JPH10165183A - メトトレキセート結合性ｄｎａ - Google Patents
メトトレキセート結合性ｄｎａInfo
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- JPH10165183A JPH10165183A JP8335432A JP33543296A JPH10165183A JP H10165183 A JPH10165183 A JP H10165183A JP 8335432 A JP8335432 A JP 8335432A JP 33543296 A JP33543296 A JP 33543296A JP H10165183 A JPH10165183 A JP H10165183A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】メトトレキセートの検出、または不活性化に用
いることができる新規なＤＮＡの提供。 【解決手段】下記のいずれか１つの塩基配列を有するメ
トトレキセート結合性ＤＮＡ。 TAATACGACTCAACTATAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTA AGGTGGTCCGCTGAGGGGGCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAGGTGGTCCGCTGAGG GGGCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG AGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAGGTGGTCCGCTGAGGGGG
いることができる新規なＤＮＡの提供。 【解決手段】下記のいずれか１つの塩基配列を有するメ
トトレキセート結合性ＤＮＡ。 TAATACGACTCAACTATAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTA AGGTGGTCCGCTGAGGGGGCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAGGTGGTCCGCTGAGG GGGCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG AGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAGGTGGTCCGCTGAGGGGG
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はメトトレキセートの
検出、または不活性化に用いることができる新規なＤＮ
Ａに関する。
検出、または不活性化に用いることができる新規なＤＮ
Ａに関する。
【０００２】
【従来の技術】下記式（１）で表されるメトトレキセー
トは、テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼの強力な阻害
剤で、急性白血病、悪性絨毛上皮腫、乳癌等に対する制
ガン剤、抗ガン剤、または免疫抑制剤として用いられて
いる。
トは、テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼの強力な阻害
剤で、急性白血病、悪性絨毛上皮腫、乳癌等に対する制
ガン剤、抗ガン剤、または免疫抑制剤として用いられて
いる。
【化１】
【０００３】しかし、メトトレキセートは巨赤芽球性骨
髄、細胞減少低形成、粘膜潰瘍、および皮膚炎等の副作
用も併せ持っている。したがって患者にメトトレキセー
トを投与する際には、メトトレキセートの血中濃度を慎
重に観察することが必要である。また、副作用が重篤な
場合には患者の体内のメトトレキセートを速やかに不活
性化させる必要がある。
髄、細胞減少低形成、粘膜潰瘍、および皮膚炎等の副作
用も併せ持っている。したがって患者にメトトレキセー
トを投与する際には、メトトレキセートの血中濃度を慎
重に観察することが必要である。また、副作用が重篤な
場合には患者の体内のメトトレキセートを速やかに不活
性化させる必要がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、メト
トレキセートの検出、または不活性化、副作用の軽減化
に用いることができる新規なＤＮＡを提供しようとす
る。
トレキセートの検出、または不活性化、副作用の軽減化
に用いることができる新規なＤＮＡを提供しようとす
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は鋭意研究の
末、メトトレキセートに特異的に結合するＤＮＡを見出
し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
下記の配列番号１に相当する塩基配列を有するメトトレ
キセート結合性ＤＮＡ、 TAATACGACTCAACTATAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAG GTGGTCCGCTGAGGGGGCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG 配列番号１の配列からＴ７プロモーターを除いた、下記
の配列番号２に相当する塩基配列を有するメトトレキセ
ート結合性ＤＮＡ、 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAGGTGGTCCGCTGAGGGG GCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG および、配列番号２の配列から更に制限酵素サイトを除
いた下記の配列番号３に相当する塩基配列を有するメト
トレキセート結合性ＤＮＡを提供する。 AGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAGGTGGTCCGCTGAGGGGG
末、メトトレキセートに特異的に結合するＤＮＡを見出
し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
下記の配列番号１に相当する塩基配列を有するメトトレ
キセート結合性ＤＮＡ、 TAATACGACTCAACTATAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAG GTGGTCCGCTGAGGGGGCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG 配列番号１の配列からＴ７プロモーターを除いた、下記
の配列番号２に相当する塩基配列を有するメトトレキセ
ート結合性ＤＮＡ、 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAGGTGGTCCGCTGAGGGG GCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG および、配列番号２の配列から更に制限酵素サイトを除
いた下記の配列番号３に相当する塩基配列を有するメト
トレキセート結合性ＤＮＡを提供する。 AGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAGGTGGTCCGCTGAGGGGG
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明に係る新規なＤＮＡは配列
番号１〜３で表されるものである。本発明に係るＤＮＡ
はこのような１本鎖のＤＮＡ配列をとることにより、分
子内の相補的な配列間でアニーリングをおこしてメトト
レキセートに特異的に結合する。
番号１〜３で表されるものである。本発明に係るＤＮＡ
はこのような１本鎖のＤＮＡ配列をとることにより、分
子内の相補的な配列間でアニーリングをおこしてメトト
レキセートに特異的に結合する。
【０００７】その他、以下の配列を有するＤＮＡも分子
内アニーリングを起こして、本発明に係るＤＮＡと同じ
立体構造をとり得る。本発明に係るＤＮＡの配列番号３
の部分の配列中、ＡとＴを置き換えたもの、ＣとＧ
を置き換えたもの、ＡとＴ、およびＣとＧを置き換え
たもの、ＡとＧ、およびＴとＣを置き換えたもの、
ＡとＣ、およびＴとＧを置き換えたもの。その他本願Ｄ
ＮＡの活性が損なわれない範囲、または、立体構造が壊
れない範囲で、塩基の置換、削除、挿入、付加、欠失な
どをしてもよい。
内アニーリングを起こして、本発明に係るＤＮＡと同じ
立体構造をとり得る。本発明に係るＤＮＡの配列番号３
の部分の配列中、ＡとＴを置き換えたもの、ＣとＧ
を置き換えたもの、ＡとＴ、およびＣとＧを置き換え
たもの、ＡとＧ、およびＴとＣを置き換えたもの、
ＡとＣ、およびＴとＧを置き換えたもの。その他本願Ｄ
ＮＡの活性が損なわれない範囲、または、立体構造が壊
れない範囲で、塩基の置換、削除、挿入、付加、欠失な
どをしてもよい。
【０００８】本発明に係る新規なＤＮＡは適当な条件下
で分子内アニーリングをすることにより、メトトレキセ
ートと特異的に結合する立体構造を採ることができ、メ
トトレキセートに対する認識能を取得する。
で分子内アニーリングをすることにより、メトトレキセ
ートと特異的に結合する立体構造を採ることができ、メ
トトレキセートに対する認識能を取得する。
【０００９】例えば結合バッファー（０．５Ｍ ＬｉＣ
ｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ７．６）中で９４℃で５分間保温したのち、室温に
放置することによりメトトレキセートと特異的に結合す
る立体構造を採ることができる。
ｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ７．６）中で９４℃で５分間保温したのち、室温に
放置することによりメトトレキセートと特異的に結合す
る立体構造を採ることができる。
【００１０】メトトレキセートはテトラヒドロ葉酸デヒ
ドロゲナーゼの強力な阻害剤で、急性白血病、悪性絨毛
上皮腫、乳癌等に対する制ガン剤、抗ガン剤、または免
疫抑制剤として用いられる一方で、同時に巨赤芽球性骨
髄、細胞減少低形成、粘膜潰瘍、および皮膚炎等の副作
用も併せ持っている。そのためその投与に際しては、体
液中、例えば血中のメトトレキセート濃度の経時的な観
察が必要である。
ドロゲナーゼの強力な阻害剤で、急性白血病、悪性絨毛
上皮腫、乳癌等に対する制ガン剤、抗ガン剤、または免
疫抑制剤として用いられる一方で、同時に巨赤芽球性骨
髄、細胞減少低形成、粘膜潰瘍、および皮膚炎等の副作
用も併せ持っている。そのためその投与に際しては、体
液中、例えば血中のメトトレキセート濃度の経時的な観
察が必要である。
【００１１】本発明に係る新規なＤＮＡは、メトトレキ
セートと特異的に結合することより、メトトレキセート
を認識することが出来る。例えば本発明の新規なＤＮＡ
を蛍光物質、発色物質、放射性同位体等でラベルし、蛍
光測定法等によりメトトレキセートを投与した患者から
採取した体液中、例えば血中のメトトレキセートの検出
および濃度測定に使用することができる。またメトトレ
キセートに対する抗体、蛍光・発光基質や発色基質を結
合させた本発明のＤＮＡ、蛍光酵素、発光酵素、発色酵
素などを組み合わせて、メトトレキセートの検出および
濃度測定が行えるキットを提供することも可能である。
セートと特異的に結合することより、メトトレキセート
を認識することが出来る。例えば本発明の新規なＤＮＡ
を蛍光物質、発色物質、放射性同位体等でラベルし、蛍
光測定法等によりメトトレキセートを投与した患者から
採取した体液中、例えば血中のメトトレキセートの検出
および濃度測定に使用することができる。またメトトレ
キセートに対する抗体、蛍光・発光基質や発色基質を結
合させた本発明のＤＮＡ、蛍光酵素、発光酵素、発色酵
素などを組み合わせて、メトトレキセートの検出および
濃度測定が行えるキットを提供することも可能である。
【００１２】本発明のＤＮＡによるメトトレキセートの
検出、濃度測定に供される対象としては、尿、血清、血
漿、全血、唾液、涙液、または髄液等のヒトおよび他の
動物由来の体液が例示される。しかし、本発明のＤＮＡ
がメトトレキセートの検出、濃度測定の測定のために用
いられる限り、測定対象は特に限定されない。またメト
トレキセートの投与により重篤な副作用が引き起された
場合は、すみやかに血中メトトレキセートの有効濃度を
低下させる必要がある。そのような場合に、患者に本発
明に係るＤＮＡを投与することにより、当該ＤＮＡが体
内に存在するメトトレキセートと結合し、メトトレキセ
ートを不活性化することにより、副作用の鎮静、若しく
は低減を図ることが可能である。
検出、濃度測定に供される対象としては、尿、血清、血
漿、全血、唾液、涙液、または髄液等のヒトおよび他の
動物由来の体液が例示される。しかし、本発明のＤＮＡ
がメトトレキセートの検出、濃度測定の測定のために用
いられる限り、測定対象は特に限定されない。またメト
トレキセートの投与により重篤な副作用が引き起された
場合は、すみやかに血中メトトレキセートの有効濃度を
低下させる必要がある。そのような場合に、患者に本発
明に係るＤＮＡを投与することにより、当該ＤＮＡが体
内に存在するメトトレキセートと結合し、メトトレキセ
ートを不活性化することにより、副作用の鎮静、若しく
は低減を図ることが可能である。
【００１３】本発明の新規なＤＮＡはランダムな塩基配
列を有するＤＮＡの集団からメトトレキセートに特異的
に結合する配列を有するＤＮＡを選びだしてくることに
よって作製することができる。すなわち、化学合成に
よるランダム塩基配列ＤＮＡライブラリー作成、ＰＣ
Ｒによる増幅、メトトレキセートを担持させた担体を
用いたカラムクロマトグラフィーによる選抜の工程によ
って作製することができる。
列を有するＤＮＡの集団からメトトレキセートに特異的
に結合する配列を有するＤＮＡを選びだしてくることに
よって作製することができる。すなわち、化学合成に
よるランダム塩基配列ＤＮＡライブラリー作成、ＰＣ
Ｒによる増幅、メトトレキセートを担持させた担体を
用いたカラムクロマトグラフィーによる選抜の工程によ
って作製することができる。
【００１４】まず、合成時の収率や、ベクターへの組み
込みやすさなどを考慮して、配列番号４のような塩基配
列を設計し、全長で約１００塩基のうち、５’、３’末
端のそれぞれ約２０塩基をプライマー結合部位とし、残
りの６０塩基をランダム配列とし、固相法によりランダ
ムに合成する。この合成により理論的には４60種類の配
列を有するＤＮＡライブラリーを作製することが出来
る。
込みやすさなどを考慮して、配列番号４のような塩基配
列を設計し、全長で約１００塩基のうち、５’、３’末
端のそれぞれ約２０塩基をプライマー結合部位とし、残
りの６０塩基をランダム配列とし、固相法によりランダ
ムに合成する。この合成により理論的には４60種類の配
列を有するＤＮＡライブラリーを作製することが出来
る。
【００１５】得られたランダム塩基配列ＤＮＡライブラ
リーに対して、まずプライマー１（配列番号５）とプラ
イマー２（配列番号６）を用いて通常のＰＣＲを行い、
主に配列番号４で表される塩基配列にＴ７プライマーに
相当する配列が付いたＤＮＡと、それに対して相補的な
配列を有するＤＮＡを得る。次いでプライマー１（配列
番号５）のみを使用して非対称なＰＣＲを行い、目的と
する配列番号４にＴ７プライマーが付いた塩基配列で表
される１本鎖ＤＮＡのみを増幅させる。
リーに対して、まずプライマー１（配列番号５）とプラ
イマー２（配列番号６）を用いて通常のＰＣＲを行い、
主に配列番号４で表される塩基配列にＴ７プライマーに
相当する配列が付いたＤＮＡと、それに対して相補的な
配列を有するＤＮＡを得る。次いでプライマー１（配列
番号５）のみを使用して非対称なＰＣＲを行い、目的と
する配列番号４にＴ７プライマーが付いた塩基配列で表
される１本鎖ＤＮＡのみを増幅させる。
【００１６】ＰＣＲを用いた増幅によりカラムクロマト
グラフィーを行うのに十分なＤＮＡ量が確保できたら、
メトトレキセートを担持させた担体によりカラムクロマ
トグラフィーを行い、メトトレキセートに特異的に結合
するＤＮＡを選抜する。カラムクロマトグラフィーを行
う前にＤＮＡには分子内アニーリングを起こさせ、立体
的な構造をとるようにさせる必要がある。カラムクロマ
トグラフィーによるメトトレキセートに選択的に結合す
るＤＮＡの選別と、選ばれたＤＮＡのＰＣＲによる増幅
を交互に行うことにより、メトトレキセート結合性ＤＮ
Ａの、量的な確保と、ＤＮＡの集団の中での相対的な占
拠率を向上させることができる。
グラフィーを行うのに十分なＤＮＡ量が確保できたら、
メトトレキセートを担持させた担体によりカラムクロマ
トグラフィーを行い、メトトレキセートに特異的に結合
するＤＮＡを選抜する。カラムクロマトグラフィーを行
う前にＤＮＡには分子内アニーリングを起こさせ、立体
的な構造をとるようにさせる必要がある。カラムクロマ
トグラフィーによるメトトレキセートに選択的に結合す
るＤＮＡの選別と、選ばれたＤＮＡのＰＣＲによる増幅
を交互に行うことにより、メトトレキセート結合性ＤＮ
Ａの、量的な確保と、ＤＮＡの集団の中での相対的な占
拠率を向上させることができる。
【００１７】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。
【００１８】１．ランダム塩基配列ＤＮＡのＰＣＲによ
る増幅 配列番号４に記載した配列を有するＤＮＡのランダム
塩基配列ＤＮＡライブラリー、および、配列番号５、６
に記載のプライマー１、２を固相法で合成した（（株）
サワディーテクノロジーに製造委託）。得られたライブ
ラリーをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲの反応条件は
以下のとおりであった。；滅菌蒸留水７３．５μｌ、１
０倍濃縮ＰＣＲ緩衝液原液（パーキンエルマー社製）１
０μｌ、ｄＮＴＤ混合液（ファルマシア社製）１μｌ、
５μＭプライマー１（配列番号５）５μｌ、５μＭプラ
イマー２（配列番号６）５μｌ、ＡｍｐｌｉタッグＤＮ
Ａポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）０．５μｌ、
およびテンプレートＤＮＡ（配列番号４）５μｌ（約１
０6 分子包含）を混合し反応液１００μｌを調製した。
パーキンエルマー社製のサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ
ＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００）を用いて、調製し
た反応液を始め９４℃で１分間反応させ、続いて１サイ
クルを９４．０℃３０秒、５５．０℃３０秒、７２．０
℃３０秒とし、３０サイクルの反応を行った。最後に７
２℃で７分間反応を行い、ＰＣＲを終了させた。 ＰＣＲにより増幅させたＤＮＡに対して３％ＮｕＳｅ
ｉｖｅアガロースゲル電気泳動を行い、複製されたＤＮ
Ａに相当するバンドを切り出し、ＱＩＡＧＥＮＩＩキッ
ト（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりゲル中からＤＮＡを回収
した。 回収したＤＮＡの非対称ＰＣＲを以下の条件で行っ
た。；滅菌蒸留水６３．５μｌ、１０倍濃縮ＰＣＲ緩衝
液原液（パーキンエルマー社製）１０μｌ、ｄＮＴＤ混
合液（ファルマシア社製）１μｌ、１０μＭプライマー
１（配列番号５）５μｌ、ＡｍｐｌｉタッグＤＮＡポリ
メラーゼ（パーキンエルマー社製）０．５μｌ、および
テンプレートＤＮＡ（配列番号４）２０μｌを混合し反
応液１００μｌを調製した。調製した反応液を、パーキ
ンエルマー社製のサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ
ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００）を用いて、始め９４℃で
１分間反応させ、続いて１サイクルを９４．０℃３０
秒、５５．０℃３０秒、７２．０℃３０秒とし、４５サ
イクルの反応を行った。最後に７２℃で７分間反応を行
い、ＰＣＲを終了させた。 と同様に、電気泳動、および、回収を行い、一本鎖
オリゴＤＮＡ（主として配列番号４にＴ７プライマーの
付いた配列を有するもの）ライブラリーを得た。
る増幅 配列番号４に記載した配列を有するＤＮＡのランダム
塩基配列ＤＮＡライブラリー、および、配列番号５、６
に記載のプライマー１、２を固相法で合成した（（株）
サワディーテクノロジーに製造委託）。得られたライブ
ラリーをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲの反応条件は
以下のとおりであった。；滅菌蒸留水７３．５μｌ、１
０倍濃縮ＰＣＲ緩衝液原液（パーキンエルマー社製）１
０μｌ、ｄＮＴＤ混合液（ファルマシア社製）１μｌ、
５μＭプライマー１（配列番号５）５μｌ、５μＭプラ
イマー２（配列番号６）５μｌ、ＡｍｐｌｉタッグＤＮ
Ａポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）０．５μｌ、
およびテンプレートＤＮＡ（配列番号４）５μｌ（約１
０6 分子包含）を混合し反応液１００μｌを調製した。
パーキンエルマー社製のサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ
ＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００）を用いて、調製し
た反応液を始め９４℃で１分間反応させ、続いて１サイ
クルを９４．０℃３０秒、５５．０℃３０秒、７２．０
℃３０秒とし、３０サイクルの反応を行った。最後に７
２℃で７分間反応を行い、ＰＣＲを終了させた。 ＰＣＲにより増幅させたＤＮＡに対して３％ＮｕＳｅ
ｉｖｅアガロースゲル電気泳動を行い、複製されたＤＮ
Ａに相当するバンドを切り出し、ＱＩＡＧＥＮＩＩキッ
ト（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりゲル中からＤＮＡを回収
した。 回収したＤＮＡの非対称ＰＣＲを以下の条件で行っ
た。；滅菌蒸留水６３．５μｌ、１０倍濃縮ＰＣＲ緩衝
液原液（パーキンエルマー社製）１０μｌ、ｄＮＴＤ混
合液（ファルマシア社製）１μｌ、１０μＭプライマー
１（配列番号５）５μｌ、ＡｍｐｌｉタッグＤＮＡポリ
メラーゼ（パーキンエルマー社製）０．５μｌ、および
テンプレートＤＮＡ（配列番号４）２０μｌを混合し反
応液１００μｌを調製した。調製した反応液を、パーキ
ンエルマー社製のサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ
ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００）を用いて、始め９４℃で
１分間反応させ、続いて１サイクルを９４．０℃３０
秒、５５．０℃３０秒、７２．０℃３０秒とし、４５サ
イクルの反応を行った。最後に７２℃で７分間反応を行
い、ＰＣＲを終了させた。 と同様に、電気泳動、および、回収を行い、一本鎖
オリゴＤＮＡ（主として配列番号４にＴ７プライマーの
付いた配列を有するもの）ライブラリーを得た。
【００１９】２．メトトレキセート固定化担体によるカ
ラムクロマトグラフィー 回収したＤＮＡを結合バッファー（０．５Ｍ ＬｉＣ
ｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．６）３００μｌに溶解し、９５℃で５分間
インキュベートした。その後、ゆっくりと室温に戻し、
ＤＮＡに分子内アニーリングを起こさせた。 アガロース担体にメトトレキセートを固定化させ、ベ
ッド体積が約１ｍｌになるようにカラムに充填し、上記
結合バッファーでカラムの平衡化を行った。平衡化した
カラムに、３００μｌの結合バッファーに溶解させたＤ
ＮＡを該カラムにかけ、約６ｍｌの結合バッファーで該
カラムを洗浄し、非吸着ＤＮＡを除去した。次いで、蒸
留水を約３ｍｌ流して、カラムに吸着したＤＮＡを溶出
させて回収することにより、メトトレキセートに結合す
るＤＮＡの選抜を行った。回収されたＤＮＡに対しては
再度ＰＣＲを行った。メトトレキセート固定化アガロー
スでのカラムクロマトグラフィーによる選抜と回収した
ＤＮＡへのＰＣＲを６回繰り返した。このうち２回目の
選抜では蒸留水の代わりにメトトレキセート飽和溶液で
溶出を行い、非特異的にアガロース担体に吸着している
ＤＮＡを溶出させることなく、特異的にメトトレキセー
トに結合しているＤＮＡのみの溶出を行った。また５回
目の選抜を行う前にはメトトレキセートのアナログであ
る葉酸をアガロース担体に固定したプレカラムを通過さ
せて、葉酸やアガロース担体に結合するＤＮＡを除去し
た。以上の工程によりメトトレキセートに特異的に結合
するＤＮＡを得るとができた。
ラムクロマトグラフィー 回収したＤＮＡを結合バッファー（０．５Ｍ ＬｉＣ
ｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．６）３００μｌに溶解し、９５℃で５分間
インキュベートした。その後、ゆっくりと室温に戻し、
ＤＮＡに分子内アニーリングを起こさせた。 アガロース担体にメトトレキセートを固定化させ、ベ
ッド体積が約１ｍｌになるようにカラムに充填し、上記
結合バッファーでカラムの平衡化を行った。平衡化した
カラムに、３００μｌの結合バッファーに溶解させたＤ
ＮＡを該カラムにかけ、約６ｍｌの結合バッファーで該
カラムを洗浄し、非吸着ＤＮＡを除去した。次いで、蒸
留水を約３ｍｌ流して、カラムに吸着したＤＮＡを溶出
させて回収することにより、メトトレキセートに結合す
るＤＮＡの選抜を行った。回収されたＤＮＡに対しては
再度ＰＣＲを行った。メトトレキセート固定化アガロー
スでのカラムクロマトグラフィーによる選抜と回収した
ＤＮＡへのＰＣＲを６回繰り返した。このうち２回目の
選抜では蒸留水の代わりにメトトレキセート飽和溶液で
溶出を行い、非特異的にアガロース担体に吸着している
ＤＮＡを溶出させることなく、特異的にメトトレキセー
トに結合しているＤＮＡのみの溶出を行った。また５回
目の選抜を行う前にはメトトレキセートのアナログであ
る葉酸をアガロース担体に固定したプレカラムを通過さ
せて、葉酸やアガロース担体に結合するＤＮＡを除去し
た。以上の工程によりメトトレキセートに特異的に結合
するＤＮＡを得るとができた。
【００２０】３．評価 得られたメトトレキセート結合性ＤＮＡの塩基配列を決
定し、このうち、配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡ
を新たに固相法で合成し、得られた８μｇのＤＮＡを結
合バッファー５００μｌに溶解し、９４℃で５分間加熱
した後、室温に放置した。室温放置後、約５００μｌの
ＤＮＡ含有結合バッファーのうち３００μｌを結合バッ
ファーで平衡化したメトトレキセート固定化カラムに添
加した。添加後３０分間放置し、その後、結合バッファ
ー約３００μｌで６回カラムの洗浄を行うことにより、
非吸着ＤＮＡを除去した。その後蒸留水でメトトレキセ
ートに結合したＤＮＡを溶出させ、２６０ｎｍの吸収に
より結合したＤＮＡの量を測定し、カラムへの結合率を
計算したところ約５０％であった。この結合率の値は、
配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡが体液中等のメト
トレキセートの検出等に十分使用できることを示してい
る。
定し、このうち、配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡ
を新たに固相法で合成し、得られた８μｇのＤＮＡを結
合バッファー５００μｌに溶解し、９４℃で５分間加熱
した後、室温に放置した。室温放置後、約５００μｌの
ＤＮＡ含有結合バッファーのうち３００μｌを結合バッ
ファーで平衡化したメトトレキセート固定化カラムに添
加した。添加後３０分間放置し、その後、結合バッファ
ー約３００μｌで６回カラムの洗浄を行うことにより、
非吸着ＤＮＡを除去した。その後蒸留水でメトトレキセ
ートに結合したＤＮＡを溶出させ、２６０ｎｍの吸収に
より結合したＤＮＡの量を測定し、カラムへの結合率を
計算したところ約５０％であった。この結合率の値は、
配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡが体液中等のメト
トレキセートの検出等に十分使用できることを示してい
る。
【００２１】
【発明の効果】本発明のＤＮＡはメトトレキセートと特
異的に結合するため、体液中等に存在するメトトレキセ
ートの検出、濃度測定に用いることができ、またメトト
レキセートに起因する副作用を鎮静、または低減する薬
剤として使用することができる。
異的に結合するため、体液中等に存在するメトトレキセ
ートの検出、濃度測定に用いることができ、またメトト
レキセートに起因する副作用を鎮静、または低減する薬
剤として使用することができる。
【００２２】
配列番号：１ 配列の長さ：１１１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ TAATACGACT CAACTATAGG GAATTCGTCG ACGGATCCAG CGAGCAGCGT GTGGCGAGGT CCTGTGCTTA AGGTGGTCCG CTGAGGGGGC TGCAGGTCGA CGCATGCGCC G
【００２３】配列番号：２ 配列の長さ：９５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCAGCGAGCA GCGTGTGGCG AGGTCCTGTG CTTAAGGTGG TCCGCTGAGG GGGCTGCAGG TCGACGCATG CGCCG
【００２４】配列番号：３ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ AGCGAGCAGC GTGTGGCGAG GTCCTGTGCT TAAGGTGGTC CGCTGAGGGG G
【００２５】配列番号：４ 配列の長さ：１０４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNCTGCAGGT CGACGCATGC GCCG
【００２６】配列番号：５ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ TAATACGACT CAACTATAGG GAATTCGTCG ACGGAT
【００２７】配列番号：６ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ CGGCGCATGC GTCGACCTG
Claims (3)
- 【請求項１】下記（配列表の配列番号１）の塩基配列を
有するメトトレキセート結合性ＤＮＡ。 TAATACGACTCAACTATAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAG GTGGTCCGCTGAGGGGGCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG - 【請求項２】下記（配列表の配列番号２）の塩基配列を
有するメトトレキセート結合性ＤＮＡ。 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAGGTGGTCCGCTGAGGGG GCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG - 【請求項３】下記（配列表の配列番号３）の塩基配列を
有するメトトレキセート結合性ＤＮＡ。 AGCGAGCAGCGTGTGGCGAGGTCCTGTGCTTAAGGTGGTCCGCTGAGGGGG
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8335432A JPH10165183A (ja) | 1996-12-16 | 1996-12-16 | メトトレキセート結合性ｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8335432A JPH10165183A (ja) | 1996-12-16 | 1996-12-16 | メトトレキセート結合性ｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10165183A true JPH10165183A (ja) | 1998-06-23 |
Family
ID=18288502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8335432A Withdrawn JPH10165183A (ja) | 1996-12-16 | 1996-12-16 | メトトレキセート結合性ｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10165183A (ja) |
-
1996
- 1996-12-16 JP JP8335432A patent/JPH10165183A/ja not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20040302 |