JPH10167983A - 弱毒生ネオスポラワクチン - Google Patents

弱毒生ネオスポラワクチン

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JPH10167983A
JPH10167983A JP9310686A JP31068697A JPH10167983A JP H10167983 A JPH10167983 A JP H10167983A JP 9310686 A JP9310686 A JP 9310686A JP 31068697 A JP31068697 A JP 31068697A JP H10167983 A JPH10167983 A JP H10167983A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の目的は、病原性寄生原虫、ネオスポ
ラの弱毒生培養物および哺乳動物における臨床的疾患お
よび流産の予防に有用なこれから作られるネオスポラ病
に対する生ワクチンを提供することである。 【解決手段】 本発明生ワクチンは、細胞が親株ものと
比較して弱毒した病原性を示すが、生ワクチンとして投
与された場合ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する
免疫斑の引き金を引くことができる、ネオスポラ種の病
原性親株から由来する株の細胞の培養物を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は病原性原虫、ネオス
ポラ(Neospora)の弱毒株、並びに哺乳動物おける臨床的
疾患および流産の予防に有用である弱毒株から調製され
るネオスポラ病（ｎｅｏｓｐｏｒｏｓｉｓ）に対する生
ワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】ネオスポラは、動物の病原性寄生原虫で
あって、哺乳動物における流産、新生児死亡、先天的感
染症および脳疾患の主な原因として最近認識されてき
た。デュベイおよびリンドセイ(Dubey and Lindsay) 、
1993、Parasitology Today, 9:452-458 。ネオスポラ
カニナム(N. caninum)はイヌに感染し、先天的に子犬に
感染し、これがしばしば脳性麻痺（ｐｒａｌｙｓｉｓ）
に繋がる。ネオスポラ カニナムのタキゾイトは自然に
感染した子犬から単離された。リンドセイおよびデュベ
イ、1989、J. Parasitol. 、75:163-165。ネオスポラ種
は家畜牛（ｄａｉｌｙ ｃａｔｔｌｅ）における流産の
主な原因である。ネオスポラ関連疾患、すなわちネオス
ポラ病のケースはヤギ、ヒツジおよびウマにおいても報
告されている。
【０００３】ネオスポラ カニナムは病原体、トキソプ
ラズマ ゴンジ(Toxoplasma gondii) と表面的には類似
しているが、ネオスポラ カニナムとトキソプラズマ
ゴンジは抗原性および微細構造的には相互に区別されて
きた。デュベイおよびリンドセイ、1993、前出。さら
に、流産したウシ胎児の脳から単離されそしてインビト
ロで連続培養したネオスポラ様の寄生原虫は、抗原的に
も微細構造的にもトキソプラズマ ゴンジおよびハモン
ディア ハモンジ(Hammondia hammondi)とは異なり、ネ
オスポラ カニナムと最も類似している。コンラッドら
(Conrad et al.)、1993、Parasitology 106:239-249。
さらに、核の小サブユニットリボソームRNA 遺伝子の分
析により、ウシおよびイヌから単離されるネオスポラ種
の間にヌクレオチドの差がないことが証明されたが、し
かしトキソプラズマ ゴンジとの一定の差を示した。マ
ルシュら、1995, J.Parasitol. 81:530-535 。
【０００４】ネオスポラのウシからの単離物の、ウシの
流産および先天的疾患における病因論的役割が確認され
た。バールら(Barr et al.) 、1994, J.Vet. Diag. Inv
est.6: 207-215 。中枢神経系ネオスポラ病の囓歯目動
物モデルがネオスポラ カニナムに感染した同系BALB/c
マウスを用いて開発された。リンドセイら、1995, J.Pa
rasitol. 81:313-315。さらに、妊娠した異系および同
系マウスにおけるネオスポラ カニナムの経胎盤伝達を
研究するためのモデルがコーレら(Cole et al.) 、199
5, J.Parasitol. 81:730-732 およびロングら(Long et
al.) 、1996, J.Parasitol. 82:608-611 にそれぞれ記
載されている。さらに、自然獲得されたネオスポラ- 誘
因家畜流産と非常に似ている実験用ネオスポラ カニナ
ム小型ヤギ(pygmy goat)のモデルが示されている。リン
ドセイら、1995, Am. J. Vet. Res.56:1176- 1180。
【０００５】ＷＯ第9525541号にはウシネオスポラの生
物学的に純粋な培養物、抗- ネオスポラ抗体およびネオ
スポラ- 特異的核酸を検出する方法、並びにワクチンと
して使用するためのウシネオスポラ抗原および担体を含
む組成物を記載している。しかしながら、WO第9525541
号にはネオスポラの弱毒した生培養物、またはこれから
調製されるワクチン接種した動物における保護免疫反応
の引き金を引くことができる生ワクチンについては記載
されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】第一の見地において、
本発明は、ネオスポラ種の病原性親株から由来する株の
細胞であって、該細胞が親株のものと比較して弱毒の病
原性を示すが生ワクチンとして投与した場合ネオスポラ
病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引く
ことができるものの培養物を提供することである。
【０００７】第二の見地において、本発明は、ネオスポ
ラ種の病原性親株から由来する株の生細胞であって、親
株のものと比較して弱毒の病原性を示すが生ワクチンと
して投与した場合、ネオスポラ病に対して哺乳動物を保
護する免疫反応の引き金を引くことができる細胞の免疫
学的に有効な量、並びに獣医学的に許容可能な担体とを
含む、ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護するための
ワクチンを提供することである。本発明のワクチンはさ
らに一つ以上の他の成分、たとえばアジュバントを含ん
でよい。本発明のワクチンはネオスポラにより起こされ
る感染症および疾患に感受性のある哺乳動物種、たとえ
ば非限定的に、イヌ、ウシ、ヤギ、ヒツジおよびウマへ
投与されうる。
【０００８】第三の見地において、本発明は、ネオスポ
ラ種の病原性親株からの細胞を変性し；親株の細胞と比
較して弱毒の病原性を示す変性した細胞の一つ以上を選
択し、クローン増殖させ；そして、生ワクチンとして投
与された場合、ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護す
る免疫反応の引き金を引くことができる弱毒細胞の一つ
以上を選択し、クローン増殖させることを含む、ネオス
ポラ病に対し哺乳動物を保護するワクチンに使用するた
めのネオスポラ病原性親株からの弱毒細胞の培養物を調
製する方法を提供することである。
【０００９】第四の見地において、本発明は、ネオスポ
ラ種の病原性親株からの細胞を変性し；親株の細胞と比
較して弱毒の病原性を示すが、生ワクチンとして投与さ
れた場合、哺乳動物においてネオスポラ病に対し保護す
る免疫反応の引き金を引くことができる変性された細胞
を選択し、クローン増殖させ；そして哺乳動物に対する
生ワクチンとして投与されるのに適する形態となるよう
に、弱毒細胞の免疫学的に有効な量を獣医学的に許容可
能な担体とともに組み合わせることを含む、ネオスポラ
病に対し哺乳動物を保護するワクチンを調製する方法を
提供することである。
【００１０】第五の見地において、本発明は、ネオスポ
ラ種の病原性親株から由来する株の生細胞であって、親
株のものと比較して弱毒の病原性を示すが、生ワクチン
として投与された場合、ネオスポラ病に対して哺乳動物
を保護する免疫反応の引き金を引くことができる生細
胞、並びに獣医学的に許容可能な担体、とを含むワクチ
ンの免疫学的に有効な量を哺乳動物へ投与することを含
む、ネオスポラ病に対して哺乳動物にワクチン接種する
ための方法を提供することである。
【００１１】第六の見地において、本発明は、ネオスポ
ラ種の病原性親株から由来する株の生細胞であって、親
株のものと比較して弱毒の病原性を示すが、生ワクチン
として投与された場合ネオスポラ病に対し哺乳動物を保
護する免疫反応の引き金を引くことができる細胞の免疫
学的に有効な量；疾患または病状に対して哺乳動物を保
護する免疫反応の引き金を引く一つ以上の他の抗原；並
びに獣医学的に許容可能な担体とを含む、混合ワクチン
を提供するものである。この混合ワクチンはさらに一つ
以上の他の成分たとえばアジュバントを含むことができ
る。
【００１２】
【課題を解決するための手段】出願人は、ネオスポラ種
の病原性株の細胞を弱毒化し、その得られた弱毒細胞が
生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対し哺
乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くことができる
ことを発見した。したがって本発明は、ネオスポラ種の
病原性親株から由来する株の細胞であって、親株のもの
と比較して弱毒の病原性を示すが生ワクチンとして投与
した場合ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫
反応の引き金を引くことができる細胞の培養物を提供す
るものである。
【００１３】本発明はさらに、ネオスポラ種の病原性親
株からの細胞をたとえば高次の連続継代培養または突然
変異誘発剤への暴露により、あるいは組換えDNA 技術を
用いた遺伝子工学により変性し；親株の細胞と比べて弱
毒の病原性を示す一つ以上の変性した細胞を選択し、ク
ローン増殖させ；そして、生ワクチンとして投与された
場合ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応
の引き金を引くことができる弱毒細胞の一つ以上を選択
し、クローン増殖させることを含む、ネオスポラ病に対
し哺乳動物を保護するワクチンに使用するためのネオス
ポラ種の弱毒細胞の培養物を調製する方法を提供する。
【００１４】本明細書中で使用される用語“ネオスポラ
病(neosporosis) ”とは、ネオスポラの種または株によ
る哺乳動物の感染、またはネオスポラによる哺乳動物の
感染に伴う臨床的症候群、症状、状態または病状のいず
れかに関する。
【００１５】本明細書中で使用する用語“弱毒された、
弱毒の（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）”とは、そこから弱毒
細胞、培養物または株が由来するネオスポラの親株のも
のと比較してインビトロまたはインビボで感染力または
菌力において検出可能な低下を示す、ネオスポラの細
胞、培養物または株を示す。菌力における低下は、たと
えばインビトロまたはインビボにおける感染力を含む菌
力の特性、または感染に伴う臨床的症候群または症状の
程度または進行速度におけるいずれかの低下を含む。
【００１６】用語“親株”は、インビボまたはインビト
ロで一つ以上の継代によりまたは弱毒工程によりこれか
ら由来する弱毒株より、哺乳動物へ投与されたとき比較
的高い病原性を示すネオスポラの株に関する。
【００１７】さらに本発明は特定の哺乳動物種において
病原性ではない株または種から由来するネオスポラの株
の細胞であって、この細胞がその哺乳動物種のメンバー
において保護免疫反応の引き金を引くことのできるよう
に化学的または遺伝的手段により変性された細胞のワク
チンの調製およびその使用を含む。
【００１８】本発明の弱毒生細胞は、生ワクチンとして
一回以上の投与後ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護す
る免疫反応の引き金を引くことができる。“保護免疫反
応”は、哺乳動物において抗体もしくは細胞仲介免疫の
いずれかまたは両方が生じて、次の感染を予防するかも
しくはかなり低下させ、またはネオスポラ病に伴う一つ
以上の臨床的徴候または症状を除くかもしくはその程度
をかなり軽減しまたは進行速度をかなり低下させる、い
ずれかの免疫学的反応として定義されうる。用語“免疫
学的有効量”は、哺乳動物へ投与された場合、保護免疫
反応の引き金となるワクチンまたは抗原の量または投与
量に関する。
【００１９】ネオスポラの弱毒株の調製 本発明はネオスポラの病原性株の細胞が弱められ、そし
て得られた弱毒細胞が生ワクチンとして投与された場合
ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引
き金となりうるという発見に基づくものであり、本発明
の実施が弱毒化の特定の方法に制限されるものではな
い。むしろ、ネオスポラの病原性株の細胞の弱毒化は、
この分野で公知の技術または手法のいずれかを用いて、
たとえば非限定的例であるが、高次継代培養、または突
然変異誘発剤への暴露、または組み換えDNA 技術を用い
た遺伝子工学、またはこれらの組合せにより行われう
る。
【００２０】高次継代培養は、感受性宿主細胞における
ネオスポラの病原性株の細胞のインビトロ培養を十分な
弱毒化が生じるまで繰り返し行うことにより行われる。
継代は弱毒化細胞を選択するための特別な環境条件下で
行ってもよい。たとえば、継代培養は、哺乳動物へワク
チンを投与する場合、増殖しないかまたは低速で増殖す
るだけのネオスポラの温度感受性株を選択するために、
ワクチン接種した意図する哺乳動物の体温より低い温度
で行いうる。
【００２１】突然変異誘発は、当該技術分野で記載され
ているように、化学的突然変異原または放射線へネオス
ポラ細胞を晒すことにより行いうる。本発明の実施に有
用な化学的突然変異原の非限定的例は、N-メチル- N'-
ニトロ- N-ニトロソグアニジン(MNNG)(シグマ）であ
り、その使用が以下の実施例１に記載されている。放射
線は紫外線またはイオン化放射線のいずれかから選択さ
れうる。
【００２２】突然変異原への暴露の程度、すなわち化学
的突然変異原の濃度、または放射線のレベル、ならびに
暴露期間は、弱毒レベルの病原性を示すが、哺乳動物へ
生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に対して
保護する免疫反応の引き金となりうるネオスポラの一つ
以上の生細胞が得られる量であることが好ましい。突然
変異誘発剤の使用に好適なパラメーターは標準技術を用
いて経験的に決定されうる。
【００２３】ネオスポラの病原性株はまた、当該分野で
公知の技術に従って組み換えDNA 技術を用いて弱めら
れ、本発明はこれから調製される変性した株およびワク
チンを含むものである。本発明を実施するために使用さ
れうる組換えDNA 技術の非限定的例は、一つ以上の遺伝
子を無力化し、その結果弱毒病原性を有する株を得る遺
伝子置換または遺伝子ノックダウンを含む。無力化され
うる遺伝子は、たとえば必須代謝遺伝子、または菌力フ
ァクターをコードする遺伝子、または哺乳動物宿主にお
いて免疫反応を調節する役割を果たす表面抗原をコード
する遺伝子を含む。
【００２４】ネオスポラゲノムにおける分裂の標的にさ
れうる必須代謝遺伝子の非限定的例は、ジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ- チミジル酸 シンターゼ(DHFR-TS) 遺伝子
である。チタスら(Titus et al.)、1995, Proc.Natl.Ac
ad. Sci. U.S.A. 、92: 10267-10271 は、DHFR-TS 遺伝
子をノックアウトして安全な生ライシュマニアワクチン
(Leishmania vaccine)を作ることを記載している(文献
は、参考文献として援用される）。ネオスポラにおける
DHFR-TS 遺伝子を分裂させることにより、継続する増殖
に対しチミジンを必要とし、弱められた病原性を示し、
そして生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に
対し哺乳動物において保護する免疫反応の引き金となり
うる栄養要求性突然変異体が作り出されるであろう。
【００２５】遺伝子置換または遺伝子ノックダウンのた
めの組換えDNA 技術が当該技術で公知であり、これに限
定されるものでないが、相同組換えの利点を有するもの
を含む。たとえば、ネオスポラの病原性株において、必
須の代謝遺伝子好ましくは一本のコピー遺伝子に通常は
近接するかまたは内部に位置する相同ヌクレオチド配列
を含むベクターたとえばプラスミドを用いて、ネオスポ
ラの病原性株の細胞を形質転換するかまたはトランスフ
ェクトしてもよい。相同ヌクレオチド配列の間またはそ
の内部において、ベクターは、病原性株におけるヌクレ
オチド配列に相当するがしかしたとえば病原性株の配列
と比較して一つ以上のヌクレオチドにおいて非- サイレ
ント( non-silent) " 変化または欠失を有する結果とし
て不完全であるヌクレオチド配列をさらに含んでもよ
い。ベクターを用いた病原性株の細胞の形質転換に続い
て、ネオスポラゲノムへ不完全な遺伝子配列を組み込
み、これはまた本来のすなわち野性型 "配列を置換する
ために働く。したがって、標的遺伝子が形質転換細胞に
おいて無力化される。次いで形質転換細胞を、弱毒病原
性を示すこれらの細胞についてスクリーニングする。次
いで弱毒病原性を示す形質転換細胞を、生ワクチンとし
て投与された場合ネオスポラ病に対して保護する哺乳動
物における免疫反応の引き金になりうるこれらの細胞に
ついて再びスクリーニングする。
【００２６】形質転換体の選択を助けるために、ベクタ
ーはさらにレポーター遺伝子生成物または他の選択性マ
ーカーをコードする配列を含むように設計されうる。本
発明に有用なレポーター遺伝子はこの技術でよく知られ
ており、たとえばクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ(CAT) をコードする遺伝子、またはルシフ
ェラーゼをコードする遺伝子を含む。レポーター遺伝子
のさらに別の非限定的例は、大腸菌β- ガラクトシダー
ゼをコードする配列であり、これはベクターへ挿入され
そしてたとえば赤色- β- D-ガラクトピラノシドのよう
な基質を着色生成物へ転化することを介して酵素活性を
検出することにより形質転換体を確認することに使用さ
れる。シーバーおよびブースロイド(Seeber and Boothr
oyd)、1996, Gene, 169:39-45 は、トキソプラズマ ゴ
ンジにおける形質転換体を検出するためにこのレポータ
ー酵素を使用し、この文献は参考文献として本明細書中
に援用される。
【００２７】本発明に有用な選択性マーカーをコードす
るコード配列は、当該技術でよく知られており、抗生物
質または抗- 代謝産物に対する抵抗性を付与するかまた
は栄養要求性を供給する遺伝子産物をコードするものを
含む。このような配列の例は、ヒグロマイシン、または
ネオマイシン、またはフレオマイシンに対する抵抗性を
付与するものを含む。異なる病原菌における耐微生物性
マーカーの使用の例がメシナら(Messina et al.)、199
5, Gene,165:213-217により記載されており、ここには
トキソプラズマ ゴンジにおいて安定な形質転換体を構
築するためにフレオマイシンに対する耐性マーカーを使
用することが記載されており、参考文献として援用され
る。
【００２８】レポーター遺伝子産物または選択性マーカ
ーに対するコード配列のいずれも、調節要素コード配列
と機能可能なように結合してベクターへ挿入されるのが
好ましい。ここで使用する調節要素 "とは、非限定的
に、非- 誘因性プロモーター、エンハンサー、オペレー
ターおよび他の発現を行いおよび／または調節するため
に働く当該技術で公知の他の要素を含む。また、ここで
使用されるDNA コード配列は、一つ以上の調節要素と機
能可能な結合(operative association) " にあり、ここ
で調節要素はDNA コード配列の転写および／または相当
するmRNAの翻訳を効果的に調節し行う。たとえば、ネオ
スポラ細胞において選択性マーカーble を発現するベク
ターは、ネオスポラの遺伝子からまたは非常に類似した
アピコンプレキサ(Apicomplexa) 、トキソプラズマから
の調節領域とともにble オープンリーディングフレーム
(ORF) を側部に位置させることにより構築されうる。別
の一本鎖コピーネオスポラまたはトキソプラズマ遺伝子
からの5'側部領域を使用してble を発現してもよい。一
本鎖コピートキソプラズマ遺伝子の例は次のようであ
る；（i)SAG1, 主なタキゾイト表面抗原、p30 をコード
する( ブルグら(Burg etal.) 、1988, J. Immunol. 14
1:3584-3591)；（ii）GRA1, 分泌たんぱく質、 p23をコ
ードする( セスブロン- デラウら(Cesbron-Delauw et a
l.) 、1989, Proc. Natl.Acad. Sci.86:7537-7541))；
（iii ）GRA2, 分泌たんぱく質、 p28をコードする( メ
ルサーら( Mercier et al.) 、1993,Mol. Biochem. Par
asitol.58:71-82)。；一本鎖コピーネオスポラ遺伝子の
例は次のものを含む：（i)トキソプラズマSAG1,GRA1 お
よびGRA2遺伝子の相同体、たとえば公開されているトキ
ソプラズマ配列に基づいて標準PCR 法を用いて同定；
（ii）ネオスポラ カニナムタキゾイトの主要な細胞表
面たんぱく質、NC-p43をコードする遺伝子( ヘムフィル
( Hemphill）、1996,Infect. Immun. 64:4279-4287) ；
および（iii ）免疫優性17- 、29-、30- および37kDa
排泄/ 分泌たんぱく質をコードする遺伝子( ブジェルカ
スら(Bjerkas et al.)、1994, Clin. Diag. Lab. Immu
n. 1:214-221)。SAG1遺伝子からの3'側部領域を使用し
てポリアデニル化配列を提供してもよい。5'プロモータ
ー、ble 遺伝子および3'ポリアデニル化配列の挿入のた
めのベクターの基本骨格は、標準的な市販のプラスミド
のいずれか、たとえばpBLUESCRIPT TM( ストラタジー
ン）でよい。
【００２９】適当なベクターを構築すると、これを用い
てネオスポラの親株からの一つ以上の細胞を形質転換ま
たはトランスフェクトする。ベクターは、たとえば非限
定的例であるが、エレクトロポレーション、微量注入、
ウィルストランスフェクション、リポソーム仲介トラン
スフェクション、微量発射爆撃(microprojectile bomba
rdment）のような公知技術により細胞へ導入される。
【００３０】ベクターをネオスポラ細胞へ導入すると、
宿主細胞ゲノム、またはエピソームへ導入されたコード
配列の存在、組み込みおよび維持は、非限定的例である
が、たとえばサザンハイブリッド化分析；逆転写酵素-
PCR (RT-PCR)を含むPCR 分析；予想されるたんぱく質生
成物に対する免疫学的または比色計による分析；マーカ
ー遺伝子機能たとえば新規栄養要求性の出現の有無の検
知；または病原性における弱毒性の検知を含む標準技術
により確認されそしてモニターされる。
【００３１】ベクター構築、形質転換、形質転換体の選
択、宿主細胞発現等の例、たとえば特に病原性原虫へ適
用されるものは、以下の刊行物に記載されており、これ
らは本明細書中に参考文献として援用される。：シーバ
ーおよびブースロイド、1996, 前出；ティタスら、199
5, 前出；メッシーナら、1995, Gene, 165: 213-217;シ
ブリーら(Sibley et al.) 、1994,Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 91:5508-5512 ；ドナルドおよびロース(Donal
d and Roos), 1994, Mol.Biochem. Parasitol., 63:243
-253；キムら(Kim et al.), 1993, Science, 262:911-9
14；リアンら(Ryan et al.)、1993, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA , 90: 8609-8613；ソルダティおよびブース
ロイド( Soldati and Boothroyd)、1993, Science, 26
0:349-352；エイドおよびソルナー- ウェッブ(Eid and
Sollner-Webb),1991, Proc. Natl.Acad. Sci.USA , 88:
2118-2121 ;レボウィッツら(LeBowitz et al.), 1990,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 87: 9736-9740 ; リー
およびファンデルプレグ(Lee and Van der Ploeg), 199
0, Science, 250:1583-1586 ；アスブレークら(Asbroek
et al.), 1990, Nature, 348:174 -175；クルツおよび
ベベルレイ(Cruz and Beverley), 1990, Nature, 348:1
71 -173 ；およびラバンら(Laban et al.),Nature, 34
3:572 -574。
【００３２】ベクター構築、形質転換、形質転換体の選
択、宿主細胞発現等を含む遺伝子組換えの一般的技術
は、さらにマニアティスら(Maniatis et al.) 、1989,
Molecu lar Cloning, A Laboratory Manual, Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.
Y.;アウスベルら(Ausubel et al.)1989, Current Proto
c ols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc
iates & Wiley Interscience, N.Y. ; サムブルックら
( Sambrook et al. ） 1989, Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; イニスら( Inn
is et al.）、(eds), 1995, PCR Strategie s , Academi
c Press, Inc., San Diego, Ca;エールリッヒ( Erlic
h） (ed), 1992, PCR Technology, Oxford University
Press, New York, に記載されており、これらは参考文
献として援用される。
【００３３】弱毒工程の後で、弱毒病原性の一つ以上の
指標を示す細胞を培養物から選択し、限界希釈後にクロ
ーン増殖する。このような指標の例は、非制限的である
が、インビトロで新規の温度感受性もしくは新規の栄養
要求性の出現、または菌力特性たとえば感染性、あるい
はとりわけ親株を用いた感染と比べて株の細胞の投与後
哺乳動物における一つ以上の徴候または症状の程度もし
くは進行速度の低下を含む。本発明を実施するのに有用
な温度感受性の特別な非限定的な例は、32℃で増殖する
がしかし37℃では増殖しない弱毒株の細胞である。この
ような温度感受性株は32℃で感染した宿主細胞の溶解を
起こし、その結果宿主細胞単層に損傷またはプラークが
出現する。37℃で増殖すると、弱毒株は十分に複製せ
ず、したがって宿主細胞単層にプラークが生じない。
【００３４】ネオスポラの弱毒株は、非限定的であるが
ネオスポラ カニナムのような属のいずれかの種のいず
れかの病原性株から由来するものである。弱毒株が実際
に由来するネオスポラ カニナムの特定病原性株の非限
定的例は、米国、メリーランド州20852 、ロックビレ、
パークタウンドライブ12301 のアメリカン タイプカル
チュー コレクション(ATCC)からの感染したMARC 145サ
ル腎臓細胞に存在する株NC-1(ATCC 受託番号 No. CRL-1
2231) である。NC-1株はまたデュベイら,1988, J. Am.
Vet. Med. Assoc. 193:1259-63に記載されており、この
文献は参考文献として援用される。これに代わって、ネ
オスポラの病原性株は、ネオスポラ病の臨床的症状を示
す感染動物の組織、器官または体液から、たとえば前記
の文献に記載されているように、標準単離技術を用いて
得られうる。ネオスポラ カニナムのNC-1株から由来す
る弱毒生株の非限定的例はNCTS-8であり、これはATCCか
らの感染したMARC 145サル腎臓細胞(ATCC 受託番号 No.
CRL-12230) に存在するものである。
【００３５】ネオスポラの親株および弱毒株の両方と
も、当該技術で公知の技術に従って株のタキゾイトを感
受性細胞系のいずれか、好ましくは哺乳動物細胞系に感
染させることによりインビトロで培養されうる。ネオス
ポラのタキゾイトが培養されうる哺乳動物細胞系は、と
りわけたとえばヒト包茎（ｆｏｒｅｓｋｉｎ）線繊芽細
胞( リンドセイら、1993, Am. J. Vet. Res. 54:103-10
6)；ウシ心肺大動脈内皮細胞( マルシュら、1995, 前
出）；およびウシ単球( リンドセイおよびデュベイ、19
89, 前出）である。たとえば、ネオスポラ カニナムの
タキゾイトは、Hs68ヒト包茎線繊芽細胞(ATCC 受託番号
No. CRL-1635) の単層において培養されうる( リンドセ
イら、1993、前出) 。ブラディゾイトもまた同様に培養
されそして取り扱われる。
【００３６】哺乳動物細胞培養物が増殖され、そしてネ
オスポラを感染した細胞培養物が当該技術において記載
されている幾つかの培養培地の一つで維持される。たと
えば、ネオスポラ カニナムのタキゾイトに感染したウ
シ心肺大動脈内皮細胞の静置単層培養が、熱不活化ウシ
胎児血清(FBS) または成人ウマ血清( ES)10%v/v 、2mM
L-グルタミン、50 U/ml ペニシリンおよび50μg / mlス
トレプトマイシンを添加したダルベッコ最小必須培地(D
MEM : ニューヨークのＧｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）において増殖されうる( コンラッドら、 1993
、前出) 。Hs68ヒト包茎線繊芽細胞の単層は、2%(v/v)
ウシ胎児血清、1.0mM ピルビン酸ナトリウム、1 x 104
U/mlペニシリン、1 x 10 4μg / mlストレプトマイシ
ン、5 x 10-2 mM 2- メルカプトエタノール並びに0.3mg
/ml L- グルタミンを含むRPIM 1640(Ｇｉｂｃｏ）(維持
培地）において維持されうる。ネオスポラに感染したHs
68ヒト包茎線繊芽細胞の単層培養物は、同定培地では
あるがウシ胎児血清が10%(v/v)まで増加した培地(増殖
培地）に維持される。新規栄養要求性を有するネオスポ
ラの弱毒株は当該技術で公知のように、増殖を支持する
ために培養基に対し適当な修正を要求するであろう。
【００３７】哺乳動物細胞のネオスポラ感染単層培養物
は、一般的には標準的組織培養条件たとえば37℃で5% C
O 2 で維持される。タキゾイトは一般に、培養物におけ
る哺乳動物細胞の70-90%が感染した場合、非感染単層培
養物に継代培養させ、これは標準的技術を用いて顕微鏡
的に決定されるであろう。タキゾイトは、標準的技術を
用いて宿主細胞を溶解しタキゾイトの生育力を維持し、
そしてたとえば濾過または遠心分離によりタキゾイトを
集めることにより、感染した哺乳動物細胞培養物から集
められうる。
【００３８】ワクチンの調製および使用 本発明は、ネオスポラ種の病原性親株から由来する株の
生細胞であって、親株のものと比べて弱毒の病原性を示
すが、生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ病に
対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金となりうる
細胞の免疫学的に有効な量、並びに獣医学的に許容可能
な担体とを含む、ネオスポラ病に対するワクチンを提供
する。
【００３９】本発明はさらに、ネオスポラ種の病原性親
株からの細胞を変性し；親株の細胞と比較して弱毒の病
原性を示すが、生ワクチンとして投与された場合、哺乳
動物においてネオスポラ病に対して保護する免疫反応の
引き金となりうる変性細胞を選択し、クローン増殖さ
せ；そして、哺乳動物に対する生ワクチンとして投与さ
れるのに好適な形態となるように、弱毒細胞の免疫学的
に有効な量を獣医学的に許容可能な担体とともに組み合
わせることを含む、ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護
するワクチンを調製する方法を提供する。
【００４０】本発明はさらに、ネオスポラ種の病原性親
株から由来する株の生細胞であって、親株のものと比べ
て弱毒の病原性を示すが、生ワクチンとして投与された
場合ネオスポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応
の引き金となりうる生細胞、並びに獣医学的に許容可能
な担体とを含むワクチンの、免疫学的に有効な量を哺乳
動物に投与することを含む、ネオスポラ病に対し哺乳動
物へワクチン接種する方法を提供するものである。
【００４１】本発明のワクチンは、ネオスポラの弱毒株
の生細胞を、単独の抗原性成分とし、あるいはネオスポ
ラ病に関係するかまたは関係しないかもしれない疾患ま
たは病気に対し哺乳動物を保護する免疫反応の引き金と
なる他の抗原一つ以上と組合せとしてのいずれかで含
む。すなわち、本発明はさらに、ネオスポラ種の病原性
親株から由来する株の生細胞であって親株の細胞と比較
して弱毒の病原性を示すが生ワクチンとして投与された
場合ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護する免疫反応の
引き金を引くことができる細胞の免疫学的に有効な量；
疾患または病気に対して哺乳動物を保護する免疫反応の
引き金となる一つ以上の他の抗原；および獣医学的に許
容可能な担体とを含む組合せワクチンを提供するもので
ある。組合せワクチンはさらに他の成分の一つ以上たと
えばアジュバントを含んでよい。
【００４２】ワクチンは、非経口投与たとえば皮下また
は筋肉内注射により投与されるのが都合がよい。しかし
ながら、ワクチンはまた腹腔内もしくは静脈内注射によ
り、あるいは他のルート、たとえば経口、経鼻、直腸も
しくは経膣投与されてもよく、ワクチンがこのように投
与される場合、獣医学的に許容可能な担体が好適に選択
される。ワクチンは単に培養液に弱毒細胞を含んだだけ
でもよく、これは哺乳動物へ直接投与される。あるい
は、ワクチンは投与経路およびその細胞生存性を維持す
る能力に基づいて当該技術で公知のものから選択される
獣医学的および薬剤的に許容可能な担体と組み合わせた
弱毒細胞を含むものでもよい。このような担体の非限定
的例は、水、生理食塩水、緩衝化ビヒクル等である。好
適な他のワクチンビヒクルおよび添加剤は知られている
か、または当業者であれば明白であろう。たとえば、レ
ミントン(Remington) 、Pharmaceutical Science, 18th
ed.1990 ,Mack Publishingを参照、これは参考文献と
して援用される。
【００４３】ワクチンはさらに一つ以上の他の成分、た
とえば免疫調節剤、たとえばインターロイキン-1、また
は他の免疫強化物質たとえば獣医学的に許容可能なアジ
ュバントを含むことができる。アジュバントの非限定的
例は、フロイント完全アジュバントおよび不完全アジュ
バント、無機質ゲルたとえば水酸化アルミニウム、およ
び水中油型（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）または油中水
型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ）親株のものと比較して
弱毒の病原性を示すが配合剤を含む。免疫調節剤は、弱
毒ネオスポラ細胞の生育力およびワクチン接種した哺乳
動物における保護免疫反応の引き金を引く細胞の能力の
両方を維持するこれらの能力に基づいて選択される。
【００４４】本発明のワクチンにおいてアジュバントと
して有用な水中油型配合剤の非限定的例は、以下のよう
なエマルジョン1-3 を含む。エマルジョン1 は次のもの
からなる：（a) ME6201( 5%v/vスクワレン、0.1% v/vビ
タミンE 、および0.8% v/vトゥイーンTM 80 分散剤）;
（b)クィル A (QA) サポニン製剤( スーパーホス(Super
fos)(200μg / ml) ; および(c) コレステロール(cho
l.)(100 μg / ml) 。エマルジョン2 は次のものからな
る；（a) ME6201 ；および（b)アブリジンリポイドアミ
ン(1mg/ml)。エマルジョン3 は ME6210( 5%v/vスクワレ
ン、1.0% v/vビタミンE 、および0.8% v/vトゥイーンTM
80 分散剤）からなる。
【００４５】効果的投与量は通常の方法により決めら
れ、弱毒細胞の低投与量から始まり次いで効果を調べな
がら投与量を増加し、さらに系統的に投与量を変化させ
る。動物に対する最適投与量を決定する場合多数の要因
が考慮される。これらのうち主なものは、種、動物の大
きさ、動物の年齢、動物の全身的状態、動物における他
の薬剤の存在、ワクチン接種されている動物に対するネ
オスポラの特定株の菌力等である。実際的投与量は他の
動物研究の結果を考慮した後に選択されるのが好まし
い。
【００４６】ワクチンレジメはまた前記要因に基づいて
選択される。動物はいずれの時点でワクチン接種しても
よく、たとえば繁殖の直前またはその時点でもよい。完
全予防のためには補給投与、すなわちブースターが必要
なこともある。適切な免疫保護が達成されたかどうかを
検出する一つの方法は、ワクチン接種後に動物において
セロコンバーション（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）
および抗体価を測定することである。すなわち、本発明
のワクチンは、幾つかの要因たとえば別の動物の間でネ
オスポラ病が大量発生するタイミングなどに従って、ワ
クチン接種すべき特定の動物の生活のいずれかの時点で
投与されうる。ワクチンは、離乳期もしくはそれより幼
い時期の動物へ、またはより成長した動物へ、たとえば
ネオスポラ関連先天的疾患または流産に対し保護するた
めに繁殖前ワクチンとして投与される。効果的ワクチン
接種は一次ワクチン接種だけを必要とするか、または一
次ワクチン接種とブースターワクチン接種一回以上を必
要とする。ブースターワクチン接種は、一次ワクチン接
種後のいずれかの時点で、たとえば一次ワクチン接種後
の免疫反応、大発生の程度、大発生を起こすネオスポラ
の株の菌力、ワクチン接種された動物の健康などに従っ
て投与される。ワクチン接種のタイミングおよび追加免
疫の回数(もし、行う場合）は、すべての関連した要因
の分析に基づいて獣医が決めるのが好ましく、その幾つ
かは前述した通りである。
【００４７】ワクチンに使用されるネオスポラ細胞はタ
キゾイト( tachyzoites )が好ましいが、しかしブラデ
ィゾイト( bradyzoites )、またはオーシスト( oocyst
)、またはこれらの組み合わせたものに代えてもよい。
ワクチンにおける弱毒細胞の濃度は、好ましくは約1 x
10 3 /mlから約1 x 10 8/ ml、およびより好ましくは約
2 x 10 6 /mlから約2 x 10 7/ mlである。好適な投与サ
イズの範囲は約0.5mlから約1.0ml である。
【００４８】一般的には、予備投与に基づいて、動物へ
投与される弱毒細胞の数は、好ましくは約2 x 10 4から
約2 x 10 8、より好ましくは約2 x 10 5から約 2 x 10
7；そして最も好ましくは約1 x 10 6から約 1 x 10 7で
ある。
【００４９】本発明ワクチンは、ネオスポラにより起こ
される感染症または疾患に対し哺乳動物を保護する。ワ
クチンは、たとえば非限定的例であるが、ウシ、ヒツ
ジ、ヤギ、イヌおよびウマ種を含む妊娠または非妊娠哺
乳動物の両方を保護することに有用である。用語“保
護”は広い意味で使用され、ネオスポラによる感染の完
全な予防に限定されず、感染性における低下または感染
の結果生じる疾患または症状の程度における低下（感染
の結果生じる、一つ以上の病理学的作用もしくは徴候の
検出可能な低下を含む）、またはこのような病理学的作
用もしくは徴候の一つ以上の進行速度における検出可能
な低下を含む。本発明のワクチンはまた安全であり、す
なわちワクチン接種した哺乳動物に疾患または重度の副
作用を起こさない。
【００５０】以下の実施例を本発明の組成物および方法
を説明するために提供するが、しかしこれに限定される
ものではない。
【００５１】
【実施例】
実施例 1: ネオスポラ カニナムの温度依存性株の確立
およびBALB/cマウスにおける病原性の分析 本研究の目的は、ネオスポラ カニナムの温度感受性株
(NCTS)を確立し、血清抗体反応、組織嚢および脳病変
物、並びにネオスポラ病に対し高い感受性であることが
知られているBALB/cマウスにおける臨床的症状の発生を
分析することにより、これらの株の病原性を試験するこ
とである。
【００５２】材料および方法 ネオスポラ カニナムのNC-1株( デュベイら、1988、前
出）のタキゾイトを、記載(リンドセイおよびデュベ
イ、 1989,前出）したように、限界希釈し37℃に維持す
ることにより二度クローン化した。タキゾイトを25 cm2
フラスコに播種し、Hs68ヒトの包皮線繊芽細胞の単層
を含む96ウェルプレートにおいてクローン化した( ATCC
受託番号 No. CRL-1635)( リンドセイら、1993, 前
出）。Hs68細胞を、2%(v/v) ウシ胎児血清、1.0mM ピル
ビン酸ナトリウム、1 ×104 U/mlペニシリン、1 ×104
μg / mlストレプトマイシン、5 ×10-2mM 2- メルカプ
トエタノールおよび0.3mg/ml L- グルタミンを含むRPMI
1640 ( 維持培地）において予め増殖した。感染した細
胞培養物単層を同一培地において維持するが、しかしこ
の培地においてウシ胎児血清を10%(v/v)まで増加した(
増殖培地）。クローンを単離し、実験ではNC-1-2C 系と
命名したが、ここでは簡単にNC-1株と呼ぶ。
【００５３】NC-1株のタキゾイトを、増殖培地において
0.5 μM N-メチル- N'- ニトロ- N-ニトロソグアニジン
(シグマ）へ24時間晒すことにより突然変異誘発し、次
いで維持培地においてHs68細胞中で3 カ月間32.5℃にて
増殖し、その後タキゾイトを限界希釈によりクローン化
した。最初に12個のクローンを単離した。維持培地にお
いて32.5℃で8 カ月以上Hs68中で連続培養にて維持した
後、3 個のクローンをさらに別の研究のために選択し、
NCTS-4、NCTS-8およびNCTS-12 と命名した( NCTS = N.
caninum, temperature-sensitive( ネオスポラ カニナ
ム温度感受性））。
【００５４】マウスの血清学的試験を以下のように行っ
た。間接免疫蛍光抗体試験(IFAT)(デュベイら、1988,
前出）を使用してネオスポラ カニナムに対する抗体の
存在についてマウスからの血清を分析した。マウス血清
を、ワクチン接種研究において接種を始める直前に得
た。血清をまた病原性実験を生き残ったマウスの全てか
らも得た。血清を1:50から始まる二倍希釈で試験し、終
末点を滴定した。タキゾイトを抗原として使用した。陽
性サンプルは完全なタキゾイト表面蛍光を示した。陰性
サンプルは蛍光を示さないかまたは先行する最終蛍光(a
nterior end fluoresence ) を示すだけであった。
【００５５】ネオスポラ カニナムの別々の株で誘発さ
れたマウスの脳における病変部の存在を以下のように調
べた。各マウスからの脳を解剖時に摘出し、最初の半分
を組織病理学的検査のために10%v/v中性緩衝ホルマリン
溶液に定着した。組織切片を通常の組織学的技術を用い
て作り、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して顕微
鏡的に病変部の存在を検出した。
【００５６】ヘマトキシリン- およびエオシン- 染色脳
組織切片の病変部の点数をリンドセイら、1995, J. Par
asitol. 81: 313-315 に記載の基準に従って付けた。
【００５７】炎症/ 壊死性病斑の数 点数 病斑なし 1 病斑 1-5 2 病斑 6-10 3 病斑 >10 4病斑の平均径 点数 なし 1 100-200μm 2 200-500μm 3 > 500μm 4病変の程度 点数 病変なし 1 若干 2 軽度 3 中程度 4 重度 5
【００５８】病変部点数の平均が前記した三つの値を用
いて得られた。正常な、非- 感染マウスの脳は平均病変
部の点数が3.0 であった。平均病変部の点数はクルシカ
ル-ウァリス(Kruskal-Wallis)ノンパラメトリック試験
(nonparametric test)、および分布自由倍数比較法(dis
tribution free multiple comparision methods)を用い
て評価された。病変部を有する各群におけるマウスの数
をフィッシャーの精密試験(Fisher's exact test) を用
いて調べた。統計的有意差がP<0.05のカットオフで確立
された。
【００５９】各マウスからの脳の切片を、アビジン- ビ
オチンペルオキシダーゼ複合体(ABC) 免疫組織化学的試
験と組み合わせてネオスポラ カニナムに特異的なネズ
ミモノクロナール抗体、6G7 を用いて検査し、ネオスポ
ラ カニナムの段階を検出した( コーレら、1993,J.Ve
t.Diag. Invest. 5:574-589) 。
【００６０】各マウスの脳の第二の半分を、酸- ペプシ
ンで消化し、これを用いて哺乳動物細胞培養物に接種
し、ネオスポラ カニナムの組織嚢の存在を調べた。消
化するために、マウスの脳の第二の半分をハンクスの平
衡塩溶液(HBSS)3ml に入れ、23ゲージ針を有する注射器
に二度通した。酸- ペプシン溶液3 ml(0.52g ペプシ
ン、 0.50g NaCl 、98.6ml d H 2O 、 1.4ml濃HCl 、pH
0.8）をホモジネートへ添加して、水浴中で37℃にて10
分間インキュベーションした。酸ペプシン溶液を遠心分
離により除去し、第二の脳の半分全体を表すペレット
を、前記のように培養したHs68ヒト包茎線繊芽細胞の単
層を含む一本の25cm2 組織培養フラスコへ播種した。30
分後、播種物を除去し、Hs68細胞単層を洗浄し、前記の
新鮮な維持培地にてインキュベーションした。細胞培養
物を次いで30日間試験してネオスポラカニナムの存在を
調べた( リンドセイおよびデュベイ、1989、前出）。
【００６１】ネオスポラ カニナムのNC-1および三個の
選択されたNCTS株、すなわちNCTS-4、NCTS-8およびNCTS
-12 の病原性を以下のように調べた。BALB/cマウス( 8
週齢、雌）(Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌ
ｅｙ(HSD))に、HBSS( 対照）またはHBSS中のネオスポラ
カニナムのNC-1、NCTS-4、NCTS-8またはNCTS-12 株の
いずれかの5 ×105 タキゾイト( 0.5-1.2ml 全量）を皮
下接種した。接種後(PI)42または56日目の解剖時に、生
き残ったマウスを検査した( 表 1参照）。解剖時に生き
残ったマウスから血清を集めた。これらのマウスの脳を
病変部の点数と免疫組織学的について検査し、各脳の1/
2 を酸- ペプシン消化に用いて、前記のように組織嚢の
存在を調べた。
【００６２】
【表１】 表1. ネオスポラ カニナムのNCTS-4、NCTS-8、NCTS-12 または NC-1 株のタキ ゾイトを用いたBALB/cマウスの接種の結果 処理 マウウ ネオスポラ 結 果 群 No. カニナム株 1 4 HBSS( 対照） 死亡なし 2 5 NCTS-4 死亡なし 3 5 NCTS-4 死亡なし 4 5 NCTS-8 死亡なし 5 5 NCTS-8 死亡なし 6 5 NCTS-12 死亡なし 7 5 NCTS-12 死亡なし 8 5 NC-1 臨床的ネオスポラ病がPI約16日で発症；マウ スは1-7 群より活動低下；雑な毛で覆われた ；2 匹のマウスがPI34日目でネオスポラ病の ために安楽死；さらにもう一匹がPI39日目に 死亡。 9 5 NC-1 8 群と同じ臨床的徴候；マウスはPI 26 、30、 32および41日目に死亡が見られた
【００６３】
【表２】 表2. ネオスポラ カニナムの異なった株を接種したBALB/cマウスの平均病変部 点数 処理群 病変部を有するマウスNo./試 平均病変部点数 験No./生存 No. 1 (HBSS-対照） 0/4/4 3.00 2+3 (NCTS-4) 4/10/10a 4.80 4+5 (NCTS-8) 6/10/10a 5.50 6+7 (NCTS-12) 5/10/10a 4.90 8+9 (NC-1) 8/8/3 a ， b 9.38 a ， b a = 対照(HBSS)からの有意差(P< 0.05) b = NCTS-4、NC -8および NCTS-12からの有意差(P< 0.05)
【００６４】
【表３】 表3. マウス血清における抗体価の逆数(reciprocal antibody titers) 抗 体 価 の 逆 数 処理群 < 50 800 1,600 3,200 6,400 1(HBSS-対照） 2 - - - - 42 日 PI 1(HBSS） 2 - - - - 56日 PI 2(NCTS-4) - 1 4 - - 42日 PI 3(NCTS-4) - - 5 - - 56日 PI 4(NCTS-8) - - 3 2 - 42日 PI 5(NCTS-8) - - 3 2 - 56日 PI 6(NCTS-12) - - 3 2 - 42日 PI 7(NCTS-12) - - 4 1 - 56日 PI 8(NC-1) - - 2 - - 56日 PI 9(NC-1) - - 1 - - 56日 PI
【００６５】結果 臨床的ネオスポラ病および死亡は、NC-1株を接種したBA
LB/cマウスのみに発生した( 表1)。BALB/cマウス10匹中
3 匹だけがNC-1株感染で生き残った。NCTS-4、NCTS-8、
およびNCTS-12 株はBALB/cマウスにおいて死亡を起こさ
なかった。
【００６６】平均病変部点数を表2 に示す。病変部はNC
TS株を接種したマウスの何匹かの脳において見られた
が、しかし平均病変部点数は対照(HBSS)と比較した場合
統計的に有意差はなかった。平均病変部点数および病変
部を有するマウスの数における有意差は、NC-1株を接種
したマウスがHBSS( 対照）またはネオスポラ カニナム
のNCTS株のいずれかを接種したマウスと比較した場合に
見られた。
【００６７】血清抗体価を表3 に示す。NCTS株で誘発さ
れたすべてのマウス(30/30) においてかなりのIFAT価(
≧400)が検出された。これはNCTS株が、免疫学的に無傷
であるが、遺伝的には感受性である動物において、B 細
胞反応を刺激することができることを示唆する。NCTSで
誘発されたマウスにおけるIFAT価は、NC-1で誘発された
マウスにおけるものと等しいか、または高い場合もあ
る。
【００６８】組織嚢は、前記のような酸- ペプシン消化
技術を用いて検査した半分の脳のいずれにも検出されな
かった。これは、組織嚢はもし存在しているとしても、
ネオスポラ カニナムのNCTSまたはNC-1株を接種したマ
ウスにおいて数的には少ないことを示唆する。
【００６９】実施例 2 : HSD:ICR異系マウスにおけるネ
オスポラ カニナムのNCTS株の病原性分析 この研究の目的は、免疫競合であり同系BALB/cマウスに
おけるものよりネオスポラに耐性があるHSD:ICR 異系マ
ウスにおけるネオスポラ カニナムのNCTS株の病原性を
調べることにであった。
【００７０】材料および方法 この実験ではHSD:ICR マウス(4週齢、雌）を使用した。
対照を除くすべてのHSD:ICR マウスに、HBSS中のネオス
ポラ カニナムの適当な株の5 ×105 タキゾイトを接種
した( 全量0.5-1.2ml)。対照マウスにはHBSSのみを接種
した。生き残ったマウス全てを56日PIで屠殺した。血清
をIFAT試験のために集めた。これらのマウスから脳を集
め、最初の半分を前記したように、病変部点数および免
疫学的組織構造のために使用した。各脳の第二の半分
を、前記したように、組織嚢を検出するために酸- ペプ
シン消化に使用した。
【００７１】結果 NC-1を含む試験したネオスポラ カニナム株のいずれも
HSD:ICR マウスにおいて死亡を起こさず( 表4 ）、誘発
されない対照物と比べて病変部を有するマウスの数また
は平均病変部点数になんらの有意差も見られなかった
(表5)。組織切片またはABC 染色した切片において脳の
組織嚢はなんら観察されなかった。細胞培養物において
寄生虫は単離されなかった。
【００７２】
【表４】 表4. ネオスポラ カニナムのNC-1、NCTS-4、NCTS-8またはNCTS-12 株のタキゾ イトをHSD:ICR マウスに接種した結果 処理群 マウス No. ネオスポラ カニナ 結 果 ム株 10 5 HBSS( 対照） 死亡なし 11 5 NC-1 死亡なし 13 5 NCTS-4 死亡なし 14 5 NCTS-8 死亡なし 15 5 NCTS-12 死亡なし
【００７３】
【表５】 表5. ネオスポラ カニナムの様々な株を接種したHSD:ICR マウスの平均病変部 点数 処理群 病変部を有するマウスNo./実験No./ 平均病変部 生存No. 点数a 10 (HBSS 対照） 0 / 5 / 5 3.0 11 (NC-1) 3 / 5 / 5 6.0 13 (NCTS-4) 0 / 5 / 5 3.0 14 (NCTS-8) 1 / 5 / 5 4.0 15 (NCTS-12) 0 / 5 / 5 3.0 a = 処理された群の間には何の有意差も見られなかった。
【００７４】
【表６】 表6.マウス血清における抗体価の逆数a 抗 体 価 の 逆 数 処理群 <50 400 800 1,600 3,200 6,400 10 (HBSS 対照） 5 - - - - - 11 (NC-1) - - - 2 3 - 13 (NCTS-4) - 1 3 1 - - 14 (NCTS-8) 1 - 2 1 1 - 15 (NCTS-12) 1 - 3 1 - - a = すべての価は56日PIで測定された。
【００７５】生き残りマウスの抗体価を表6 に示す。か
なりのIFAT価( ≧400)がNCTS株で誘発されたマウスの大
部分(13/15) において検出され、これはこれらの株が免
疫学的には無傷であるが（ｉｎｔａｃｔ）が遺伝的に耐
性のある動物におけるB 細胞反応を起こすことができる
ことを示す。
【００７６】組織嚢は組織学的に、免疫組織学的にまた
は酸- ペプシン消化法により検査された脳の一部に検出
されなかった。これらの結果は、BALB/cマウスを用いた
前記のような実施例1 にて示されたものを追認する。
【００７７】実施例3:免疫抑制されたHSD:ICR マウスに
おけるネオスポラ カニナムのNCTS株の病原性の分析 この研究の第一の目的は、免疫抑制されたHSD:ICR マウ
スにおけるネオスポラカニナムのNCTS株の病原性を測定
することであった。この研究の第二の目的は、37℃でネ
オスポラ カニナムのNCTS株のインビトロ継代培養後に
病原性が復元するかどうかを測定することであった。
【００７８】材料および方法 HSD:ICR マウス(4週齢、雌）を、-7、0 および7 日PIに
2mg メチルプレドニゾロンアセテート(MPA)(ユピオン-
ファルマシア）の筋肉内投与により免疫抑制した。リン
ドセイおよびデュベイ、1989、J.Parasitology 75:772-
779 。
【００７９】免疫抑制したHSD:ICR マウスに、0 日にて
NC-1、NCTS-4、NCTS-8およびNCTS-12 のいずれかのタキ
ゾイト2 ×105 を接種し、またはHBSS中のNCTS-4-37 、
NCTS-8-37 またはNCTS-12-37と命名した復元の可能性の
ある対照物(potential reversion controls ) の一つを
接種した( 全量 0.5-1.2ml)。次いでマウスを前記のよ
うに血清学的、組織学的および臨床的に検査した。
【００８０】NCTS-4、NCTS-8およびNCTS-12 クローン
を、37℃で88日間増殖し( 25細胞培養継代）、続いて免
疫抑制したHSD:ICR マウスに接種することにより病原性
の復元に関して検査した( 可能性のある復元株はNCTS-4
-37 、NCTS-8-37 およびNCTS-12-37と命名する）。
【００８１】結果 ネオスポラ カニナムのNC-1、NCTS-4-37 およびNCTS-1
2-37株は免疫抑制したHSD:ICR マウスにおいて100%の死
亡率を起こした( 表7)。NCTS-4、NCTS-8、NCTS-12 およ
びNCTS-8-37 株は免疫抑制したHSD:ICR マウスに対して
病原性が低く死亡率0-20% を起こしただけであった。平
均病変部点数を表8 に示す。PI 56 日目の解剖時に検査
したマウスのいずれからも酸- ペプシン消化物において
タキゾイトは検出されなかった。
【００８２】生存マウスの抗体価を表9 に示す。かなり
のIFAT価( ≧800)が誘発後56日目にNCTS-4、-8および-1
2 ならびにNCTS-8-37 マウスにおいて検出され、これら
の株が免疫学的に無傷であるが遺伝的に耐性がある動物
におけるB 細胞反応を刺激することができることを示
す。
【００８３】
【表７】 表7. ネオスポラ カニナムのNC-1、NCTS-4、NCTS-8およびNCTS-12 、または可 能性のある復元株のタキゾイトを免疫抑制したHSD:ICR マウスに接種した結果 処理群 マウスNo. ネオスポラ 結 果 カニナム株 16 5 HBSS( 対照） 死亡なし PI20日目にマウス3 匹が死亡または 17 5 NC-1 安楽死＊し、そしてPI22および23日 目の各々においてマウス一匹が死亡 18 5 NCTS-4 死亡なし 19 5 NCTS-8 マウス一匹がPI20日目に安楽死＊ 20 5 NCTS-12 マウス一匹がPI22日目に死亡 21 5 NCTS-4-37 PI13,14(2),16 および21日目に全て のマウスが死亡または安楽死＊ 22 5 NCTS-8-37 PI 29 日目にマウス一匹が死亡 23 5 NCTS-12-37 PI 14 日目に全てのマウスが死亡ま たは安楽死＊ ＊ = 臨床的脳ネオスポラ病のために瀕死のマウスは人道的理由のために安 楽死させた。
【００８４】
【表８】 表8. ネオスポラ カニナムの様々な株を接種した免疫抑制HSD:ICR マウスの平 均病変部点数 処理群 病変部を有するマウスNo./試 平均病変部点数 験No./生存 No. 16(HBSS-対照） 0 / 5 / 5 3.0 17(NC-1) 4 / 4 / 0 a 9.8a 18(NCTS-4) 1 / 5 / 5 3.6 19(NCTS-8) 2 / 5 / 4 5.2 20(NCTS-12) 3 / 5 / 4 6.2 21(NCTS-4-37) 3 / 3 / 0 a 8.7 22(NCTS-8-37) 5 / 5 / 4 a 8.2 23(NCTS-12-37) 4 / 4 / 0 a 9.5a a =対照物( 群16) とはかなりの差(P < 0.05)。
【００８５】
【表９】 表 9 マウス血清における抗体価の逆数a 抗 体 価 の 逆 数 処理群 <50 100 800 1,600 3,200 6,400 12,800 16 (HBSS 対照） 5 - - - - - - 18 (NCTS-4) - 1 1 1 1 1 - 19 (NCTS-8) - - - 2 1 1 - 20 (NCTS-12) - - - 1 2 1 - 22 (NCTS-8-37) - - - - 1 2 1 a = 全ての力価はPI 56 日目に測定した。
【００８６】NCTS株は、NC-1、NCTS-4-37 およびNCTS-1
2-37株よりも免疫抑制HSD:ICR マウスにおいて病原性が
低かった。NCTS-4-37 またはNCTS-12-37復元株を接種し
たマウスの100%死亡率と比較してNCTS-8-37 復元株を接
種したマウスの比較的高い生存率(4/5) は、NCTS-8-37
復元株が37℃での継続する継代培養の間弱毒化した病原
性を維持することを示唆する。この示された弱毒化病原
性の維持に基づいて、ネオスポラ カニナムのNCTS-8株
が強力なワクチン候補として選択されそして以下に示す
ようにさらに別の研究に使用される。
【００８７】実施例4: 脳炎誘発ネオスポラ カニナム
に対するBALB/cマウスのワクチン接種 この研究の第一の目的は、ネオスポラ カニナムの生の
温度感受性株を用いたワクチン接種が、ネオスポラ カ
ニナムの病原性株たとえばNC-1を用いて行ったその後の
誘発により生じる疾患に対して保護をもたらすことがで
きることを示すものである。この研究の第二の目的は、
ネオスポラ カニナムのNC-1株を用いてその後に誘発さ
れた死滅( 凍結）NCTS-8タキゾイトを用いたBALB/cマウ
スのワクチン接種によりもたらされる保護のレベルを測
定することであった。
【００８８】材料および方法 BALB/cマウス(9週齢、雌）に、HBSS( 対照）(0.5ml) ま
たはHBSS中のNCTS-8株の5 ×10 5生タキゾイト(0.5ml)
、またはHBSS中の2 ×10 6死滅（凍結）タキゾイト(0.
5ml) のいずれかを皮下注射することによりワクチン接
種した( 表10) 。ワクチン接種を受けた動物に最初の注
射と同じ材料でPI 21 日目に追加免疫を行った。次い
で、追加免疫後14日目に、HBSS中のネオスポラ カニナ
ムのNC-1株の1 ×106 タキゾイトまたはHBSS単独( 対
照）を皮下注射( 全量0.5ml)することによりマウスを攻
撃した。
【００８９】IFATを使用して、前記したネオスポラ カ
ニナムに対する抗体の存在についての実験を生き抜いた
マウスからの血清を試験した。各マウスからの脳を解剖
時に摘出した。最初の半分を組織病理学および免疫組織
学的に使用し、そして第二の半分を前記したように酸-
ペプシン消化に使用した。凍結後のタキゾイトの生存能
力は、前記したように、Hs68ヒト包茎線繊芽細胞の単層
培養物を接種することにより決定された。
【００９０】結果 試験群のいずれのマウスも一回目のワクチンまたはブー
スターワクチンの接種後に死ななかった。HBSS(対照）
をワクチン接種したマウス10匹のうち2 匹、および死滅
NCTS-8タキゾイトをワクチン接種したマウス10匹のうち
3 匹がNC-1タキゾイトで攻撃後に死亡した。生き残った
マウスの平均病変部点数を表11に示す。
【００９１】生き残りマウスの抗体価の逆数を表12に示
す。有意のIFAT価( ≧800)が、生NCTS-8タキゾイトをワ
クチン接種し次いでブースターを行ったマウスにおいて
検出され、これは前記した先の結果を確認する。これと
対照的に、攻撃前に死滅NCTS-8タキゾイトをワクチン接
種したマウスのいずれにも有意のIFAT価が存在せず、こ
れは遺伝的に感受性の高い宿主において死滅タキゾイト
が有意の抗体反応を引き起こすことができなかったこと
を示す。
【００９２】ネオスポラ カニナムのタキゾイトは、偽
- ワクチン接種し攻撃した2 匹のマウス(24 群、マウス
No.1および2 ）および死滅NCTS-8タキゾイトをワクチン
接種した1 匹のマウス( 31群、マウスNo.5）からの酸-
ペプシン消化脳組織を接種した細胞培養物から単離され
た。タキゾイトは、他のいずれのマウスの脳組織を接種
した培養物からも単離されなかった。
【００９３】
【表１０】 表10. BALB/cマウスのワクチン接種および攻撃のためのプロトコール 処理群 マウスNo. ワクチン接種および追加免疫 攻 撃 24 5 HBSS NC-1 25 5 HBSS NC-1 26 5 NCTS-8( 生） HBSS 27 5 NCTS-8( 生） HBSS 28 5 NCTS-8( 生） NC-1 29 5 NCTS-8( 生） NC-1 30 5 NCTS-8( 死滅） NC-1 31 5 NCTS-8( 死滅） NC-1
【００９４】
【表１１】 表11. ワクチン接種し、誘発されたBALB/cマウスの平均病変部点数 処理群 病変部を有するマウスNo./試 平均病変部点数 験No./生存 No. 24 + 25 8 / 8 / 8 9.3 26 + 27 1 / 10 / 10 3.4a，b 28 + 29 1 / 10 / 10 3.3a，b 30 + 31 6 / 7 / 7 7.7 a = 群 24 + 25からの有効差 (P<0.05) b = 群 30 + 31からの有効差 (P<0.05)
【００９５】
【表１２】 表12. 誘発前および後におけるマウス血清の抗体価の逆数 誘発 抗 体 価 の 逆 数 処理群 前- 後- <50 50 100 400 800 1,600 3,200 6,400 24+25 (HBSS- 前 10 - - - - - - - 対照） 24+25 (HBSS- 後 - - - - - 1 4 3 対照） 26+27 (NCTS-8, 前 - - - 1 4 4 1 - 生;HBSS) 26+27 (NCTS-8, 後 - - - - 3 4 3 - 生;HBSS) 28+29 (NCTS-8, 前 - - - - 1 9 - - 生;NC-1) 28+29 (NCTS-8, 後 - - - - 1 8 1 - 生;NC-1) 30+31 (NCTS-8, 前 6 2 2 - - - - - 死;NC-1) 30+31 (NCTS-8, 後 - - - 1 1 2 2 1 死;NC-1)
【００９６】ネオスポラ カニナム のNCTS-8株の生タ
キゾイトをワクチン接種したマウスは死亡しないかまた
は臨床的疾患症候群を発症しなかった。NCTS-8株の生タ
キゾイトをワクチン接種し続いてNC-1株のタキゾイトで
攻撃したマウス( 表11、群 28+29) は、NCTS-8株の生タ
キゾイトをワクチン接種し続いてHBSSを投与したマウス
( 表 11,群26+27)の幾つかと殆ど同じ点数であった。こ
れは、NCTS-8株の生タキゾイトのワクチン接種がネオス
ポラ カニナムのNC-1株で感染したことにより起こされ
る疾患に対してかなり保護していることを示す。NCTS-8
株の死滅タキゾイトをマウスにワクチン接種すると、ネ
オスポラ病から僅かに保護される( 表11、群30+31)。
【００９７】実施例 5: ネオスポラ カニナムのNCTS-8
株の低投与量を用いたワクチン接種 本研究の目的は、ネオスポラ カニナムのNCTS-8株の低
投与量すなわち5 ×104 タキゾイトがその後の攻撃感染
に対して保護することができるかどうかを調べることで
あった。
【００９８】材料および方法 BALB/cマウス( 7 週齢、雌）に、HBSS(0.5ml) またはHB
SS中のNCTS-8株の5 ×10 4タキゾイト(0.5ml) のいずれ
かを皮下注射することによりワクチン接種した( 表13)
。タキゾイトのこの投与量は前記実施例に使用された
量の1/10であった。最初の注射と同じ材料でPI 21 日目
にマウスに追加免疫を行った。次いで、追加免疫後14日
目に、マウスをネオスポラ カニナムのNC-1株の1 ×10
6 タキゾイトで誘発した。
【００９９】IFAT を使用して、前記のようにネオスポ
ラ カニナムに対する抗体についての実験を生き抜いた
マウスからの血清を試験した。各マウスからの脳を解剖
により摘出した。最初の半分を組織病理学および免疫組
織学に使用し、そして残りの第二の半分を前記したよう
に酸- ペプシン消化に使用した。
【０１００】結果 ネオスポラ カニナムのNC-1株のタキゾイトで次に攻撃
後、一匹の対照マウス(HBSS のみを投与）が死亡した。
ネオスポラ カニナムのNCTS-8株タキゾイトの低投与量
をワクチン接種したいずれのマウスにも、NC-1株タキゾ
イトの次の攻撃後の死亡はなかった。病変部を有するマ
ウスの平均病変点数および数は、NCTS-8株のタキゾイト
の低投与量でワクチン接種したマウスにおけるよりもHB
SSのみの偽- ワクチン接種した対照マウスにおいて著し
く高かった( 表14) 。抗体価の逆数を表15に示す。
【０１０１】
【表１３】表13.BALB/c マウスにおける低投与量ワクチン接種および誘発のためのプロトコ ール 処理群 マウスNo. ワクチン接種およびブースター 誘 発 32 5 HBSS N C-1 36 5 NCTS-8(5×10 4タキゾイト） N C-1
【０１０２】
【表１４】 表14. マウスにおける平均病変部点数 処理群 病変部を有する生存マウスNo./ 平均病変部 生存マウスNo. 点数 32(HBSS/NC-1) 4/4 10.25a 36(NCTS-8/NC-1) 2/5 4.50 a =群 36 からの有意差(P<0.05)
【０１０３】
【表１５】 表15. 攻撃接種前のマウス血清における抗体価の逆数 抗 体 価 の 逆 数 処理群 <50 400 800 1,600 3,200 6,400 32(HBSS) 10 - - - - - 抗- ネオスポラ価 36(NCTS-8) - 3 4 3 - - 抗- ネオスポラ価
【０１０４】実施例6 : アジュバント含有または不含有
ワクチンの有効性 本研究の目的は、変性- 生ネオスポラワクチンへのアジ
ュバントの添加の効果、およびこれから得られるネオス
ポラ病に対する保護の程度を調べることであった。
【０１０５】材料および方法 予め行ったインビトロ試験の結果( データは図示せず）
は、少なくとも一つの変性- 生ネオスポラ カニナム
株、すなわちNCTS-8を幾つかの異なった水中油型製剤の
一つとともに同時培養した場合、ある程度の生存率およ
び伝染性をインビトロで保持することを示している。こ
れらのインビトロの結果に基づいて、三つの特定の配合
物をインビボ評価をするためにアジュバントとして選択
した。
【０１０６】15週齢の雌のBALB/cマウス10匹の群に、HB
SS単独( 対照）、またはHBSS中のネオスポラ カニナム
のNCTS-8株タキゾイト5 ×105 、または以下の三つの水
中油型エマルジョンの一つにおけるネオスポラ カニナ
ムのNCTS-8株タキゾイト5 ×105 のいずれかを、PI 0日
( 一回目のワクチン接種）および21日目(追加免疫）に
皮下注射(0.2ml) によりワクチン接種した。
【０１０７】エマルジョン1 は次のものからなる：（a)
ME6201 (5% v/vスクワレン、0.1%v/v ビタミンE および
0.8%v/v トゥイーンTM80分散剤）；（b)クィルA サポニ
ン製剤(QA)( スパーホス）(200μg / ml);および(c) コ
レステロール(chol.)(100 μg / ml) 。
【０１０８】エマルジョン2 は次のものからなる：（a)
ME6201；および（b)アブリジンリポイドアミン(1mg/m
l)。
【０１０９】エマルジョン3 は次のものからなる：ME62
01 (5% v/vスクワレン、1.0% v/vビタミンE および0.8%
v/vトゥイーンTM80分散剤）。
【０１１０】
【表１６】 表16. アジュバント含有および不含有ワクチン配合剤を試験するためのプロトコ ール 処 理 群 ワ ク チ ン エマルジョン 38 HBSS 不含有 39 NCTS-8 不含有 40 HBSS 1 41 NCTS-8 1 42 HBSS 2 43 NCTS-8 2 44 HBSS 3 45 NCTS-8 3
【０１１１】PI 35 日目に、すべてのマウスに、HBSS中
のネオスポラ カニナムNC-1株のタキゾイト1 ×106 (
0.2ml)を皮下投与することにより攻撃した。ワクチンの
効果を評価するために、3-5 匹の群をPI 49 および63日
目に屠殺した。
【０１１２】0 日において開始し、死亡率、ならびに毛
皮の粗さの外観、不規則な動き、骨盤部分麻痺および全
身的な衰弱に基づいて疾患を評価した。
【０１１３】組織病理学的分析を以下のように行った。
肺サンプルを49日目に得、10%v/v中性緩衝化ホルマリン
溶液に固定し、組織を切片化し、一般的な病理学的技術
を用いて染色した。ヘマトキシリン- およびエオシン-
染色肺切片をコード化し、処理群を認識することなく病
変部をブラインド方法により点数化した。以下の系を用
いて肺炎病変部を点数化した：0 = なし；1 = 軽度；2
= 中度；3 = 顕著；4=重度。
【０１１４】結果 ネオスポラ カニナムのNCTS-8株からのタキゾイトおよ
びアジュバントを含む配合物をワクチン接種したマウス
は、HBSS (56%)のみをワクチン接種した対照マウスと比
べてネオスポラ カニナムのNC-1株攻撃後に発生する軽
度の肺炎がかなり少ない( P<0.01) 。NCTS-8をワクチン
接種した非- 攻撃マウスは、ワクチン接種後9 週目に調
査した場合、いずれも脳炎疾患または寄生虫炎の徴候を
示さなかった( データは示さず）。これはNCTS-8の投与
が臨床的疾患を起こさないことを確認する。
【０１１５】結果は、弱毒生ネオスポラタキゾイトおよ
びアジュバントを含む配合物が、ネオスポラ病に対する
ワクチンとしての使用に関して、アジュバントを含まな
い同じ配合物と少なくとも同程度に有効であり、また安
全であることを示す( 表17)。
【０１１６】
【表１７】 表17. アジュバント含有または不含有ワクチンを投与したネオスポラ カニナム のNC-1株で誘発した後のマウス肺組織の組織病理学的分析 肺病変部を有するマウスNo. 処 理 処理群No. / 試験したマウスNo. 38 3 / 5 対照マウス 40 3 / 4 (HBSS のみをワクチン接種） 42 2 / 4 44 2 / 5 アジュバント不含有NC TS-8でワクチン接種し 39 0 / 4 たマウス アジュバント含有NC 41 1 / 4 TS-8でワクチン接種し 43 0 / 4 たマウス 45 3 / 4
【０１１７】実施例 7: ネオスポラ病からの小型ヤギ(p
ygmy goats) の保護 本研究の目的は、ネオスポラ カニナムの弱毒生株によ
る小型ヤギのワクチン接種がネオスポラ病に対してヤギ
を保護することができるかどうかを調べる。より詳しく
は、ネオスポラ誘因流産に対し小型ヤギの雌を保護する
ネオスポラ カニナムのNCTS-8株の生タキゾイトを含む
ワクチンの能力が試験された。
【０１１８】材料および方法 ほぼ2-5 才の範囲の小型ヤギの雌をランダムにA-E の群
に分けた(表18) 。非-偽ワクチン投与群( 群A-C)の各々
における投与量は、指示した株の4 ×106 タキゾイトか
らなる。0 日( 一回目）および21日目(追加免疫）の皮
下ワクチン接種( 1.0ml/雌）に続いて、28日および39日
目に雌をＬＵＴＡＬＹＳＥTMプロスタグランジン調剤
(アップジョン- ファルマシア）( 10mg/ ヤギ、筋肉内
経路）を用いて同調させた。雌は、52日と56日の間に自
然のサービス(natural service)により出産した。妊娠
した雌は超音波で調べられ、攻撃の時点で41日と55日の
妊娠期間であった。
【０１１９】群A-D の雌は、頸静脈内投与により血清不
含有維持培地(0.45ml)においてネオスポラ カニナムの
NC-1株の4 ×106 タキゾイトで攻撃された。次いで雌
を、超音波および攻撃後７日間にわたって毎日検温し、
そして攻撃後一週間当たり一回採血した。
【０１２０】
【表１８】 表18. 妊娠した小型ヤギの雌の処理群 群 雌No. ワクチン株 アジュバント 誘発株 A 4 NC-1 なし NC-1 B 5 NCTS-8 なし NC-1 C 4 NCTS-8 エマルジョン2 a NC-1 D 6 偽 エマルジョン2 NC-1 E 2 偽 なし なし
【０１２１】結果 ネオスポラ カニナムの生NC-1株( 群A)またはネオスポ
ラ カニナムの弱毒生NCTS-8株( 群B,C)のいずれかをワ
クチン接種したヤギは全てセロコンバーション（ｓｅｒ
ｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）し、そして追加免疫後10日目
に測定可能なIFAT価を有した( 表19) 。これらのデータ
により、NC-1およびNCTS-8は妊娠したヤギにおいて免疫
誘発性であることが示される。群A のGMT は群B および
C よりも数値的に高く、これは弱毒NCTS-8株と比べてNC
-1株の宿主において複製が強化されたことを示唆する。
【０１２２】表20は、小型ヤギの雌をネオスポラ誘因流
産から保護するためのネオスポラの弱毒生タキゾイトを
含むワクチンの能力を示す。生NC-1株をワクチン接種し
た4匹のヤギの雌(A) は、NC-1で誘発後に流産を示した
( 保護 0% ）。偽ワクチン接種したヤギの雌(D) の6 匹
中5 匹がNC-1誘発後に流産を示した( 保護17%)。対照的
に、NCTS-8をワクチン接種したヤギの雌(B) の5 匹中2
匹だけがNC-1で誘発後に流産し( 保護60% ）そしてアジ
ュバントを有するNCTS-8をワクチン接種したヤギの雌
(C) の4 匹中2 匹だけがNC-1で誘発後に流産した( 50%
保護）。
【０１２３】これらの結果は、妊娠した小型ヤギの雌が
ネオスポラ カニナムのNCTS-8株の弱毒した生タキゾイ
トのワクチン接種によりネオスポラ誘因流産に対しかな
り保護されたことを示す。これは、ネオスポラの病原株
から由来する弱毒した生タキゾイトのワクチン接種によ
りネオスポラ誘因流産に対し妊娠した哺乳動物が保護さ
れることの第一の証明である。
【０１２４】
【表１９】表19. 追加免疫後10日目の小型ヤギの抗体価
の逆数の幾何的平均値(GMT)群 抗体価の逆数(GMT) 範 囲 A 566 200 - 6,400 B 283 100 - 800 C 259 100 - 400 D <50 < 50E <50 < 50
【０１２５】
【表２０】 表20. 小型ヤギにおけるネオスポラ カニナムにより起こされる胎児流産に対し 弱毒生ワクチンによりもたらされる保護 群 ワクチン 流産 No./ 攻撃 No. 保護 % A NC-1 4/4 0 B NCTS-8 2/5 60 C NCTS-8 2/4 50 ｗ／アジュバント D 偽 5/6 17 E 妊娠対照 誘発せず なし
【０１２６】生物材料の寄託 以下の生物材料は、1996年11月6 日に米国、メリーラン
ド州20852 、ロックビレ、パークローンドライブ12301
のアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄
託され、以下の受託番号が付けられた； 1. MARC 145 サル腎臓細胞におけるネオスポラ カニナ
ムのNC-1株、ATCC受託番号 No. CRL-12231. 2. MARC 145 サル腎臓細胞におけるネオスポラ カニナ
ムのNCTS-8株、ATCC受託番号 No. CRL-12230. 前記した全ての特許、特許出願および文献もこれら全体
が、参考文献として本明細書中に援用される。
【０１２７】本発明はここに記載した特定の実施態様に
より範囲を制限されるものでなく、これは単に本発明の
個々の見地の例を示すだけである。機能的に等価な組成
物および方法も本発明の範囲内である。実際、ここに示
しそして記載したものに加えて、本発明の様々な変形が
微生物学、寄生虫学、免疫学、分子生物学、獣医学用医
薬および以後の記載からの関連する分野の当業者には明
白であろう。このような変形は添付の請求の範囲の範囲
内に属することを意図するものである。
フロントページの続き (71)出願人 597158986 309 Ｓａｍｆｏｒｄ Ｈａｌｌ，Ａｕｂ ｕｒｎ，Ａｌａｂａｍａ 36849，Ｕｎｉ ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉ ｃａ (72)発明者 デーヴィッド・エイ・ブレイク アメリカ合衆国コネチカット州06333，イ ースト・ライム，アッパー・パッタガンセ ット・ロード 196 (72)発明者 バイロン・エル・ブラッグバーン アメリカ合衆国アラバマ州36830，オーバ ーン，ウォータークレスト・コート 309 (72)発明者 デーヴィッド・エス・リンゼー アメリカ合衆国ヴァージニア州24073，ク リスチャンズバーグ，スリーピー・ホロ ー・ロード 1655

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細胞が親株のものと比較して弱毒の病原性
    を示すが、生ワクチンとして投与された場合ネオスポラ
    病（ｎｅｏｓｐｒｏｓｉｓ）に対して哺乳動物を保護す
    る免疫反応の引き金を引くことができる、ネオスポラ(N
    eospora)種の病原性親株から由来する株の細胞の培養
    物。
  2. 【請求項２】細胞が温度感受性である請求項１の培養
    物。
  3. 【請求項３】親株の種がネオスポラ カニナム(N.canin
    um) である請求項１または請求項２の培養物。
  4. 【請求項４】ネオスポラ カニナムの親株が、ATCC受託
    番号No.CRL-12231を有する MARC 145 サル腎臓細胞に存
    在するNC-1である請求項３の培養物。
  5. 【請求項５】弱毒化細胞の株が、ATCC受託番号No.CRL-1
    2230を有する MARC 145 サル腎臓細胞に存在するNCTS-8
    である請求項４の培養物。
  6. 【請求項６】ネオスポラの種の病原性親株から由来する
    株の生細胞であって、親株のものと比較して弱毒の病原
    性を示すが、生ワクチンとして投与された場合ネオスポ
    ラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引
    くことができる細胞の免疫学的に有効量、並びに獣医学
    的に許容可能な担体とを含む、ネオスポラ病に対し哺乳
    動物を保護するワクチン。
  7. 【請求項７】細胞が請求項２−５のいずれか一つに定義
    されたものである請求項6 のワクチン。
  8. 【請求項８】さらに、アジュバントを含む請求項６また
    は請求項７のワクチン。
  9. 【請求項９】アジュバントが水中油型エマルジョンであ
    る請求項８のワクチン。
  10. 【請求項１０】ネオスポラ種の病原性親株からの細胞を
    変性し；親株の細胞と比較して弱毒の病原性を示す一つ
    以上の変性した細胞を選択し、クローン増殖させ；そし
    て、生ワクチンとして投与された場合、ネオスポラ病に
    対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引くこと
    ができる一つ以上の弱毒細胞を選択し、クローン増殖さ
    せることを含む、ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護す
    るワクチンに使用するためのネオスポラ種の弱毒細胞の
    培養物を調製する方法。
  11. 【請求項１１】細胞が請求項２−５のいずれか1 に定義
    されたものである請求項10の方法。
  12. 【請求項１２】ネオスポラ種の病原性親株からの細胞を
    変性し；親株の細胞と比較して弱毒の病原性を示すが生
    ワクチンとして投与された場合、哺乳動物においてネオ
    スポラ病に対し保護する免疫反応の引き金を引くことが
    できる変性した細胞を選択し、クローン増殖させ；そし
    て、哺乳動物に対する生ワクチンとして投与されるのに
    適する形態となるように、弱毒細胞の免疫学的に有効な
    量を獣医学的に許容可能な担体とともに組み合わせるこ
    とを含む、ネオスポラ病に対し哺乳動物を保護するワク
    チンを調製する方法。
  13. 【請求項１３】細胞が請求項２−５のいずれか1 つに定
    義されたものである請求項12の方法。
  14. 【請求項１４】ネオスポラの種の病原性親株から由来す
    る株の生細胞であって、親株の細胞と比較して弱毒の病
    原性を示すが生ワクチンとして投与された場合、ネオス
    ポラ病に対し哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引
    くことができる細胞の免疫学的に有効な量；疾患または
    病状に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を引
    く一つ以上の他の抗原；並びに獣医学的に許容可能な担
    体とを含む混合ワクチン。
  15. 【請求項１５】ネオスポラ種の病原性親株から由来する
    株の生細胞であって、親株のものと比較して弱毒の病原
    性を示すが、生ワクチンとして投与された場合、ネオス
    ポラ病に対して哺乳動物を保護する免疫反応の引き金を
    引くことができる生細胞、並びに獣医学的に許容可能な
    担体、とを含むワクチンの免疫学的に有効な量を哺乳動
    物へ投与することを含む、ネオスポラ病に対してヒト以
    外の哺乳動物にワクチン接種するための方法
  16. 【請求項１６】弱毒化細胞が温度感受性である、請求項
    １５の方法。
  17. 【請求項１７】親株の種がネオスポラ カニナム(N.can
    inum) である、請求項１５の方法。
  18. 【請求項１８】ネオスポラ カニナムの親株が、ATCC受
    託番号No.CRL-12231を有する MARC 145 サル腎臓細胞に
    存在するNC-1である請求項１７の方法。
  19. 【請求項１９】弱毒化細胞の株が、ATCC受託番号No.CRL
    -12230を有する MARC 145 サル腎臓細胞に存在するNCTS
    -8である請求項１８の方法。
  20. 【請求項２０】ワクチンがさらにアジュバントを含む、
    請求項１５の方法。
  21. 【請求項２１】アジュバントが水中油型エマルジョンで
    ある、請求項２０の方法。
  22. 【請求項２２】哺乳動物が、イヌ、ウシ、ヤギ、ヒツ
    ジ、およびウマからなるグループから選択される、請求
    項１５の方法。
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