JPH10165178A - 抗Ｆａｓ抗体の可変領域をコードするＤＮＡ及び抗Ｆａｓ抗体 - Google Patents
抗Ｆａｓ抗体の可変領域をコードするＤＮＡ及び抗Ｆａｓ抗体Info
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- JPH10165178A JPH10165178A JP19176997A JP19176997A JPH10165178A JP H10165178 A JPH10165178 A JP H10165178A JP 19176997 A JP19176997 A JP 19176997A JP 19176997 A JP19176997 A JP 19176997A JP H10165178 A JPH10165178 A JP H10165178A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 自己免疫疾患の治療・診断に使用可能な抗Ｆ
ａｓ抗体、その抗Ｆａｓ抗体の可変領域をコードするＤ
ＮＡ。 【解決手段】 重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、
ヒトＩｇＧの重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと共に
ベクターに組み込み、重鎖を発現するベクターとし、軽
鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、ヒトＩｇＧの軽鎖
の定常領域と共にベクターに組み込み、軽鎖を発現する
ベクターとする。そして、これらの発現ベクターにより
細胞を形質転換し、この形質転換細胞から抗ヒトＦａｓ
抗体を得る。 【表１】
ａｓ抗体、その抗Ｆａｓ抗体の可変領域をコードするＤ
ＮＡ。 【解決手段】 重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、
ヒトＩｇＧの重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと共に
ベクターに組み込み、重鎖を発現するベクターとし、軽
鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、ヒトＩｇＧの軽鎖
の定常領域と共にベクターに組み込み、軽鎖を発現する
ベクターとする。そして、これらの発現ベクターにより
細胞を形質転換し、この形質転換細胞から抗ヒトＦａｓ
抗体を得る。 【表１】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗Ｆａｓ抗体の可
変領域をコ−ドするＤＮＡ、及び、抗Ｆａｓ抗体に関す
るものである。
変領域をコ−ドするＤＮＡ、及び、抗Ｆａｓ抗体に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】多細胞生物においては個体発生の過程に
おいて多くの細胞が細胞死により除去される。この細胞
死はあらかじめ決められたプログラムによって起こって
いると推測されており、火傷等の外的原因によって起こ
る受動的な細胞死（これをネクローシスと呼ぶ）と区別
してアポトーシスと呼ばれている。発生や分化あるいは
組織のターンオーバーの過程で見られる細胞死はアポト
ーシスによって起こると考えられている。
おいて多くの細胞が細胞死により除去される。この細胞
死はあらかじめ決められたプログラムによって起こって
いると推測されており、火傷等の外的原因によって起こ
る受動的な細胞死（これをネクローシスと呼ぶ）と区別
してアポトーシスと呼ばれている。発生や分化あるいは
組織のターンオーバーの過程で見られる細胞死はアポト
ーシスによって起こると考えられている。
【０００３】アポトーシスあるいはプログラム細胞死と
呼ばれる細胞死の制御に深く関連すると考えられている
生体構成細胞表層に存在するタンパクは、Ｆａｓ抗原と
呼ばれる膜貫通タンパクである。マウス及びヒトＦａｓ
抗原のアミノ酸配列、及びアミノ酸配列をコードするｃ
ＤＮＡ配列は既に明らかにされている（Cell、第66巻、
233頁−243頁、1991年、イトウナオトら、J. Immunol.
、第148巻、第4号、1274頁−1279頁、1992年、ワタナ
ベ（フクナガ）リエら、J. Biol. Chem. 、第267巻、第
15号、10709−10715頁、1992年、エーム（Alexander Oe
hm）ら、J. Exp.Med. 、第169巻，1747−1756頁、1989
年、ヨネハラシンら、Proc. Natl. Acad.Sci. USA、第8
7巻、9620−9624頁、1990年、コバヤシノブユキら、Sci
ence、第245巻、301−305頁、1989年、トラウス（Bernh
ard C. Trauth）ら、J. Immunol.、第149巻、第10号、3
166−3173頁、1992年、ダイン（Jeas Dein）ら、The La
ncet. 第335巻、497−500頁、1990年、デバティン（Kla
us-Michael Debatin）ら、J. Immunol.、第149巻、第11
号、3753−3758頁、1992年、ミヤワキトシオら、Genomi
cs、第14巻、179−180頁、1992年、リヒター（Peter Li
chter）ら等参照）。
呼ばれる細胞死の制御に深く関連すると考えられている
生体構成細胞表層に存在するタンパクは、Ｆａｓ抗原と
呼ばれる膜貫通タンパクである。マウス及びヒトＦａｓ
抗原のアミノ酸配列、及びアミノ酸配列をコードするｃ
ＤＮＡ配列は既に明らかにされている（Cell、第66巻、
233頁−243頁、1991年、イトウナオトら、J. Immunol.
、第148巻、第4号、1274頁−1279頁、1992年、ワタナ
ベ（フクナガ）リエら、J. Biol. Chem. 、第267巻、第
15号、10709−10715頁、1992年、エーム（Alexander Oe
hm）ら、J. Exp.Med. 、第169巻，1747−1756頁、1989
年、ヨネハラシンら、Proc. Natl. Acad.Sci. USA、第8
7巻、9620−9624頁、1990年、コバヤシノブユキら、Sci
ence、第245巻、301−305頁、1989年、トラウス（Bernh
ard C. Trauth）ら、J. Immunol.、第149巻、第10号、3
166−3173頁、1992年、ダイン（Jeas Dein）ら、The La
ncet. 第335巻、497−500頁、1990年、デバティン（Kla
us-Michael Debatin）ら、J. Immunol.、第149巻、第11
号、3753−3758頁、1992年、ミヤワキトシオら、Genomi
cs、第14巻、179−180頁、1992年、リヒター（Peter Li
chter）ら等参照）。
【０００４】1989年に米原らはヒトＦＳ−７細胞の表面
抗原に対するモノクローナル抗体を作製し、この中から
アポトーシスを誘導する抗体、抗Ｆａｓ抗体を得た（Yo
nehara,S. et al. : J.Exp.Med., 169 :1747-1756, 198
9)。また、これとは別に、トラウス(Trauth)らも抗Ｆａ
ｓ抗体によく似た性質を持ち、細胞を殺す活性を示すモ
ノクローナル抗体、ＡＰＯ−１抗体を得ており(Trauth,
B.C. et al. : Science, 245 :301-305, 1989)、この二
つは抗体の認識する抗原の分布や分子量などは極めてよ
く似ており、同じものであることが明らかにされてい
る。
抗原に対するモノクローナル抗体を作製し、この中から
アポトーシスを誘導する抗体、抗Ｆａｓ抗体を得た（Yo
nehara,S. et al. : J.Exp.Med., 169 :1747-1756, 198
9)。また、これとは別に、トラウス(Trauth)らも抗Ｆａ
ｓ抗体によく似た性質を持ち、細胞を殺す活性を示すモ
ノクローナル抗体、ＡＰＯ−１抗体を得ており(Trauth,
B.C. et al. : Science, 245 :301-305, 1989)、この二
つは抗体の認識する抗原の分布や分子量などは極めてよ
く似ており、同じものであることが明らかにされてい
る。
【０００５】Ｆａｓ抗原はその構造解析の結果、腫瘍壊
死因子（ＴＮＦ）レセプタ−や神経成長因子（ＮＧＦ）
によく似た構造を有していること、外部からのシグナル
を受けて細胞死を起こす新しい種類のレセプターである
ことが明らかにされ、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリー
を形成する受容体の一つとされている。
死因子（ＴＮＦ）レセプタ−や神経成長因子（ＮＧＦ）
によく似た構造を有していること、外部からのシグナル
を受けて細胞死を起こす新しい種類のレセプターである
ことが明らかにされ、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体ファミリー
を形成する受容体の一つとされている。
【０００６】最近において、自己免疫の症状を呈するマ
ウス（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス）においてＦａｓ遺伝子の
異常が認められることなどから、Ｆａｓ抗原の発現と自
己免疫疾患の関連が注目されるようになった。自己免疫
疾患とは、生体防御機構である免疫系が自己の細胞成分
と反応する自己抗体やリンパ球を産生し、その結果組織
障害や病変を生ずるものであるが、このような自己免疫
の成立機序には交叉反応や抗原の修飾等の抗原側の原因
の他に、本来ならば発生過程においてアポトーシスによ
り除かれるべき自己の細胞成分との反応性を有するリン
パ球が、アポトーシスの異常によって生体に残存するこ
とによって引き起こされているとする説が有力になりつ
つある。
ウス（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス）においてＦａｓ遺伝子の
異常が認められることなどから、Ｆａｓ抗原の発現と自
己免疫疾患の関連が注目されるようになった。自己免疫
疾患とは、生体防御機構である免疫系が自己の細胞成分
と反応する自己抗体やリンパ球を産生し、その結果組織
障害や病変を生ずるものであるが、このような自己免疫
の成立機序には交叉反応や抗原の修飾等の抗原側の原因
の他に、本来ならば発生過程においてアポトーシスによ
り除かれるべき自己の細胞成分との反応性を有するリン
パ球が、アポトーシスの異常によって生体に残存するこ
とによって引き起こされているとする説が有力になりつ
つある。
【０００７】このことから、抗Ｆａｓモノクローナル抗
体を生体に投与してアポトーシスを誘導し、生体中に残
存する自己抗体産生細胞を除くことによって自己免疫疾
患の治療に役立てることが考えられる。
体を生体に投与してアポトーシスを誘導し、生体中に残
存する自己抗体産生細胞を除くことによって自己免疫疾
患の治療に役立てることが考えられる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】一般に、疾患の治療に
モノクローナル抗体を用いることについては、従来より
癌の治療法として提案されておりいくつかの試みがなさ
れてきたが、モノクローナル抗体は通常マウス等の動物
細胞によって産生されていることから、これら異種動物
によって産生された蛋白質をヒトに投与した場合にはヒ
ト蛋白と区別されてヒトの循環系から即座に排除されて
しまう、あるいはアレルギー反応を引き起こすことから
継続して使用することは困難であった。
モノクローナル抗体を用いることについては、従来より
癌の治療法として提案されておりいくつかの試みがなさ
れてきたが、モノクローナル抗体は通常マウス等の動物
細胞によって産生されていることから、これら異種動物
によって産生された蛋白質をヒトに投与した場合にはヒ
ト蛋白と区別されてヒトの循環系から即座に排除されて
しまう、あるいはアレルギー反応を引き起こすことから
継続して使用することは困難であった。
【０００９】これらの問題を回避するためにはヒトのモ
ノクローナル抗体を用いることが望ましいが、ヒト抗原
の場合ヒトの免疫系では外来抗原として認識されず免疫
原性がないこと、ヒトモノクローナル抗体の多くはあま
り利用効率のよくないＩｇＭ型であり、より効果的なＩ
ｇＧ型のモノクローナル抗体を得ることは容易でないこ
となど、ヒトモノクローナル抗体を細胞融合で自在に産
生するには困難である。そのため、最近では遺伝子工学
的手法によりマウスモノクローナル抗体の可変領域（抗
原認識部位）とヒト抗体の定常領域を組み合わせたキメ
ラモノクロ−ナル抗体の産生研究が行われている（特開
昭６０−１５５１３２号など）。
ノクローナル抗体を用いることが望ましいが、ヒト抗原
の場合ヒトの免疫系では外来抗原として認識されず免疫
原性がないこと、ヒトモノクローナル抗体の多くはあま
り利用効率のよくないＩｇＭ型であり、より効果的なＩ
ｇＧ型のモノクローナル抗体を得ることは容易でないこ
となど、ヒトモノクローナル抗体を細胞融合で自在に産
生するには困難である。そのため、最近では遺伝子工学
的手法によりマウスモノクローナル抗体の可変領域（抗
原認識部位）とヒト抗体の定常領域を組み合わせたキメ
ラモノクロ−ナル抗体の産生研究が行われている（特開
昭６０−１５５１３２号など）。
【００１０】本発明の目的は、自己免疫疾患の治療・診
断に使用可能な抗Ｆａｓ抗体を産生するため、抗Ｆａｓ
抗体の可変領域をコードするＤＮＡを提供すること、ま
た、上記抗Ｆａｓ抗体を提供することにある。
断に使用可能な抗Ｆａｓ抗体を産生するため、抗Ｆａｓ
抗体の可変領域をコードするＤＮＡを提供すること、ま
た、上記抗Ｆａｓ抗体を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段、発明の実施の形態及び発
明の効果】上記課題を解決するため、第１発明は、抗Ｆ
ａｓ抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡであっ
て、GACTACAACATGCACで表される塩基配列、TATATTTATCC
TTACAATGGTGGTACTGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGCで表される
塩基配列、及びAGTTACTATGCTATGGACTACで表される塩基
配列を含むことを特徴とする。かかるＤＮＡは、例えば
配列表の配列番号１又は配列番号５に示す塩基配列であ
ってもよい（尚、配列表の配列番号１に示す塩基配列の
うち前記各塩基配列に該当する箇所は、塩基番号９１〜
１０５、１４８〜１９８、２９５〜３１５であり、配列
表の配列番号５に示す塩基配列のうち前記各塩基配列に
該当する個所は、塩基番号１４８〜１６２、２０５〜２
５５、３５２〜３７２である）。
明の効果】上記課題を解決するため、第１発明は、抗Ｆ
ａｓ抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡであっ
て、GACTACAACATGCACで表される塩基配列、TATATTTATCC
TTACAATGGTGGTACTGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGCで表される
塩基配列、及びAGTTACTATGCTATGGACTACで表される塩基
配列を含むことを特徴とする。かかるＤＮＡは、例えば
配列表の配列番号１又は配列番号５に示す塩基配列であ
ってもよい（尚、配列表の配列番号１に示す塩基配列の
うち前記各塩基配列に該当する箇所は、塩基番号９１〜
１０５、１４８〜１９８、２９５〜３１５であり、配列
表の配列番号５に示す塩基配列のうち前記各塩基配列に
該当する個所は、塩基番号１４８〜１６２、２０５〜２
５５、３５２〜３７２である）。
【００１２】第２発明は、抗Ｆａｓ抗体の軽鎖の可変領
域をコードするＤＮＡであって、AGATCTAGTAAGAGCCTTGT
ACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATで表される塩基配列、AA
AGTTTCCAACCGATTTTCTで表される塩基配列、及びTCTCAAA
GTACACATGTTCCTCCGGCGで表される塩基配列を含むことを
特徴とする。かかるＤＮＡは、例えば配列表の配列番号
２及び配列番号６に示す塩基配列であってもよい（尚、
配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち前記各塩基配
列に該当する箇所は、塩基番号７０〜１１７、１６３〜
１８３、２８０〜３０６であり、配列表の配列番号６に
示す塩基配列のうち前記各塩基配列に該当する個所は、
塩基番号１２７〜１７４、２２０〜２４０、３３７〜３
６３である）。
域をコードするＤＮＡであって、AGATCTAGTAAGAGCCTTGT
ACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATで表される塩基配列、AA
AGTTTCCAACCGATTTTCTで表される塩基配列、及びTCTCAAA
GTACACATGTTCCTCCGGCGで表される塩基配列を含むことを
特徴とする。かかるＤＮＡは、例えば配列表の配列番号
２及び配列番号６に示す塩基配列であってもよい（尚、
配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち前記各塩基配
列に該当する箇所は、塩基番号７０〜１１７、１６３〜
１８３、２８０〜３０６であり、配列表の配列番号６に
示す塩基配列のうち前記各塩基配列に該当する個所は、
塩基番号１２７〜１７４、２２０〜２４０、３３７〜３
６３である）。
【００１３】一般に、抗体（免疫グロブリン）は、分子
量の大きな重鎖、分子量の小さな軽鎖から構成されてい
る。重鎖と軽鎖は、ともにＮ末端から約１１０残基にお
いて可変領域と称されるアミノ酸配列の異なる領域を有
しており、重鎖の可変領域はＶH 、軽鎖の可変領域はＶ
L と表される。この重鎖の可変領域ＶH と軽鎖の可変領
域ＶL が相対して（非共有）結合することにより、その
先端に抗原結合部位が形成される。可変領域の中でも特
にアミノ酸配列の変異の頻度が高い領域を超可変領域と
いい、この重鎖の超可変領域と軽鎖の超可変領域が、抗
Ｆａｓ抗体固有の抗原結合部位構造をつくりだし、抗原
への親和性・特異性を決定するとともに、その結合部位
の持つ抗原性も決定する。
量の大きな重鎖、分子量の小さな軽鎖から構成されてい
る。重鎖と軽鎖は、ともにＮ末端から約１１０残基にお
いて可変領域と称されるアミノ酸配列の異なる領域を有
しており、重鎖の可変領域はＶH 、軽鎖の可変領域はＶ
L と表される。この重鎖の可変領域ＶH と軽鎖の可変領
域ＶL が相対して（非共有）結合することにより、その
先端に抗原結合部位が形成される。可変領域の中でも特
にアミノ酸配列の変異の頻度が高い領域を超可変領域と
いい、この重鎖の超可変領域と軽鎖の超可変領域が、抗
Ｆａｓ抗体固有の抗原結合部位構造をつくりだし、抗原
への親和性・特異性を決定するとともに、その結合部位
の持つ抗原性も決定する。
【００１４】第１発明において、配列表の配列番号１又
は配列番号５に示す塩基配列は重鎖の可変領域ＶH をコ
ードし、このうち、GACTACAACATGCACで表される塩基配
列（配列番号１の配列における塩基番号９１〜１０５、
配列番号５の配列における塩基番号１４８〜１６２）、
TATATTTATCCTTACAATGGTGGTACTGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAG
Cで表される塩基配列（配列番号１の配列における塩基
番号１４８〜１９８、配列番号５の配列における塩基番
号２０５〜２５５）、及び、AGTTACTATGCTATGGACTACで
表される塩基配列（配列番号１の配列における塩基番号
２９５〜３１５、配列番号５の配列における塩基番号３
５２〜３７２）、は重鎖の超可変領域をコードする。
は配列番号５に示す塩基配列は重鎖の可変領域ＶH をコ
ードし、このうち、GACTACAACATGCACで表される塩基配
列（配列番号１の配列における塩基番号９１〜１０５、
配列番号５の配列における塩基番号１４８〜１６２）、
TATATTTATCCTTACAATGGTGGTACTGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAG
Cで表される塩基配列（配列番号１の配列における塩基
番号１４８〜１９８、配列番号５の配列における塩基番
号２０５〜２５５）、及び、AGTTACTATGCTATGGACTACで
表される塩基配列（配列番号１の配列における塩基番号
２９５〜３１５、配列番号５の配列における塩基番号３
５２〜３７２）、は重鎖の超可変領域をコードする。
【００１５】また、第２発明において、配列表の配列番
号２又は配列番号６に示す塩基配列は軽鎖の可変領域Ｖ
L をコードし、このうち、AGATCTAGTAAGAGCCTTGTACACAG
TAATGGAAACACCTATTTACATで表される塩基配列（配列番号
２の配列における塩基番号７０〜１１７、配列番号６の
配列における塩基番号１２７〜１７４）、AAAGTTTCCAAC
CGATTTTCTで表される塩基配列（配列番号２の配列にお
ける塩基番号１６３〜１８３、配列番号６の配列におけ
る塩基番号２２０〜２４０）、及び、TCTCAAAGTACACATG
TTCCTCCGGCGで表される塩基配列（配列番号２の配列に
おける塩基番号２８０〜３０６、配列番号６の配列にお
ける塩基番号３３７〜３６３）、は軽鎖の超可変領域を
コードする。
号２又は配列番号６に示す塩基配列は軽鎖の可変領域Ｖ
L をコードし、このうち、AGATCTAGTAAGAGCCTTGTACACAG
TAATGGAAACACCTATTTACATで表される塩基配列（配列番号
２の配列における塩基番号７０〜１１７、配列番号６の
配列における塩基番号１２７〜１７４）、AAAGTTTCCAAC
CGATTTTCTで表される塩基配列（配列番号２の配列にお
ける塩基番号１６３〜１８３、配列番号６の配列におけ
る塩基番号２２０〜２４０）、及び、TCTCAAAGTACACATG
TTCCTCCGGCGで表される塩基配列（配列番号２の配列に
おける塩基番号２８０〜３０６、配列番号６の配列にお
ける塩基番号３３７〜３６３）、は軽鎖の超可変領域を
コードする。
【００１６】第１、第２発明のＤＮＡは、例えば、抗ヒ
トＦａｓマウスモノクローナル抗体の重鎖の可変領域、
軽鎖の可変領域に相当するものである。かかる抗ヒトＦ
ａｓマウスモノクローナル抗体としては、例えば、ハイ
ブリドーマ(Mouse-Mouse hybridoma)ＣＢＥ、ＷＢ３、
ＶＢ３、ＪＡＥ、ＡＸ６、ＺＢ４、ＵＢ２及びＣＨ１１
からなる群の中から選ばれた一つのハイブリドーマから
産生される抗体を用いることができる。
トＦａｓマウスモノクローナル抗体の重鎖の可変領域、
軽鎖の可変領域に相当するものである。かかる抗ヒトＦ
ａｓマウスモノクローナル抗体としては、例えば、ハイ
ブリドーマ(Mouse-Mouse hybridoma)ＣＢＥ、ＷＢ３、
ＶＢ３、ＪＡＥ、ＡＸ６、ＺＢ４、ＵＢ２及びＣＨ１１
からなる群の中から選ばれた一つのハイブリドーマから
産生される抗体を用いることができる。
【００１７】ここで、例えば、ハイブリドーマＺＢ４、
ＵＢ２は、ヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡで形質転換したマウ
ス細胞より得たリコンビナントＦａｓ抗原をＢＡＬＢ／
ｃマウスに免疫後、その脾細胞とマウスミエローマ細胞
（ＮＳ−１）とを融合させることにより得ることができ
る。また、ハイブリドーマＣＢＥ、ＷＢ３、ＶＢ３、Ｊ
ＡＥ、ＡＸ６も、ハイブリドーマＺＢ４、ＵＢ２と同様
に作製できる。一方、ハイブリドーマＣＨ１１は、ヒト
二倍体繊維芽細胞ＦＳ−７をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫
後、その脾細胞とマウスミエローマ細胞（ＮＳ−１）と
を融合させることにより得ることができる（Yonehara,
S., Ishii, A. & Yonehara, M. :"A cell killing mono
clonal antibody(anti-Fas) to a cell surface antige
n co-downregulated with the receptor of tumor necr
osis factor."J. Exp. Med., 169:1747-1756(1989)）。
ＵＢ２は、ヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡで形質転換したマウ
ス細胞より得たリコンビナントＦａｓ抗原をＢＡＬＢ／
ｃマウスに免疫後、その脾細胞とマウスミエローマ細胞
（ＮＳ−１）とを融合させることにより得ることができ
る。また、ハイブリドーマＣＢＥ、ＷＢ３、ＶＢ３、Ｊ
ＡＥ、ＡＸ６も、ハイブリドーマＺＢ４、ＵＢ２と同様
に作製できる。一方、ハイブリドーマＣＨ１１は、ヒト
二倍体繊維芽細胞ＦＳ−７をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫
後、その脾細胞とマウスミエローマ細胞（ＮＳ−１）と
を融合させることにより得ることができる（Yonehara,
S., Ishii, A. & Yonehara, M. :"A cell killing mono
clonal antibody(anti-Fas) to a cell surface antige
n co-downregulated with the receptor of tumor necr
osis factor."J. Exp. Med., 169:1747-1756(1989)）。
【００１８】尚、ハイブリドーマＣＢＥ、ＷＢ３、ＶＢ
３、ＪＡＥ、ＡＸ６、ＺＢ４、ＵＢ２及びＣＨ１１の受
託番号は、それぞれＦＥＲＭ Ｐ−１５７０１、ＦＥＲ
ＭＰ−１５７０２、ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０３、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５７０４、ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０５、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５７０６、ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０７、Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１５７０８である。また、これらのうちハ
イブリドーマＺＢ４、ＵＢ２、ＣＨ１１から産生される
モノクローナル抗体は、（株）医学生物学研究所より市
販されており、それぞれのカタログ番号はＭＤ−１１−
３、ＭＤ−１０−３、ＳＹ−００１である。
３、ＪＡＥ、ＡＸ６、ＺＢ４、ＵＢ２及びＣＨ１１の受
託番号は、それぞれＦＥＲＭ Ｐ−１５７０１、ＦＥＲ
ＭＰ−１５７０２、ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０３、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５７０４、ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０５、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５７０６、ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０７、Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１５７０８である。また、これらのうちハ
イブリドーマＺＢ４、ＵＢ２、ＣＨ１１から産生される
モノクローナル抗体は、（株）医学生物学研究所より市
販されており、それぞれのカタログ番号はＭＤ−１１−
３、ＭＤ−１０−３、ＳＹ−００１である。
【００１９】第１、第２発明のＤＮＡは、例えば、以下
のようにして利用することができる。即ち、第１発明に
係る重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、重鎖の定常
領域（例えばヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域）を
コードするＤＮＡと共にベクターに組み込み、重鎖を発
現するベクターとする。一方、第２発明に係る軽鎖の可
変領域をコードするＤＮＡを、軽鎖の定常領域（例えば
ヒト免疫グロブリンの軽鎖の定常領域）と共にベクター
に組み込み、軽鎖を発現するベクターとする。そして、
これらの発現ベクターにより細胞を形質転換し、この形
質転換細胞から抗ヒトＦａｓ抗体（第３発明に係る抗Ｆ
ａｓ抗体）を得ることができる。
のようにして利用することができる。即ち、第１発明に
係る重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、重鎖の定常
領域（例えばヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領域）を
コードするＤＮＡと共にベクターに組み込み、重鎖を発
現するベクターとする。一方、第２発明に係る軽鎖の可
変領域をコードするＤＮＡを、軽鎖の定常領域（例えば
ヒト免疫グロブリンの軽鎖の定常領域）と共にベクター
に組み込み、軽鎖を発現するベクターとする。そして、
これらの発現ベクターにより細胞を形質転換し、この形
質転換細胞から抗ヒトＦａｓ抗体（第３発明に係る抗Ｆ
ａｓ抗体）を得ることができる。
【００２０】第３発明は、抗Ｆａｓ抗体であって、重鎖
の可変領域が、Asp Tyr Asn Met Hisで表されるアミノ
酸配列（配列番号３の配列におけるアミノ酸番号３１〜
３５、配列番号７の配列におけるアミノ酸番号５０〜５
４）、Tyr Ile Tyr Pro TyrAsn Gly Gly Thr Gly Tyr A
sn Gln Lys Phe Lys Serで表されるアミノ酸配列（配列
番号３の配列におけるアミノ酸番号５０〜６６、配列番
号７の配列におけるアミノ酸番号６９〜８５）、及び、
Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyrで表されるアミノ酸配列
（配列番号３の配列におけるアミノ酸番号９９〜１０
５、配列番号７の配列における同じくアミノ酸番号１１
８〜１２４）、を含み、重鎖の定常領域が、ヒト免疫グ
ロブリンの重鎖の定常領域であり、軽鎖の可変領域が、
Arg SerSer Lys Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr
Tyr Leu Hisで表されるアミノ酸配列（配列番号４の配
列におけるアミノ酸番号２４〜３９、配列番号８の配列
におけるアミノ酸番号４３〜５８）、Lys Val Ser Asn
Arg Phe Serで表されるアミノ酸配列（配列番号４の配
列におけるアミノ酸番号５５〜６１、配列番号８の配列
におけるアミノ酸番号７４〜８０）、Ser Gln Ser Thr
His Val Pro ProAlaで表されるアミノ酸配列（配列番号
４の配列におけるアミノ酸番号９４〜１０２、配列番号
８の配列におけるアミノ酸配列１１３〜１２１）、を含
み、軽鎖の定常領域が、ヒト免疫グロブリンの軽鎖の定
常領域であることを特徴とする。
の可変領域が、Asp Tyr Asn Met Hisで表されるアミノ
酸配列（配列番号３の配列におけるアミノ酸番号３１〜
３５、配列番号７の配列におけるアミノ酸番号５０〜５
４）、Tyr Ile Tyr Pro TyrAsn Gly Gly Thr Gly Tyr A
sn Gln Lys Phe Lys Serで表されるアミノ酸配列（配列
番号３の配列におけるアミノ酸番号５０〜６６、配列番
号７の配列におけるアミノ酸番号６９〜８５）、及び、
Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyrで表されるアミノ酸配列
（配列番号３の配列におけるアミノ酸番号９９〜１０
５、配列番号７の配列における同じくアミノ酸番号１１
８〜１２４）、を含み、重鎖の定常領域が、ヒト免疫グ
ロブリンの重鎖の定常領域であり、軽鎖の可変領域が、
Arg SerSer Lys Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr
Tyr Leu Hisで表されるアミノ酸配列（配列番号４の配
列におけるアミノ酸番号２４〜３９、配列番号８の配列
におけるアミノ酸番号４３〜５８）、Lys Val Ser Asn
Arg Phe Serで表されるアミノ酸配列（配列番号４の配
列におけるアミノ酸番号５５〜６１、配列番号８の配列
におけるアミノ酸番号７４〜８０）、Ser Gln Ser Thr
His Val Pro ProAlaで表されるアミノ酸配列（配列番号
４の配列におけるアミノ酸番号９４〜１０２、配列番号
８の配列におけるアミノ酸配列１１３〜１２１）、を含
み、軽鎖の定常領域が、ヒト免疫グロブリンの軽鎖の定
常領域であることを特徴とする。
【００２１】第３発明の抗Ｆａｓ抗体は、Ｆａｓ抗原の
認識部位を決定する超可変領域を含む可変領域と、ヒト
免疫グロブリンの定常領域とを組み合わせたことによ
り、ヒトに投与した場合であってもヒト蛋白と認識され
るためヒトの循環系から排除されにくく、アレルギー反
応も起こりにくい。このため、本来ならばアポトーシス
により除かれるべきリンパ球であって自己の細胞成分と
の反応性を有するものが生体に残存している患者に対し
て、この抗Ｆａｓ抗体を投与すれば、アポトーシスが誘
導されてかかるリンパ球が除かれるため、自己免疫疾患
の有効な治療剤となることが期待される。
認識部位を決定する超可変領域を含む可変領域と、ヒト
免疫グロブリンの定常領域とを組み合わせたことによ
り、ヒトに投与した場合であってもヒト蛋白と認識され
るためヒトの循環系から排除されにくく、アレルギー反
応も起こりにくい。このため、本来ならばアポトーシス
により除かれるべきリンパ球であって自己の細胞成分と
の反応性を有するものが生体に残存している患者に対し
て、この抗Ｆａｓ抗体を投与すれば、アポトーシスが誘
導されてかかるリンパ球が除かれるため、自己免疫疾患
の有効な治療剤となることが期待される。
【００２２】ここで、第３発明の抗Ｆａｓ抗体は単独で
もアポトーシス活性を有するが、ＩｇＧに分類されるも
のについては単独では十分にアポトーシスを誘導するこ
とができない。その理由は、アポトーシスの誘導のため
には細胞表面上のＦａｓ抗原のうち３つが架橋される必
要があるのに対し、ＩｇＧクラスのものは単独ではＦａ
ｓ抗原と反応はしても架橋することができないからと考
えられる。
もアポトーシス活性を有するが、ＩｇＧに分類されるも
のについては単独では十分にアポトーシスを誘導するこ
とができない。その理由は、アポトーシスの誘導のため
には細胞表面上のＦａｓ抗原のうち３つが架橋される必
要があるのに対し、ＩｇＧクラスのものは単独ではＦａ
ｓ抗原と反応はしても架橋することができないからと考
えられる。
【００２３】このため、ＩｇＧを架橋可能な２次抗体を
用いて、反応した抗Ｆａｓ抗体同士を架橋することによ
り、単独で用いる場合に比べて高いアポトーシス活性を
誘導するのが好ましい。第３発明の抗Ｆａｓ抗体とこの
ような２次抗体とを適宜併用することにより、例えばＷ
Ｒ１９Ｌ１２ａの細胞生存率（ＭＴＴアッセイ法によ
る）を２０％以下に抑えることができる。なお、このよ
うな２次抗体としては、例えば、抗ヒトγ重鎖抗体、抗
ヒトκ軽鎖抗体、抗ヒトＦｃ抗体、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋
Ｌ）抗体等の抗体のほか、プロテインＡ、プロテインＧ
等が挙げられる。
用いて、反応した抗Ｆａｓ抗体同士を架橋することによ
り、単独で用いる場合に比べて高いアポトーシス活性を
誘導するのが好ましい。第３発明の抗Ｆａｓ抗体とこの
ような２次抗体とを適宜併用することにより、例えばＷ
Ｒ１９Ｌ１２ａの細胞生存率（ＭＴＴアッセイ法によ
る）を２０％以下に抑えることができる。なお、このよ
うな２次抗体としては、例えば、抗ヒトγ重鎖抗体、抗
ヒトκ軽鎖抗体、抗ヒトＦｃ抗体、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋
Ｌ）抗体等の抗体のほか、プロテインＡ、プロテインＧ
等が挙げられる。
【００２４】第３発明の抗Ｆａｓ抗体は、重鎖の可変領
域が配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、軽
鎖の可変領域が、配列表の配列番号４に示すアミノ酸配
列を含んでいてもよい。あるいは、重鎖の可変領域が配
列表の配列番号７に示すアミノ酸配列を含み、軽鎖の可
変領域が、配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列を含
んでいてもよい。また、重鎖の定常領域がヒトＩｇＧの
重鎖の定常領域であり、軽鎖の定常領域がヒトＩｇＧの
軽鎖の定常領域であることが、生体に投与してアポトー
シスを誘導する上でより効果的であると期待されるため
好ましい。
域が配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、軽
鎖の可変領域が、配列表の配列番号４に示すアミノ酸配
列を含んでいてもよい。あるいは、重鎖の可変領域が配
列表の配列番号７に示すアミノ酸配列を含み、軽鎖の可
変領域が、配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列を含
んでいてもよい。また、重鎖の定常領域がヒトＩｇＧの
重鎖の定常領域であり、軽鎖の定常領域がヒトＩｇＧの
軽鎖の定常領域であることが、生体に投与してアポトー
シスを誘導する上でより効果的であると期待されるため
好ましい。
【００２５】例えば、このような抗Ｆａｓ抗体として
は、抗ヒトＦａｓマウスモノクローナル抗体の可変領域
とヒトＩｇＧの定常領域を組み合わせたキメラ・モノク
ローナル抗体を挙げることができる。抗ヒトＦａｓマウ
スモノクローナル抗体としては、前述のハイブリドーマ
ＣＢＥ、ＷＢ３、ＶＢ３、ＪＡＥ、ＡＸ６、ＺＢ４、Ｕ
Ｂ２及びＣＨ１１からなる群の中から選ばれた一つのハ
イブリドーマから産生される抗体を用いることができ
る。
は、抗ヒトＦａｓマウスモノクローナル抗体の可変領域
とヒトＩｇＧの定常領域を組み合わせたキメラ・モノク
ローナル抗体を挙げることができる。抗ヒトＦａｓマウ
スモノクローナル抗体としては、前述のハイブリドーマ
ＣＢＥ、ＷＢ３、ＶＢ３、ＪＡＥ、ＡＸ６、ＺＢ４、Ｕ
Ｂ２及びＣＨ１１からなる群の中から選ばれた一つのハ
イブリドーマから産生される抗体を用いることができ
る。
【００２６】
【実施例】以下に、本発明の好適な実施例を図面に基づ
いて説明する。尚、本発明の実施の形態は、下記の実施
例に何ら限定されるものではなく、本発明の技術的範囲
に属する限り種々の形態を採り得ることはいうまでもな
い。 ［実施例１］抗Ｆａｓ抗体の可変領域をコードするＤＮ
Ａを有するプラスミド ［１−１］抗ヒトＦａｓマウスモノクローナル抗体ｃＤ
ＮＡの調製 抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ＩｇＭ）を産生している
ハイブリドーマＣＨ−１１（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−
１５７０８）を１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＤ
ＭＥＭで培養し、１×１０7 個の細胞からｍＲＮＡ調製
キット（ファルマシア社製）、商品名 「Quick Prep Mic
ro m-RNA purification Kit」）を用いてｐｏｌｙＡ−Ｒ
ＮＡを調製した。このｍＲＮＡ５μｇより、ｃＤＮＡ合
成キット（ファルマシア社製、商品名 「First Strand c
-DNA Synthesis Kit」 ）を用いて、キットの操作説明書
に従い操作し、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
いて説明する。尚、本発明の実施の形態は、下記の実施
例に何ら限定されるものではなく、本発明の技術的範囲
に属する限り種々の形態を採り得ることはいうまでもな
い。 ［実施例１］抗Ｆａｓ抗体の可変領域をコードするＤＮ
Ａを有するプラスミド ［１−１］抗ヒトＦａｓマウスモノクローナル抗体ｃＤ
ＮＡの調製 抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ＩｇＭ）を産生している
ハイブリドーマＣＨ−１１（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−
１５７０８）を１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＤ
ＭＥＭで培養し、１×１０7 個の細胞からｍＲＮＡ調製
キット（ファルマシア社製）、商品名 「Quick Prep Mic
ro m-RNA purification Kit」）を用いてｐｏｌｙＡ−Ｒ
ＮＡを調製した。このｍＲＮＡ５μｇより、ｃＤＮＡ合
成キット（ファルマシア社製、商品名 「First Strand c
-DNA Synthesis Kit」 ）を用いて、キットの操作説明書
に従い操作し、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００２７】尚、ハイブリドーマＣＨ−１１は次のよう
にして調製した。まず、ヒトＦａｓ抗原を発現している
ヒト２倍体線維芽細胞ＦＳ−７細胞株を用いてＢａｌｂ
／ｃ雌マウスを免疫感作させた。感作マウスを開腹し脾
臓を摘出し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培養液中でステン
レスメッシュ上ですりつぶした後、脾臓細胞液を遠心分
離（１５００ｒｐｍで７分間）した。遠心残査を回収
し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培養液に懸濁させた。さら
に、無血清ＲＰＭＩ１６４０培養液で２回洗浄し、抗体
産生マウス脾臓細胞を取得した。一方、マウスミエロ−
マ細胞ＮＳ−１（ATCC TIB18）を、３７℃、５％ＣＯ2
下、１０％ＦＣＳ及び５０Ｕ／ｍｌのカナマイシン含有
ＡＳＦ−１０４培地（味の素社（製））中で培養した。
にして調製した。まず、ヒトＦａｓ抗原を発現している
ヒト２倍体線維芽細胞ＦＳ−７細胞株を用いてＢａｌｂ
／ｃ雌マウスを免疫感作させた。感作マウスを開腹し脾
臓を摘出し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培養液中でステン
レスメッシュ上ですりつぶした後、脾臓細胞液を遠心分
離（１５００ｒｐｍで７分間）した。遠心残査を回収
し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培養液に懸濁させた。さら
に、無血清ＲＰＭＩ１６４０培養液で２回洗浄し、抗体
産生マウス脾臓細胞を取得した。一方、マウスミエロ−
マ細胞ＮＳ−１（ATCC TIB18）を、３７℃、５％ＣＯ2
下、１０％ＦＣＳ及び５０Ｕ／ｍｌのカナマイシン含有
ＡＳＦ−１０４培地（味の素社（製））中で培養した。
【００２８】次いで、無血清ＲＰＭＩ１６４０培養液で
洗浄したマウスミエロ−マ細胞ＮＳ−１細胞と前述のよ
うに調製したマウス脾臓細胞を混合した無血清ＲＰＭＩ
１６４０溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍで１０分間）
し、遠心残査を回収し、ヘルツェンバ−グ（Herzenber
g, L. A. ）らの方法（セレクテッド・メソッズ・イン
・セリュラー・イムノロジー（ Selected Methods in C
ellular Immunology）第３５１頁（１９８０年））に従
って細胞融合を行ない、複数のハイブリド−マのコロニ
−を得た。
洗浄したマウスミエロ−マ細胞ＮＳ−１細胞と前述のよ
うに調製したマウス脾臓細胞を混合した無血清ＲＰＭＩ
１６４０溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍで１０分間）
し、遠心残査を回収し、ヘルツェンバ−グ（Herzenber
g, L. A. ）らの方法（セレクテッド・メソッズ・イン
・セリュラー・イムノロジー（ Selected Methods in C
ellular Immunology）第３５１頁（１９８０年））に従
って細胞融合を行ない、複数のハイブリド−マのコロニ
−を得た。
【００２９】そして、抗ヒトＦａｓモノクロ−ナル抗体
を産生しているハイブリド−マをスクリ−ニングするた
め、Ｆａｓ抗原を発現しているヒト胸腺細胞に対する各
ハイブリド−マコロニ−の培養上清の反応性をフロ−サ
イトメ−タ−により測定し、抗ヒトＦａｓモノクロ−ナ
ル抗体を産生しているハイブリド−マＣＨ１１（Ｉｇ
Ｍ）を取得した。 ［１−２］可変領域プライマーの作製 ハイブリドーマＣＨ１１によって産生されるモノクロー
ナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変部位（以下ＶH 及びＶL
とする）をコ−ドする遺伝子をクローニングするための
ミックスセンスプライマーと、ミックスアンチセンスプ
ライマーを、Ｋａｂａｔらの報告（"Sequences of Prot
eins of IMMUNOLOGICAL INTEREST" , Kabat et al. ,
Health service National insutitute of Health (199
1) ）を参考にしてＤＮＡシンセサイザー（パ−キンエ
ルマー社製）を用いて作製した。それぞれの塩基配列を
下記表１に示すと共に、配列表の配列番号９〜１２にも
示した。
を産生しているハイブリド−マをスクリ−ニングするた
め、Ｆａｓ抗原を発現しているヒト胸腺細胞に対する各
ハイブリド−マコロニ−の培養上清の反応性をフロ−サ
イトメ−タ−により測定し、抗ヒトＦａｓモノクロ−ナ
ル抗体を産生しているハイブリド−マＣＨ１１（Ｉｇ
Ｍ）を取得した。 ［１−２］可変領域プライマーの作製 ハイブリドーマＣＨ１１によって産生されるモノクロー
ナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変部位（以下ＶH 及びＶL
とする）をコ−ドする遺伝子をクローニングするための
ミックスセンスプライマーと、ミックスアンチセンスプ
ライマーを、Ｋａｂａｔらの報告（"Sequences of Prot
eins of IMMUNOLOGICAL INTEREST" , Kabat et al. ,
Health service National insutitute of Health (199
1) ）を参考にしてＤＮＡシンセサイザー（パ−キンエ
ルマー社製）を用いて作製した。それぞれの塩基配列を
下記表１に示すと共に、配列表の配列番号９〜１２にも
示した。
【００３０】
【表１】
【００３１】尚、表１において、ＲはＡ又はＧであり、
ＳはＧ又はＣであり、ＭはＡ又はＣであり、ＫはＧ又は
Ｔであり、ＷはＡ又はＴであり、ＨはＡ又はＣ又はＴで
あり、ＢはＣ又はＧ又はＴであり、ＹはＣ又はＴであ
る。 ［１−３］可変領域遺伝子のＰＣＲ増幅 次に、このプライマーを用いて、抗ヒトＦａｓマウスモ
ノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子をポリメラ
ーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）により増幅し
た。即ち、上記［１−１］で作製したｃＤＮＡ溶液３μ
ｌに、上記［１−２］で作製したプライマーの２０μＭ
溶液５μｌ、２０ｍＭのｄ−ＮＴＰ１μｌ及びＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）１μｌに１０倍
濃度ＰＣＲバッファー１０μｌ及び精製水７５μｌを加
えて全体を１００μｌとし、ＤＮＡサイクラー（ＭＪリ
サーチ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４℃
１分、５５℃２分、７２℃２分を１サイクルとし、３０
サイクルを行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロ−
スゲルにて電気泳動し、それぞれ約３００ｂｐの産物を
確認し、ゲルより回収した。 ［１−４］ｐＵＣ１９への組み込み 上記で回収したＶH 、ＶL のＰＣＲ産物を、常法により
プラスミドｐＵＣ１９のＳｍａＩサイトに組み込み、そ
れぞれをｐＵＣ−ＶH 、ｐＵＣ−ＶL と命名した。尚、
ｐＵＣ１９の制限酵素地図を図１に示した（図１中、数
字は、５’…ＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴ…３’の最初のＴを
１として、その位置から制限酵素の切断部位までの数を
表した。（ ）内の数字は、その制限酵素の切断数を示
した）。 ［１−５］ＤＮＡ配列の分析 上記［１−４］で作製したｐＵＣ−ＶH 、ｐＵＣ−ＶL
について、ジデオキシ法（プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス[Proc.Nat
l..Acad.Sci.USA]第７４巻、５４６３頁（１９７７
年））によりＤＮＡ配列を確認した。これらプラスミド
に含まれるＤＮＡの塩基配列を、それぞれ配列表の配列
番号１及び配列番号２に示した。尚、各ＤＮＡがコード
するアミノ酸配列は、一義的に配列番号３及び配列番号
４のアミノ酸配列となる。 ［実施例２］ヒト免疫グロブリンの定常領域をコードす
るＤＮＡを有するプラスミド ［２−１］ヒト免疫グロブリンｃＤＮＡの合成 次にヒトＩｇＧの定常領域をクローニングするため、ヒ
ト末梢血リンパ球を調製し、一本鎖ｃＤＮＡを合成し
た。即ち、ヒト血液３０ｍｌを０．９％ＮａＣｌで２倍
に希釈し、３ｍｌのリンホプレップ（ニコメッド社製）
を分注した遠心管に希釈血液６ｍｌを重層し、８００Ｇ
で２０分間遠心し、分離したリンパ球層を集め、０．９
％ＮａＣｌで洗浄した。このリンパ球１×１０7 個よ
り、上記［１−１］と同様に一本鎖ｃＤＮＡを合成し
た。 ［２−２］定常領域プライマーの合成 ヒト免疫グロブリンとのキメラ抗体を作製するため、ヒ
ト免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の定常領域（以下ＣH
及びＣL とする）をコードする遺伝子をクローニングす
るためのセンスプライマー及びアンチセンスプライマー
を上記［１−２］と同様に合成した。このプライマーの
塩基配列を表２に示すと共に、配列表の配列番号１３〜
１６にも示した。
ＳはＧ又はＣであり、ＭはＡ又はＣであり、ＫはＧ又は
Ｔであり、ＷはＡ又はＴであり、ＨはＡ又はＣ又はＴで
あり、ＢはＣ又はＧ又はＴであり、ＹはＣ又はＴであ
る。 ［１−３］可変領域遺伝子のＰＣＲ増幅 次に、このプライマーを用いて、抗ヒトＦａｓマウスモ
ノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子をポリメラ
ーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）により増幅し
た。即ち、上記［１−１］で作製したｃＤＮＡ溶液３μ
ｌに、上記［１−２］で作製したプライマーの２０μＭ
溶液５μｌ、２０ｍＭのｄ−ＮＴＰ１μｌ及びＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）１μｌに１０倍
濃度ＰＣＲバッファー１０μｌ及び精製水７５μｌを加
えて全体を１００μｌとし、ＤＮＡサイクラー（ＭＪリ
サーチ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４℃
１分、５５℃２分、７２℃２分を１サイクルとし、３０
サイクルを行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロ−
スゲルにて電気泳動し、それぞれ約３００ｂｐの産物を
確認し、ゲルより回収した。 ［１−４］ｐＵＣ１９への組み込み 上記で回収したＶH 、ＶL のＰＣＲ産物を、常法により
プラスミドｐＵＣ１９のＳｍａＩサイトに組み込み、そ
れぞれをｐＵＣ−ＶH 、ｐＵＣ−ＶL と命名した。尚、
ｐＵＣ１９の制限酵素地図を図１に示した（図１中、数
字は、５’…ＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴ…３’の最初のＴを
１として、その位置から制限酵素の切断部位までの数を
表した。（ ）内の数字は、その制限酵素の切断数を示
した）。 ［１−５］ＤＮＡ配列の分析 上記［１−４］で作製したｐＵＣ−ＶH 、ｐＵＣ−ＶL
について、ジデオキシ法（プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス[Proc.Nat
l..Acad.Sci.USA]第７４巻、５４６３頁（１９７７
年））によりＤＮＡ配列を確認した。これらプラスミド
に含まれるＤＮＡの塩基配列を、それぞれ配列表の配列
番号１及び配列番号２に示した。尚、各ＤＮＡがコード
するアミノ酸配列は、一義的に配列番号３及び配列番号
４のアミノ酸配列となる。 ［実施例２］ヒト免疫グロブリンの定常領域をコードす
るＤＮＡを有するプラスミド ［２−１］ヒト免疫グロブリンｃＤＮＡの合成 次にヒトＩｇＧの定常領域をクローニングするため、ヒ
ト末梢血リンパ球を調製し、一本鎖ｃＤＮＡを合成し
た。即ち、ヒト血液３０ｍｌを０．９％ＮａＣｌで２倍
に希釈し、３ｍｌのリンホプレップ（ニコメッド社製）
を分注した遠心管に希釈血液６ｍｌを重層し、８００Ｇ
で２０分間遠心し、分離したリンパ球層を集め、０．９
％ＮａＣｌで洗浄した。このリンパ球１×１０7 個よ
り、上記［１−１］と同様に一本鎖ｃＤＮＡを合成し
た。 ［２−２］定常領域プライマーの合成 ヒト免疫グロブリンとのキメラ抗体を作製するため、ヒ
ト免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の定常領域（以下ＣH
及びＣL とする）をコードする遺伝子をクローニングす
るためのセンスプライマー及びアンチセンスプライマー
を上記［１−２］と同様に合成した。このプライマーの
塩基配列を表２に示すと共に、配列表の配列番号１３〜
１６にも示した。
【００３２】
【表２】
【００３３】［２−３］プラスミドｐＵＣ１９への組み
込み 上記［１−３］と同様に操作して上記のプライマーを用
いてＰＣＲを行いヒト免疫グロブリンＩｇＧ２の定常領
域をコードする遺伝子を増幅させた後、上記［１−４］
と同様に電気泳動し、軽鎖に対応する約３００ｂｐの産
物及び重鎖に対応する約１Ｋｂｐの産物を回収し、ｐＵ
Ｃ１９プラスミドのＳｍａＩサイトにクローニングし、
ジデオキシ法によりＤＮＡの配列がＣH 及びＣL をコー
ドするＤＮＡ配列（公知）であることを確認した。
込み 上記［１−３］と同様に操作して上記のプライマーを用
いてＰＣＲを行いヒト免疫グロブリンＩｇＧ２の定常領
域をコードする遺伝子を増幅させた後、上記［１−４］
と同様に電気泳動し、軽鎖に対応する約３００ｂｐの産
物及び重鎖に対応する約１Ｋｂｐの産物を回収し、ｐＵ
Ｃ１９プラスミドのＳｍａＩサイトにクローニングし、
ジデオキシ法によりＤＮＡの配列がＣH 及びＣL をコー
ドするＤＮＡ配列（公知）であることを確認した。
【００３４】これらプラスミドをｐＵＣ−ＣL 、ｐＵＣ
−ＣH と命名した。 ［実施例３］抗ヒトＦａｓマウスモノクローナル抗体の
可変領域とヒトＩｇＧの定常領域を組み合わせたキメラ
モノクローナル抗体（以下、ヒト型抗体という） ［３−１］発現ベクタ−の構築 クローニングしたＶH 、ＶL 、ＣH 及びＣL を哺乳動物
の発現ベクタ−であるｐＲＥＰ４及びｐＲＥＰ９（イン
ビトロゲン社製）に組み込むため、ｐＵＣ−ＶH 、ｐＵ
Ｃ−ＶL 、ｐＵＣ−ＣL 、ｐＵＣ−ＣH のそれぞれを鋳
型として表３に示すプライマーを用いてＰｆｕポリメラ
ーゼ（トーヨーボー社製）を用いてＰＣＲを行った。Ｐ
ＣＲは上記［１−３］と同様に行った。ここで、ＶH５
およびＶL５プライマーは、ＡＴＧコドンとＨｉｎｄＩ
ＩＩサイトを含み、ＣH３およびＣL３プライマーはスト
ップコドンとＢａｍＨＩサイトを含む。なお、各プライ
マーの塩基配列は配列表の配列番号１７〜２４にも示し
た。
−ＣH と命名した。 ［実施例３］抗ヒトＦａｓマウスモノクローナル抗体の
可変領域とヒトＩｇＧの定常領域を組み合わせたキメラ
モノクローナル抗体（以下、ヒト型抗体という） ［３−１］発現ベクタ−の構築 クローニングしたＶH 、ＶL 、ＣH 及びＣL を哺乳動物
の発現ベクタ−であるｐＲＥＰ４及びｐＲＥＰ９（イン
ビトロゲン社製）に組み込むため、ｐＵＣ−ＶH 、ｐＵ
Ｃ−ＶL 、ｐＵＣ−ＣL 、ｐＵＣ−ＣH のそれぞれを鋳
型として表３に示すプライマーを用いてＰｆｕポリメラ
ーゼ（トーヨーボー社製）を用いてＰＣＲを行った。Ｐ
ＣＲは上記［１−３］と同様に行った。ここで、ＶH５
およびＶL５プライマーは、ＡＴＧコドンとＨｉｎｄＩ
ＩＩサイトを含み、ＣH３およびＣL３プライマーはスト
ップコドンとＢａｍＨＩサイトを含む。なお、各プライ
マーの塩基配列は配列表の配列番号１７〜２４にも示し
た。
【００３５】
【表３】
【００３６】これらの増幅したフラグメントをそれぞれ
対応する制限酵素で処理した後、Ｔ４ＤＮＡライゲース
（バイオラッド社製）を用いてＶH とＣH 、ＶL とＣL
をそれぞれライゲーションし、ｐＲＥＰ４およびｐＲＥ
Ｐ９ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩサイトに組
み込み、これらプラスミドをそれぞれｐＲＥＰ４−Ｈ、
ｐＲＥＰ９−Ｌと命名した。
対応する制限酵素で処理した後、Ｔ４ＤＮＡライゲース
（バイオラッド社製）を用いてＶH とＣH 、ＶL とＣL
をそれぞれライゲーションし、ｐＲＥＰ４およびｐＲＥ
Ｐ９ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩサイトに組
み込み、これらプラスミドをそれぞれｐＲＥＰ４−Ｈ、
ｐＲＥＰ９−Ｌと命名した。
【００３７】尚、ｐＲＥＰ４及びｐＲＥＰ９の制限酵素
地図をそれぞれ図２及び図３に示した。 ［３−２］発現ベクターのマウスミエローマ細胞への導
入 ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで培養したマウスミエローマ細
胞Ｓｐ−２／ｏ−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ（アメリカン タ
イプ カルチャー コレクション）コード：ＣＲＬ１５
８１；Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｎｒｉｎｎｏｎ−ｓｅｃｒｅ
ｔｉｎｇ）に、Ｍａｍｍａｌｉａｎトランスフェクショ
ンキット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて同時に
ｐＲＥＰ４−ＨおよびｐＲＥＰ９−ＬをＤＥＡＥ−デキ
ストラン法（McCutchan J.H. and Pagano J.G., 1968,
J.Natl. Cancer Inst. 41, 351-356）でトランスフェク
ションし、９６穴滅菌プレ−トに薬剤（ネオマイシン７
５０μｇ／ｍｌ、ハイグロマイシン５００μｇ／ｍｌ）
を含むＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで限界希釈して培養し、
薬剤耐性株をスクリ−ニングした。 ［３−３］ヒト型抗体の精製 ヒト型抗体は、薬剤耐性を示した細胞を大量培養した
後、遠心によって集め、２％Ｔｒｉｔｏｎ−１００／２
５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に
溶解した後、超音波処理し、さらに遠心した上清を０．
２２μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、
ＰＢＳ（生理的リン酸緩衝液）に透析し、ＰＢＳ／０．
１５Ｍ ＮａＣｌで平衡化したプロテインＧセファロー
ス４ＦＦ（ファルマシア社製）を充填したカラムに通し
た後、カラムをＰＢＳで洗浄し、カラムに結合した抗体
を０．１７Ｍグリシン（ｐＨ２．３）で溶出し、抗体分
画を集めＰＢＳに透析した。 ［実施例４］キメラ抗体（ヒト型抗体）の性質 ヒトＦａｓ抗原過剰発現形質転換細胞ＷＲ１９Ｌ１２ａ
（創製法についてはセル（cell）第６６巻、第２３３〜
２４３頁（１９９１年）における報告を参照）を培養
し、この細胞の抽出液を抗原としてＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行い、ナイロンメンブレンにブロッティングした。これ
に１μｇ／ｍｌのヒト型抗体（実施例３で得たもの）を
反応させ、室温で１時間インキュベートした後、ペルオ
キシダーゼ標識抗ヒトＦｃ抗体（（株）医学生物学研究
所製）を用いて可視化し、分子量を確認した。その結
果、図４に示すとおり、Ｆａｓ抗原の分子量約４５ｋＤ
の位置に１本のバンドを確認した。
地図をそれぞれ図２及び図３に示した。 ［３−２］発現ベクターのマウスミエローマ細胞への導
入 ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで培養したマウスミエローマ細
胞Ｓｐ−２／ｏ−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ（アメリカン タ
イプ カルチャー コレクション）コード：ＣＲＬ１５
８１；Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｎｒｉｎｎｏｎ−ｓｅｃｒｅ
ｔｉｎｇ）に、Ｍａｍｍａｌｉａｎトランスフェクショ
ンキット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて同時に
ｐＲＥＰ４−ＨおよびｐＲＥＰ９−ＬをＤＥＡＥ−デキ
ストラン法（McCutchan J.H. and Pagano J.G., 1968,
J.Natl. Cancer Inst. 41, 351-356）でトランスフェク
ションし、９６穴滅菌プレ−トに薬剤（ネオマイシン７
５０μｇ／ｍｌ、ハイグロマイシン５００μｇ／ｍｌ）
を含むＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで限界希釈して培養し、
薬剤耐性株をスクリ−ニングした。 ［３−３］ヒト型抗体の精製 ヒト型抗体は、薬剤耐性を示した細胞を大量培養した
後、遠心によって集め、２％Ｔｒｉｔｏｎ−１００／２
５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に
溶解した後、超音波処理し、さらに遠心した上清を０．
２２μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、
ＰＢＳ（生理的リン酸緩衝液）に透析し、ＰＢＳ／０．
１５Ｍ ＮａＣｌで平衡化したプロテインＧセファロー
ス４ＦＦ（ファルマシア社製）を充填したカラムに通し
た後、カラムをＰＢＳで洗浄し、カラムに結合した抗体
を０．１７Ｍグリシン（ｐＨ２．３）で溶出し、抗体分
画を集めＰＢＳに透析した。 ［実施例４］キメラ抗体（ヒト型抗体）の性質 ヒトＦａｓ抗原過剰発現形質転換細胞ＷＲ１９Ｌ１２ａ
（創製法についてはセル（cell）第６６巻、第２３３〜
２４３頁（１９９１年）における報告を参照）を培養
し、この細胞の抽出液を抗原としてＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行い、ナイロンメンブレンにブロッティングした。これ
に１μｇ／ｍｌのヒト型抗体（実施例３で得たもの）を
反応させ、室温で１時間インキュベートした後、ペルオ
キシダーゼ標識抗ヒトＦｃ抗体（（株）医学生物学研究
所製）を用いて可視化し、分子量を確認した。その結
果、図４に示すとおり、Ｆａｓ抗原の分子量約４５ｋＤ
の位置に１本のバンドを確認した。
【００３８】次に、上記ＷＲ１９Ｌ１２ａと、コントロ
ールとしてのＷＲ１９Ｌ細胞（Ｍｏｕｓｅｌｙｍｐｈｏ
ｍａ，ＡＴＣＣコード；ＴＩＢ−５２）を用いて細胞の
アポトーシス実験を行った。ヒト型抗体と、コントロー
ルとしてのマウスＣＨ１１抗体をそれぞれＲＰＭＩ／１
０％ＦＣＳで４μｇ／ｍｌの濃度に希釈して作用させ、
約１２時間後に生細胞を数えたところ、ＷＲ１９Ｌ細胞
においては実施例３で得たヒト型抗体、マウスＣＨ１１
抗体ともアポトーシスは認められなかったのに対し、Ｗ
Ｒ１９Ｌ１２ａ細胞ではどちらにおいてもアポトーシス
を起こしていることが確認された。
ールとしてのＷＲ１９Ｌ細胞（Ｍｏｕｓｅｌｙｍｐｈｏ
ｍａ，ＡＴＣＣコード；ＴＩＢ−５２）を用いて細胞の
アポトーシス実験を行った。ヒト型抗体と、コントロー
ルとしてのマウスＣＨ１１抗体をそれぞれＲＰＭＩ／１
０％ＦＣＳで４μｇ／ｍｌの濃度に希釈して作用させ、
約１２時間後に生細胞を数えたところ、ＷＲ１９Ｌ細胞
においては実施例３で得たヒト型抗体、マウスＣＨ１１
抗体ともアポトーシスは認められなかったのに対し、Ｗ
Ｒ１９Ｌ１２ａ細胞ではどちらにおいてもアポトーシス
を起こしていることが確認された。
【００３９】この結果、実施例３で得たヒト型抗体は、
マウスＣＨ１１抗体と同様、ヒトＦａｓ抗原過剰発現形
質転換細胞ＷＲ１９Ｌ１２ａに対してアポトーシスを誘
導する作用を有することが分かった。また、マウスＣＨ
１１抗体は異種動物によって産生されたタンパク質であ
るため、ヒトに投与した場合にはヒト蛋白と区別されて
ヒトの循環系から排除されるか、アレルギー反応を引き
起こすおそれがあるが、ヒト型抗体ではこのようなおそ
れがないため、自己免疫疾患の治療剤として有望視され
る。 ［実施例５］抗ヒトＦａｓマウスモノクローナル抗体ｃ
ＤＮＡの調製 上記実施例１の［１−４］で得られたプラスミドｐＵＣ
−ＶH 、ｐＵＣ−ＶLに含まれるＤＮＡの塩基配列（配
列表の配列番号１、２参照）は、［１−２］で作製した
ミックスセンスプライマーとミックスアンチセンスプラ
イマーを用いて［１−３］でＰＣＲを行うことにより得
られたものである。ミックスセンスプライマー及びミッ
クスアンチセンスプライマーは、プライマー部分の配列
が特定できないために、いくつかの可能性のあるものを
混合してプライマーとして用いるものであり、本来の配
列と若干異なる配列が混合したものである。これらのプ
ライマーは本来の配列と似ているため、若干配列の異な
るものでもプライマーとしてｃＤＮＡの伸長に用いるこ
とができるが、これにより得られたＤＮＡの塩基配列は
真の配列とは若干異なることがある。
マウスＣＨ１１抗体と同様、ヒトＦａｓ抗原過剰発現形
質転換細胞ＷＲ１９Ｌ１２ａに対してアポトーシスを誘
導する作用を有することが分かった。また、マウスＣＨ
１１抗体は異種動物によって産生されたタンパク質であ
るため、ヒトに投与した場合にはヒト蛋白と区別されて
ヒトの循環系から排除されるか、アレルギー反応を引き
起こすおそれがあるが、ヒト型抗体ではこのようなおそ
れがないため、自己免疫疾患の治療剤として有望視され
る。 ［実施例５］抗ヒトＦａｓマウスモノクローナル抗体ｃ
ＤＮＡの調製 上記実施例１の［１−４］で得られたプラスミドｐＵＣ
−ＶH 、ｐＵＣ−ＶLに含まれるＤＮＡの塩基配列（配
列表の配列番号１、２参照）は、［１−２］で作製した
ミックスセンスプライマーとミックスアンチセンスプラ
イマーを用いて［１−３］でＰＣＲを行うことにより得
られたものである。ミックスセンスプライマー及びミッ
クスアンチセンスプライマーは、プライマー部分の配列
が特定できないために、いくつかの可能性のあるものを
混合してプライマーとして用いるものであり、本来の配
列と若干異なる配列が混合したものである。これらのプ
ライマーは本来の配列と似ているため、若干配列の異な
るものでもプライマーとしてｃＤＮＡの伸長に用いるこ
とができるが、これにより得られたＤＮＡの塩基配列は
真の配列とは若干異なることがある。
【００４０】この実施例５では、抗Ｆａｓ抗体の可変領
域をコードするＤＮＡの真の塩基配列を追究すべく行っ
たものであり、［１−４］で得られたプラスミドｐＵＣ
ーＶH 、ｐＵＣ−ＶL に含まれるＤＮＡをプローブとし
て、ｃＤＮＡライブラリー中から真の塩基配列を有する
ＤＮＡを釣り上げ、その塩基配列を明らかにした。その
実験手順を以下に示す。
域をコードするＤＮＡの真の塩基配列を追究すべく行っ
たものであり、［１−４］で得られたプラスミドｐＵＣ
ーＶH 、ｐＵＣ−ＶL に含まれるＤＮＡをプローブとし
て、ｃＤＮＡライブラリー中から真の塩基配列を有する
ＤＮＡを釣り上げ、その塩基配列を明らかにした。その
実験手順を以下に示す。
【００４１】前述のハイブリドーマＣＨ１１をＤＭＥＭ
／１０％ＦＣＳで培養し、細胞数１×１０7 個よりQuic
k Prep m-RNA Purification Kit（ファルマシア社製）
を用いてｐｏｌｕ ＲＮＡを調製した。そのｍＲＮＡ５
μｇより、ZAP cDNA合成キット（ストラタジン社製）を
用いてファースト・ストランド・ｃＤＮＡを合成し、次
にセカンド・ストランド・ｃ−ＤＮＡを合成し、さらに
リンカー（ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏ−Ｉサイトを持つ）をラ
イゲーションし、そのｃＤＮＡをZAP cDNA合成キット中
のＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターのＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏ
−Ｉサイトに組み込んだ。つぎにZAP cDNA Gigapack II
I Gold Cloning Kit（ストラタジン社製）を用いてＶＣ
ＭＧ１３ファージにパッケージングし、ｃＤＮＡライブ
ラリーを作製した。
／１０％ＦＣＳで培養し、細胞数１×１０7 個よりQuic
k Prep m-RNA Purification Kit（ファルマシア社製）
を用いてｐｏｌｕ ＲＮＡを調製した。そのｍＲＮＡ５
μｇより、ZAP cDNA合成キット（ストラタジン社製）を
用いてファースト・ストランド・ｃＤＮＡを合成し、次
にセカンド・ストランド・ｃ−ＤＮＡを合成し、さらに
リンカー（ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏ−Ｉサイトを持つ）をラ
イゲーションし、そのｃＤＮＡをZAP cDNA合成キット中
のＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターのＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏ
−Ｉサイトに組み込んだ。つぎにZAP cDNA Gigapack II
I Gold Cloning Kit（ストラタジン社製）を用いてＶＣ
ＭＧ１３ファージにパッケージングし、ｃＤＮＡライブ
ラリーを作製した。
【００４２】そのファージをキット中のＥ．ｃｏｌｉ／
ＸＬ−Ｉ ｂｌｕｅに感染させ、培地上でプラークを形
成させた。その上にＨｙｂｏｎｄ−Ｍ＋ メンブレン
（アマシャム社）をのせ、プラークをメンブレンに転写
させた後、メンブレンを１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ
ＮａＯＨに２分、次に１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で５分、０．２Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／２×ＳＳＣで３０秒間
洗浄し、風乾させた。次にECL direct nucleicacid lab
elling and detection system（アマシャム社製）を用
いて、実施例１の「１−４］で得られたｐＵＣ−ＶH 、
ｐＵＣ−ＶL をプローブとしてラベルし、メンブレンと
インキュベートしてハイブリダイゼーションを行った
後、メンブレンを洗浄した。
ＸＬ−Ｉ ｂｌｕｅに感染させ、培地上でプラークを形
成させた。その上にＨｙｂｏｎｄ−Ｍ＋ メンブレン
（アマシャム社）をのせ、プラークをメンブレンに転写
させた後、メンブレンを１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ
ＮａＯＨに２分、次に１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で５分、０．２Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／２×ＳＳＣで３０秒間
洗浄し、風乾させた。次にECL direct nucleicacid lab
elling and detection system（アマシャム社製）を用
いて、実施例１の「１−４］で得られたｐＵＣ−ＶH 、
ｐＵＣ−ＶL をプローブとしてラベルし、メンブレンと
インキュベートしてハイブリダイゼーションを行った
後、メンブレンを洗浄した。
【００４３】次に、そのメンブレンをHyper-film ECL
（アマシャム社製）に密着させ５分間感光させた。その
フィルムをもとに培地よりポジティブプラークを単離し
た。その後、Uni-ZAP XR Vector Cloning Kit（ストラ
タジン社製）を用いて、ポジティブファージをＥ．ｃｏ
ｌｉ／ＳＯＬＲ ｓｔｒａｉｎに感染させ、ファージ中
のＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲ ＤＮＡから、ファージミドを
切り出させた。
（アマシャム社製）に密着させ５分間感光させた。その
フィルムをもとに培地よりポジティブプラークを単離し
た。その後、Uni-ZAP XR Vector Cloning Kit（ストラ
タジン社製）を用いて、ポジティブファージをＥ．ｃｏ
ｌｉ／ＳＯＬＲ ｓｔｒａｉｎに感染させ、ファージ中
のＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲ ＤＮＡから、ファージミドを
切り出させた。
【００４４】次に、Ｅ．ｃｏｌｉ／ＳＯＬＲ ｓｔｒａ
ｉｎ からファージミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法によ
り精製した。このファージミドＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ−ＶH 、ＶL と名付け、ジデオキシ法により配
列を確認した。これらの塩基配列を、それぞれ配列表の
配列番号５及び６に示した。尚、各ＤＮＡがコードする
アミノ酸配列は、一義的に配列番号７及び配列番号８の
アミノ酸配列となる。 ［実施例６］ヒト型抗体−実施例３の別の実施例 ［６−１］発現ベクターの構築 上記で得られたプラスミドを、ほ乳動物細胞発現ベクタ
ーであるＢＣＭＧＳｎｅｏ（図５参照、Karasuyama,H.,
Kudo,A., Melchers,F.:J.Exp.Med., 172:969-972(199
0)）に組み込むため、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＶH 及
びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＶL と、ｐＵＣ−ＣH 及び
ｐＵＣ−ＣL をそれぞれ鋳型とし、表４に示すＮＶ
H５、ＮＶL５プライマー及びＮＣH３、ＮＣL３プライマ
ーを用い、ＰｆｕポリメラーゼによりＰＣＲを行った。
ここで、ＮＶH５、ＮＶL５プライマーはＡＴＧコドン
（表４にて網掛で表示）とＸｈｏＩサイト（表４にて下
線で表示）を含み、ＮＣH３、ＮＣL３プライマーはＳｔ
ｏｐコドン（表４にて網掛で表示）とＮｏｔＩサイト
（表４にて下線で表示）を含む。なお、各プライマーの
塩基配列は配列表の配列番号２５〜３２にも示した。
ｉｎ からファージミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法によ
り精製した。このファージミドＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ−ＶH 、ＶL と名付け、ジデオキシ法により配
列を確認した。これらの塩基配列を、それぞれ配列表の
配列番号５及び６に示した。尚、各ＤＮＡがコードする
アミノ酸配列は、一義的に配列番号７及び配列番号８の
アミノ酸配列となる。 ［実施例６］ヒト型抗体−実施例３の別の実施例 ［６−１］発現ベクターの構築 上記で得られたプラスミドを、ほ乳動物細胞発現ベクタ
ーであるＢＣＭＧＳｎｅｏ（図５参照、Karasuyama,H.,
Kudo,A., Melchers,F.:J.Exp.Med., 172:969-972(199
0)）に組み込むため、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＶH 及
びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＶL と、ｐＵＣ−ＣH 及び
ｐＵＣ−ＣL をそれぞれ鋳型とし、表４に示すＮＶ
H５、ＮＶL５プライマー及びＮＣH３、ＮＣL３プライマ
ーを用い、ＰｆｕポリメラーゼによりＰＣＲを行った。
ここで、ＮＶH５、ＮＶL５プライマーはＡＴＧコドン
（表４にて網掛で表示）とＸｈｏＩサイト（表４にて下
線で表示）を含み、ＮＣH３、ＮＣL３プライマーはＳｔ
ｏｐコドン（表４にて網掛で表示）とＮｏｔＩサイト
（表４にて下線で表示）を含む。なお、各プライマーの
塩基配列は配列表の配列番号２５〜３２にも示した。
【００４５】
【表４】
【００４６】なお、図５中、ＣＭＶP はサイトメガロウ
イルスプロモータ、ｐｏｌｙ（Ａ）はポリ（Ａ）付加シ
グナル、Ｉｎｔｒｏｎはスプライシング用イントロン、
ＮｅｏR はネオマイシン耐性遺伝子、ＡｍｐR はアンピ
シリン耐性遺伝子、ｏｒｉは複製起点を表す。
イルスプロモータ、ｐｏｌｙ（Ａ）はポリ（Ａ）付加シ
グナル、Ｉｎｔｒｏｎはスプライシング用イントロン、
ＮｅｏR はネオマイシン耐性遺伝子、ＡｍｐR はアンピ
シリン耐性遺伝子、ｏｒｉは複製起点を表す。
【００４７】ＰＣＲは鋳型ＤＮＡのｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ−ＶHに対してはプライマーＮＶH５とＮＶH３を用
い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＶLに対してはプライマ
ーＮＶL５とＮＶL３を用い、ｐＵＣ−ＣHに対してはプ
ライマーＮＣH５とＮＣH３を用い、ｐＵＣ−ＣLに対し
てはプライマーＮＣL５とＮＣL３を用いた。それぞれの
フラグメントを電気泳動で確認し精製した後、これらの
フラグメントをそれぞれＴ４キナーゼ（ニューイングラ
ンドバイオラブ社：ＮＥＢ）を用いてリン酸化し、それ
ぞれ制限酵素処理した後、Ｔ４ＤＮＡライゲース（ＮＥ
Ｂ）を用いてＮＶLとＮＣL、ＮＶHとＮＣHをそれぞれラ
イゲーションし、ＢＣＭＧＳｎｅｏベクターのＸｈｏＩ
サイト、ＮｏｔＩサイトに組み込み、それらプラスミド
をＢＣＭＧ−Ｈ、ＢＣＭＧ−Ｌと命名した。
ｐｔ−ＶHに対してはプライマーＮＶH５とＮＶH３を用
い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＶLに対してはプライマ
ーＮＶL５とＮＶL３を用い、ｐＵＣ−ＣHに対してはプ
ライマーＮＣH５とＮＣH３を用い、ｐＵＣ−ＣLに対し
てはプライマーＮＣL５とＮＣL３を用いた。それぞれの
フラグメントを電気泳動で確認し精製した後、これらの
フラグメントをそれぞれＴ４キナーゼ（ニューイングラ
ンドバイオラブ社：ＮＥＢ）を用いてリン酸化し、それ
ぞれ制限酵素処理した後、Ｔ４ＤＮＡライゲース（ＮＥ
Ｂ）を用いてＮＶLとＮＣL、ＮＶHとＮＣHをそれぞれラ
イゲーションし、ＢＣＭＧＳｎｅｏベクターのＸｈｏＩ
サイト、ＮｏｔＩサイトに組み込み、それらプラスミド
をＢＣＭＧ−Ｈ、ＢＣＭＧ−Ｌと命名した。
【００４８】［６−２］キメラ抗体発現ベクターのトラ
ンスフェクション チャイニーズハムスターの卵巣由来細胞ＣＨＯを３５ｍ
ｍ培養皿でＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで５０％コンフルー
エントの状態のままで培養した後、ＤＭＥＭで２回洗浄
し、ＣＨＯ−ＳＦＭ培地（無血清培地、ＧＩＢＣＯ社）
３ｍｌを加えた。同時に精製したＢＣＭＧ−Ｈ、ＢＣＭ
Ｇ−ＬプラスミドＤＮＡ各３μｇと、リポフェクチン
（宝酒造）１２μｌ、ＣＨＯ−ＳＦＭ培地１００μｌを
室温で１５分間インキュベートし、リポフェクチン−Ｄ
ＮＡコンプレックスを形成させた。このリポフェクチン
−ＤＮＡ溶液をＣＨＯに加え、約４時間培養した。その
後培地をネオマイシン５００μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ
／１０％ＦＣＳに替え、約１週間培養し、薬剤耐性株を
スクリーニングした。
ンスフェクション チャイニーズハムスターの卵巣由来細胞ＣＨＯを３５ｍ
ｍ培養皿でＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで５０％コンフルー
エントの状態のままで培養した後、ＤＭＥＭで２回洗浄
し、ＣＨＯ−ＳＦＭ培地（無血清培地、ＧＩＢＣＯ社）
３ｍｌを加えた。同時に精製したＢＣＭＧ−Ｈ、ＢＣＭ
Ｇ−ＬプラスミドＤＮＡ各３μｇと、リポフェクチン
（宝酒造）１２μｌ、ＣＨＯ−ＳＦＭ培地１００μｌを
室温で１５分間インキュベートし、リポフェクチン−Ｄ
ＮＡコンプレックスを形成させた。このリポフェクチン
−ＤＮＡ溶液をＣＨＯに加え、約４時間培養した。その
後培地をネオマイシン５００μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ
／１０％ＦＣＳに替え、約１週間培養し、薬剤耐性株を
スクリーニングした。
【００４９】［６−３］キメラ抗体（ヒト型抗体）の検
出 耐性株（以下「キメラ細胞」とする）を培養した培養上
清１５μｌに３倍濃縮サンプルバッファー５μｌを加
え、１２．５％アクリルアミドゲルで電気泳動した後、
メンブレンにブロッティングし、そのメンブレンを１０
μｇ／ｍｌの抗ヒトκ軽鎖抗体（（株）医学生物学研究
所）又は抗ヒトγ重鎖抗体（（株）医学生物学研究所）
と反応させた後、ペルオキシダーゼ標識二次抗体（抗ヤ
ギイムノグロブリン）と反応させ、発色基質を加えメン
ブレンを発色させたところ、図６に示すように、約３０
Ｋｄの位置に軽鎖、約５０Ｋｄの位置に重鎖と思われる
バンドが検出された。なお、図６において、Ｍは分子量
マーカー、ＮＨＳは正常ヒト血清、１〜７はＨ鎖ベクタ
ー、Ｌ鎖ベクターともトランスフェクトしたクローン、
Ｌ１，Ｌ２はＬ鎖ベクターのみトランスフェクトしたク
ローン、Ｈ１，Ｈ２はＨ鎖ベクターのみトランスフェク
トしたクローンを示す。
出 耐性株（以下「キメラ細胞」とする）を培養した培養上
清１５μｌに３倍濃縮サンプルバッファー５μｌを加
え、１２．５％アクリルアミドゲルで電気泳動した後、
メンブレンにブロッティングし、そのメンブレンを１０
μｇ／ｍｌの抗ヒトκ軽鎖抗体（（株）医学生物学研究
所）又は抗ヒトγ重鎖抗体（（株）医学生物学研究所）
と反応させた後、ペルオキシダーゼ標識二次抗体（抗ヤ
ギイムノグロブリン）と反応させ、発色基質を加えメン
ブレンを発色させたところ、図６に示すように、約３０
Ｋｄの位置に軽鎖、約５０Ｋｄの位置に重鎖と思われる
バンドが検出された。なお、図６において、Ｍは分子量
マーカー、ＮＨＳは正常ヒト血清、１〜７はＨ鎖ベクタ
ー、Ｌ鎖ベクターともトランスフェクトしたクローン、
Ｌ１，Ｌ２はＬ鎖ベクターのみトランスフェクトしたク
ローン、Ｈ１，Ｈ２はＨ鎖ベクターのみトランスフェク
トしたクローンを示す。
【００５０】［実施例７］キメラ抗体（ヒト型抗体）の
性質 キメラ細胞をＣＨＯ−ＳＦＭ培地で約５日間培養した培
養上清を限外ろ過器で１０文の１に濃縮し、Ｆａｓ発現
細胞であるＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞とコントロールとして
のＷＲ１９Ｌ細胞（Ｆａｓ非発現細胞）を用いてフロー
サイトメトリーを行った。
性質 キメラ細胞をＣＨＯ−ＳＦＭ培地で約５日間培養した培
養上清を限外ろ過器で１０文の１に濃縮し、Ｆａｓ発現
細胞であるＷＲ１９Ｌ１２ａ細胞とコントロールとして
のＷＲ１９Ｌ細胞（Ｆａｓ非発現細胞）を用いてフロー
サイトメトリーを行った。
【００５１】ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄した１×１０5
この細胞に、正常ヤギ血清２０μｌを反応させブロッキ
ングした後、抗ＧＳＴ抗体（培養上清、マウス陰性コン
トロール）、正常ウサギ血清（容量が１０００倍となる
ように希釈、以下１０００倍希釈という）、正常ヒト血
清（１０００倍希釈）、抗Ｆａｓ抗体（ハイブリドーマ
ＺＢ４、１０μｇ／ｍｌ）、キメラ抗体培養上清（容量
が１／１０倍となるように濃縮、以下１／１０倍濃縮と
いう）、抗ヒトγ重鎖抗体（ウサギ、１０μｇ／ｍｌ）
をそれぞれ２０μｌ、室温で３０分反応させ、ＰＢＳ／
１％ＢＳＡで洗浄した。キメラ抗体培養上清（１／１０
倍濃縮）と正常ヒト血清（１００倍希釈）を反応させた
ものについては、さらに抗ヒトγ重鎖抗体（ウサギ、１
０μｇ／ｍｌ）を３０分反応させＰＢＳ／１％ＢＳＡで
洗浄した。次に、ＦＩＴＣ標識抗ウサギイムノグロブリ
ン抗体又はＦＩＴＣ標識抗マウスイムノグロブリン抗体
を３０分反応させた後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄し、
２００μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡに懸濁した。この細胞
を用いてフローサイトメトリーを行った。その結果を図
７に示す。なお、図７における各グラフの説明を表５に
まとめた。
この細胞に、正常ヤギ血清２０μｌを反応させブロッキ
ングした後、抗ＧＳＴ抗体（培養上清、マウス陰性コン
トロール）、正常ウサギ血清（容量が１０００倍となる
ように希釈、以下１０００倍希釈という）、正常ヒト血
清（１０００倍希釈）、抗Ｆａｓ抗体（ハイブリドーマ
ＺＢ４、１０μｇ／ｍｌ）、キメラ抗体培養上清（容量
が１／１０倍となるように濃縮、以下１／１０倍濃縮と
いう）、抗ヒトγ重鎖抗体（ウサギ、１０μｇ／ｍｌ）
をそれぞれ２０μｌ、室温で３０分反応させ、ＰＢＳ／
１％ＢＳＡで洗浄した。キメラ抗体培養上清（１／１０
倍濃縮）と正常ヒト血清（１００倍希釈）を反応させた
ものについては、さらに抗ヒトγ重鎖抗体（ウサギ、１
０μｇ／ｍｌ）を３０分反応させＰＢＳ／１％ＢＳＡで
洗浄した。次に、ＦＩＴＣ標識抗ウサギイムノグロブリ
ン抗体又はＦＩＴＣ標識抗マウスイムノグロブリン抗体
を３０分反応させた後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄し、
２００μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡに懸濁した。この細胞
を用いてフローサイトメトリーを行った。その結果を図
７に示す。なお、図７における各グラフの説明を表５に
まとめた。
【００５２】
【表５】
【００５３】図７に示すように、キメラ抗体は抗Ｆａｓ
モノクローナル抗体（ハイブリドーマＺＢ４）と同様
に、Ｆａｓ発現細胞であるＷＲ１９Ｌ１２ａと反応し、
Ｆａｓ非発現細胞であるＷＲ１９Ｌとは反応しなかっ
た。また、陰性コントロールとして用いた抗ＧＳＴ抗
体、正常ウサギ血清及び正常ヒト血清ではＷＲ１９Ｌ１
２ａ、ＷＲ１９Ｌともに反応は見られなかった。抗ヒト
γ重鎖抗体のみでも同様に反応は見られなかった。
モノクローナル抗体（ハイブリドーマＺＢ４）と同様
に、Ｆａｓ発現細胞であるＷＲ１９Ｌ１２ａと反応し、
Ｆａｓ非発現細胞であるＷＲ１９Ｌとは反応しなかっ
た。また、陰性コントロールとして用いた抗ＧＳＴ抗
体、正常ウサギ血清及び正常ヒト血清ではＷＲ１９Ｌ１
２ａ、ＷＲ１９Ｌともに反応は見られなかった。抗ヒト
γ重鎖抗体のみでも同様に反応は見られなかった。
【００５４】同様の方法でＷＲ１９Ｌ１２ａとＷＲ１９
Ｌに抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ハイブリドーマＣＨ
１１、培養上清）とキメラ抗体培養上清、抗ＧＳＴ抗
体、抗ヒトγ重鎖抗体を反応させ、蛍光顕微鏡で検鏡し
た。その結果を図８〜図１４（図面代用写真）に示す。
これらの写真から明らかなように、ＷＲ１９Ｌ１２ａは
抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ハイブリドーマＣＨ１
１、図８参照）、キメラ抗体（図９参照）ともに同様の
パターンで染色されたが、抗ＧＳＴ抗体（図１０参
照）、抗ヒトγ重鎖抗体（図１１参照）では染色されな
かった。また、ＷＲ１９Ｌは抗Ｆａｓモノクローナル抗
体（ハイブリドーマＣＨ１１）でもキメラ抗体でも抗Ｇ
ＳＴ抗体でも染色されなかった（図１２〜図１４参
照）。これらのことから、キメラ抗体は確かにＦａｓ抗
原と反応していることが確認された。
Ｌに抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ハイブリドーマＣＨ
１１、培養上清）とキメラ抗体培養上清、抗ＧＳＴ抗
体、抗ヒトγ重鎖抗体を反応させ、蛍光顕微鏡で検鏡し
た。その結果を図８〜図１４（図面代用写真）に示す。
これらの写真から明らかなように、ＷＲ１９Ｌ１２ａは
抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ハイブリドーマＣＨ１
１、図８参照）、キメラ抗体（図９参照）ともに同様の
パターンで染色されたが、抗ＧＳＴ抗体（図１０参
照）、抗ヒトγ重鎖抗体（図１１参照）では染色されな
かった。また、ＷＲ１９Ｌは抗Ｆａｓモノクローナル抗
体（ハイブリドーマＣＨ１１）でもキメラ抗体でも抗Ｇ
ＳＴ抗体でも染色されなかった（図１２〜図１４参
照）。これらのことから、キメラ抗体は確かにＦａｓ抗
原と反応していることが確認された。
【００５５】次に、キメラ抗体のアポトーシス活性をＷ
Ｒ１９Ｌ１２ａとＷＲ１９Ｌ細胞を材料として、ＭＴＴ
アッセイ法により測定した。ＭＴＴアッセイ法とは、ア
イソトープを用いない細胞増殖能、細胞生存率測定法で
ある。細胞増殖能及び細胞毒性の評価については、 3Ｈ
−チミジンの細胞核内への取り込みが良く利用されてい
るが、アイソトープの取り扱いに種々の規制があるため
に使用できる研究者が限られるという不都合がある。こ
れに対してＭＴＴアッセイ法ではこのような不都合がな
い。ＭＴＴ（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Di-ph
enyl tetrazolium bromide）は淡黄色物質で、生細胞の
ミトコンドリア中に存在する酵素により、暗青色のハル
マザンに開裂されること（死細胞はＭＴＴを開裂できな
い）が知られている。ＭＴＴアッセイ法は、このような
ＭＴＴの性質を利用したアッセイ法であり、 3Ｈ−チミ
ジンの代わりにＭＴＴ比色定量法を用いることにより、
細胞増殖能を測定することができる。
Ｒ１９Ｌ１２ａとＷＲ１９Ｌ細胞を材料として、ＭＴＴ
アッセイ法により測定した。ＭＴＴアッセイ法とは、ア
イソトープを用いない細胞増殖能、細胞生存率測定法で
ある。細胞増殖能及び細胞毒性の評価については、 3Ｈ
−チミジンの細胞核内への取り込みが良く利用されてい
るが、アイソトープの取り扱いに種々の規制があるため
に使用できる研究者が限られるという不都合がある。こ
れに対してＭＴＴアッセイ法ではこのような不都合がな
い。ＭＴＴ（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Di-ph
enyl tetrazolium bromide）は淡黄色物質で、生細胞の
ミトコンドリア中に存在する酵素により、暗青色のハル
マザンに開裂されること（死細胞はＭＴＴを開裂できな
い）が知られている。ＭＴＴアッセイ法は、このような
ＭＴＴの性質を利用したアッセイ法であり、 3Ｈ−チミ
ジンの代わりにＭＴＴ比色定量法を用いることにより、
細胞増殖能を測定することができる。
【００５６】ＭＴＴアッセイは市販のキット（ケミコン
インターナショナル社、ＭＴＴ Ａｓｓａｙ）を用いて
行った。即ち、各細胞を９６穴マイクロプレートに１×
１０5 ／ｍｌの濃度で１ウエル当たり５０μｌまき、５
０μｌの抗体を反応させて一晩培養した後、ＭＴＴ（５
ｍｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ ＩＮＣ）を１０μｌ加え、４時間培養した後、
イソプロパノールと塩酸の混液を１００μｌ加え、波長
５７０ｎｍにおける吸光度と波長６２０ｎｍにおける吸
光度の比（Ａ５７０／６２０）を測定した。抗体は抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体（ハイブリドーマＣＨ１１）の
培養上清（フローサイトメトリーに用いたものと同
じ）、キメラ細胞培養上清（１０倍濃縮）、キメラ細胞
培養上清（１０倍濃縮）＋抗ヒトγ重鎖抗体（最終濃度
１０μｇ／ｍｌ）及びＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳをそれぞ
れ反応させた。
インターナショナル社、ＭＴＴ Ａｓｓａｙ）を用いて
行った。即ち、各細胞を９６穴マイクロプレートに１×
１０5 ／ｍｌの濃度で１ウエル当たり５０μｌまき、５
０μｌの抗体を反応させて一晩培養した後、ＭＴＴ（５
ｍｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ ＩＮＣ）を１０μｌ加え、４時間培養した後、
イソプロパノールと塩酸の混液を１００μｌ加え、波長
５７０ｎｍにおける吸光度と波長６２０ｎｍにおける吸
光度の比（Ａ５７０／６２０）を測定した。抗体は抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体（ハイブリドーマＣＨ１１）の
培養上清（フローサイトメトリーに用いたものと同
じ）、キメラ細胞培養上清（１０倍濃縮）、キメラ細胞
培養上清（１０倍濃縮）＋抗ヒトγ重鎖抗体（最終濃度
１０μｇ／ｍｌ）及びＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳをそれぞ
れ反応させた。
【００５７】結果は図１５、図１６に示す通りである。
即ち、図１５から明らかなように、キメラ細胞培養上清
と抗ヒトγ重鎖抗体の混合液を反応させた場合にはＷＲ
１９Ｌ１２ａにおいて抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ハ
イブリドーマＣＨ１１）同様にアポトーシス活性が認め
られたが、キメラ抗体のみの場合は若干のアポトーシス
活性が認められたにとどまり、抗ヒトγ重鎖抗体のみ、
あるいはＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳではアポトーシス活性
は認められなかった。また、図１６から明らかなよう
に、ＷＲ１９Ｌにおいてはいずれもアポトーシスを誘導
することができなかった。
即ち、図１５から明らかなように、キメラ細胞培養上清
と抗ヒトγ重鎖抗体の混合液を反応させた場合にはＷＲ
１９Ｌ１２ａにおいて抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ハ
イブリドーマＣＨ１１）同様にアポトーシス活性が認め
られたが、キメラ抗体のみの場合は若干のアポトーシス
活性が認められたにとどまり、抗ヒトγ重鎖抗体のみ、
あるいはＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳではアポトーシス活性
は認められなかった。また、図１６から明らかなよう
に、ＷＲ１９Ｌにおいてはいずれもアポトーシスを誘導
することができなかった。
【００５８】このような結果が得られた理由について
は、以下のように考えられる。即ち、細胞表面上のＦａ
ｓ抗原は３量体であることが知られており、この３つの
Ｆａｓ抗原が抗Ｆａｓ抗体（Ｆａｓリガンド）によって
架橋されることによりアポトーシスが誘導されると考え
られる。抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ハイブリドーマ
ＣＨ１１）はＩｇＭクラスの抗体であり、５量体の抗体
であることから、Ｆａｓ抗原を架橋することができ、単
独でアポトーシスを誘導することができると考えられ
る。
は、以下のように考えられる。即ち、細胞表面上のＦａ
ｓ抗原は３量体であることが知られており、この３つの
Ｆａｓ抗原が抗Ｆａｓ抗体（Ｆａｓリガンド）によって
架橋されることによりアポトーシスが誘導されると考え
られる。抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ハイブリドーマ
ＣＨ１１）はＩｇＭクラスの抗体であり、５量体の抗体
であることから、Ｆａｓ抗原を架橋することができ、単
独でアポトーシスを誘導することができると考えられ
る。
【００５９】一方、キメラ抗体のようなＩｇＧクラスの
抗体は単量体であるため、Ｆａｓ抗原と反応はするもの
のＦａｓ抗原を架橋しにくく、単独では低いアポトーシ
ス活性しか得られなかったものと考えられる。この場合
の低いアポトーシス活性はキメラ抗体同士が自然凝集を
起こすことによるものと考えられる。これに対して、キ
メラ抗体単独ではなく抗ヒトγ重鎖抗体のようなＩｇＧ
抗体を架橋させる物質を併存させた場合、抗ヒトγ重鎖
抗体によってキメラ抗体が架橋され、多量体として作用
するためアポトーシス活性が格段に向上したもの（細胞
生存率２０％以下）と考えられる。
抗体は単量体であるため、Ｆａｓ抗原と反応はするもの
のＦａｓ抗原を架橋しにくく、単独では低いアポトーシ
ス活性しか得られなかったものと考えられる。この場合
の低いアポトーシス活性はキメラ抗体同士が自然凝集を
起こすことによるものと考えられる。これに対して、キ
メラ抗体単独ではなく抗ヒトγ重鎖抗体のようなＩｇＧ
抗体を架橋させる物質を併存させた場合、抗ヒトγ重鎖
抗体によってキメラ抗体が架橋され、多量体として作用
するためアポトーシス活性が格段に向上したもの（細胞
生存率２０％以下）と考えられる。
【００６０】以上のことから、本キメラ抗体は細胞上に
表出されているＦａｓ抗原と反応し、アポトーシスを誘
導することができる抗体であることが明らかにされた。
この結果、実施例６で得たヒト型抗体は、ＩｇＧを架橋
可能な２次抗体と併用することにより、マウスＣＨ１１
抗体と同様、ヒトＦａｓ抗原過剰発現形質転換細胞ＷＲ
１９Ｌ１２ａに対してアポトーシスを誘導する作用を有
することが分かった。また、マウスＣＨ１１抗体は異種
動物によって産生された蛋白質であるため、ヒトに投与
した場合にはヒト蛋白と区別されてヒトの循環系から排
除されるか、アレルギー反応を起こすおそれがあるが、
ヒト型抗体ではこのようなおそれがないため、自己免疫
疾患の治療剤として有望視される。
表出されているＦａｓ抗原と反応し、アポトーシスを誘
導することができる抗体であることが明らかにされた。
この結果、実施例６で得たヒト型抗体は、ＩｇＧを架橋
可能な２次抗体と併用することにより、マウスＣＨ１１
抗体と同様、ヒトＦａｓ抗原過剰発現形質転換細胞ＷＲ
１９Ｌ１２ａに対してアポトーシスを誘導する作用を有
することが分かった。また、マウスＣＨ１１抗体は異種
動物によって産生された蛋白質であるため、ヒトに投与
した場合にはヒト蛋白と区別されてヒトの循環系から排
除されるか、アレルギー反応を起こすおそれがあるが、
ヒト型抗体ではこのようなおそれがないため、自己免疫
疾患の治療剤として有望視される。
【００６１】
配列番号：1 配列の長さ：348 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CAGGTCCAGC TGCAGGAGTC AGGACCTGAG CTGGTGAAAC CTGGGGCCTC AGTGAAGATA 60 TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA TGCACTGGGT GAAGCAGAGC 120 CATGGAAAGA GCCTTGAGTG GATTGGATAT ATTTATCCTT ACAATGGTGG TACTGGCTAC 180 AACCAGAAGT TCAAGAGCAA GGCCACATTG ACTGTTGACA ATTCCTCCAG CACAGCCTAC 240 ATGGAGCTCC GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGAAGTTAC 300 TATGCTATGG ACTACTGGGG CCAAGGGACC ACGGTTACCG TCTCGTCA 348 配列番号：2 配列の長さ：339 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GATGTTTTGA TGACCCAAAC TCCACTCTCC CTGCCTGTCA GTCTTGGAGA TCAAGCCTCC 60 ATCTCTTGCA GATCTAGTAA GAGCCTTGTA CACAGTAATG GAAACACCTA TTTACATTGG 120 TACCTGCAGA AGCCAGGCCA GTCTCCAAAG CTCCTGATCT ACAAAGTTTC CAACCGATTT 180 TCTGGGGTCC CAGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTCAC ACTCAAGATC 240 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TCTGGGAGTT TATTTCTGCT CTCAAAGTAC ACATGTTCCT 300 CCGGCGTTCG GTGGAGGCAC CAAGCTGGAA ATCAAACGG 339 配列番号：3 配列の長さ：116 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser 65 70 75 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 95 100 105 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 配列番号：4 配列の長さ：113 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Val 20 25 30 His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 35 40 45 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val 80 85 90 Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gly 95 100 105 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 110 配列番号：5 配列の長さ：405 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATGGGATGGA GCTGGATCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGCGT CCACTCTGAG 60 GTCCAGCTTC AGCAGTCAGG ACCTGAGCTG GTGAAACCTG GGGCCTCAGT GAAGATATCC 120 TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAGCCAT 180 GGAAAGAGCC TTGAGTGGAT TGGATATATT TATCCTTACA ATGGTGGTAC TGGCTACAAC 240 CAGAAGTTCA AGAGCAAGGC CACATTGACT GTTGACAATT CCTCCAGCAC AGCCTACATG 300 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG AAGTTACTAT 360 GCTATGGACT ACTGGGGTCA AGGAACCTCA GTCACCGTCT CCTCA 405 配列番号：6 配列の長さ：396 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG ATGTTCTGGA TTCCTGCTTC CAGCAGTGAT 60 GTTGTGATGA CCCAAAGTCC ACTCTCCCTG CCTGTCAGTC TTGGAGATCA AGCCTCCATC 120 TCTTGCAGAT CTAGTAAGAG CCTTGTACAC AGTAATGGAA ACACCTATTT ACATTGGTAC 180 CTGCAGAAGC CAGGCCAGTC TCCAAAGCTC CTGATCTACA AAGTTTCCAA CCGATTTTCT 240 GGGGTCCCAG ACAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCAGGGACAG ATTTCACACT CAAGATCAGC 300 AGAGTGGAGG CTGAGGATCT GGGAGTTTAT TTCTGCTCTC AAAGTACACA TGTTCCTCCG 360 GCGTTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAAATC AAACGG 396 配列番号：7 配列の長さ：135 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala 1 5 10 15 Gly Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 20 25 30 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His 50 55 60 Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly 65 70 75 Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr 80 85 90 Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu 95 100 105 Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr 110 115 120 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 125 130 135 配列番号：8 配列の長さ：132 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu 20 25 30 Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 35 40 45 Lys Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr 50 55 60 Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val 65 70 75 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 80 85 90 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 95 100 105 Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro 110 115 120 Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 125 130 配列番号：9 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VHミックスセンスフ゜ライマー） 配列の特徴 存在位置：1 他の情報：N=GまたはC 存在位置：6 他の情報：N=GまたはC 存在位置：7 他の情報：N=AまたはC 存在位置：12 他の情報：N=GまたはT 存在位置：13 他の情報：N=GまたはC 存在位置：16 他の情報：N=GまたはC 存在位置：21 他の情報：N=AまたはT 配列 NAGGTNNAGC TNNAGNAGTC N 配列番号：10 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VHミックスアンチセンスフ゜ライマ
ー） 配列の特徴 存在位置：3 他の情報：N=AまたはC 存在位置：10 他の情報：N=GまたはT 存在位置：15 他の情報：N=GまたはC 存在位置：16 他の情報：N=AまたはC 配列 TGNGGAGATN GTGANNGTGG T 配列番号：11 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VLミックスセンスフ゜ライマー） 配列の特徴 存在位置：3 他の情報：N=AまたはCまたはT 存在位置：4 他の情報：N=AまたはG 存在位置：7 他の情報：N=GまたはT 存在位置：10 他の情報：N=AまたはC 存在位置：18 他の情報：N=AまたはG 存在位置：19 他の情報：N=AまたはT 配列 GANNTTNTGN TGACCCANNC T 配列番号：12 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VLミックスアンチセンスフ゜ライマ
ー） 配列の特徴 存在位置：7 他の情報：N=CまたはGまたはT 存在位置：9 他の情報：N=GまたはT 存在位置：10 他の情報：N=CまたはT 配列 CCGTTTNANN TCCAGCTTGG T 配列番号：13 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CHセンスフ゜ライマー） 配列 GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGT 配列番号：14 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CHアンチセンスフ゜ライマー） 配列 TTTACCCGGA GACAGGGAGA GGC 配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CLセンスフ゜ライマー） 配列 ACTGTGGCTG CACCATCTGT 配列番号：16 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CLアンチセンスフ゜ライマー） 配列 ACACTCTCCC CTGTTGAAGC 配列番号：17 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VH5フ゜ライマー） 配列 AAGCTTATGC AGGTCCAGCT GCAGGTGTCA 配列番号：18 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VH3フ゜ライマー） 配列 TGACGAGACG GTAACCGTGG T 配列番号：19 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CH5フ゜ライマー） 配列 GCCTCCACCA AGGGCCCATC G 配列番号：20 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CH3フ゜ライマー） 配列 GGATCCCTAT TTACCCGGAG ACAGGGAGAG 配列番号：21 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VL5フ゜ライマー） 配列 AAGCTTATGG ATGTTTTGAT GACCCAAACT 配列番号：22 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VL3フ゜ライマー） 配列 CCGTTTGATT TCCAGCTTGG T 配列番号：23 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CL5フ゜ライマー） 配列 ACTGTGGCTG CACCATCTGC T 配列番号：24 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CL3フ゜ライマー） 配列 GGATCCCTAA CACTCTCCCC TGTTGAAGCT 配列番号：25 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NVH5フ゜ライマー） 配列 CCGCTCGAGA TGGGATGGAG CTGGATCTTT 配列番号：26 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NVH3フ゜ライマー） 配列 TGAGGAGACG GTGACTGAG 配列番号：27 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NCH5フ゜ライマー） 配列 GCTTCCACCA AGGGCCCATC GGT 配列番号：28 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NCH3フ゜ライマー） 配列 ATAAGAATGC GGCCGCTATT TACCCGGAGA CAGGGAG 配列番号：29 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NVL5フ゜ライマー） 配列 CCGCTCGAGA TGAAGTTGCC TGTTAGGCTG 配列番号：30 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NVL3フ゜ライマー） 配列 CCGTTTGATT TCCAGCTTGG T 配列番号：31 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NCL5フ゜ライマー） 配列 ACTGTGGCTG CACCATCTGT 配列番号：32 配列の長さ：38 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NCL3フ゜ライマー） 配列 ATAAGAATGC GGCCGCTAAC ACTCTCCCCT GTTGAAGC
ー） 配列の特徴 存在位置：3 他の情報：N=AまたはC 存在位置：10 他の情報：N=GまたはT 存在位置：15 他の情報：N=GまたはC 存在位置：16 他の情報：N=AまたはC 配列 TGNGGAGATN GTGANNGTGG T 配列番号：11 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VLミックスセンスフ゜ライマー） 配列の特徴 存在位置：3 他の情報：N=AまたはCまたはT 存在位置：4 他の情報：N=AまたはG 存在位置：7 他の情報：N=GまたはT 存在位置：10 他の情報：N=AまたはC 存在位置：18 他の情報：N=AまたはG 存在位置：19 他の情報：N=AまたはT 配列 GANNTTNTGN TGACCCANNC T 配列番号：12 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VLミックスアンチセンスフ゜ライマ
ー） 配列の特徴 存在位置：7 他の情報：N=CまたはGまたはT 存在位置：9 他の情報：N=GまたはT 存在位置：10 他の情報：N=CまたはT 配列 CCGTTTNANN TCCAGCTTGG T 配列番号：13 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CHセンスフ゜ライマー） 配列 GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGT 配列番号：14 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CHアンチセンスフ゜ライマー） 配列 TTTACCCGGA GACAGGGAGA GGC 配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CLセンスフ゜ライマー） 配列 ACTGTGGCTG CACCATCTGT 配列番号：16 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CLアンチセンスフ゜ライマー） 配列 ACACTCTCCC CTGTTGAAGC 配列番号：17 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VH5フ゜ライマー） 配列 AAGCTTATGC AGGTCCAGCT GCAGGTGTCA 配列番号：18 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VH3フ゜ライマー） 配列 TGACGAGACG GTAACCGTGG T 配列番号：19 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CH5フ゜ライマー） 配列 GCCTCCACCA AGGGCCCATC G 配列番号：20 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CH3フ゜ライマー） 配列 GGATCCCTAT TTACCCGGAG ACAGGGAGAG 配列番号：21 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VL5フ゜ライマー） 配列 AAGCTTATGG ATGTTTTGAT GACCCAAACT 配列番号：22 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（VL3フ゜ライマー） 配列 CCGTTTGATT TCCAGCTTGG T 配列番号：23 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CL5フ゜ライマー） 配列 ACTGTGGCTG CACCATCTGC T 配列番号：24 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（CL3フ゜ライマー） 配列 GGATCCCTAA CACTCTCCCC TGTTGAAGCT 配列番号：25 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NVH5フ゜ライマー） 配列 CCGCTCGAGA TGGGATGGAG CTGGATCTTT 配列番号：26 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NVH3フ゜ライマー） 配列 TGAGGAGACG GTGACTGAG 配列番号：27 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NCH5フ゜ライマー） 配列 GCTTCCACCA AGGGCCCATC GGT 配列番号：28 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NCH3フ゜ライマー） 配列 ATAAGAATGC GGCCGCTATT TACCCGGAGA CAGGGAG 配列番号：29 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NVL5フ゜ライマー） 配列 CCGCTCGAGA TGAAGTTGCC TGTTAGGCTG 配列番号：30 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NVL3フ゜ライマー） 配列 CCGTTTGATT TCCAGCTTGG T 配列番号：31 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NCL5フ゜ライマー） 配列 ACTGTGGCTG CACCATCTGT 配列番号：32 配列の長さ：38 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA（NCL3フ゜ライマー） 配列 ATAAGAATGC GGCCGCTAAC ACTCTCCCCT GTTGAAGC
【図１】 ｐＵＣの制限酵素地図である。
【図２】 ｐＲＥＰ４の制限酵素地図である。
【図３】 ｐＲＥＰ９の制限酵素地図である。
【図４】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す説明図であ
る。
る。
【図５】 ｃＤＮＡ発現ベクターＢＣＭＧＳｎｅｏの制
限酵素地図である。
限酵素地図である。
【図６】 薬剤耐性株の培養上清を電気泳動後、メンブ
レンに転写して抗ヒトκ軽鎖抗体又は抗ヒトγ重鎖抗体
と反応後、標識二次抗体と反応させ、発色基質を加えメ
ンブレンを発色させたときのバンドの様子を表す説明図
である。
レンに転写して抗ヒトκ軽鎖抗体又は抗ヒトγ重鎖抗体
と反応後、標識二次抗体と反応させ、発色基質を加えメ
ンブレンを発色させたときのバンドの様子を表す説明図
である。
【図７】 Ｆａｓ抗原高発現細胞（ＷＲ１９Ｌ１２ａ）
及び非発現細胞（ＷＲ１９Ｌ）を用いてフローサイトメ
トリーを行ったときのグラフである。
及び非発現細胞（ＷＲ１９Ｌ）を用いてフローサイトメ
トリーを行ったときのグラフである。
【図８】 Ｆａｓ抗原高発現細胞（ＷＲ１９Ｌ１２ａ）
と抗Ｆａｓ抗体とを用いて蛍光染色を行ったときの写真
である。
と抗Ｆａｓ抗体とを用いて蛍光染色を行ったときの写真
である。
【図９】 Ｆａｓ抗原高発現細胞（ＷＲ１９Ｌ１２ａ）
とキメラ抗体とを用いて蛍光染色を行ったときの写真で
ある。
とキメラ抗体とを用いて蛍光染色を行ったときの写真で
ある。
【図１０】 Ｆａｓ抗原高発現細胞（ＷＲ１９Ｌ１２
ａ）と抗ＧＳＴ抗体とを用いて蛍光染色を行ったときの
写真である。
ａ）と抗ＧＳＴ抗体とを用いて蛍光染色を行ったときの
写真である。
【図１１】 Ｆａｓ抗原高発現細胞（ＷＲ１９Ｌ１２
ａ）と抗ヒトγ重鎖抗体とを用いて蛍光染色を行ったと
きの写真である。
ａ）と抗ヒトγ重鎖抗体とを用いて蛍光染色を行ったと
きの写真である。
【図１２】 Ｆａｓ抗原非発現細胞（ＷＲ１９Ｌ）と抗
Ｆａｓ抗体とを用いて蛍光染色を行ったときの写真であ
る。
Ｆａｓ抗体とを用いて蛍光染色を行ったときの写真であ
る。
【図１３】 Ｆａｓ抗原非発現細胞（ＷＲ１９Ｌ）とキ
メラ抗体とを用いて蛍光染色を行ったときの写真であ
る。
メラ抗体とを用いて蛍光染色を行ったときの写真であ
る。
【図１４】 Ｆａｓ抗原非発現細胞（ＷＲ１９Ｌ）と抗
ＧＳＴ抗体とを用いて蛍光染色を行ったときの写真であ
る。
ＧＳＴ抗体とを用いて蛍光染色を行ったときの写真であ
る。
【図１５】 Ｆａｓ抗原高発現細胞（ＷＲ１９Ｌ１２
ａ）を用いてアポトーシス誘導後の細胞生存率を見たと
きのグラフである。
ａ）を用いてアポトーシス誘導後の細胞生存率を見たと
きのグラフである。
【図１６】 Ｆａｓ抗原非発現細胞（ＷＲ１９Ｌ）を用
いてアポトーシス誘導後の細胞生存率を見たときのグラ
フである。
いてアポトーシス誘導後の細胞生存率を見たときのグラ
フである。
Claims (10)
- 【請求項１】抗Ｆａｓ抗体の重鎖の可変領域をコードす
るＤＮＡであって、GACTACAACATGCACで表される塩基配
列、TATATTTATCCTTACAATGGTGGTACTGGCTACAACCAGAAGTTCA
AGAGCで表される塩基配列、及びAGTTACTATGCTATGGACTAC
で表される塩基配列を含むことを特徴とするＤＮＡ。 - 【請求項２】抗Ｆａｓ抗体の重鎖の可変領域をコードす
るＤＮＡであって、配列表の配列番号１又は配列番号５
に示す塩基配列を含むことを特徴とする請求項１記載の
ＤＮＡ。 - 【請求項３】抗Ｆａｓ抗体の軽鎖の可変領域をコードす
るＤＮＡであって、AGATCTAGTAAGAGCCTTGTACACAGTAATGG
AAACACCTATTTACATで表される塩基配列、AAAGTTTCCAACCG
ATTTTCTで表される塩基配列、及びTCTCAAAGTACACATGTTC
CTCCGGCGで表される塩基配列を含むことを特徴とするＤ
ＮＡ。 - 【請求項４】抗Ｆａｓ抗体の軽鎖の可変領域をコードす
るＤＮＡであって、配列表の配列番号２又は配列番号６
に示す塩基配列を含むことを特徴とする請求項３記載の
ＤＮＡ。 - 【請求項５】重鎖の可変領域が、Asp Tyr Asn Met His
で表されるアミノ酸配列、Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gl
y Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Serで表され
るアミノ酸配列、及び、Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
で表されるアミノ酸配列を含み、 重鎖の定常領域が、ヒト免疫グロブリンの重鎖の定常領
域であり、 軽鎖の可変領域が、Arg Ser Ser Lys Ser Leu Val His
Ser Asn Gly Asn ThrTyr Leu Hisで表されるアミノ酸配
列、Lys Val Ser Asn Arg Phe Serで表されるアミノ酸
配列、Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala で表され
るアミノ酸配列を含み、 軽鎖の定常領域が、ヒト免疫グロブリンの軽鎖の定常領
域であることを特徴とする抗Ｆａｓ抗体。 - 【請求項６】重鎖の可変領域が配列表の配列番号３に示
すアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域が、配列表の配
列番号４に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請
求項５記載の抗Ｆａｓ抗体。 - 【請求項７】重鎖の可変領域が配列表の配列番号７に示
すアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域が、配列表の配
列番号８に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請
求項５記載の抗Ｆａｓ抗体。 - 【請求項８】重鎖の定常領域がヒトＩｇＧの重鎖の定常
領域であり、軽鎖の定常領域がヒトＩｇＧの軽鎖の定常
領域であることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに
記載の抗Ｆａｓ抗体。 - 【請求項９】Ｆａｓ抗原を発現する細胞に対してアポト
ーシス活性を有する請求項５〜８のいずれかに記載の抗
Ｆａｓ抗体。 - 【請求項１０】ＩｇＧを架橋可能な２次抗体と併用する
ことにより、単独で用いた場合に比べてＦａｓ抗原を発
現する細胞に対するアポトーシス活性が高められる請求
項５〜８のいずれかに記載の抗Ｆａｓ抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19176997A JPH10165178A (ja) | 1996-07-02 | 1997-07-01 | 抗Ｆａｓ抗体の可変領域をコードするＤＮＡ及び抗Ｆａｓ抗体 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17222896 | 1996-07-02 | ||
| JP8-172228 | 1996-10-09 | ||
| JP26873796 | 1996-10-09 | ||
| JP8-268737 | 1996-10-09 | ||
| JP19176997A JPH10165178A (ja) | 1996-07-02 | 1997-07-01 | 抗Ｆａｓ抗体の可変領域をコードするＤＮＡ及び抗Ｆａｓ抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10165178A true JPH10165178A (ja) | 1998-06-23 |
Family
ID=27323592
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19176997A Pending JPH10165178A (ja) | 1996-07-02 | 1997-07-01 | 抗Ｆａｓ抗体の可変領域をコードするＤＮＡ及び抗Ｆａｓ抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10165178A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6972323B1 (en) | 1997-04-01 | 2005-12-06 | Sankyo Company, Limited | Anti-Fas antibodies |
| US8747849B2 (en) | 2005-04-09 | 2014-06-10 | Fusion Antibodies Limited | Antibody and uses thereof |
-
1997
- 1997-07-01 JP JP19176997A patent/JPH10165178A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6972323B1 (en) | 1997-04-01 | 2005-12-06 | Sankyo Company, Limited | Anti-Fas antibodies |
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