０℃で１時
間、緩やかにふり混ぜた。その後さらにＴＥ飽和フェノ
ール５ｍｌを加え、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
した。水層を別の遠心管に回収し、７．５ｍｌのＴＥ飽
和フェノールおよび７．５ｍｌのクロロホルムを加え、
激しく攪拌後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し
た。再び水層を別の遠心管に回収し、１／２容量の８Ｍ
酢酸アンモニウム溶液と２５ｍｌのエタノールを加え、
−８０℃で１５分間冷却後、１００００ｒｐｍ、４℃で
１０分間遠心分離した。沈澱を５ｍｌのＴＥに溶解し、
２ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡおよび２５００単位
／ｍｌのリボヌクレアーゼＴ１を含む溶液を１００μｌ
添加し、３７℃で２０分間保温した。これに２０ｍｌの
イソプロパノールを加え、緩やかに混合することによ
り、生じた糸状のＤＮＡをピンセットで釣り上げ、０．
８ｍｌのＴＥに溶解した。

【００６２】このＤＮＡ溶液に１／２容量のＴＥ飽和フ
ェノールと１／２容量のクロロホルムを加え、激しく攪
拌後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、水層を回
収した。この操作をさらに３回繰り返して、得られた水
層に等量のクロロホルムを加え、激しく攪拌後、１５０
００ｒｐｍで５分間遠心分離し、水層を回収した。この
水層に１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．
５）および２．５容量のエタノールを加え、−８０℃で
１５分間冷却後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離
し、沈澱を回収した。この沈澱に１ｍｌの８０％（ｖ／
ｖ）エタノールを加えて、１５０００ｒｐｍで５分間遠
心分離し、沈澱を回収した。この沈澱を減圧乾燥し、Ｔ
Ｅに溶解したものを、精製アスペルギルス・オリゼ染色
体ＤＮＡとした。

【００６３】次いで、アスペルギルス・オリゼ染色体Ｄ
ＮＡ（１５μｇ相当）を、４００単位の制限酵素Ｐｓｔ
Ｉを用いて消化（３７℃、１２時間）した後、エタノー
ル沈澱した。

【００６４】一方、３μｇ相当のプラスミドｐＵＣ１８
（宝酒造（株）社製）を１００単位の制限酵素ＰｓｔＩ
で消化し、エタノール沈澱した。沈澱を２００μｌのＴ
Ｅに溶解し、２．５単位／μｌのアルカリフォスファタ
ーゼ（ＣＡＰ−１０１；東洋紡 (株) 社製）を１μｌ添
加して、３７℃で３０分間保温した後、フェノール・ク
ロロホルム抽出し、エタノール沈澱した。

【００６５】制限酵素ＰｓｔＩで消化したアスペルギル
ス・オリゼ染色体ＤＮＡ（５００ｎｇ相当）と、同じく
ＰｓｔＩ消化したｐＵＣ１８とを、ＤＮＡライゲーショ
ンキット（宝酒造（株）社製）を用いて連結した。この
反応液で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換［Hanahan, D. (1
983) J. Mol. Biol. 166, 557-580 参照］することによ
り、アスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡライブラリ
ーを調製した。

【００６６】実施例５． ＰＣＲ法によるＰＬＡ１遺伝
子のクローニング ＰＬＡ１の部分アミノ酸配列： Asp Leu Phe Ala Gln Tyr （配列表の配列番号６のアミ
ノ酸番号１１〜１６） をコードする１７ｍｅｒの混合センスプライマー： 5'- GA(CT)(TC)T(ACGT)TT(CT)G CICA(AG)TA -3' （配
列表の配列番号８；なお配列中、括弧で囲まれた部分
は、該括弧内のヌクレオチドのうちの任意の１ヌクレオ
チドを表わす） を固相ホスホアミダイト法［Beaucage, et al. (1981)
Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 参照］により化学
合成した。

【００６７】また、ＰＬＡ１の別の部分アミノ酸配列： Asp Glu Phe Asn Glu Ser （配列表の配列番号５のアミ
ノ酸番号２０〜２５） をコードする１６ｍｅｒの混合アンチセンスプライマ
ー： 5'- (GC)(AT)TC(AG)TT(AG)AA (CT)TC(AG)TC -3' （配
列表の配列番号９） を化学合成した。プライマーの合成はＤＮＡシンセサイ
ザー（モデル３８０Ａ；アプライドバイオシステム社
製）を用いて行なった。

【００６８】実施例３で調製したアスペルギルス・オリ
ゼのｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、上記混合セン
スプライマー９２５ｎｇ、混合アンチセンスプライマー
９２５ｎｇ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣ
ＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、
５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウムお
よび２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）０．１ｍｌ中
で、１サイクルあたり９４℃で１分、５０℃で１分、７
２℃で２分の条件で、３０サイクルのＰＣＲを実施し
た。

【００６９】ＰＣＲにより得られた反応生成物から０．
１４ｋｂｐの断片を切り出し、ＤＮＡブランティングキ
ット（宝酒造 (株) 社製）を用いて末端を平滑化後、Ｄ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造 (株) 社製）を用い
て、プラスミドｐＵＣ１８（宝酒造 (株) 社製）のＳｍ
ａＩ切断部位に挿入することにより、プラスミドｐＲＡ
Ｖ１２を構築した。

【００７０】ｐＲＡＶ１２に挿入された０．１４ｋｂｐ
断片のヌクレオチド配列の解析は、ダイデオキシ法によ
り行なった。すなわち、プラスミドｐＲＡＶ１２をチャ
ングらの方法［Zhang, H., et al. (1988) Nucleic Aci
ds Res. 16, 1220参照］でアルカリ変性し、鋳型ＤＮＡ
を調製した後、７−デアザシークエネース バージョン
２．０キット（東洋紡（株）社製）を用いてヌクレオチ
ド配列を解析した。また、該キットのＤＮＡポリメラー
ゼ反応用プライマーＤＮＡとしては、Ｍ１３プライマー
Ｍ４（宝酒造 (株) 社製）あるいはＭ１３プライマーＲ
Ｖ（宝酒造 (株) 社製）を用いた。

【００７１】その結果、ｐＲＡＶ１２中の０．１４ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片は、 Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Asp Glu Asn Leu 、および Ser Val Gly Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Ser Th
r Gln Ser Leu のアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレ
ームを含んでいた。上記配列は実施例１で決定されたＰ
ＬＡ１の部分アミノ酸配列（配列表の配列番号６および
配列番号５；解析不能であるシステインを除く）の一部
と一致していたので、このＤＮＡ断片はＰＬＡ１遺伝子
をコードしていることが確かめられた。

【００７２】実施例６． コロニーハイブリダイゼーシ
ョン 実施例４で作製したアスペルギルス・オリゼの染色体Ｄ
ＮＡライブラリーを含む大腸菌ＪＭ１０９株を、ＴＹ培
地（１０ｇ／リットルのバクト・トリプトン（ディフコ
社製）、５ｇ／リットルのイーストエキストラクト（デ
ィフコ社製）、１．５％（ｗ／ｖ）寒天末および１００
μｇ／ｍｌ アンピシリン）を入れた培養プレート（直
径９ｃｍ）１枚あたり約２０００コロニーとなるように
播種した。３７℃で一晩培養後、円形のニトロセルロー
スフィルター（ＨＡ、孔径０．４５μｍ、直径８２ｍ
ｍ：ミリポア社製）を培地に載せることにより、プレー
ト中の大腸菌のコロニーを移した。このフィルターを、
新しいＴＹ培地上に置いて、３７℃で一晩培養した。

【００７３】大腸菌のコロニーが生育したニトロセルロ
ースフィルターを、０．５Ｍの水酸化ナトリウムを染み
込ませたろ紙（Ｎｏ．２：アドバンテック (株) 社製）
に載せ、室温で５分間静置することにより大腸菌を溶菌
した。次いで、フィルターを１Ｍ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８）を染み込ませたろ紙上に置き、室温で５分間
静置した。さらに、フィルターを１．５Ｍ 塩化ナトリ
ウムを含む１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）を染み
込ませたろ紙上に載せ、室温で５分間静置後、２×ＳＳ
Ｃ溶液（０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０３Ｍ
クエン酸三ナトリウム二水和物溶液）を染み込ませたろ
紙上に載せ、室温で５分間静置した。フィルターを風乾
後、８０℃で２時間加温してから、６×ＳＳＣ（０．９
Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０９Ｍ クエン酸三ナト
リウム二水和物溶液）中で十分に洗浄し、風乾した。

【００７４】プローブの標識は、以下に記載する方法に
より行なった。まず２０μｇのｐＲＡＶ１２を２００単
位のＥｃｏＲＩで消化した（３７℃、１２時間）。これ
を６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いて１×
ＴＢＥ緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを含む５０ｍ
Ｍトリス−ほう酸緩衝液（ｐＨ８．３）中、１００Ｖで
電気泳動した後、０．１４ｋｂｐに相当するバンドのＤ
ＮＡ断片をを切り出した。この０．１４ｋｂｐのＤＮＡ
断片をニックトランスレーションキット（アマシャム社
製）および〔α−³²Ｐ〕−ｄＣＴＰを用いて標識した。
未反応の〔α−³²Ｐ〕−ｄＣＴＰは、ニックカラム（フ
ァルマシア社製）を用いて除去した。

【００７５】ハイブリダイゼーションは、以下の方法に
より行なった。すなわち、風乾したニトロセルロースフ
ィルターをハイブリダイゼーション溶液（４０％（ｖ／
ｖ）ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ 塩化ナト
リウム、０．０１５Ｍ クエン酸三ナトリウム）、５×
デンハルト溶液（ウシ血清アルブミン（シグマ社製）１
ｇ／リットル、フィコール４００（ファルマシア社製）
１ｇ／リットル、ポリビニルピロリドン（シグマ社製）
１ｇ／リットル）、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび１
００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む１０ｍＭ リン
酸緩衝液（ｐＨ７．０））に浸し、４２℃で２時間保温
した。その後、上記のごとく標識したプローブを添加
し、同じハイブリダイゼーション溶液中で４２℃で一晩
保温した。その後、フィルターを４０％（ｖ／ｖ）ホル
ムアミドおよび５×ＳＳＣを含む０．１％（ｗ／ｖ）Ｓ
ＤＳ溶液中に移し、４２℃で３０分間洗浄した。さらに
フィルターを２×ＳＳＣ中で４２℃、１時間洗浄した後
風乾し、オートラジオグラフィーを行なった。

【００７６】上記の方法で約５２５００個のコロニーを
スクリーニングし、３個の陽性クローンを選択した。こ
れらの陽性クローンから調製したプラスミドをそれぞれ
制限酵素ＰｓｔＩで消化することによりｐＵＣ１８由来
の２．７ｋｂｐ相当のバンドの他に４．３ｋｂｐ相当の
バンドを生じたクローンを選択し、該クローンが保持す
るプラスミドをｐＲＡＶ４３と命名した。

【００７７】実施例７． ＰＬＡ１をコードするｃＤＮ
Ａのクローニング ｐＲＡＶ４３に含まれるＰＬＡ１ゲノムＤＮＡのヌクレ
オチド配列の解析は、ジデオキシ法とＤＮＡシークエン
サーを併用することにより実施した。ジデオキシ法の場
合は、ｐＲＡＶ４３を前記チャングらの方法によりアル
カリ変性させることにより鋳型ＤＮＡを調製した。配列
の決定は７−デアザシークエネース バージョン２．０
キットを用いて行った。

【００７８】また、ＤＮＡシークエンサーを用いる場合
は、ダイターミネーターサイクルシークエンシングキッ
ト（パーキンエルマー・ジャパン社製）を使用して試料
を調製し、ＤＮＡシークエンサーモデル３７３Ａ（パー
キンエルマー・ジャパン社製）でヌクレオチド配列を決
定した。

【００７９】以上のごとくして決定されたＰＬＡ１のゲ
ノムＤＮＡのヌクレオチド配列より、該ＤＮＡ中には３
つのイントロンの存在が予想された。また、ＰＬＡ１ゲ
ノム遺伝子の塩基配列の中で、ＰＬＡ１のＮ末端アミノ
酸およびＣ末端アミノ酸をコードする位置を推定してプ
ライマーを設計した。すなわち、以下に記載する配列の
ヌクレオチドプライマー： 5'- CGTCCTGCAC GGCATTCAAA -3' （センスプライマー：
配列表の配列番号１０） および、 5'- TCCCTTCTCA AAGCCAGAAT -3' （アンチセンスプライ
マー：配列表の配列番号１１） を合成した。

【００８０】次いで、実施例３で作製したアスペルギル
ス・オリゼのｃＤＮＡライブラリー１μｇを、２０単位
の制限酵素ＰｓｔＩを用いて消化した（３７℃、２時
間）。このＰｓｔＩ処理したｃＤＮＡライブラリー５ｎ
ｇを、センスプライマー２００ｎＭ、アンチセンスプラ
イマー２００ｎＭ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ
ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴ
Ｐ、１０ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ 硫酸アンモニウ
ム、２ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１％（ｗ／ｖ）ト
ライトンＸ−１００、０．０１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清ア
ルブミン、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジー
ン社製）５単位を含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）５０μｌに溶解し、１サイクルあたり９
４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の条件
で、３０サイクルのＰＣＲを実施した。ＰＣＲ後の反応
液をフェノール・クロロホルム抽出し、エタノール沈澱
して、沈澱をＴＥに溶解した。

【００８１】このＰＣＲ反応生成物（２０μｇ相当）
に、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ＡＴＰ、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造 (株) 社製）１０
０単位、および５ｍＭ ジチオスレイトールを含む５０
ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）４００μｌを
加え、３７℃で３０分間保温した。反応液をフェノール
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行って、沈澱を
ＴＥに溶解した。

【００８２】一方、１０μｇのｐＵＣ１８を１００単位
のＳｍａＩで消化した（２５℃、３時間）後、反応液を
フェノール・クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行
って、沈澱を２００μｌのＴＥに溶解した。これにアル
カリフォスファターゼ（東洋紡 (株) 社製）を５単位添
加し、３７℃で３０分間保温した後、フェノール・クロ
ロホルム抽出し、エタノール沈澱を行って、沈澱をＴＥ
に溶解した。

【００８３】上記のごとくして得られたＳｍａＩ消化ｐ
ＵＣ１８（１００ｎｇ相当）と、リン酸化したＰＣＲ反
応生成物（５０ｎｇ相当）とを、ＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造 (株) 社製）を用いて連結し、プラスミ
ドｐＲＡＶ８８５を構築した。

【００８４】ｐＲＡＶ８８５に含まれる、ＰＬＡ１をコ
ードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ダイターミネ
ーターサイクルシークエンシングキットおよびＤＮＡシ
ークエンサーを用いて決定した。このヌクレオチド配列
（配列表の配列番号１）と前記ＰＬＡ１ゲノムＤＮＡの
ヌクレオチド配列との比較により、ゲノム上のイントロ
ンの位置を決定した。

【００８５】実施例８． 動物細胞用発現ベクターの構
築 １０μｇのｐＲＡＶ８８５を１００単位の制限酵素Ｓａ
ｃＩで消化した（３７℃、３時間）後、フェノール・ク
ロロホルム抽出し、エタノール沈澱した。このＤＮＡの
切断末端を、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造
(株) 社製）を用いて平滑化した後、反応液をフェノー
ル・クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行って、沈
澱を０．４ｍｌのＴＥに溶解した。これに５単位のアル
カリフォスファターゼ（東洋紡 (株) 社製）を添加し、
３７℃で３０分間保温した後、フェノール・クロロホル
ム抽出し、エタノール沈澱した。このＤＮＡに、０．５
μｇのＰｓｔＩリンカー（宝酒造 (株) 社製）を添加
し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造 (株) 社製）
を用いて閉環することにより、ｐＲＡＶ８８５のＳａｃ
Ｉ切断配列をＰｓｔＩ切断配列に置換したプラスミドｐ
ＲＡＶ８２０を構築した。

【００８６】次に、ｐＲＡＶ８２０を制限酵素ＳａｌＩ
とＰｓｔＩで消化し、ｃＤＮＡインサートを含む約１．
０ｋｂｐの断片を単離、精製した。

【００８７】一方、高発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ［Har
a, T., et al. (1992) EMBO J. 11,1875参照］を制限酵
素ＸｈｏＩおよびＰｓｔＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いた反応により、上記のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ
消化したＤＮＡ断片と連結した。このＤＮＡで大腸菌を
形質転換し、得られた形質転換株からそれぞれプラスミ
ドＤＮＡを抽出した。これらの形質転換株のうち、プラ
スミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することによ
り０．３ｋｂｐおよび３．６ｋｂｐの断片を生じ、かつ
制限酵素ＸｂａＩ消化により０．９ｋｂｐおよび３．０
ｋｂｐの断片を生じるようなクローンを選択し、該クロ
ーンが保持するプラスミドをｐＲＡＶ８２５と命名し
た。

【００８８】実施例９． ＣＯＳ−１細胞におけるＰＬ
Ａ１遺伝子の発現 ＣＯＳ−１細胞のトランスフェクションは、遺伝子導入
装置（モデルＧＴＥ−１；島津製作所 (株) 社製）を用
いて、電気穿孔法により行った。まずＣＯＳ−１細胞
を、細胞培養フラスコ中、血清を含まないでダルベッコ
変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）でセミコ
ンフルエントになるまで増殖させてから、トリプシン−
ＥＤＴＡ処理により細胞を剥がして回収し、ＰＢＳ
（−）緩衝液（宝酒造（株）社製）で２回洗浄した後、
ＰＢＳ（−）緩衝液で６×１０⁷ 細胞／ｍｌとなるよう
に懸濁した。

【００８９】一方、ＤＮＡ精製キット（ウィザード・マ
キシプレップス・ＤＮＡピュリフィケーションシステ
ム：プロメガ社製）で調製したｐＲＡＶ８２５およびｐ
ＭＥ１８Ｓを、ＰＢＳ（−）緩衝液でそれぞれ２００μ
ｇ／ｍｌに調整した。

【００９０】上記細胞懸濁液とＤＮＡ溶液を２０μｌづ
つ混合し、これを電極間隔２ｍｍのチャンバーに入れ、
６００Ｖ−３０ｓｅｃのパルスを１秒間隔で２回与え
た。チャンバーを４℃で５分間冷却した後、チャンバー
中の細胞・ＤＮＡ混合液を１０％ウシ胎児血清を含むＤ
ＭＥＭ １０ｍｌに加え、細胞培養用シャーレに移し
て、３７℃、５％炭酸ガス下で一晩培養した。その後、
培養上清を除き、血清を含まないＤＭＥＭで細胞を洗浄
し、ＤＭＥＭ １０ｍｌを加えて３日間培養してから、
培養上清を回収した。

【００９１】試験例１ 実施例９で調製したＣＯＳ−１細胞培養上清各２．５ｍ
ｌを、限外濾過膜付き遠心管（セントリコン−１０；グ
レースジャパン社製）を用いて、５０００ｒｐｍ、４℃
で１．５時間遠心分離することにより、それぞれ２２０
μｌまで濃縮し、以下に記載するホスホリパーゼ活性測
定用の検体（以下「ＣＯＳ−１／ｐＲＡＶ８２５」およ
び「ＣＯＳ−１／ｐＭＥ１８Ｓ」という）として使用し
た。

【００９２】２％（ｗ／ｖ）ＳＬＰ−ホワイト（ツルー
レシチン社製：ＳＬＰ−ホワイト０．２ｇに４％（ｖ／
ｖ）トライトンＸ−１００ １０ｍｌを加え溶解させた
もの）０．５ｍｌに、０．１Ｍ 塩化カルシウム二水和
物溶液０．０５ｍｌおよび０．２Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ
４．０）０．２５ｍｌを加え、３７℃で５分間予備加温
した後、検体０．１ｍｌを添加し、３７℃で１０分間保
温した。これに１Ｎ塩酸を０．１ｍｌ添加することによ
り反応を停止させた。反応停止後直ちに、反応液２０μ
ｌ中に含まれる遊離脂肪酸を遊離脂肪酸定量用の酵素キ
ット（デタミナー：協和メディクス (株) 社製）を用い
て定量した。なお、１分間に遊離脂肪酸１μmoleを生成
する酵素活性を１単位とした。

【００９３】上記の方法で測定した各検体のホスホリパ
ーゼ活性は表１に記載する通りであった。

【００９４】

【表１】 ───────────────────────────── 検体 活性（単位／リットル） ───────────────────────────── ＣＯＳ−１／ｐＲＡＶ８２５ ４．８×１０² ＣＯＳ−１／ｐＭＥ１８Ｓ ０．０ ─────────────────────────────実施例１０． 酵母用の発現ベクターの構築 酵母用発現ベクターの構築のための出発材料のプラスミ
ドとしては、ｐＣＹ３０３［特開平５−１７１３２参
照］を用いた。ＰＬＡ１を酵母の細胞外に分泌させるた
め、以下に記載する方法で酵母のカルポキシペプチダー
ゼＹ（以下「ＣＰＹ」という）由来のプレ領域、プロ領
域、およびＣＰＹ成熟体のＮ末端の２アミノ酸（リジン
−イソロイシン）をコードするＤＮＡ［Valls, L. A.,
et al. (1987) Cell 48, 887-897参照］を、ポリメラー
ゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）［Saiki, R. K.,
et al. (1988) Science 239, 487-491参照］を用いて、
ＰＬＡ１成熟体をコードするＤＮＡに連結することによ
り、酵母用のＰＬＡ１遺伝子発現プラスミドｐＣＹ３３
９を構築した。具体的には、以下に記載する方法で行っ
た。

【００９５】まず、以下に記載するヌクレオチド配列を
有するプライマー： 5'- GGGTCGACAT GAAAGCATTC ACCAGTTT -3' （Ｓ１：配
列表の配列番号１２）および、 5'- AGAAGGGAAG AGCTGACATC AATCTTGTTG ACACGAAGCT -
3' （Ａ２：配列表の配列番号１３） を合成した。

【００９６】次に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した
ｐＣＹ３０３を５ｎｇ、センスプライマーＳ１を２００
ｎＭ、アンチセンスプライマーＡ２を２００ｎＭ、０．
２ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ
ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、１０ｍＭ 塩化カリ
ウム、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、２ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．１％（ｗ／ｖ）トライトンＸ−１００、
０．０１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン、Ｐｆｕ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）５単位を含む
２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌ
中で、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分
の条件で３０サイクルのＰＣＲを行なった後、さらに７
２℃で１０分間保温した。

【００９７】未反応のプライマーを除くため、ＰＣＲ反
応液を、１×ＴＢＥ緩衝液中、１００Ｖでアガロースゲ
ル電気泳動し、０．３７ｋｂｐに相当するバンド部分の
ゲルを切り出し、透析チューブ（排出限界分子量 12000
-14000：ギブコ・ビーアールエル社製）中に入れて、２
００Ｖで１時間溶出した。透析チューブ内液を、フェノ
ール・クロロホルム処理し、エタノール沈澱した。沈澱
を風乾後、ＴＥに溶解した（以下、同様の操作を「切り
出し」という）。

【００９８】一方、以下に記載するヌクレオチド配列を
有するプライマー： 5'- AGCTTCGTGT CAACAAGATT GATGTCAGCT CTTCCCTTCT -
3' （Ｓ２：配列表の配列番号１４）および、 5'- CCCAAGCTTC TATGAACATT CGCTAATAT -3' （Ａ１：
配列表の配列番号１５） を合成した。

【００９９】次いで、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し
たｐＲＡＶ８８５（５ｎｇ）を鋳型とし、センスプライ
マーＳ２を２００ｎＭ、アンチセンスプライマーＡ１を
２００ｎＭ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣ
ＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、
１０ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、
２ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１％（ｗ／ｖ）トライ
トンＸ−１００、０．０１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブ
ミン、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社
製）５単位を含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）５０μｌ中で、９４℃で３０秒、５５℃で３０
秒、７２℃で１分の条件で、３０サイクルのＰＣＲを行
なった後、さらに７２℃で１０分間保温した。反応液を
１００Ｖでアガロースゲル電気泳動し、０．８４ｋｂｐ
に相当するバンドのＤＮＡを切り出した。

【０１００】以上のＰＣＲで得られた０．３７ｋｂｐの
ＤＮＡ断片（２．５ｎｇ）および０．８４ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片（２．５ｎｇ）を鋳型とし、センスプライマーＳ
１を２００ｎＭ、アンチセンスプライマーＡ１を２００
ｎＭ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、１０ｍ
Ｍ 塩化カリウム、６ｍＭ 硫酸アンモニウム、２ｍＭ
塩化マグネシウム、０．１％（ｗ／ｖ）トライトンＸ
−１００、０．０１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン、
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）５
単位を含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）５０μｌ中で、１サイクルあたり９４℃で３０秒、
５５℃で３０秒、７２℃で１分の条件で、３０サイクル
のＰＣＲを行った後、さらに７２℃で１０分間保温し
た。この反応液をフェノール・クロロホルム処理し、エ
タノール沈澱した。沈澱を風乾後、ＴＥに溶解した。こ
のようにして得られたＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩ、およ
び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、１×ＴＢＥ緩衝液
中で、１００Ｖでアガロースゲル電気泳動し、１．２ｋ
ｂｐに相当するバンドのＤＮＡを切り出した。

【０１０１】上記方法により得られた１．２ｋｂｐのＳ
ａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、制限酵素ＳａｌＩ、お
よびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＹ３０３に、ＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造（株）社製）を用いて挿
入することにより、酵母用発現プラスミドｐＣＹ３３９
を構築した。

【０１０２】実施例１１． 酵母の形質転換 パン酵母サッカロミセス・セレビジエＫＳ５８−２Ｄ株
（γ, ssl1, leu2, his1 or 3, ura3 ）の形質転換は、
レディとマーレイの方法により行なった［Reddy, A. an
d Maley, F. (1993) Anal. Biochem. 208, 211-212参
照］。すなわち、１コロニーのＫＳ５８−２Ｄ株を２０
ｍｌのＹＰＤ培地［１％（ｗ／ｖ）イーストエキストラ
クト（ディフコ社製）、２％（ｗ／ｖ）バクトペプトン
（ディフコ社製）を含む２％（ｗ／ｖ）グルコース］を
含む１００ｍｌ容三角フラスコに植菌し、２８℃、２１
０ｒｐｍ、３日間前培養した。前培養液１ｍｌを１００
ｍｌのＹＰＤ培地を含む５００ｍｌ容の三角フラスコに
植菌し、２８℃、２１０ｒｐｍで培養し、６００ｎｍの
波長により測定した濁度が１．５になったところで、培
養液を５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、菌
体を回収した。

【０１０３】回収した菌体に１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ
を含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
（以下「Ｗ溶液」という）を添加し、十分に菌体を洗浄
後、再び５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し
た。沈澱に１０ｍＭ 塩化カルシウム、１５ｍＭ ジチ
オスレイトールを含むＷ溶液を１０ｍｌ添加し、室温で
２０分間静置した。この懸濁液を１１００ｒｐｍ、４℃
で５分間遠心分離し、沈澱に１０ｍｌの冷却したＷ溶液
を添加し、よく菌体を洗浄後、再び、１１００ｒｐｍ、
４℃で５分間遠心分離し、沈澱を２ｍｌのＷ溶液中に懸
濁した。該懸濁液０．２ｍｌを採取して１．５ｍｌ容マ
イクロテストチューブに移し、これにプラスミドｐＣＹ
３３９を５μｇ相当を添加し、よく振り混ぜた。さらに
１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．１Ｍ 酢酸リチウム、
４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（アルドリッ
チ社製、分子量３４００）を含む１０ｍＭ トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．８ｍｌ添加し、よく振り
混ぜた後、３０℃で４５分間保温した。その後、４２
℃、１０分間保温した後、４０００ｒｐｍ、４℃で５分
間遠心分離し、沈澱を蒸留水１ｍｌ中に懸濁した。この
懸濁液を４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。

【０１０４】沈澱を蒸留水０．５ｍｌ中に懸濁した後、
ＳＤプレート（０．６６７％（ｗ／ｖ）イースト・ナイ
トロジェン・ベース（ディフコ社製）、２％（ｗ／ｖ）
グルコース、１×アミノ酸混合液^a)を含む２％（ｗ／
ｖ）寒天プレート）上に菌体を塗沫した。このプレート
を３０℃で静置培養し、生育したコロニーを得た。この
形質転換株をＫＳ５８−２Ｄ／ｐＣＹ３３９と命名し
た。

【０１０５】 ａ）１×アミノ酸混合液： Ｌ−トリプトファン ０．００２％（ｗ／ｖ） ウラシル ０．０２％（ｗ／ｖ） Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩 ０．００２％（ｗ／ｖ） Ｌ−リジン一塩酸塩 ０．００３％（ｗ／ｖ） Ｌ−アルギニン一塩酸塩 ０．００２％（ｗ／ｖ） Ｌ−スレオニン ０．０２％（ｗ／ｖ） Ｌ−メチオニン ０．００２％（ｗ／ｖ） Ｌ−チロシン ０．００３％（ｗ／ｖ） Ｌ−フェニルアラニン ０．００５％（ｗ／ｖ） Ｌ−イソロイシン ０．００３％（ｗ／ｖ） Ｌ−バリン ０．０１５％（ｗ／ｖ） 硫酸アデニン ０．００２％（ｗ／ｖ） Ｌ−グルタミン酸 ０．０１％（ｗ／ｖ） Ｌ−アスパラギン酸 ０．０１％（ｗ／ｖ） Ｌ−セリン ０．３７５％（ｗ／ｖ）実施例１２． 酵母におけるＰＬＡ１遺伝子の発現 サッカロミセス・セレビジェＫＳ５８−２Ｄ／ｐＣＹ３
３９株、およびプラスミドを有していないＫＳ５８−２
Ｄ株を、それぞれ２０ｍｌのＹＰＤ培地を含む１００ｍ
ｌ容の三角フラスコに植菌し、２８℃、２１０ｒｐｍで
３日間前培養した。前培養液０．５ｍｌを完全合成培地
^b)２０ｍｌを含む１００ｍｌ容の三角フラスコに植菌
し、引き続き２８℃、２１０ｒｐｍで培養した。ただ
し、ＫＳ５８−２Ｄ株の場合は、ロイシンを培地中に最
終濃度０．００３％（ｗ／ｖ）になるように添加した。
経時的に培養液の一部を採取し、１５０００ｒｐｍで５
分間遠心分離後、上清を回収して、ホスホリパーゼ活性
測定用の試料とした。

【０１０６】ｂ）完全合成培地： チアミン塩酸塩 ４００μｇ／リットル ビオチン ２μｇ／リットル ほう酸 ５００μｇ／リットル 硫酸銅 ４０μｇ／リットル ヨウ化カリウム １００μｇ／リットル 塩化第二鉄 ２００μｇ／リットル 硫酸マンガン ４００μｇ／リットル モリブデン酸ナトリウム ２００μｇ／リットル 硫酸亜鉛 ４００μｇ／リットル 硫酸アンモニウム ０．５％（ｗ／ｖ） リン酸二カリウム ０．５％（ｗ／ｖ） 硫酸マグネシウム ０．０５％（ｗ／ｖ） 塩化ナトリウム ０．０１％（ｗ／ｖ） 塩化カルシウム ０．０１％（ｗ／ｖ） グルコース ２％（ｗ／ｖ） ガラクトース ２％（ｗ／ｖ） リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６） ０．２Ｍ ウシ血清アルブミン ０．５％（ｗ／ｖ） アミノ酸混合液 ３倍濃度試験例２ 実施例１２で調製した試料のホスホリパーゼ活性を、試
験例１に記載した方法により測定した。各試料のホスホ
リパーゼ活性は表２に記載する通りであった。

【０１０７】

【表２】 ──────────────────────────────── 試料 培養日数（日） 3 5 7 10 13 17 ──────────────────────────────── ＫＳ５８−２Ｄ（対照） 0 0 0 0 0 0 ＫＳ５８−２Ｄ／ｐＣＹ３３９ 3.9 6.2 7.7 10.3 12.1 13.8 ──────────────────────────────── 単位：Ｕ／ｍｌ 実施例１３． アスペルギルス・オリゼでの発現 （１）発現プラスミドベクターの構築 実施例７で調製したプラスミドｐＲＡＶ８８５ ３μｇ
を制限酵素ＳａｃＩで消化し、エタノール沈澱を行って
ＤＮＡを回収し、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、
エタノール沈澱を行ってＤＮＡを回収した。このＤＮＡ
をアガロースゲル電気泳動し、０．９４ｋｂｐに相当す
るバンド部分のゲルを切り出し、ＤＮＡを回収した。こ
の０．９４ｋｂｐ断片の末端を、ＤＮＡブランティング
キットを用いて平滑化した。その後、フェノール・クロ
ロホルム抽出を２回、エタノール沈澱を１回行ってＤＮ
Ａを回収した。

【０１０８】一方、アスペルギルス・オリゼ用発現プラ
スミドベクター ｐＴＡｅｘ３［Fujii, T., et al. (1
995) Biosci. Biotech. Biochem. 59, 1869-1874参照］
１．５μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、エタノール
沈澱を行ってＤＮＡを回収した。このＤＮＡの末端を、
ＤＮＡブランティングキットを用いて平滑化した後、フ
ェノール・クロロホルム抽出を２回、エタノール沈澱を
１回行ってＤＮＡを回収した。さらに、このＤＮＡの末
端を仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（宝酒造
（株）社製）３０単位で脱リン酸化した後、フェノール
・クロロホルム抽出を２回、エタノール沈澱を１回行っ
てＤＮＡを回収した。

【０１０９】このＥｃｏＲＩ消化したｐＴＡｅｘ３ Ｄ
ＮＡ １μｇと、ｐＲＡＶ８８５より得た０．９４ｋｂ
ｐのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片 ０．４μｇとを、ＤＮ
Ａライゲーションキットを用いて連結した。この連結反
応液を用いてコンピテント大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ
１０１を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むＬＢ寒天培地（１％ バクト・トリプトン、０．
５％ バクト・イーストエキストラクト、０．５％ 塩
化ナトリウム、１．５％ バクト・アガー）上で生育し
たコロニーを選択した。このアンピシリン耐性株の中か
ら、その保持するプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＢｇｌＩＩで消化した際に５．５ｋｂｐ、２．
３ｋｂｐおよび０．７ｋｂｐの３本の断片を生成するも
のを選択した。この株を大量培養し、ＰＬＡ１のアスペ
ルギルス・オリゼ用発現プラスミドベクターｐＡＡＰを
調製した。

【０１１０】（２）アスペルギルス・オリゼの形質転換 上記（１）で調製した発現ベクターｐＡＡＰのアスペル
ギルス・オリゼへの導入は、五味らの方法［Gomi, K.,
et al. (1987) Agric. Biol. Chem. 51, 2549-2555参
照］に基づいて行なった。すなわち、まずＤＰ培地（２
％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ リ
ン酸１カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウム）を８
０ｍｌ仕込んだ５００ｍｌ容三角フラスコに、アスペル
ギルス・オリゼ Ｍ−２−３株［醸造研究所より分譲：
前出Gomi, K., et al.参照］を１白金耳接種し、３０℃
で２０から４０時間振盪培養した。得られたペレット状
の菌体をガラスフィルター３Ｇ１（ハリオ (株) 社製）
で濾過して回収し、滅菌水で洗浄後、水切りして５０ｍ
ｌのコニカルチューブに入れた。この菌体に、フィルタ
ー滅菌したプロトプラスト化溶液（５ｍｇ／ｍｌ ノボ
ザイム２３４（ノボ社製）、５ｍｇ／ｍｌ セルラーゼ
Ｒ−１０（生化学工業 (株) 社製）、０．８Ｍ塩化ナト
リウム、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０））を１
０ｍｌ加えて、３０℃、１００ｒｐｍで３時間振盪し
た。この反応液をガラスフィルター３Ｇ３（ハリオ
(株) 社製）で濾過し、濾液を０．８Ｍ 塩化ナトリウ
ム溶液で２回洗浄後、溶液Ｉ（０．８Ｍ 塩化ナトリウ
ム、１０ｍＭ 塩化カルシウム、１０ｍＭ トリス−塩
酸（ｐＨ７．５））で洗浄し、２０００ｒｐｍで５分間
遠心分離して、沈澱したプロトプラストを得た。

【０１１１】このプロトプラストを２．５×１０⁸ ／ｍ
ｌとなるように最終容量の４／５量の溶液Ｉに懸濁し、
これに１／５量の溶液ＩＩ（４０％ ポリエチレングリ
コール４０００、５０ｍＭ 塩化カルシウム、５０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５））と１／１００量のジメ
チルスルホキシドを加えた。このプロトプラスト懸濁液
０．２ｍｌにｐＡＡＰ ＤＮＡ １０μｇを添加して、
３０分氷冷した。次に、１ｍｌの溶液ＩＩを加えてよく
混合し、２０分間室温で放置した後、１０ｍｌの溶液Ｉ
を加え、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈澱し
たプロトプラストを適量の溶液Ｉに懸濁し、０．８Ｍ
塩化ナトリウムを含むを含むCzapek-Dox寒天培地（０．
２％ 硝酸ナトリウム、０．１％ リン酸２カリウム、
０．０５％ 硫酸マグネシウム、０．０５％ 塩酸カリ
ウム、０．００１％ 硫酸第１鉄、３％ シュークロー
ス、２％ 寒天）に塗抹した。アスペルギルス・オリゼ
Ｍ−２−３株はアルギニン要求性であることから、通常
は最少培地であるCzapek-Dox培地で生育できず、ｐＡＡ
Ｐが導入された株のみが生育できる。Czapek-Doxplate
上で生育した形質転換体は、さらにCzapek-Dox培地で３
回植継ぎ、安定生産株アスペルギルス・オリゼ Ｍ−２
−３／ｐＡＡＰ株を取得した。

【０１１２】（３）形質転換体の培養およびＰＬＡ１活
性の確認 スラント上に生育したアスペルギルス・オリゼ Ｍ−２
−３／ｐＡＡＰ株より、胞子および菌糸を１白金耳かき
取り、ＤＰＹ培地（２％ デキストリン、１％ポリペプ
トン、０．５％ イーストエキストラクト、０．５％
リン酸１カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウム、ｐ
Ｈ６．５）を８０ｍｌ仕込んだ５００ｍｌ容三角フラス
コに植菌した。これを２６℃、２１０ｒｐｍの条件で培
養し、培養開始７日目の培養上清のＰＬＡ１活性を、試
験例１に記載した方法で測定した結果、少なくとも３０
Ｕ／ｍｌの活性が認められた。この分泌生産量は、プラ
スミドを保持しないアスペルギルス・オリゼ Ｍ−２−
３株の３００倍以上に相当し、ＰＬＡ１遺伝子の過剰発
現によりＰＬＡ１の分泌生産量が大幅に増大したことを
示した。

【０１１３】このアスペルギルス・オリゼ Ｍ−２−３
／ｐＡＡＰ株の培養上清 １０μｌを試料として、１０
−２０％のグラジエントゲルを用いたＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を実施した。泳動終了後、ゲル
中のタンパク質を転写装置（ザルトブロットＩＩ−Ｓ：
ザルトリウス社製）を用いてニトロセルロース膜（アマ
シャム社製）に転写した。このニトロセルロース膜につ
いて、抗ＰＬＡ１ウサギＩｇＧ抗体を一次抗体、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（バ
イオラッド社製）を二次抗体とするウエスタンブロット
解析を実施した結果、多量のＰＬＡ１が検出され、アス
ペルギルス・オリゼ Ｍ−２−３／ｐＡＡＰ株において
ＰＬＡ１が大量に産生されていることが確認された。

【０１１４】

【発明の効果】 以上のごとく、本発明の方法によって
製造される組換えタンパク質は、優れたホスホリパーゼ
活性を有する。本発明により、組換えＰＬＡ１の工業的
規模の製造を高収率・高純度で行うことが可能となっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＲＡＶ１２の制限酵素地図。

【図２】プラスミドｐＲＡＶ４３の制限酵素地図。

【図３】プラスミドｐＲＡＶ８８５の制限酵素地図。

【図４】プラスミドｐＲＡＶ８２５の構築図。

【図５】プラスミドｐＣＹ３３９の構築図。

【図６】プラスミドｐＡＡＰの構築図。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：８８８ 配列の種類：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の型： ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源 生物名：アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryza
e） 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 位置：1..885 特徴を表す記号：mat_peptide 位置：79..885 特徴を表す記号： sig_peptide 位置：1..78 配列 ATG TTT AGT CTC GCG CGA TTG GGG ACC GTT GCA GGT CTA TTT TTA CTG 48 Met Phe Ser Leu Ala Arg Leu Gly Thr Val Ala Gly Leu Phe Leu Leu -26 -25 -20 -15 GCT CAG GCT GCC CCG GCT TCA CTG CGC AGA GAT GTC AGC TCT TCC CTT 96 Ala Gln Ala Ala Pro Ala Ser Leu Arg Arg Asp Val Ser Ser Ser Leu -10 -5 1 5 CTC AAT AAC CTG GAT CTC TTT GCA CAG TAC AGC GCC GCC GCA TAC TGT 144 Leu Asn Asn Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys 10 15 20 GAT GAG AAC CTG AAC TCT ACG GGG ACC AAG TTG ACA TGC TCT GTT GGC 192 Asp Glu Asn Leu Asn Ser Thr Gly Thr Lys Leu Thr Cys Ser Val Gly 25 30 35 AAC TGT CCT TTG GTA GAA GCG GCC TCT ACC CAA TCA TTG GAT GAA TTC 240 Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Ser Thr Gln Ser Leu Asp Glu Phe 40 45 50 AAC GAA TCG TCA TCC TAC GGC AAC CCC GCC GGG TAC CTC GCC GCT GAT 288 Asn Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Pro Ala Gly Tyr Leu Ala Ala Asp 55 60 65 70 GAG ACT AAC AAG CTC CTA GTC CTG TCC TTC CGG GGT AGC GCT GAC TTG 336 Glu Thr Asn Lys Leu Leu Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Ala Asp Leu 75 80 85 GCC AAT TGG GTC GCC AAC CTG AAT TTT GGT CTC GAG GAT GCC AGC GAT 384 Ala Asn Trp Val Ala Asn Leu Asn Phe Gly Leu Glu Asp Ala Ser Asp 90 95 100 CTG TGT TCT GGG TGC GAA GTG CAC AGC GGC TTC TGG AAG GCA TGG AGT 432 Leu Cys Ser Gly Cys Glu Val His Ser Gly Phe Trp Lys Ala Trp Ser 105 110 115 GAA ATC GCC GAC ACC ATC ACT TCC AAA GTG GAA TCA GCT TTG TCG GAT 480 Glu Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Glu Ser Ala Leu Ser Asp 120 125 130 CAT TCC GAT TAT TCC TTG GTC TTG ACC GGA CAT AGT TAC GGC GCT GCG 528 His Ser Asp Tyr Ser Leu Val Leu Thr Gly His Ser Tyr Gly Ala Ala 135 140 145 150 CTG GCA GCC CTC GCA GCG ACT GCT CTG CGG AAC TCC GGC CAT AGT GTT 576 Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly His Ser Val 155 160 165 GAG CTG TAC AAC TAC GGT CAA CCT CGA CTT GGA AAC GAG GCA TTG GCA 624 Glu Leu Tyr Asn Tyr Gly Gln Pro Arg Leu Gly Asn Glu Ala Leu Ala 170 175 180 ACA TAT ATC ACG GAC CAA AAC AAG GGT GGC AAC TAT CGC GTT ACG CAC 672 Thr Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Lys Gly Gly Asn Tyr Arg Val Thr His 185 190 195 ACT AAT GAT ATT GTG CCT AAA CTG CCA CCC ACG CTG CTC GGG TAT CAC 720 Thr Asn Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro Thr Leu Leu Gly Tyr His 200 205 210 CAC TTC AGC CCA GAG TAC TAT ATC AGC AGC GCC GAC GAG GCA ACG GTG 768 His Phe Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Ala Asp Glu Ala Thr Val 215 220 225 230 ACC ACC ACT GAT GTG ACT GAG GTT ACG GGA ATC GAT GCT ACG GGC GGT 816 Thr Thr Thr Asp Val Thr Glu Val Thr Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly 235 240 245 AAT GAT GGA ACC GAC GGA ACT AGC ATC GAT GCT CAT CGG TGG TAC TTT 864 Asn Asp Gly Thr Asp Gly Thr Ser Ile Asp Ala His Arg Trp Tyr Phe 250 255 260 ATT TAT ATT AGC GAA TGT TCA TAG 888 Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser 265 配列番号：２ 配列の長さ：２９５ 配列の種類：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の型：蛋白質 配列 Met Phe Ser Leu Ala Arg Leu Gly Thr Val Ala Gly Leu Phe Leu Leu -26 -25 -20 -15 Ala Gln Ala Ala Pro Ala Ser Leu Arg Arg Asp Val Ser Ser Ser Leu -10 -5 1 5 Leu Asn Asn Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys 10 15 20 Asp Glu Asn Leu Asn Ser Thr Gly Thr Lys Leu Thr Cys Ser Val Gly 25 30 35 Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Ser Thr Gln Ser Leu Asp Glu Phe 40 45 50 Asn Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Pro Ala Gly Tyr Leu Ala Ala Asp 55 60 65 70 Glu Thr Asn Lys Leu Leu Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Ala Asp Leu 75 80 85 Ala Asn Trp Val Ala Asn Leu Asn Phe Gly Leu Glu Asp Ala Ser Asp 90 95 100 Leu Cys Ser Gly Cys Glu Val His Ser Gly Phe Trp Lys Ala Trp Ser 105 110 115 Glu Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Glu Ser Ala Leu Ser Asp 120 125 130 His Ser Asp Tyr Ser Leu Val Leu Thr Gly His Ser Tyr Gly Ala Ala 135 140 145 150 Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly His Ser Val 155 160 165 Glu Leu Tyr Asn Tyr Gly Gln Pro Arg Leu Gly Asn Glu Ala Leu Ala 170 175 180 Thr Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Lys Gly Gly Asn Tyr Arg Val Thr His 185 190 195 Thr Asn Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro Thr Leu Leu Gly Tyr His 200 205 210 His Phe Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Ala Asp Glu Ala Thr Val 215 220 225 230 Thr Thr Thr Asp Val Thr Glu Val Thr Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly 235 240 245 Asn Asp Gly Thr Asp Gly Thr Ser Ile Asp Ala His Arg Trp Tyr Phe 250 255 260 Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser 265 配列番号：３ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Gly Gly Asn Tyr Arg Val Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Lys 1 5 10 15 配列番号：４ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列番号：５ 配列の長さ：３９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Leu Thr Xaa Ser Val Gly Asn Xaa Pro Leu Val Glu Ala Ala Ser Thr 1 5 10 15 Gln Ser Leu Asp Glu Phe Asn Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Pro Ala 20 25 30 Gly Tyr Leu Ala Ala Xaa Glu 35 配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Asp Val Ser Ser Ser Leu Leu Asn Asn Leu Asp Leu Phe Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Tyr Xaa Asp Glu Asn Leu 20 25 配列番号：７ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Val Glu Ser Ala Leu Ser Asp His Ser Asp Tyr Ser Leu Val Leu Thr 1 5 10 15 Gly His Ser Tyr Gly Ala Ala Leu Xaa Xaa Leu Xaa Ala Thr 20 25 30 配列番号：８ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GAYYTNTTYG CNCARTA 17 配列番号：９ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Noアンチセンス :Yes 配列 SWTCRTTRAA YTCRTC 16 配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CGTCCTGCAC GGCATTCAAA 20 配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 TCCCTTCTCA AAGCCAGAAT 20 配列番号：１２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGGTCGACAT GAAAGCATTC ACCAGTTT 28 配列番号：１３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 配列 AGAAGGGAAG AGCTGACATC AATCTTGTTG ACACGAAGCT 40 配列番号：１４ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 ＡＧＣＴＴＣＧＴＧＴ ＣＡＡＣＡＡＧＡＴＴ ＧＡＴＧＴＣＡＧＣＴ ＣＴＴ
ＣＣＣＴＴＣＴ ４０ 配列番号：１５ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Yes 配列 CCCAAGCTTC TATGAACATT CGCTAATAT 29

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 津路 俊昭 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内 (72)発明者 芹澤 伸記 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内 (72)発明者 柴 陽一郎 福島県いわき市泉町下川字大剱389−４ 三共株式会社内 (72)発明者 吉川 博治 福島県いわき市泉町下川字大剱389−４ 三共株式会社内

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜
   ２６９で示されるアミノ酸配列を含むことからなり、ホ
   スホリパーゼ活性を有するポリペプチド、または配列表
   の配列番号２のアミノ酸番号１〜２６９で示されるアミ
   ノ酸配列中の１つもしくは２つ以上の部位において１つ
   もしくは２つ以上のアミノ酸が置換、欠失または挿入さ
   れているアミノ酸配列からなり、ホスホリパーゼ活性を
   有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜
   ２６９で示されるアミノ酸配列を含むことからなり、ホ
   スホリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１のヌクレオチド番号
   １〜８８５で示されるヌクレオチド配列を含むことから
   なるＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のＤＮＡとハイブリダイ
   ズし、ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドをコー
   ドするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項３に記載のＤＮＡとストリンジェ
   ントな条件下でハイブリダイズし、ホスホリパーゼ活性
   を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項３に記載のＤＮＡと６×ＳＳＣ、
   ６０〜７０℃の条件でハイブリダイズし、ホスホリパー
   ゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項１乃至６のいずれか１つに記載の
   ＤＮＡを含むことからなる組換えＤＮＡベクター。
8. 【請求項８】 プラスミド ｐＣＹ３３９である、請求
   項７記載の組換えＤＮＡベクター。
9. 【請求項９】 プラスミド ｐＡＡＰである、請求項７
   記載の組換えＤＮＡベクター。
10. 【請求項１０】 請求項７乃至９のいずれか１つに記載
    の組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞。
11. 【請求項１１】 サッカロミセス・セレビジエ ＫＳ５
    ８−２Ｄ／ｐＣＹ３３９である、請求項１０記載の宿主
    細胞。
12. 【請求項１２】 アスペルギルス・オリゼ Ｍ−２−３
    ／ｐＡＡＰである、請求項１０記載の宿主細胞。
13. 【請求項１３】 遺伝子操作によって得られ、配列表の
    配列番号２のアミノ酸番号１〜２６９で示されるアミノ
    酸配列を含むことからなり、ホスホリパーゼ活性を有す
    るポリペプチド、または配列表の配列番号２のアミノ酸
    番号１〜２６９で示されるアミノ酸配列中の１つもしく
    は２つ以上の部位において１つもしくは２つ以上のアミ
    ノ酸が置換、欠失または挿入されているアミノ酸配列か
    らなり、ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチド。
14. 【請求項１４】 遺伝子操作によって得られ、配列表の
    配列番号２のアミノ酸番号１〜２６９で示されるアミノ
    酸配列を含むことからなり、ホスホリパーゼ活性を有す
    るポリペプチド。
15. 【請求項１５】 請求項１０乃至１２のいずれか１つに
    記載の宿主細胞を、ホスホリパーゼの産生可能な条件下
    で培養し、次いで、該培養物からホスホリパーゼ活性を
    有するポリペプチドを回収することを特徴とする、該ポ
    リペプチドの製造方法。