JPH10161034A - コンフォーカル顕微鏡及びコンフォーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作成方法 - Google Patents

コンフォーカル顕微鏡及びコンフォーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作成方法

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JPH10161034A
JPH10161034A JP8336421A JP33642196A JPH10161034A JP H10161034 A JPH10161034 A JP H10161034A JP 8336421 A JP8336421 A JP 8336421A JP 33642196 A JP33642196 A JP 33642196A JP H10161034 A JPH10161034 A JP H10161034A
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JP
Japan
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objective lens
scanning
sample
optical axis
unit
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JP8336421A
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Hiroyuki Hakozaki
博之 箱崎
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Nikon Corp
Original Assignee
Nikon Corp
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 高速計算が可能な高価なコンピュータを使用
することなしに歪のない３次元画像の作成及び回転を高
速に行う。 【解決手段】 光源２と、光源２からの光を試料４上で
２次元走査する２次元スキャンユニット１０と、２次元
スキャンユニット１０と試料４との間に配置された対物
レンズ２０と、対物レンズ２０と試料４とを、対物レン
ズ２０の光軸方向に相対移動させる対物レンズ駆動部２
１と、対物レンズ２０の焦点面と共役な位置に設けられ
たピンホール３１と、ピンホール３１を通過した試料４
からの光を検出する蛍光検出器４０とを備えたコンフォ
ーカル顕微鏡１において、２次元スキャンユニット１０
による走査と対物レンズ駆動部２１による光軸方向の移
動とを同時に行うとともに、２次元スキャンユニット１
０の走査速度に対する対物レンズ駆動部２１の移動速度
及び移動方向を制御する制御部５０を備え、光軸に対し
て傾斜した軸に直交する試料４の切片像を取得する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明はコンフォーカル顕
微鏡及びコンフォーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作
成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】コンフォーカル顕微鏡は、励起レーザ光
を発して試料に照射する光源と、励起レーザ光と試料か
ら発せられる蛍光とを分離するダイクロイックミラー
と、励起レーザ光を２次元走査する２次元スキャンユニ
ットと、２次元スキャンユニットと試料との間に配置さ
れた対物レンズと、ダイクロイックミラーと検出装置と
の間に配置され、集光レンズと集光レンズの焦点面に設
けられたピンホールとからなる集光部とを備える。
【０００３】レーザ光源から射出された励起レーザ光
は、ダイクロイックミラーによって反射された後、２次
元スキャンユニットによって２次元走査され、対物レン
ズによって光軸にほぼ直角な試料面に集光される。励起
レーザ光の照射によって試料から発生した蛍光は励起レ
ーザ光とともに対物レンズから走査ミラーへと光路を逆
行し、ダイクロイックミラーで励起レーザ光と分離され
る。ダイクロイックミラーを透過した蛍光は、集光レン
ズにより光路中に配置したピンホールに集光される。こ
のとき、試料の結像部で発した蛍光のみがピンホールを
通過し、検出装置で受光されるとともに、検出装置で光
量に応じた電気信号に変換される。この信号と走査位置
情報とをコンピュータを用いて所定の処理を行うことで
試料の蛍光像や反射像の切片画像を得る。
【０００４】図７は３次元画像の作成方法を説明する図
である。
【０００５】対物レンズと試料との距離（ピント）を変
えて各ピントにおける光軸Ｌ１０に直角な複数の面Ｅ１
〜Ｅ４の切片画像を取得し、上下の切片画像間を補完し
て３次元像を作成し、立体視等の手法を用いて３次元像
の表示を行う。
【０００６】図８は切片画像を得る方法を説明する図、
図９は切片画像から３次元画像を作成する方法を説明す
る図である。
【０００７】光軸Ｌ１０に直角な面の画像を、光軸Ｌ１
０に対して僅かに傾きかつ光軸Ｌ１０に対して対象な軸
Ｌ２０，Ｌ３０に直角な面Ｆ１，Ｆ２に射影する。各ピ
ントで射影によって得られた像Ｆ１１〜Ｆ１４及び像Ｆ
２１〜Ｆ２４を傾きに応じてずらして順次重ね合わせる
ことで異なる方向から見た画像を作成し、これらの画像
を横に並べて立体視等を用いた３次元像の表示を行った
り、色を変えて重ね合わせ、色眼鏡を用いて３次元像を
作成したりしている。
【０００８】また、像の射影を行わずに、各ピントで得
られた像をずらして重ね合わせることで疑似的な３次元
像の表示を行うこともできる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】図７に示す方法では歪
の少ない３次元画像を作成することができ、３次元像の
回転も容易に行うことができるが、３次元画像の作成や
３次元像の回転には多くの計算が必要であるため、３次
元画像を高速に得るには高価なコンピュータが必要とな
る。
【００１０】また、図８及び図９に示す方法では射影を
行うとき、コンピュータで射影の計算を行う必要があ
り、３次元画像の作成に時間がかかる。
【００１１】更に、射影を行わない方法では、コンピュ
ータによる計算が簡単となり、高速に３次元画像の作成
を行うことができるが、光軸に直角な面で走査して得ら
れた画像から直接３次元画像を作成しているため、空間
的な歪みが生じてしまう。
【００１２】この発明はこのような事情に鑑みてなされ
たもので、その課題は高速計算が可能な高価なコンピュ
ータを使用せずに歪のない３次元画像の作成及び回転を
高速に行うことができるコンフォーカル顕微鏡及びコン
フォーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作成方法を提供
することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】前述の課題を解決するた
め請求項１記載の発明のコンフォーカル顕微鏡は、光源
と、前記光源からの光を試料上で２次元走査する走査手
段と、前記走査手段と前記試料との間に配置された対物
レンズと、前記対物レンズと前記試料とを、前記対物レ
ンズの光軸方向に相対移動させる駆動手段とを備えたコ
ンフォーカル顕微鏡において、前記走査手段による走査
と前記駆動手段による前記光軸方向の移動とを同時に行
わせるとともに、前記走査手段の走査速度に対する前記
駆動手段の移動速度及び移動方向を制御して前記光軸に
対して傾斜した軸に直交する前記試料の切片像を取得す
る制御手段を備えていることを特徴とする。
【００１４】走査手段による走査と駆動手段による光軸
方向の移動とを同時に行わせ、走査速度に対する駆動手
段の移動速度を制御することによって光軸に対して所定
角度傾いた軸に垂直な面における複数の切片画像を得る
ことができる。
【００１５】請求項２記載の発明のコンフォーカル顕微
鏡を用いた３次元画像の作成方法は、光源から発した光
を対物レンズを介して試料に集光し、前記光を走査手段
により前記試料上で２次元走査し、前記対物レンズの焦
点面と共役な位置に設けられたピンホールによって焦点
面以外からの光を除去し、前記ピンホールを通過した光
を検出手段で検出して切片画像を取得するとともに、前
記２次元走査と同時に駆動手段によって前記対物レンズ
と前記試料とを前記対物レンズの光軸方向に相対移動さ
せて前記試料に対する前記対物レンズの焦点面を前記光
軸方向にずらし、前記走査手段の走査速度に対する前記
駆動手段の移動速度及び移動方向を制御し、前記光軸に
対して傾斜した２つの軸にそれぞれ直交する複数枚の切
片画像を取得することを特徴とする。
【００１６】光軸に対して傾斜した２つの軸にそれぞれ
直交する複数枚の切片画像を取得することで３次元画像
を作成することができる。また、走査手段の走査速度に
対する駆動手段の移動速度を制御することで３次元画像
の回転を行うことができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態を図
面に基づいて説明する。
【００１８】図１はこの発明の第１実施形態に係るコン
フォーカル顕微鏡のブロック構成図である。
【００１９】コンフォーカル顕微鏡１は、光源２と、ダ
イクロイックミラー３と、２次元スキャンユニット（走
査手段）１０と、対物レンズ２０と、集光部３０と、蛍
光検出器（検出手段）４０と、ＣＰＵ（制御部）５０
と、画像処理回路６０とを備える。
【００２０】光源２は励起レーザ光を発してステージ６
上に載置された試料４を照射する。
【００２１】ダイクロイックミラー３は励起レーザ光と
試料４から発せられる蛍光とを分離させる。
【００２２】２次元スキャンユニット１０はスキャナ駆
動装置１１によってＸＹ方向の走査を行う水平スキャナ
と垂直スキャナとを備える。スキャナ駆動装置１１はＣ
ＰＵ５０から出力される、走査位置を指示する走査位置
信号５０ａにより制御され、試料４上で励起レーザ光を
所定の走査速度で２次元走査する。水平スキャナと垂直
スキャナとしては、ガルバノスキャナやレゾナントスキ
ャナを用いる。
【００２３】対物レンズ２０は２次元スキャンユニット
１０と試料４との間に配置され、対物レンズ駆動部（駆
動手段）２１によって試料４に対して光軸方向に移動す
る。
【００２４】対物レンズ駆動部２１はＣＰＵ５０から出
力される、光軸方向の移動速度及び移動方向を指示する
移動信号５０ｂによって制御される。
【００２５】対物レンズ駆動部２１としてはＤＣモータ
を用いる。このＤＣモータとしては、高速応答性に優
れ、トルクが大きく、トルクが電圧に比例して発生す
るため、制御回路の設計がし易く、効率がよいという
特徴を有するＤＣサーボモータが好ましい。
【００２６】集光部３０はダイクロイックミラー３と蛍
光検出器４０との間に配置され、ダイクロイックミラー
３によって分離された蛍光を集光させるための集光レン
ズ（図示せず）と、対物レンズ２０の焦点面と共役な位
置に設けられたピンホール３１とを備える。したがっ
て、ピンホール３１は試料４の結像部で発した蛍光だけ
を通過させる。
【００２７】蛍光検出器４０はピンホール３１を通過し
た試料４の蛍光を検出し、入力した蛍光を光強度を表す
信号４０ａに変換する。
【００２８】画像処理回路６０はＡ／Ｄ変換器、フレー
ムメモリ、Ｄ／Ａ変換器等の画像化のための回路及びＣ
ＰＵ５０からの指示により画像を重ね書きするためのオ
ーバレイメモリ回路を備える。
【００２９】この画像処理回路６０は蛍光検出器４０の
信号４０ａとスキャナ駆動装置１１から出力される走査
位置信号１１ａとから得られた試料４の蛍光像や反射像
の切片画像をＣＰＵ５０の指示に基づいて所定の処理を
行うことで試料４の３次元画像を作成し、その画像を例
えばモニタ８０に表示する。
【００３０】また、ＣＰＵ５０は画像取得時、ユーザに
よってキーボード７０から入力され、メモリ６に記憶さ
れた情報に基づいて走査位置信号５０ａ及び移動信号５
０ｂを出力する。なお、この実施形態ではＣＰＵ５０、
画像処理回路６０、メモリ６はパソコン（パーソナルコ
ンピュータ）９０の一部を用いている。
【００３１】図２はこの発明の第１実施形態に係るコン
フォーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作成方法を説明
する図（Ｘ軸方向から見た図）、図３は制御部による２
次元スキャンユニットと駆動部との制御方法を説明する
フローチャートである。なお、図３においてＳ１〜Ｓ５
は各ステップを示す。
【００３２】図２において、軸Ｌ２，Ｌ３はそれぞれ光
軸Ｌ１を中心に対象の位置にあり、ＣＰＵ５０は各軸Ｌ
２，Ｌ３に直角な複数の面Ａ４〜Ａ９，Ａ１０〜Ａ１５
の切片画像を得る。
【００３３】次にＣＰＵ５０による制御動作を図１〜図
３を参照して説明する。
【００３４】まず、ユーザによってキーボード７０から
入力された情報（光軸方向の移動距離及び画像取得枚
数）７０ａをメモリ６に記憶させる。
【００３５】ＤＣモータを用いてピント位置を走査の始
点に移動させ、対物レンズ２０をその位置に停止させて
おく（Ｓ１）。
【００３６】画像取得信号７０ｂを入力したとき、走査
位置信号５０ａに基づいて２次元スキャンユニット１０
による一定速度の２次元走査を開始させ、同時に移動信
号５０ｂに基づいてＤＣモータを駆動し、対物レンズ２
０を光軸方向へ移動させる。
【００３７】このとき、対物レンズ２０の移動速度及び
移動方向はユーザによってキーボード７０から入力され
た情報に基づいて決まるため、移動速度に応じたＤＣモ
ータの回転数を予め計算によって求めておき、その回転
数となるようにＤＣモータへの印加電圧を変更するとと
もに、回転数を例えばサーボ制御によって制御し、同時
に移動方向に応じて電源の極性を変える（Ｓ２）。
【００３８】この制御によって取得したい傾きで２次元
走査を行うことができる。例えば、移動距離１０μｍ中
に６つの切片画像を取得するとき、移動速度は（５／
３）μｍ／（１切片画像を取得する時間）となる。
【００３９】２次元スキャンユニット１０による２次元
走査の終了と同時にＤＣモータを停止させる（Ｓ３）。
【００４０】上記動作により１つの面Ａ４の切片画像が
得られるので、この画像を例えばフレームメモリに記憶
する。
【００４１】同様の動作を全画像を取得するまで繰り返
し（Ｓ４）、左眼に対する面Ａ４〜Ａ９の切片画像を取
得した後、右眼に対する面Ａ１５〜Ａ１０の切片画像を
取得し、フレームメモリに記憶する。
【００４２】全画像に対する切片画像を取得し、オーバ
レイメモリ回路を用いて左眼に対する面Ａ４〜Ａ９の切
片画像を重ね合わせた画像と右眼に対する面Ａ１５〜Ａ
１０の切片画像を重ね合わせた画像とを、例えばシャッ
タ眼鏡を用いて左眼に対する画像と右眼に対する画像と
を交互に切り換えて立体視することによって、又はそれ
ぞれの画像をステレオモニタに表示することによって、
３次元画像を作成する（Ｓ５）。
【００４３】なお、左眼に対する面Ａ４〜Ａ９の切片画
像を取得した後、右眼に対する面Ａ１５〜Ａ１０の切片
画像を取得するようにしたので、対物レンズ２０の移動
距離（移動時間）が短くなり、高速に３次元画像を作成
することができる。
【００４４】また、それぞれの画像に色（例えば左眼用
の像を青、右眼用の像を赤）を付けて重ね合わせて表示
し、色眼鏡を用いて３次元画像を得ることもできる。
【００４５】この第１実施形態によれば、各切片画像は
軸Ｌ２，Ｌ３に直角であるので空間的に歪のない３次元
画像を作成できる。
【００４６】図４はこの発明の第２実施形態に係るコン
フォーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作成方法を説明
する図（Ｘ軸方向から見た図）である。
【００４７】第１実施形態では光軸Ｌ１を中心に対象の
位置にある２つの軸Ｌ２，Ｌ３に垂直な複数の面Ａ１〜
Ａ１５の切片画像を得たのに対し、この第２実施形態で
は光軸Ｌ１ではなく、光軸Ｌ１に対して所定角度傾斜し
た軸Ｌ４を中心に対象の位置にある２つの軸Ｌ５，Ｌ６
と直角な面Ｂ５〜Ｂ１６の切片画像を得るようにした。
【００４８】ＣＰＵ５０は第１実施形態と同様に２次元
スキャンユニット１０による２次元走査とＤＣモータに
よる対物レンズ２０の光軸方向への移動を制御すること
で面Ｂ５〜Ｂ１６の切片画像を得、面Ｂ５〜Ｂ１６の複
数の切片画像から３次元画像を作成する。
【００４９】この第２実施形態によれば、第１実施形態
と同様の効果を発揮できるとともに、光軸Ｌ１からずれ
た軸Ｌ４から観察した３次元画像を、試料４を回転させ
ずに見ることができる。
【００５０】図５はこの発明の第３実施形態に係るコン
フォーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作成方法を説明
する図（Ｘ軸方向から見た図）である。
【００５１】この第３実施形態は対物レンズ２０をＤＣ
モータではなくピエゾ素子を用いて光軸方向（Ｚ軸方
向）に移動させるとともに、２次元スキャンユニット１
０による２次元走査のうち、例えば水平走査の帰線期間
にも走査を行う、つまり往復走査を行うようにしたもの
である。
【００５２】ピエゾ素子を用いたときには、対物レンズ
２０をＤＣモータを用いたときのように連続的に移動さ
せることはできず、光軸方向に複数のピエゾ素子を配置
し、それぞれのピエゾ素子の通電を所定の順序で切り換
えることで対物レンズ２０を、例えば２５ｎｍづつ段階
的に移動させる。
【００５３】ＣＰＵ５０は２次元スキャンユニット１０
による２次元走査の開始と同時にピエゾ素子への通電を
制御して対物レンズ２０を光軸方向に移動させて切片画
像を得、これらの切片画像をそれぞれ重ね合わせて３次
元画像を作成する。
【００５４】したがって、この実施形態のように１０μ
ｍ中で軸Ｌ２に対して垂直な面Ｃ４〜Ｃ７及び軸Ｌ３に
対して垂直な面Ｃ８〜Ｃ１１の８つの切片画像を取得す
る場合、光軸Ｌ１方向に１．２５μｍ移動する毎に１つ
の切片画像が取得される。
【００５５】このとき、復路走査によって得られた面Ｃ
８〜Ｃ１１の切片画像は、Ｙ軸方向に関して反転させて
フレームメモリに記憶されオーバレイメモリ回路によっ
て重ね合わせられる。
【００５６】なお、面Ｃ４〜Ｃ７の切片画像及び面８〜
１１の切片画像はそれぞれ軸Ｌ２，Ｌ３の傾きに応じて
所定量ずらして重ね合せられ、３次元画像が作成され
る。
【００５７】このずれ量は三角形の相似関係より求めら
れ、この実施形態の場合、ずれ量ｓ１，ｓ４は１．２５
×２．５／ｓｑｒｔ（１．２５2 ＋Ｗ2 ）μｍ（ＷはＹ
軸方向の長さ）、ｓ２，ｓ５は２．５×２．５／ｓｑｒ
ｔ（１．２５2 ＋Ｗ2 ）μｍ、ｓ３，ｓ６は７．５×
１．２５／ｓｑｒｔ（１．２５2 ＋Ｗ2 ）μｍである。
【００５８】ここで、ＷはＹ軸方向の長さである。
【００５９】なお、数式で表わせば下記のとおりであ
る。
【００６０】
【数１】
【００６１】
【数２】
【００６２】
【数３】 この第３実施形態によれば、光軸方向に対物レンズ２０
を一方向に移動させるだけで３次元画像を作成できるの
で、第１実施形態以上に高速に３次元画像を作成するこ
とができる。
【００６３】またピエゾ素子を用いたので、電圧の印加
回数に応じて、μｍオーダによって対物レンズ２０を移
動させることができ、ＤＣモータに比し精密なピント位
置の制御を行うことができる。
【００６４】更に、ピエゾ素子を用いた場合、ＤＣモー
タを用いた場合のように、ピエゾ素子と対物レンズ２０
との間に減速機構を介在させなくてもよく、対物レンズ
２０を移動させる対物レンズ駆動部２１の全体構造をコ
ンパクトにすることができる。
【００６５】図６はこの発明の第４実施形態に係るコン
フォーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作成方法を説明
する図（Ｘ軸方向から見た図）である。
【００６６】第３実施形態が光軸Ｌ１を中心に対象の位
置にある２つの軸Ｌ２，Ｌ３に直角な複数の面Ｃ４〜Ｃ
７の切片画像を得ていたのに対し、この第４実施形態は
光軸Ｌ１ではなく、光軸Ｌ７に対して所定角度傾斜した
光軸Ｌ７を中心に対象の位置にある２つの軸Ｌ８，Ｌ９
と垂直な面Ｄ５〜Ｄ８及び面Ｄ９〜Ｄ１２の切片画像を
得るようにしたものである。
【００６７】ＣＰＵ５０は第３実施形態と同様に２次元
スキャンユニット１０による２次元走査の開始と同時に
ピエゾ素子をＺ方向に駆動して対物レンズ２０を光軸方
向に一定速度で移動させて複数の切片画像を得、これら
の切片画像から３次元画像を作成する。
【００６８】この第４実施形態によれば、第３実施形態
と同様の効果を発揮できるとともに、光軸Ｌ１からずれ
た軸Ｌ７から観察した３次元画像を、第２実施形態と同
様に試料４を回転させずに見ることができる。また、コ
ンピュータの計算による回転を行わなくて良いので高速
な回転を行える。
【００６９】なお、上記実施形態ではＤＣモータ及びピ
エゾ素子を用いた場合で説明したが、ステッピングモー
タ（回転式）、超音波モータ（回転式）及びステッピン
グリニヤモータ等を用いることもできる。
【００７０】
【発明の効果】以上に説明したように請求項１に記載の
発明のコンフォーカル顕微鏡及び請求項２に記載の発明
のコンフォーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作成方法
によれば、光軸に対して傾斜した２つの軸にそれぞれ直
交する複数枚の切片画像を取得することで計算時間が高
速である高価なコンピュータを使用することなしに、歪
のない３次元画像を作成することができ、走査手段の走
査速度に対する駆動手段の移動速度を制御することで３
次元画像の回転を高速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はこの発明に係るコンフォーカル顕微鏡の
ブロック構成図である。
【図２】図２はこの発明の第１実施形態に係るコンフォ
ーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作成方法を説明する
図である。
【図３】図３は制御部による２次元スキャンユニットと
駆動部との制御方法を説明するフローチャートである。
【図４】図４はこの発明の第２実施形態に係るコンフォ
ーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作成方法を説明する
図である。
【図５】図５はこの発明の第３実施形態に係るコンフォ
ーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作成方法を説明する
図である。
【図６】図６はこの発明の第４実施形態に係るコンフォ
ーカル顕微鏡を用いた３次元画像の作成方法を説明する
図である。
【図７】図７は３次元画像の作成方法を説明する図であ
る。
【図８】図８は切片画像を得る方法を説明する図であ
る。
【図９】図９は切片画像から３次元画像を作成する方法
を説明する図である。
【符号の説明】
１ コンフォーカル顕微鏡 ２ 光源 ４ 試料 １０ ２次元スキャニングユニット（走査手段） ２０ 対物レンズ ２１ 対物レンズ駆動部（駆動手段） ３１ ピンホール ４０ 蛍光検出器（検出手段） ５０ ＣＰＵ（制御手段） Ｌ１ 光軸 Ｌ２，Ｌ３ 光軸Ｌ１に対して傾斜した軸

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 光源と、前記光源からの光を試料上で２
    次元走査する走査手段と、前記走査手段と前記試料との
    間に配置された対物レンズと、前記対物レンズと前記試
    料とを、前記対物レンズの光軸方向に相対移動させる駆
    動手段とを備えたコンフォーカル顕微鏡において、 前記走査手段による走査と前記駆動手段による前記光軸
    方向の移動とを同時に行わせるとともに、前記走査手段
    の走査速度に対する前記駆動手段の移動速度及び移動方
    向を制御して前記光軸に対して傾斜した軸に直交する前
    記試料の切片像を取得する制御手段を備えていることを
    特徴とするコンフォーカル顕微鏡。
  2. 【請求項２】 光源から発した光を対物レンズを介して
    試料に集光し、前記光を走査手段により前記試料上で２
    次元走査し、前記対物レンズの焦点面と共役な位置に設
    けられたピンホールによって焦点面以外からの光を除去
    し、前記ピンホールを通過した光を検出手段で検出して
    切片画像を取得するとともに、前記２次元走査と同時に
    駆動手段によって前記対物レンズと前記試料とを前記対
    物レンズの光軸方向に相対移動させて前記試料に対する
    前記対物レンズの焦点面を前記光軸方向にずらし、前記
    走査手段の走査速度に対する前記駆動手段の移動速度及
    び移動方向を制御し、前記光軸に対して傾斜した２つの
    軸にそれぞれ直交する複数枚の切片画像を取得すること
    を特徴とするコンフォーカル顕微鏡を用いた３次元画像
    の作成方法。
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