JPH10168100A - アンチトロンビン−ｉｉｉの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ヒト血漿または誘導ヒト血漿画分を原料とし低
温加熱処理によりウイルスが不活化されており且つ、実
質的に熱変性物を含まないアンチトロンビン−IIIを得
ること。 【解決手段】原料ヒト血漿または誘導ヒト血漿画分をヘ
パリン・アフィニティークロマトグラフィー（Ａ）、強
陰イオン交換体処理（Ｂ）およびウイルス不活性化のた
めの乾燥加熱処理（Ｃ）を施すことにより所期の目的が
達成された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はヒト血漿に由来する
アンチトロンビン−IIIを高度に精製しうる方法の提供
に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液凝固系において、トロンビンの作用
によりフィブリンを生じ血栓が形成される止血機構は既
によく知られている。アンチトロンビン−IIIは血漿中
に存在するα₂グロブリンに属する糖蛋白質の一種で、
プロテアーゼ阻害活性を有し、トロンビン、活性化Ｘ因
子などのプロテアーゼを阻害することで血液凝固活性を
阻害する。またこのアンチトロンビン−IIIの血液凝固
阻害活性は、ヘパリンの共存下において顕著に増大す
る。このような薬理作用を有するアンチトロンビン−II
Iは、血液凝固異常亢進症、たとえばＤＩＣと称される
汎発性血管内凝固症候群の予防ならびに治療に不可欠の
ものである。ヘパリンによるアンチトロンビン−IIIの
活性増大は、主としてヘパリンとアンチトロンビン−II
Iとが特異的に結合して複合体を形成することに起因し
ている。この両者の結合が高度に特異的であることか
ら、その性質を利用して不純物を含む血漿由来のアンチ
トロンビン−III含有溶液を、固定化されたヘパリンを
吸着支持体とするアフィニティークロマトグラフィーに
付すことにより、アンチトロンビン−IIIを精製する方
法がアンダーソン（Anderson）らにより提供され（米国
特許第３８４２０６１号参照）、その効果は広く認めら
れている。

【０００３】しかしアンチトロンビン−IIIを含有する
ヒト血漿または誘導ヒト血漿画分、特にアンチトロンビ
ン−IIIを豊富に含んでいるコーン低温エタノール分画
法による上清Ｉや画分IV−１は、多量のリポ蛋白質およ
び他の成分も含んでいるので単一のヘパリン・アフィニ
ティークロマトグラフィーに付しただけでは夾雑物の除
去は充分ではない。また、ヒト血漿や誘導ヒト血漿画分
はエイズウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパルボウイ
ルスＢ１９などのウイルスにより汚染されている可能性
がある。そこで原料ヒト血漿や誘導ヒト血漿画分を６０
℃、１０時間溶液状態で加熱することによりアンチトロ
ンビン−IIIを不活性化することなくウイルスを不活性
化する方法が提案された（Tabor ら、“ Thrombosis R
esearch ”22巻 233-238(1981)）。しかしこのアンチ
トロンビン−III溶液の低温殺菌法によるウイルス不活
化も、その加熱処理の間に無視し得ないアンチトロンビ
ン−IIIの熱変性物の生成が観測された（Tabor および
Barrowcliffe ら、“ Fr. J. Haematology”, 55巻、37-
46(1983 )）。このアンチトロンビン−IIIの熱変性物、
すなわち熱変性蛋白質の注射による体内投与は、抗原・
抗体反応を誘発する恐れがあり、またサイトカインの過
剰な生産を誘発する恐れもある。そこで、固定化された
ヘパリン・アフィニティークロマトグラフィー、それに
続く低温殺菌法によるウイルス不活化工程、その後さら
にヘパリン・アフィニティークロマトグラフィーを行う
という方法が提案されている（特開平６−３２１９９４
号公報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前述の特開平６−３２
１９９４号公報に記載の方法は、低温殺菌法によるウイ
ルス不活化工程の前と後に２度にわたるヘパリン・アフ
ィニティークロマトグラフィーを実施する方法である
が、第１回目のヘパリン・アフィニティークロマトグラ
フィーで除去しきれなかった成分は、第１回目と同じヘ
パリンをリガンドとする第２回目のヘパリン・アフィニ
ティークロマトグラフィーにおいても除去は困難であ
る。またアンチトロンビン−IIIを含む溶液の６０℃、
１０時間の加熱処理は、多くはないが無視できない量の
アンチトロンビン−IIIの熱変性物を生成するので、そ
の後の１度のヘパリン・アフィニティークロマトグラフ
ィー処理のみによってこれらの熱変性物を完全に除去す
ることはできない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ウイルス
が不活性化され、且つアンチトロンビン−IIIの熱変性
物を実質的に含有しない高度に精製されたアンチトロン
ビン−IIIを比較的簡単な操作で、且つ高い収率で得る
方法について鋭意研究を重ねてきた結果、遂にその目的
を達成した。すなわち本発明は、（１）ヒト血漿または
誘導ヒト血漿画分をヘパリン・アフィニティークロマト
グラフィーに付す工程（Ａ）、工程（Ａ）に付した後、
アンチトロンビン−IIIを含む溶液を強陰イオン交換体
による吸脱着処理に付す工程（Ｂ）および工程（Ｂ）に
付した後、乾燥状態のアンチトロンビン−IIIをウイル
スが不活化されるまで加熱する工程（Ｃ）を含むことを
特徴とするアンチトロンビン−IIIの精製法、（２）誘
導ヒト血漿画分がコーン低温エタノール分画法における
上清Ｉである前記（１）記載の精製法、（３）強陰イオ
ン交換体が４級アミノ基含有強陰イオン交換体である前
記（１）記載の精製法、（４）工程（Ｂ）と（Ｃ）の
間、または工程（Ｃ）の後にアンチトロンビン−III含
有溶液をヘパリン・アフィニティークロマトグラフィー
に付す工程（Ｄ）を加えた前記（１）記載の精製法、お
よび（５）誘導ヒト血漿画分がコーン低温エタノール分
画法における上清Ｉであり、強陰イオン交換体が４級ア
ミノ基含有強陰イオン交換体であり、工程（Ｂ）と
（Ｃ）の間に工程（Ｄ）を行う前記（１）記載の精製
法、である。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の精製法において原料とし
て用いられるものはヒトアンチトロンビン−IIIを含有
するヒト血漿または誘導ヒト血漿画分であり、それらと
しては、たとえば、ヒト血漿やコーン低温エタノール分
画法で得られる上清Ｉ，上清II＋III，画分IV−１、ク
エン酸含有血漿から血液凝固第VIII因子を回収した後の
残渣画分等ヒト血漿から誘導された画分が挙げられる。
これらの中で上清Ｉは特に好適な原料である。本発明に
おいてはまず、この原料ヒト血漿または誘導ヒト血漿画
分を、ヘパリン・アフィニティークロマトグラフィーに
付す（工程Ａ）。この工程自体は前述のごとく公知であ
るが、本発明において好適に用いられる吸着支持体は、
たとえばヘパリンがセルロース、アガロース等の不溶性
担体に共有結合したものである。この工程（Ａ）により
大部分の夾雑物を除去することができる。得られたアン
チトロンビン−IIIを含む溶液は、必要により自体公知
の限外濾過に付し、ついで強陰イオン交換体による吸脱
着処理工程（Ｂ）に付される。本発明において使用され
る強陰イオン交換体としては、その解離度（ｐＫａ）が
通常１０.３以上、好ましくは１０.５以上のものであ
る。その構造的特徴として、４級アミノ基を有するも
の、特にトリアルキルアミノアルキル基を有するものが
好適に使用される。強陰イオン交換体の具体例として
は、たとえばトリメチルアミノメチル基、ジエチルヒド
ロキシプロピルアミノエチル基などのトリアルキルアミ
ノアルキル基を有するものが挙げられる。これらの中で
もトリメチルアミノメチル基を有するものが特に好まし
い。

【０００７】これらの官能基を有する不溶性担体として
は、たとえばセルロース、アガロース、デキストラン、
ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体、ポリビニル共
重合体、ポリスチレン共重合体などが挙げられる。アン
チトロンビン−III含有液と強陰イオン交換体との接触
条件はｐＨ６〜８程度、塩濃度０〜０.５Ｍ程度が好ま
しく、このような条件を具有する溶媒としては、たとえ
ば０.０５Ｍ塩化ナトリウム含有０.０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６.５〜７.５）等が挙げられる。また、溶出条件
はｐＨ６〜８程度、塩濃度０.１〜０.５Ｍ程度のものが
よく、具体例としては、溶媒として０.１７Ｍ塩化ナト
リウム含有０.０１リンＭ酸緩衝液（ｐＨ７）などが挙
げられる。接触方法はカラム法、バッチ法のいずれでも
よい。バッチ法にて行う場合、上記接触条件に調製した
アンチトロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で平衡
化した当該強陰イオン交換体に接触させる。その条件と
しては、該交換体１ｍｌに対して該水溶液１〜１００ｍ
ｌを用い、２〜２０℃で３０分〜２時間程度混和した後
に遠心分離して、該交換体を回収する。さらに、該交換
体に上記溶出用溶媒を添加する。混和条件は接触時と同
じであるが、遠心分離して上澄を回収する。一方、カラ
ム法にて行う場合、上記の接触条件に調製したアンチト
ロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で平衡化され、
且つカラムに充填された当該強陰イオン交換体に通し、
非吸着画分を廃棄する。必要に応じてカラムを洗浄した
後、溶出用溶媒を流して溶出画分を回収する。この工程
（Ｂ）により、ヘパリン・アフィニティークロマトグラ
フィーによっても除去しきれなかったヘパリンと親和性
を有する夾雑物および熱抵抗性の強いヒトパルボウイル
スＢ１９を含む各種ウイルスがかなり除去されることが
判明した。

【０００８】工程（Ｂ）の処理後、乾燥加熱工程（Ｃ）
が行われる。加熱に先立ち、工程（Ｂ）で得られたアン
チトロンビン−III含有組成物は水分含量が５％以下、
望ましくは３％以下となるよう乾燥される。通常の凍結
乾燥により、この条件は満たされる。乾燥された組成物
の形状は、水分含有量が５％以下であれば粉末状、ケー
キ状または他のいずれの形態でもよい。加熱温度は５０
〜８０℃、好ましくは５５〜７５℃、さらに好ましくは
６０〜７０℃であり、加熱時間は２４〜１２０時間、好
ましくは７２〜１０８時間、さらに好ましくは８４〜１
００時間程度である。加熱時の雰囲気としては通常大気
圧の空気が用いられるが必要により減圧空気、窒素その
他の不活性ガス中で行っても差し支えない。また加熱時
のアンチトロンビン−IIIの熱変性を極力防止する目的
で有機酸塩類、無機酸塩類等を溶液中に添加しておき、
それを乾燥して加熱処理に付してもよい。加熱はどのよ
うな手段でもよいが、オーブン、赤外線照射、砂浴また
は水浴などの手段が適宜使用される。この工程（Ｃ）の
操作によりウイルスは不活性化される。前述の工程
（Ｂ）と（Ｃ）の間、または（Ｃ）の後にさらに工程
（Ｄ）を挿入することにより、目的物の純度を一層向上
させることができる。

【０００９】このようにして得られた精製アンチトロン
ビン−IIIは、さらに必要によりウイルス除去膜処理等
ののち製剤化される。製剤としては、水溶液、懸濁剤、
凍結乾燥製剤等が挙げられ、これらの製剤化は、医薬上
許容される添加剤（希釈剤、等張化剤、界面活性剤等）
を適宜混合し、製剤上の常套手段により行うことができ
る。また、該製剤は静脈注射等の注射剤として用いら
れ、凍結乾燥製剤は用時に注射用蒸留水等に溶解して用
いられる。本発明により得られる高度に精製されたアン
チトロンビン−IIIは、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩ
Ｃ）をはじめ、手術後、肝炎・肝硬変、膵炎、新生児呼
吸窮迫症候群等により血液中のアンチトロンビン−III
レベルが低下した患者に投与して血栓の発生を防止する
ことができる。

【００１０】

【実施例】以下に実施例をあげてさらに本発明を具体的
に説明するが、本発明はそれらによって限定されるもの
ではない。 実施例１ コーン低温エタノール分画の上清Ｉ約１７.５リットル
をＤＥＡＥ陰イオン交換体処理後、未吸着画分をプール
として集めた。０.０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.３）
で前もって平衡化したヘパリン−セファロースゲル約３
７０ｍｌを充填したカラムに前述のプール画分を負荷し
た。引き続き、０.０２Ｍのリン酸緩衝液、０.３Ｍ塩化
ナトリウム溶液（ｐＨ７.３）３.０リットルで洗浄した
後、０.０２Ｍリン酸緩衝液、２.０Ｍ塩化ナトリウム溶
液（ｐＨ７.３）３.０リットルでアンチトロンビン−II
Iを溶出した。次いで、ヘパリン−セファロースゲルか
ら溶出したアンチトロンビン−III画分を限外濾過装置
（フィルトロン社製 ポアサイズ１０Ｋ）を用い、０．
１Ｍ以下の塩濃度になるよう脱塩し、約２００ｍｌにな
るまで濃縮した。前記画分を０.０１Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ７.０）で約１.０リットルに希釈した。前もって
０.０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）で平衡化したＱ
−セファロースＦＦゲル（トリメチルアミノメチル／ア
ガロース、ファルマシア社製）約３４０ｍｌに前述の希
釈液を負荷した。次いで、０.０１Ｍのリン酸緩衝液、
０.１２Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７.０）を６.０リ
ットル送液して洗浄した後、０.０１Ｍのリン酸緩衝
液、０.１７Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７.０）を３.
０リットル送液しアンチトロンビン−IIIを溶出した。
この溶出画分をさらに精製するため、再度ヘパリン−セ
ファロースゲル処理を行った。０.０２Ｍのリン酸緩衝
液、ｐＨ７.３で前もって平衡化したヘパリン−セファ
ロースゲル約３７０ｍｌを充填したカラムに、前述のＱ
−セファロースＦＦゲルの溶出液を負荷した。引き続
き、０.０２Ｍのリン酸緩衝液、０.３Ｍ塩化ナトリウム
溶液（ｐＨ７.３）３.０リットルで洗浄した後、０.０
２Ｍのリン酸緩衝液、２．０Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ７.３）３.０リットルでアンチトロンビン−IIIを溶
出した。次いで、ヘパリン−セファロースゲルから溶出
した溶液を前述のものと同一の限外濾過装置を用い、濃
縮・緩衝液交換を行った。交換緩衝液として、０.０２
Ｍクエン酸緩衝液、０.０７Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ７.０）を用い、２８０ｎｍの吸光度にて１０になる
よう希釈・調製した。本溶液を小型ステンレス製皿に流
し込み、凍結乾燥機にて凍結乾燥を行った。乾燥終了
後、引き続き棚温度を上昇させ、品温６６±１℃にて９
６時間の加熱処理を行った。加熱処理終了後、約１.０
ｇの粉末を採取した。得られた粉末の比活性は蛋白質１
ｍｇ当たり７.７国際単位であった。本粉末を注射用水
で溶解後、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１０ｍｇ／ｍｌ
となるよう調製し、ウイルス除去膜（旭化成製 プラノ
バ３５Ｎ）処理を実施した。さらに約５０単位／ｍｌに
なるよう調製し、充填，凍結乾燥した。

【００１１】実施例２ コーン低温エタノール分画の上清Ｉ、約１４リットルを
ＤＥＡＥ陰イオン交換体処理後、未吸着画分をプールと
して集めた。 ヘパリン−セルロファインゲル約５６０
ｍｌを充填したカラムを、前もって０.０２Ｍのリン酸
緩衝液（ｐＨ７.３）で平衡化し、後に前述のプール画
分を負荷した。引き続き、平衡化溶液２．５リットルで
洗浄した後、０.０２Ｍのリン酸緩衝液、０.０５Ｍ塩化
ナトリウム溶液（ｐＨ７.３）２.５リットルにて洗浄
し、さらに０.０２Ｍのリン酸緩衝液、１.０Ｍ塩化ナト
リウム溶液（ｐＨ７.３）液３.５リットルにてアンチト
ロンビンを溶出した。次いで、ヘパリンーセファロース
ゲルから溶出した溶液を限外ろ過装置（フィルトロン社
製、ポアサイズ１０Ｋ）を用い、０.１Ｍ以下の塩濃度
になるよう脱塩し、約５００ｍｌまで濃縮した。次に、
Ｑ−セファロースＦＦゲル（ファルマシア社製）約３０
０ｍｌを充填したカラムを、前もって０．０１Ｍのリン
酸緩衝液、ｐＨ７．０にて平衡化し、その後に前述の濃
縮液を負荷した。次いで、０.０１Ｍのリン酸緩衝液、
０.１２Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７.０）を２.５リ
ットル送液して洗浄した後、０.０１Ｍのリン酸緩衝
液、０.１５Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７.０）を２.
０リットル送液しアンチトロンビン画分を溶出した。次
いで、Ｑ−セファロースＦＦゲルから溶出した溶液を前
述と同一の限外濾過装置を用い、濃縮・緩衝液交換を行
った。交換緩衝液として、０.０２Ｍクエン酸緩衝液、
０.０７Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７.０）を用い、濃
縮後最終液量は約６.０リットルであった。本溶液を充
填し、凍結後、凍結乾燥機を用い、凍結乾燥を行った。
乾燥終了後、引き続き温度を上昇させ、品温６６±１℃
にて９６時間の加熱処理を行い粉末を採取した。

【００１２】交叉免疫電気泳動による精製アンチトロン
ビン−IIIの分析 実施例１の粉末を約１単位／ｍｌになるように注射用水
で溶解した。この試料を５μｌ負荷して交叉免疫電気泳
動を実施した。なお、交叉免疫電気泳動法は、Sas らの
方法［British Journal of Haematology, 30巻, 265-27
2(1974)］に従い実施した。得られた結果を〔図１〕に
示す。 ウイルス除去・不活化効果の測定 実施例１の製造工程中の原薬液にウイルス液を添加した
少量のモデル実験を実施し，各工程終了後のウイルス量
を測定した。使用したウイルスは、ＨＩＶ，Ｃ型肝炎ウ
イルスのモデルウイルスであるウシ下痢症ウイルス（Ｂ
ＶＤＶ）、ヒトパルボウイルスＢ１９のモデルウイルス
であるブタパルボウイルス（ＰＰＶ），ヒトパルボウイ
ルスＢ１９（Ｂ１９）であり、これらのウイルスを指標
に各製造工程のウイルス除去・不活化効果について調査
した。ウイルス力価の測定法としては，ＨＩＶ，ＢＶＤ
Ｖ，ＰＰＶは培養細胞に対する細胞変性効果により行
い、またＢ１９はＰＣＲ法により実施した。その結果を
〔表１〕に示す。ウイルス除去・不活化効果は次式によ
り算出した。

【００１３】

【数１】

【００１４】

【表１】

【００１５】

【発明の効果】本発明によって得られる高度に精製され
たアンチトロンビン−IIIはウイルス、特にエイズウイ
ルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パルボウイルスが不活性化さ
れており、加熱処理による熱変性物を実質的に含まな
い。したがって、本発明方法によって得られた精製アン
チトロンビン−IIIの交叉免疫電気泳動図においても単
一のピークを示すのみである。

【図面の簡単な説明】

【図１】は、実施例１で得られた精製アンチトロンビン
−IIIの交叉免疫電気泳動図である。

【符号の説明】

＋は陽極を、−は陰極を、○は試料負荷位置をそれぞれ
示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト血漿または誘導ヒト血漿画分をヘパリ
   ン・アフィニティークロマトグラフィーに付す工程
   （Ａ）、工程（Ａ）に付した後、アンチトロンビン−II
   Iを含む溶液を強陰イオン交換体による吸脱着処理に付
   す工程（Ｂ）および工程（Ｂ）に付した後、乾燥状態の
   アンチトロンビン−IIIをウイルスが不活化されるまで
   加熱する工程（Ｃ）を含むことを特徴とするアンチトロ
   ンビン−IIIの精製法。
2. 【請求項２】誘導ヒト血漿画分がコーン低温エタノール
   分画法における上清Ｉである請求項１記載の精製法。
3. 【請求項３】強陰イオン交換体が４級アミノ基含有強陰
   イオン交換体である請求項１記載の精製法。
4. 【請求項４】工程（Ｂ）と（Ｃ）の間、または工程
   （Ｃ）の後にアンチトロンビン−III含有溶液をヘパリ
   ン・アフィニティークロマトグラフィーに付す工程
   （Ｄ）を加えた請求項１記載の精製法。
5. 【請求項５】誘導ヒト血漿画分がコーン低温エタノール
   分画法における上清Ｉであり、強陰イオン交換体が４級
   アミノ基含有強陰イオン交換体であり、工程（Ｂ）と
   （Ｃ）の間に工程（Ｄ）を行う請求項１記載の精製法。