JPH1017599A - 抗繊維芽細胞増殖因子５モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＦＧＦ５を抗原として特異的に認識するモノ
クローナル抗体を提供する。 【解決手段】 ＦＧＦ５のアミノ酸配列のうち、ＦＧＦ
ファミリーに属する他のメンバーのアミノ酸配列と相同
性の低い領域のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原に
用いて哺乳動物を免疫し、その哺乳動物の脾細胞と培養
細胞とを融合してハイブリドーマを作製し、そのハイブ
リドーマを培養してその培養液からモノクローナル抗体
を採取する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、繊維芽細胞増殖因
子５（以下、「ＦＧＦ５」という。）の検知に有用な抗
ＦＧＦ５モノクローナル抗体及びその製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】繊維芽細胞増殖因子（以下、「ＦＧＦ」
という。）ファミリーについては、該ファミリーに属す
るメンバーのうち現在９番までクローニングされている
が、初めて１９８５年にクローニングされたＦＧＦ１
（ａＦＧＦ）およびＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）は、生体内で
発生、細胞分化、細胞増殖、形態形成、ガン化等の非常
に重要な生命現象に関与していることが明らかになって
いる（今村亨ら、臨床科学25, 1012-1021(1989)；三井
洋司ら、蛋白核酸酵素36(7), 1237-1246(1991)）。ま
た、ごく最近１０番目のメンバーが見い出されたが、そ
の詳細はまだ明かではない。近年、その他のメンバー
も、生体内での重要な機能が徐々に明らかとなりつつあ
る（R. F. Tutrone et al., J. Urol. 149, 633-639 (1
993); B. Feldman, Science 267, 246-249 (1995); Jea
n M. Hebert et al., Cell 78, 1017-1025(1994); F. C
oulier et al.,Prog. Growth Factor Res. 5, 1-14 (19
94); S. Werner et al., J. Invest. Dermatol. 105, 5
79-584 (1995); H.Ohuchi et al.,Biochem. Biophys. R
es. Commun. 204(2), 882-888 (1994)）。

【０００３】その中で、ＦＧＦファミリーの５番目のメ
ンバーであるＦＧＦ５は、毛周期の制御因子としての機
能を持っていること（Jean M. Hebert et al., Cell, 7
8, 1017-1025 (1994)）、また、皮膚の再生において誘
導していることが遺伝子レベルで明らかとなっている
（S. Werner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
6896-6900 (1992)）。

【０００４】一方、ごく最近では、ＦＧＦ５が脳の発生
過程において何らかの機能を持っていること、脳内で定
常的に発現していること等も遺伝子レベルで明らかとな
りつつある（小沢和夫ら、生化学 67(7), 569(199
5)）。これらの事実は、生体内でのＦＧＦ５の異常が種
々の疾病を引き起こす原因になりうることを遺伝子レベ
ルで示唆するものである。従って、ＦＧＦ５の挙動をタ
ンパク質レベルで捉えてそれを解析することは、これら
の疾病の原因解明や診断にとって重要であると言うこと
ができる。

【０００５】ＦＧＦファミリーは、各メンバーの間で約
３０％の相同性があり、ＦＧＦ５の組換えタンパクを抗
原として抗体を作製した場合、作製された抗体はＦＧＦ
ファミリーの他のメンバーと交差反応する可能性が高
い。さらに、ＦＧＦ５はマウスＦＧＦ５との相同性が約
９３％もあるため、ＦＧＦ５の組換えタンパクは免疫対
象であるマウス内での抗原性が非常に弱く、抗体を形成
しないばかりか、大量投与はマウスのショック死を引き
起こす可能性も考えられる。

【０００６】ＦＧＦ５を特異的に認識するポリクローナ
ル抗体は既に作製されているが（B.Bates et al., Mol.
Cel. Biol. 11(4), 1840-1845 (1991)）、ポリクロー
ナル抗体は動物をその都度免疫し、その血中より調製し
なければならないために、ロットごとの抗体価のばらつ
きが大きく再現性に乏しいという欠点がある。これらの
欠点は、モノクローナル抗体を作製することによって解
決することができるが、現在のところＦＧＦ５を特異的
に認識するモノクローナル抗体は存在していない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＦＧＦファ
ミリーの他のメンバーを抗原として認識せず、ＦＧＦ５
を特異的に認識するモノクローナル抗体、及びその製造
方法並びにこのモノクローナル抗体を用いてＦＧＦ５を
検知する方法を提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＦＧＦ５のア
ミノ酸配列のうち、ＦＧＦファミリーの他のメンバーの
配列と相同性が低い配列を有するペプチドを免疫原とし
て用いることにより、ＦＧＦファミリーの他のメンバー
に結合せず、ＦＧＦ５に結合するモノクローナル抗体が
得られることを見いだし、本発明を完成させた。

【０００９】すなわち、本発明は、下記性質を有する抗
繊維芽細胞増殖因子５モノクローナル抗体を提供する。 （ａ）繊維芽細胞増殖因子５に結合する。 （ｂ）繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属するメンバー
であって且つ前記繊維芽細胞増殖因子５以外のものに、
結合しない。

【００１０】また、本発明は、繊維芽細胞増殖因子５の
アミノ酸配列のうち、繊維芽細胞増殖因子ファミリーに
属するメンバーであって且つ前記繊維芽細胞増殖因子５
以外のもののアミノ酸配列と相同性の低い領域を抗原と
して認識する前記抗繊維芽細胞増殖因子５モノクローナ
ル抗体を提供する。

【００１１】また、本発明は、前記領域が、配列表配列
番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部であること
を特徴とする前記抗繊維芽細胞増殖因子５モノクローナ
ル抗体を提供する。

【００１２】また、本発明は、繊維芽細胞増殖因子５の
アミノ酸配列のうち、繊維芽細胞増殖因子ファミリーに
属するメンバーであって且つ前記繊維芽細胞増殖因子５
以外のもののアミノ酸配列と相同性の低い領域のアミノ
酸配列の少なくとも一部を有するペプチドと担体との結
合物を用いて哺乳動物を免疫した後前記哺乳動物の脾細
胞を取り出し、前記脾細胞と培養細胞とを融合してハイ
ブリドーマを作製し、前記ハイブリドーマを培養してそ
の培養物から抗体蛋白を採取する工程を含む、請求項１
記載のモノクローナル抗体の製造方法を提供する。

【００１３】また、本発明は、モノクローナル抗体を用
いた免疫学的方法により繊維芽細胞増殖因子５を検知す
る方法において、前記モノクローナル抗体を用いる方
法、好ましくは毛髪の鑑定法または脳機能の鑑定法を提
供する。

【００１４】なお、本明細書において、「ＦＧＦ５に特
異的に結合する」とは、ヒトＦＧＦ５と反応して該ＦＧ
Ｆ５を抗原として特異的に認識し、且つＦＧＦファミリ
ーに属する前記ＦＧＦ５以外のメンバーには結合しない
ことをいう。

【００１５】以下、本発明を詳細に説明する。ＦＧＦ５
を含むＦＧＦファミリーのｃＤＮＡ配列は既に知られて
おり（M.Jayeet al., Science, 251, (1986); J. A. Ab
raham et al., EMBO J., 5, 2523-2528(1986); R. Moor
e et al., EMBO J., 5, 919-924(1986); P. Delli-Bovi
et al., Cell, 50, 729-737 (1987); X. Zhan et al.,
Mol Cel Biol., 8, 3487-3495 (1988); I. Marics et
al., Oncogene, 4, 335-340 (1989); J. S. Rubinet a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 802-806 (198
9); A. Tanaka et al., FEBS Lett., 363(3), 226-230
(1995); M. Miyamoto et al., Mol. Cel. Biol., 13, 4
251-4259 (1993)）、推定上のアミノ酸配列も既に知ら
れている。

【００１６】本発明者らは、これらのｃＤＮＡ配列をア
ミノ酸配列に翻訳し、比較した（図１〜図８）。その結
果、ＦＧＦ５のアミノ酸配列のうち、配列表配列番号１
に示したアミノ酸配列を有する部分が、ＦＧＦファミリ
ーに属するメンバーであって且つＦＧＦ５以外のもの
（ＦＧＦファミリーの他のメンバー）と相同性が低いこ
とを見いだした。また、この部分の近隣には糖鎖の付加
する推定上の配列があり（図１）、この部分がＦＧＦ５
のタンパク表面に出ている可能性が高いことも見いだし
た。尚、図１〜８中の「＊」はアミノ酸が一致している
部分、アンダーラインは抗原として選定した部分を示し
ており、また各図中、上段はＦＧＦ５のアミノ酸配列
を、下段はＦＧＦファミリーの他のメンバーのアミノ酸
配列を示している。

【００１７】本発明者らはこれらの点に注目し、上記配
列を有するペプチド（以下、「ＦＧＦ５に特異的なペプ
チド」ともいう。）の合成をTANA LABORATORIES, L. C.
(Texas, USA) に委託した。入手したペプチドを用いて
哺乳動物を免疫した後、脾細胞を取り出し、これを培養
細胞と融合することによりハイブリドーマを作製し、こ
のハイブリドーマにＦＧＦ５と特異的に結合するモノク
ローナル抗体を生産させることに成功した。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態につ
いて、ＦＧＦ５に特異的なモノクローナル抗体及びその
製造法を中心に製造手順に沿って説明する。

【００１９】＜１＞抗原 哺乳動物を免疫する際に用いるＦＧＦ５に特異的なペプ
チドは、そのアミノ酸配列として配列表配列番号１に示
す配列が挙げられるが、ＦＧＦ５のアミノ酸配列のう
ち、ＦＧＦファミリーの他のメンバーのアミノ酸配列と
相同性の低い領域のアミノ酸配列の少なくとも一部を有
していれば、本発明に使用することができる。このよう
なペプチドは、例えばＦＧＦ５の酵素分解物から単離す
ることにより、部分的に得ることができるが、常法によ
り化学合成することが好ましい。例えば、市販されてい
るペプチドシンセサイザーを用いて上記配列を入力すれ
ば、上記ペプチドを得ることができる。また、ペプチド
の受託合成サービスを行っている会社に委託して入手し
てもよい。

【００２０】かくして得られるペプチド（以下、「合成
ペプチド」ともいう。）は、そのまま抗原としても用い
ることができるし、キーホールリンペットヘモシアニン
（KLH:Keyhole Limpet Hemocyanin）、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ：Bovine SerumAlbumin）、卵白アルブミ
ン（ＯＶＡ：Ovalbumin）等の担体と結合させて用いる
こともできる。このような担体を用いると、ペプチドの
みでは抗原性が低い場合、あるいは抗原性がない場合で
も抗原性を上げることができる。なお、この場合は担体
に対する抗体もできるが、それらはハイブリドーマを選
択する段階で取り除くことができる。

【００２１】＜２＞哺乳動物の免疫 上記抗原で免疫する哺乳動物は、免疫実験に通常用いら
れている哺乳動物であれば特に制限がなく、マウス、ラ
ット、ウサギ等が例示できる。また、免疫する方法は、
通常の免疫の手法に則って行えば良く、例えば、合成ペ
プチド或いは担体に結合させた合成ペプチドを、フロイ
ントの完全アジュバントまたは不完全アジュバントとと
もに１〜２週間毎に数回投与を繰り返し、最終投与の２
週間以上後に、合成ペプチドのみを投与して最終免疫を
行う方法が挙げられる。

【００２２】このときの合成ペプチドあるいは担体に結
合させた合成ペプチドの投与量は、１回当たり０．５ｍ
ｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度が適当である。投与量が
０．５ｍｇ／ｋｇ未満では抗体を十分に生成しないこと
がある。また、５０ｍｇ／ｋｇを越えても更なる免疫効
果は期待できず、さらに、生体内で免疫抑制が生じ、目
的とする抗体が得られない恐れがある。

【００２３】＜３＞ハイブリドーマの作製 上記のようにして免疫した動物を、最終免疫後３〜４日
後に屠殺し、脾臓を摘出し、脾細胞を取り出す。この細
胞と、融合相手である培養細胞とを融合促進剤の存在下
で融合し、得られた融合細胞を選別することにより脾細
胞−培養細胞ハイブリドーマを得ることができる。

【００２４】融合相手の培養細胞としては、脾細胞と融
合するものであれば特に制限はないが、一般には、ミエ
ローマ細胞（骨髄腫細胞）が適当である。また、細胞融
合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにす
るために、特定の選別用の薬物マーカーを有するものが
好ましい。

【００２５】例えば、ヒポキサンチン・グアニン・ホス
ホリボシルトランスフェラーゼ欠損したものが挙げられ
る。このような細胞は、ヒポキサンチン・アミノプテリ
ン及びチミジンを添加した培地（ＨＡＴ培地）中で生育
できないが、この細胞と正常細胞との融合細胞はＨＡＴ
培地中でも生育できるようになり、未融合細胞と区別す
ることができる。具体的には、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５
３株、Ｐ３／ＮＳＩ／１−ＡＧ４−１株、ＦＯ株、ＳＰ
２／０−Ａｇ１４株等のミエローマ細胞の市販株が挙げ
られるが、これらには限定されない。

【００２６】細胞融合は通常ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ
等の培地中で、抗体産生細胞（脾細胞）とミエローマ細
胞とを１０：１〜２：１の混合比で、融合促進剤ととも
に混合することにより行われる。融合促進剤としては、
細胞融合実験で通常用いられている融合剤であれば特に
制限はなく、具体的には、センダイウイルスや平均分子
量５００〜７０００のポリエチレングリコールが例示で
きる。また電気パルスによって融合させてもよい。細胞
融合を終えた細胞は、例えばＲＰＭＩ１６４０あるいは
ＭＥＭ培地などで希釈し、遠心分離により洗浄した細胞
をＨＡＴ培地等の選択培地に浮遊させ、マルチプレート
等に分注して培養を行い、ハイブリドーマのみを生育さ
せる。

【００２７】＜４＞ハイブリドーマの選別 上記のようにして得られるハイブリドーマは、抗原に用
いたペプチドのうち異なる抗原決定部位に対するモノク
ローナル抗体や、担体に用いた蛋白に対するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ株の混合体であるの
で、これらの中から前記合成ペプチド、すなわちＦＧＦ
５に特異的なペプチドに結合するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを選別する。

【００２８】この選別の方法としては、抗原に用いた合
成ペプチドを使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）
が好ましい。例えば、合成ペプチドをプラスチックプレ
ート等に固相化しておき、これにハイブリドーマ培養上
清、さらに酵素、蛍光物質或は発光物質の結合量から合
成ペプチドに結合する抗体量を知ることができる。或
は、ハイブリドーマが産生する抗体を固相化し、これに
合成ペプチド、酵素等で標識第二抗体と順次インキュベ
ートしてもよい。

【００２９】さらに、合成ペプチドに結合するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマから、ＦＧＦ５に
結合し、ＦＧＦファミリーに属するメンバーであって前
記ＦＧＦ５以外のものに結合しないモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを選択する。

【００３０】このようにして得られたハイブリドーマの
１株は、平成８年６月７日より工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に、ＦＥＰＭ Ｐ−１５６７６として
寄託されている。

【００３１】＜５＞ＦＧＦ５に特異的に結合するモノク
ローナル抗体の調製 上記のようにして得られるハイブリドーマからＦＧＦ５
に特異的に結合するモノクローナル抗体を得るには、例
えば、適当な培地中で培養した抗体産生ハイブリドーマ
の培養上清、あるいは抗体産生ハイブリドーマをマウス
腹腔内で培養して得られた腹水を常法に従って硫安分
画、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等で
精製すればよい。

【００３２】＜６＞ＦＧＦ５に特異的に結合するモノク
ローナル抗体の利用法 本発明のＦＧＦ５に特異的に結合するモノクローナル抗
体は、ヒトＦＧＦ５と特異的に反応するので、通常の抗
原抗体反応を用いた抗原の検知方法を適用することによ
り、ＦＧＦ５を検知することができる。例えば、ウェス
タンブロットあるいはミクロオートラジオグラフィーに
おける染色用抗体、ヒト由来の培養細胞、皮膚組織等の
免疫染色における染色用抗体、さらには培養系に添加す
ることによりＦＧＦ５の作用を抑える中和抗体として使
用可能であり、ＦＧＦ５の定性あるいは定量のための検
知用試薬として利用することによりＦＧＦ５を検知する
ことができる。従って、本発明の抗ＦＧＦ５モノクロナ
ール抗体を用いることによって、毛成長におけるＦＧＦ
Ｇ５の役割を探求することができる。例えば、毛髪中の
ＦＧＦ５を検知することにより毛髪の鑑定を行うことも
できる。さらに、脳などを本発明のモノクロナール抗体
を用いて染色し、例えば脳細胞中のＦＧＦ５を検知する
ことにより、脳機能の鑑定や脳におけるＦＧＦ５の役割
を探求することができる。

【００３３】

【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。

【００３４】＜１＞ハイブリドーマの作製 ペプチドの合成および担体（ＫＬＨ）への結合は、TANA
LABORATORIES, L.C.(Texas,USA) に依頼した。

【００３５】上記の担体結合合成ペプチド１００ｍｇを
生理食塩水１００ｍｌに溶かし、完全フロイントアジュ
バント（シグマ(SIGMA)社製）１００ｍｌと混合乳化し
たものを、８週令のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）
の皮下に投与した。その後１週間目と２週間目に、上記
担体結合合成ペプチド−不完全フロイントアジュバント
等量混合乳化液２００ｍｌを腹腔内投与した。更に、３
回目の投与から２週間後に、５０ｍｇの合成ペプチドを
溶解した生理食塩水５０ｍｌを静脈注射した。

【００３６】３日後、上記マウスから脾臓を摘出し、脾
細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、洗浄を行った。
一方、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４
（大日本製薬から購入）を、細胞融合に合わせて対数増
殖期になるように培養し、遠心分離により集めた。１０
８個の脾細胞に対し、２×１０７個のミエローマを上記
培地中で混合し、遠心分離により細胞をペレットにし
た。上清を除いた後、３７℃に保温した５０％ＰＥＧ４
０００（シグマ社製：ポリエチレングリコール）を含む
ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌを１分間で徐々に滴下し、
１分間穏やかに撹拌した。更に、３７℃のＲＰＭＩ１６
４０培地２ｍｌを２分間で、更に８ｍｌを３分間で撹拌
しながら滴下した。

【００３７】滴下終了後、遠心分離により上清を除いた
後、細胞ペレットをＧＩＴ培地（和光純薬製）４０ｍｌ
に懸濁し、これを４枚の９６ウェルプレート（住友ベー
クライト社製）に、１ウェルにつき１００ｍｌずつ分注
した。翌日２５ｍｌのＨＡＴ培地を添加し、更に４日後
２５ｍｌのＨＡＴ培地を添加した。１週間培養した後、
培養上清を半分除き１００ｍｌのＧＩＴ培地を添加し
た。

【００３８】細胞融合から約２週間後、ミエローマと脾
細胞が融合したハイブリドーマのみがコロニーを形成し
たが、さらに、コロニーの直径が約１ｍｍになるまで培
養を続けた。この時点で培養上清に分泌された抗体を、
上記の合成ペプチドと市販の二次抗体(西洋ワサビペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃフラグメン
ト抗体；ケミコン(CHEMICON)社製）を用いたサンドウィ
ッチＥＬＩＳＡ法により検定した。このうち抗体価の高
かったウェル中の培養上清を、抗原を市販のＦＧＦ５組
換えタンパク（シグマ社製）に変更した上記と同様のサ
ンドウィッチＥＬＩＳＡ法によってさらに検定した。最
終的に抗体価の高かったウェル中のハイブリドーマにつ
いて限界希釈法によるクローニングを行い、モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ株を得た。この株は、平成
８年６月７日より工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）に、ＦＥＰＭ Ｐ−１５６７６として寄託されて
いる。

【００３９】＜２＞ＦＧＦ５に特異的に結合するモノク
ローナル抗体の調製 上記で得られたハイブリドーマ細胞株を培養し、ＦＧＦ
５に特異的に結合するモノクローナル抗体の採取を行っ
た。

【００４０】上記ハイブリドーマをＧＩＴ培地で培養
し、細胞濃度が約５×１０６個／ｍｌになったところで
培養上清を遠心分離により回収し、これをポアサイズ
０．２２ｍｍのフィルターでろ過し、ろ液をプロテイン
Ａカラムキット（アマシャム・ジャパン製）により精製
し、抗ＦＧＦ５モノクローナル抗体を得た。

【００４１】＜３＞抗ＦＧＦ５モノクローナル抗体の評
価 （１）抗ＦＧＦ５モノクローナル抗体とＦＧＦ５との反
応性 上記で得られたモノクローナル抗体について、市販のＦ
ＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７の組換えタンパク（シグマ
社製）を用いたエンザイムイムノブロット法により特異
性の評価を行った。５〜２０％の密度勾配ポリアクリル
アミドゲル(パジェル:アトー社製）を用いて、常法に従
って電気泳動を行った。なお、アプライ量は１レーン当
り１００ｎｇのＦＧＦをアプライした。電気泳動終了
後、ゲルの１レーンを切り出し、ＣＢＢ染色に供してト
ータル蛋白を検出した。残りのゲルをトランスファーバ
ッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ；１９２ｍＭ グリシ
ン）に浸漬した後、ブロッティング装置（セミドライブ
ロッティング装置：アットー(ATTO)社製）を用い、泳動
物をゲルから、予めトランスファーバッファーに浸漬し
たメンブレン（イモビロン(Immobilon)；ミリポア社
製）へ転写した。

【００４２】泳動物を転写したメンブレンを、ＴＢＳバ
ッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ；５００ｍＭ ＮａＣｌ；
ｐＨ７．５）に１５分間浸漬した後、ブロッキングバッ
ファー（５％スキムミルクあるいは１％ＢＳＡ及び０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳバッファー）に浸し、
２５℃で１時間緩やかに振とうした。

【００４３】その後メンブレンを、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＴＢＳバッファー（ＴＴＢＳバッファー）を
用いて洗浄（１５分１回、５分２回）し、前記＜２＞で
得られたモノクローナル抗体溶液（１０倍希釈駅を約２
ｍｌ）に浸漬し、約１時間２５℃で緩やかに振とうし
た。メンブレンを洗浄した後、さらに市販の二次抗体溶
液（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗
マウスＩｇＧ Ｆｃフラグメント抗体；ケミコン(CHEMIC
ON)社製、２０，０００倍希釈液を約２ｍｌ）に浸漬
し、２５℃で約１時間緩やかに振盪した。

【００４４】メンブレンをＴＴＢＳバッファーにより洗
浄（１５分１回、５分４回）した後、市販のＨＲＰ検出
キット（アマシャム社製；ＥＣＬキット）を使用して、
抗ＦＧＦ５モノクローナル抗体が結合した泳動物のバン
ドを検出した。なお、ＨＲＰが結合したバンドは、４−
クロロ−１−ナフトールを基質として使用しても検出す
ることができる。

【００４５】エンザイムイムノブロット法の結果を図９
に示す。この結果から明らかなように、上記で得られた
モノクローナル抗体はＦＧＦ５に結合するが、ＦＧＦ６
及びＦＧＦ７には結合しない。また、抗原として使用し
た合成ペプチドは他のＦＧＦファミリーと相同性がない
部分であり、ＦＧＦファミリーの他のメンバーとも反応
しない。すなわち、本モノクローナル抗体は相互に相同
性の高いＦＧＦファミリーのメンバーの中で、ＦＧＦ５
に特異的に反応することがわかった。

【００４６】（２）抗ＦＧＦ５モノクローナル抗体のア
イソタイプの決定 市販のアイソタイピングキット（アマシャム製）に付属
のメンブレンを、抗ヒトＦＧＦ５モノクローナル抗体
（ハイブリドーマ培養上清）とキット付属の二次抗体の
混合溶液に浸漬し室温で１５分間インキュベートした。
メンブレンを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（リ
ン酸緩衝液）による５分間洗浄を２回繰り返した後、キ
ット付属の発色剤にメンブレンを浸漬し室温で１５分間
以上インキュベートしアイソタイプを検出した。その結
果、抗ＦＧＦ５モノクローナル抗体のアイソタイプは、
ｋ軽鎖をもったＩｇＧ１であることがわかった。

【００４７】

【発明の効果】本発明の抗ＦＧＦ５モノクローナル抗体
は、ＦＧＦ５に特異的に結合するものであり、ＦＧＦ５
の検知に用いることができ、毛髪の鑑定、脳機能の鑑定
等に利用することができる。

【００４８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ser Ala Ile His Arg Thr Glu Lys Thr Lys Thr Gly 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＦＧＦ５に対するＦＧＦ１のアミノ酸配列の
相同性を示す図である。

【図２】 ＦＧＦ５に対するＦＧＦ２のアミノ酸配列の
相同性を示す図である。

【図３】 ＦＧＦ５に対するＦＧＦ３のアミノ酸配列の
相同性を示す図である。

【図４】 ＦＧＦ５に対するＦＧＦ４のアミノ酸配列の
相同性を示す図である。

【図５】 ＦＧＦ５に対するＦＧＦ６のアミノ酸配列の
相同性を示す図である。

【図６】 ＦＧＦ５に対するＦＧＦ７のアミノ酸配列の
相同性を示す図である。

【図７】 ＦＧＦ５に対するＦＧＦ８のアミノ酸配列の
相同性を示す図である。

【図８】 ＦＧＦ５に対するＦＧＦ９のアミノ酸配列の
相同性を示す図である。

【図９】 ＦＧＦ５のエンザイムイムノブロットによる
電気泳動の結果を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/50 33/577 Ｂ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ // Ａ６１Ｋ 39/395 9282−4Ｂ ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 加藤 朋美 神奈川県横浜市戸塚区柏尾町560 ポーラ 化成工業株式会社戸塚研究所内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記性質を有する抗繊維芽細胞増殖因子
   ５モノクローナル抗体。 （ａ）繊維芽細胞増殖因子５に結合する。 （ｂ）繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属するメンバー
   であって且つ前記繊維芽細胞増殖因子５以外のものに、
   結合しない。
2. 【請求項２】 繊維芽細胞増殖因子５のアミノ酸配列の
   うち、繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属するメンバー
   であって且つ前記繊維芽細胞増殖因子５以外のもののア
   ミノ酸配列と相同性の低い領域を抗原として認識する、
   請求項１記載の抗繊維芽細胞増殖因子５モノクローナル
   抗体。
3. 【請求項３】 前記領域が、配列表配列番号１に示すア
   ミノ酸配列の少なくとも一部であることを特徴とする、
   請求項２記載の抗繊維芽細胞増殖因子５モノクローナル
   抗体。
4. 【請求項４】 繊維芽細胞増殖因子５のアミノ酸配列の
   うち、繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属するメンバー
   であって且つ前記繊維芽細胞増殖因子５以外のもののア
   ミノ酸配列と相同性の低い領域のアミノ酸配列の少なく
   とも一部を有するペプチドと担体との結合物を用いて哺
   乳動物を免疫した後前記哺乳動物の脾細胞を取り出し、
   前記脾細胞と培養細胞とを融合してハイブリドーマを作
   製し、前記ハイブリドーマを培養してその培養物から抗
   体蛋白を採取する工程を含む、請求項１記載のモノクロ
   ーナル抗体の製造方法。
5. 【請求項５】 モノクローナル抗体を用いた免疫学的方
   法により繊維芽細胞増殖因子５を検知する方法におい
   て、請求項１記載のモノクローナル抗体を用いる方法。
6. 【請求項６】 請求項５記載の方法により毛髪中の繊維
   芽細胞増殖因子５を検知することを特徴とする、毛髪の
   鑑定法。
7. 【請求項７】 請求項５記載の方法により脳細胞中の繊
   維芽細胞増殖因子５を検知することを特徴とする、脳機
   能の鑑定法。