JPH10176182A - ω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方法の提
供。 【解決手段】 ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する油
脂をリパーゼを用いて加水分解し、得られる脂肪酸の混
合物を、リパーゼを用いて有機溶媒を含まない反応系で
直鎖高級アルコールと選択的エステル化反応させること
を特徴とするω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ω−３系高度不飽
和脂肪酸を高収率かつ高純度に精製する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、高度不飽和脂肪酸の有する生理活
性作用が注目されている。特に、エイコサペンタエン酸
（以下、EPAと称する。）やドコサヘキサエン酸（以
下、DHAと称する。）は、動脈硬化症、血栓症などの成
人病に対する予防効果や制癌作用、学習能の増強作用な
どの多くの生理活性作用を有していることが知られてい
る。そして、その利用法について様々な検討がなされて
いる。

【０００３】EPAやDHAを主体とした高度不飽和脂肪酸を
精製する方法としては、例えば(1)クロマトグラフィー
による方法、(2) 液−液分配による方法、(3) 低温溶剤
分別結晶化法、(4) 尿素付加による方法、(5) 二重結合
への付加物による方法、(6)蒸留による方法、およびこ
れらを組合せた方法が知られている。

【０００４】しかし、前記(2) 〜(5) の方法において
は、溶剤を使用しなければならず、溶剤の除去工程が必
要となるため、工程が煩雑である。また、(1) の方法で
は高純度の精製はできるが、溶剤及びカラムを使用する
必要があり、製造コストが掛かり過ぎてしまうため、事
業的に採算が合わない。さらに、(6) の方法において
は、処理コストは比較的安価であるが、目的とする画分
の回収率はあまり高いものではない。したがって、コス
トの低い処理方法を用いて高収率で高純度にまで精製で
きる方法の開発が望まれている。

【０００５】高度不飽和脂肪酸を精製する方法として
は、これまでに常温、常圧下で反応が進行するリパーゼ
を用いた方法が注目されている。リパーゼによる高度不
飽和脂肪酸の精製法には、油脂をリパーゼで加水分解し
未分解のグリセリド画分中に濃縮する方法（選択的加水
分解反応）、あるいは高度不飽和脂肪酸を含有する脂肪
酸混合物とアルコールとからなる反応混液にリパーゼを
作用させ、高度不飽和脂肪酸以外の脂肪酸をエステル化
し、高度不飽和脂肪酸を遊離脂肪酸画分中に精製する方
法（選択的エステル化反応）等が知られている。

【０００６】医薬品原料として高度不飽和脂肪酸を高純
度に精製する場合には、後者の方が有効であり、これま
でにω-6系脂肪酸のγ−リノレン酸を濃縮する方法とし
て、ボラージオイル（γ−リノレン酸含量25％）の脂肪
酸混合物からゲオトリカム属の糸状菌が生産するリパー
ゼを用いて、低級アルコールとn-ヘキサンを加えた反応
混液中で遊離脂肪酸画分中にγ−リノレン酸を70%の濃
度まで精製する方法が知られている（JAOCS,Vol.71,no.
6,p563（1994)、JAOCS,Vol.72,no.4,p417（1995))。

【０００７】また、DHAを濃縮する方法としては、魚油
（EPA11%、DHA含量8%）の脂肪酸混合物を尿素付加法に
よりDHA27%（EPA27%）に濃縮した脂肪酸混合物及びその
メチルエステル体と低級アルコールとからなる反応混液
に、n-ヘキサンを加えた系でリゾムコール属の微生物が
生産するリパーゼを用いてエステル化反応（この場合
は、メチルエステルとアルコールとの間のアシドリシス
反応も進行している。）することにより、遊離脂肪酸画
分中にDHAを72%まで濃縮する方法も知られている（JAOC
S,Vol.66,no.8,p1120(1989))。

【０００８】しかし、これらの方法はいずれも反応混液
（重量）に対して10〜20倍量（容量）に相当する多量の
ヘキサンを使用するため、油脂が劣化するのみならず、
実生産の際のタンク容量が莫大となり、更には有機溶媒
の除去に多大なコストが掛かってしまう。よって、油脂
の劣化を防止し、製造コストを下げるためにも有機溶媒
を含まない簡便かつ温和な条件下での反応系の確立が望
まれている。高度不飽和脂肪酸を含有する油脂の加水分
解法については、油脂を劣化させることなく分解できる
適当な工業的方法は未だ見出されていない。

【０００９】飽和脂肪酸や１価不飽和脂肪酸の加水分解
には、一般に無触媒の高圧加水分解（〜50atm）やアル
カリ触媒を用いた中圧加水分解（〜10atm）による化学
的な方法が採用されているが、高度不飽和脂肪酸の場合
は、酸化安定性の問題からこのような過酷な条件下で分
解することはできない。そのため、実験室で行われてい
るケン化分解法を選択せざるを得ない。しかし、ケン化
分解法では、油脂に対して多量なアルコール、苛性ソー
ダ、酸、水等が必要となり、アルカリ性下での加熱処理
で油脂の劣化を招くとともに、工業スケールとなると反
応タンクが大掛りになるという問題点があり、さらには
使用したアルコールの回収や排水処理の問題が生じ、工
程が煩雑になってしまうという欠点があった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ω−３系高
度不飽和脂肪酸の精製方法を提供することを目的とす
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に基づいて鋭意研究を行ない、高度不飽和脂肪酸を含有
する油脂を穏和な条件下で加水分解し、効率的に遊離の
高度不飽和脂肪酸を得る方法を検討した結果、高分解能
を有するリパーゼを用いて加水分解反応を行なうと、有
機溶媒や多量の水を使用することなく、簡便な工程で脂
肪酸画分が得られることを見出し、本発明を完成するに
至った。

【００１２】すなわち、本発明は、ω−３系高度不飽和
脂肪酸を含有する油脂をリパーゼを用いて加水分解し、
得られる脂肪酸の混合物を、リパーゼを用いて有機溶媒
を含まない反応系で直鎖高級アルコールと選択的エステ
ル化反応させることを特徴とするω−３系高度不飽和脂
肪酸の精製方法である。

【００１３】さらに、本発明は、ω−３系高度不飽和脂
肪酸を含有する油脂をリパーゼを用いて加水分解し、得
られる脂肪酸の混合物を、リパーゼを用いて有機溶媒を
含まない反応系で直鎖高級アルコールと選択的エステル
化反応させ、得られる反応産物から脂肪酸混合物を分画
し、前記選択的エステル化反応に用いたリパーゼを用い
て再度直鎖高級アルコールと選択的エステル化反応させ
ることを特徴とするω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方
法である。

【００１４】ここで、加水分解に用いられるリパーゼと
しては、シュードモナス属又はキャンディダ属に属する
微生物、例えばシュードモナス・フルオレッセンス、キ
ャンディダ・シリンドラシエ等が産生するリパーゼが挙
げられ、選択的エステル化反応に用いられるリパーゼと
しては、リゾプス属、リゾムコール属、フミコーラ属又
はフザリウム属に属する微生物が産生するリパーゼが挙
げられる。また、ω−３系高度不飽和脂肪酸（例えばド
コサヘキサエン酸）を含有する油脂としては、例えば魚
油が挙げられる。

【００１５】さらに、本発明は、前記精製方法により得
られるω−３系高度不飽和脂肪酸をカラムクロマトグラ
フィーを用いて分取することを特徴とするω−３系高度
不飽和脂肪酸の精製方法である。以下、本発明を詳細に
説明する。

【００１６】

【発明の実施の形態】リパーゼを用いて油脂を加水分解
して得られた脂肪酸画分中の脂肪酸組成は、ケン化によ
る加水分解で得られた脂肪酸画分とよく似た脂肪酸組成
を有するが、本発明者は、リパーゼの性質をうまく選択
すれば、ケン化分解で得られる脂肪酸組成に比べ、若干
EPA含量の低い脂肪酸画分が得られることを見出した。
選択的エステル化反応を用いてDHAを高純度に精製する
場合、初発のEPAが少ない脂肪酸原料を使用することが
好ましく、リパーゼによる加水分解で得られる脂肪酸画
分を選択的エステル化反応の原料とすることは、DHAの
高純度精製には非常に有効な方法である。

【００１７】本発明の高度不飽和脂肪酸の精製方法は、
まず、リパーゼを用いて油脂を加水分解し、得られる脂
肪酸混合物を、リパーゼを用いて選択的エステル化反応
を行うことを特徴とする。なお、選択的エステル化反応
は、有機溶媒の存在しない反応系で行われる。ここで、
本発明における「有機溶媒」とは、ｎ−ヘキサン、ジエ
チルエーテル、トルエン、ベンゼン等の有機溶媒（アル
コールを除く）をいい、「有機溶媒を含まない反応系」
とは、脂肪酸、直鎖高級アルコール、水、酵素等で構成
される反応系をいう。

【００１８】本発明に用いられる高度不飽和脂肪酸を含
有する油脂としては、魚油、例えば、マグロ若しくはカ
ツオの頭部から抽出されるもの、イワシ、サバ、サンマ
若しくはアジの全魚体から抽出されるもの、又はイカ若
くはタラの肝臓から抽出される肝油等がEPA、DHAを多く
含むために好ましい。魚油の抽出方法としては、マグロ
若しくはカツオの頭部、イワシ、サバ、サンマ若しくは
アジの全魚体、又はイカ若しくはタラの肝臓を採取し、
これを煮取り抽出、溶剤抽出、圧搾抽出する方法等が挙
げられる。

【００１９】高度不飽和脂肪酸としてはω−３系系高度
不飽和脂肪酸が挙げられ、該脂肪酸は、少なくとも４〜
６個の二重結合を有し、鎖式構造のメチル基末端から３
番目の位置から二重結合が始まっているものをいい、例
えばEPAやDHA等が挙げられる。

【００２０】前記抽出した魚油をリパーゼを用いて加水
分解し、脂肪酸の混合物を得る。リパーゼとしては、例
えば、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生
物、好ましくはシュードモナス・フルオレッセンス（Ps
eudomonas fluorescence）が生産するリパーゼ（天野製
薬（株）製のリパーゼAK）又はシュードモナス・エスピ
ー（Pseudomonas sp.)が生産するリパーゼ（昭和電工
（株）のLiposam）、あるいはキャンディダ（Candida)
属に属する微生物、好ましくはキャンディダ・シリンド
ラシエ(Candida cylindracea) 等が生産するリパーゼ
（名糖産業製のリパーゼOF）等が挙げられる。これらの
リパーゼの使用形態はそのままでもよいが、固定化剤
（例えば、アクリル樹脂、イオン交換樹脂、セライトや
セラミックス担体等）に固定したリパーゼを使用しても
よく、特に限定されるものではない。加水分解に使用す
るリパーゼの使用量は、反応条件によって適宜決定すれ
ばよく、特に制限されるものではないが、通常は、油脂
１g当たり50〜5,000 ユニット、好ましくは、100〜1,50
0 ユニット程度が使用される。

【００２１】加水分解反応は、通常行われている油脂の
条件で行なってよい。即ち、前記リパーゼを用いて、１
〜500％（重量％、以下同じ））の水量の下、15〜60℃
の温度条件（15℃未満ではリパーゼの反応速度が遅くな
り、60℃を超えるとリパーゼの失活が著しい。）で30分
〜72時間静置又は撹拌することにより加水分解を行な
う。但し、本発明で使用するリパーゼの活性を十分に発
現させるためには、以下の条件がより好ましい。

【００２２】すなわち、20〜200%の水分量であること、
25〜50℃の温度条件であること、撹拌して反応させるこ
と（エステル化反応は静置したままでも進行するが、撹
拌により反応効率が大幅に上昇する。）、脂肪酸の酸化
的劣化を防止するため窒素気流下で１〜50時間程度の短
時間で反応させること、である。

【００２３】本発明において、リパーゼによる油脂の加
水分解率は、次式Ｉ： 加水分解率(%)＝（酸価／ケン化価）× 100 〔Ｉ〕 によって算出することができる。

【００２４】式Ｉにおいて、酸価とは、サンプリングし
た水と油のエマルジョンを湯浴中で加温（30〜100℃）
することによりエマルジョンが破壊された時の、上層に
得られる加水分解油の測定値をいい、ケン化価とは、上
記エマルジョンの分解前の油脂のケン化価をいう。

【００２５】このようにして行なった加水分解後の加水
分解油中には、主成分の遊離脂肪酸と未分解グリセリド
および若干のグリセリンが含まれているが、次に行なう
選択的エステル化反応を円滑に進行させるためには、未
分解グリセリドおよびグリセリンは除去しておく必要が
ある。遊離の脂肪酸画分を分取する方法としては、通常
行なわれているアルカリによる抽出法（アルカリ反応さ
せて脂肪酸塩とした後、水層側に分画する方法）、溶剤
液−液分配による方法、クロマトグラフィーによる方
法、低温結晶化分別による方法、分子蒸留による方法、
精密真空蒸留による方法等が挙げられる。なお、クロマ
トグラフィーについてはカラムクロマトグラフィーがよ
り好ましく、高速液体クロマトグラフィーが最も好まし
い。

【００２６】前記加水分解反応において、１回のリパー
ゼ処理で所望の加水分解率は得られるが、更に収率よく
遊離脂肪酸の分解を望む場合には、一回目の反応で未分
解であったグリセリド画分を、上記と同様の条件で再度
加水分解反応を繰り返すことにより、収率よく脂肪酸を
回収することができる。

【００２７】次に、得られた脂肪酸の選択的エステル化
反応を行う。選択的エステル化反応に使用するリパーゼ
としては、リゾプス（Rhizopus）属に属する微生物、好
ましくはリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）が生
産するリパーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末12
0,000U/g）、リゾムコール属に属する微生物、好ましく
はリゾムコール・ミーハイ（Rhizomucor miehei）が生
産するリパーゼ（ノボノルディスク（株）製）、フミコ
ーラ（Humicola）属に属する微生物、好ましくはフミコ
ーラ・ラングノーサ（Humicola langunosa）が生産する
リパーゼ（ノボノルディスク（株）製）、フザリウム
（Fusarium）属に属する微生物、好ましくはフザリウム
・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）が生産す
るリパーゼ等が挙げられる。リパーゼの使用量はその活
性や所望の高度不飽和脂肪酸の濃縮度によっても異なる
が、脂肪酸とアルコールとの反応混液1g当たり30〜2,00
0 ユニット、好ましくは100〜1,000 ユニット程度が使
用される。

【００２８】選択的エステル化反応を行なうための反応
混液中の脂肪酸とアルコールとの原料比（モル比）は1:
1〜1:10、好ましくは1:2〜1:8程度である。エステル化
反応は、通常行なわれているリパーゼの反応条件で行な
ってよい。即ち、前記選択的エステル反応に使用するリ
パーゼを用いて、0.5〜100%（重量%、以下同様）の水分
量の下、15〜50℃の温度条件（15℃未満ではリパーゼの
反応速度が遅くなり、50℃を超えるとリパーゼの失活が
著しい。）で30分〜72時間静置又は攪拌することにより
エステル化（エステル合成）を行なう。

【００２９】但し、本発明で使用する選択的エステル化
用リパーゼの活性を十分に発現させるためには、以下の
条件がより好ましい。すなわち、５〜50%の水分量であ
ること、25〜40℃の温度条件であること、撹拌して反応
させること（エステル化反応は静置したままでも進行す
るが、撹拌により反応効率が大幅に上昇する。）、脂肪
酸の酸化的劣化を防止するため、窒素気流下で１〜30時
間程度の短時間で反応させること、である。

【００３０】本発明において、リパーゼによる脂肪酸の
エステル合成率は、次式II： エステル合成率(%)＝ （反応開始時の反応混液の酸価−反応終了時の反応混液の酸価）÷反応開始時 の反応混液の酸価 × 100 〔II〕 によって算出することができる。

【００３１】上記のエステル合成率を算出することによ
って、高度不飽和脂肪酸が濃縮した脂肪酸画分の収率を
求めることができる。例えば、エステル合成率が60%の
場合には、脂肪酸画分の収率は、100%から60%を差し引
いた値（40%）となる。前記エステル化反応において、
１回のリパーゼ処理で所望の純度の高度不飽和脂肪酸を
含む脂肪酸は得られるが、更に高純度の高度不飽和脂肪
酸を望む場合には、一回目の反応によって得られた脂肪
酸画分を同様の処理により、再度選択的エステル化反応
を繰り返し脂肪酸画分を分取することで、更に高純度ま
で精製することができる。

【００３２】選択的エステル化反応後の反応混合物中に
は、高度不飽和脂肪酸が濃縮した遊離脂肪酸画分以外
に、ワックスエステル及び未反応の高級アルコールが含
まれている。したがって、繰り返しエステル化反応を行
うときは、遊離脂肪酸画分を得るために、ワックスエス
テル及びアルコールを除去し精製しておく必要がある。

【００３３】遊離の脂肪酸画分を分取する方法として
は、通常行なわれているアルカリによる抽出法（アルカ
リ反応させて脂肪酸塩とした後、水層側に分画する方
法）、溶剤液−液分配による方法、クロマトグラフィー
による方法、低温結晶化分別による方法、分子蒸留によ
る方法、精密真空蒸留による方法等が挙げられる。クロ
マトグラフィー等を行うことによって、高度不飽和脂肪
酸を95％以上の高純度に精製することができる。なお、
クロマトグラフィーについてはカラムクロマトグラフィ
ーがより好ましく、高速液体クロマトグラフィーが最も
好ましい。

【００３４】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明は、これら実施例にその技術的
範囲を限定するものではない。

【００３５】〔実施例１〕マグロ油（ケン化価;184、DH
A22.9%,EPA6.5%）100gに、シュードモナス・フルオレッ
センス（Pseudomonas fluorescence）が生産するリパー
ゼ（天野製薬（株）製、リパーゼAK）を油1gに対して60
0 ユニットになるように溶解した蒸留水100gを加えて、
撹拌しながら40℃で16時間加水分解反応を行った。加水
分解反応後の反応液は、十分平衡に達していた。次い
で、該反応液からリパーゼを含む水層を除去して加水分
解油を得た（加水分解の酸価は114.6であった）。

【００３６】更に、該加水分解油にn-ヘキサン１Lを溶
解してから、１Lの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液
を加えて脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪酸
画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。分離し
たヘキサン層（上層）に、再度500mlの2N-水酸化カリウ
ム／エタノール溶液を加えて脂肪酸の再抽出を行った。
脂肪酸を抽出した水−エタノール層を合わせ、これに50
0mlのn-ヘキサンを加えてから4N-塩酸で中和し、ヘキサ
ン層中に脂肪酸画分を抽出した。ロータリーエバポレー
ターを用いてn-ヘキサンを留去し脂肪酸画分を濃縮精製
したところ、56.2gが得られた。得られた脂肪酸を三フ
ッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化し、
キャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成
を分析した結果、パルミチン酸酸19.4%、ステアリン酸
4.5%、オレイン酸21.2%、リノール酸1.2%、EPA4.3%、DH
A24.2%であった。

【００３７】〔実施例２〕実施例１で得られたマグロ油
由来の脂肪酸画分（DHA24.2%、EPA4.3%）50g及びラウリ
ルアルコール70g を含む反応混液（モル比1:2）に、リ
ゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパ
ーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000 U/
g）30,000ユニットを溶解した蒸留水30mlを加え（反応
混液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流
下で撹拌しながら30℃で20時間選択的エステル化反応を
行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達し
ていた（エステル合成率は72.1%であった。）。次い
で、該反応液からリパーゼを含む水層を除去して反応混
合物を得た。更に、該反応混合物をn-ヘキサン1.2Lに溶
解してから1.2Lの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液
を加え、脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪酸
画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。

【００３８】分離したヘキサン層（上層）に再度0.6Lの
2N-水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸の
再抽出を行った。脂肪酸を抽出した水−エタノール層を
合わせ、これに0.6Lのn-ヘキサンを加えて、4N-塩酸で
中和することによりヘキサン層中に脂肪酸画分を抽出し
た。ロータリーエバポレーターによりn-ヘキサンを留去
して脂肪酸を濃縮したところ、12.9gが得られた。得ら
れた脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチ
ルエステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィー
により脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸5.2%、
ステアリン酸1.2%、オレイン酸5.7%、EPA4.0%、DHA71.6
%であった。

【００３９】〔実施例３〕実施例２で得られたω−３系
高度不飽和脂肪酸を濃縮した脂肪酸画分10g及びラウリ
ルアルコール14g を含む反応混液（モル比1:2）に、リ
ゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパ
ーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000 U/
g）4,800 ユニットを溶解した蒸留水6mlを加え（反応混
液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流下
で撹拌しながら30℃で20時間で再度選択的エステル化反
応を行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に
達していた（エステル合成率は28.4%であった。）。

【００４０】実施例２と同様にスケールダウンした方法
で脂肪酸画分を抽出し、7.3gが得られた。得られた脂肪
酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステ
ル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂
肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸0.8%、ステアリ
ン酸0.9%、オレイン酸0.9%、EPA1.7%、DHA90.6%であっ
た。

【００４１】〔実施例４〕マグロ油（ケン化価;184、DH
A22.9%,EPA6.5%）100gに、シュードモナス（Pseudomona
s sp.）属の微生物が生産するリパーゼ（昭和電工
（株）、Liposam）を油1gに対して2,000 ユニットにな
るように溶解した蒸留水を100g加えて、撹拌しながら40
℃で16時間加水分解反応を行った。加水分解反応後の反
応液は、十分平衡に達していた。次いで、該反応液から
リパーゼを含む水層を除去して加水分解油を得た（加水
分解の酸価は139.5 であった）。

【００４２】更に、該加水分解油をn-ヘキサン１Lに溶
解してから、１Lの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液
を加えて脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪酸
画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。分離し
たヘキサン層（上層）に再度500mlの2N-水酸化カリウム
／エタノール溶液を加えて脂肪酸の再抽出を行った。脂
肪酸を抽出した水−エタノールを合わせ、これに500ml
のn-ヘキサンを加えてから4N-塩酸で中和してヘキサン
層中に脂肪酸画分を抽出した。ロータリーエバポレータ
ーを用いてn-ヘキサンを留去し脂肪酸画分を濃縮精製し
たところ、68.2gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ
化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化してキ
ャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を
分析した結果、パルミチン酸19.8%、ステアリン酸4.7
%、オレイン酸24.0%、リノール酸1.2%、EPA5.0%、DHA1
8.8%であった。

【００４３】〔実施例５〕実施例４で得られたマグロ油
由来の脂肪酸画分（DHA18.8%、EPA5.0%）50g及びラウリ
ルアルコール70g を含む反応混液（モル比1:2）に、リ
ゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパ
ーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000 U/
g）30,000ユニットを溶解した蒸留水30mlを加え（反応
混液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流
下で撹拌しながら30℃で20時間で選択的エステル化反応
を行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達
していた（エステル合成率は71.6%であった）。実施例
３と同様にスケールダウンした方法で脂肪酸画分を抽出
し、11.4gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ
素−メタノール法によりメチルエステル化してキャピラ
リーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析し
た結果、パルミチン酸8.0%、ステアリン酸1.8%、オレイ
ン酸9.4%、リノール酸0.5%、EPA5.1%、DHA65.0%であっ
た。

【００４４】〔実施例６〕実施例５で得られたω−３系
高度不飽和脂肪酸を濃縮した脂肪酸画分10g及びラウリ
ルアルコール14g を含む反応混液（モル比1:2）に、リ
ゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパ
ーゼ（田辺製薬（株）製、リパーゼ原末120,000 U/g）1
2,000ユニットを溶解した蒸留水6mlを加え（反応混液1g
当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流下で撹
拌しながら30℃で20時間で再度選択的エステル化反応を
行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達し
ていた（エステル合成率は22.8%であった。）。実施例
５と同様にスケールダウンした方法で脂肪酸画分を抽出
し、6.3gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ化ホウ素
−メタノール法によりメチルエステル化してキャピラリ
ーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した
結果、パルミチン酸1.7%、ステアリン酸0.4%、オレイン
酸2.1%、EPA2.8%、DHA85.4%であった。

【００４５】〔実施例７〕マグロ油（ケン化価;184、DH
A22.9%,EPA6.5%）100gにキャンディダ・シリンドラシエ
（Candida cylindracea ）が生産するリパーゼ（名糖産
業製、リパーゼOF）を油1gに対して、1,000 ユニットに
なるように溶解した蒸留水100gを加えて、撹拌しながら
40℃で16時間加水分解反応を行った。加水分解反応後の
反応液は、十分平衡に達していた。次いで、該反応液か
らリパーゼを含む水層を除去して加水分解油を得た（加
水分解の酸価は119.4 であった）。

【００４６】更に、該加水分解油にn-ヘキサン１L を溶
解してから、１L の2N- 水酸化カリウム／エタノール溶
液を加えて脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪
酸画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。分離
したヘキサン層（上層）には再度500ml の2N- 水酸化カ
リウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸の再抽出を行っ
た。脂肪酸を抽出した水- エタノール層を合わせ、これ
に500ml のn-ヘキサンを加えてから4N- 塩酸で中和して
ヘキサン層中に脂肪酸画分を抽出した。ロータリーエバ
ポレーターを用いてn-ヘキサンを留去し脂肪酸画分を濃
縮精製したところ、58.4g が得られた。得られた脂肪酸
を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル
化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪
酸組成を分析した結果、パルミチン酸20.6% 、ステアリ
ン酸4.7%、オレイン酸24.4% 、リノール酸1.4%、EPA6.4
% 、DHA13.1%であった。

【００４７】〔実施例８〕実施例７で得られたマグロ油
由来の脂肪酸画分（DHA13.1%、EPA6.4% ）50g とラウリ
ルアルコール 70gからなる反応混液（モル比1:2 ）に、
リゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリ
パーゼ（田辺製薬製、タリパーゼ原末120,000 U/g ））
30,000ユニットを溶解した蒸留水30mlを加え（反応混液
1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流下で
撹拌しながら30℃で20時間選択的エステル化反応を行っ
た。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達してい
た（エステル合成率は81.7% であった）。

【００４８】次いで、該反応液からリパーゼを含む水層
を除去して反応混合物を得た。更に、該反応混合物をn-
ヘキサン1.2Lに溶解してから1.2Lの2N- 水酸化カリウム
／エタノール溶液を加え、脂肪酸をカリウム塩にするこ
とにより、脂肪酸画分を水−エタノール層（下層）に移
行させた。分離したヘキサン層（上層）に再度0.6Lの2N
- 水酸化カリウム／エタノール 溶液を加えて脂肪酸の
再抽出を行った。脂肪酸を抽出した水−エタノール層を
合わせ、これに0.6Lのn-ヘキサンを加えて、4N- 塩酸で
中和することによりヘキサン層中に脂肪酸画分を抽出し
た。ロータリーエバポレーターによりn-ヘキサンを留去
して脂肪酸を濃縮したところ、8.2gが得られた。得られ
た脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチル
エステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーに
より脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸8.0%、ス
テアリン酸1.8%、オレイン酸9.4%、リノール酸0.5%、EP
A6.4% 、DHA58.3%であった。

【００４９】〔実施例９〕実施例８で得られた高度不飽
和脂肪酸を濃縮した脂肪酸画分5gとラウリルアルコール
7g からなる反応混液（モル比1:2 ）に、リゾプス・デ
レマー（Rhizopusdelemer）が生産するリパーゼ（田辺
製薬製、タリパーゼ原末120,000 U/g ））3,000 ユニッ
トを溶解した蒸留水3ml を加え（反応混液1g当たり酵素
量200 ユニットとした。）、窒素気流下で撹拌しながら
30℃で20時間で再度選択的エステル化反応を行った。エ
ステル化反応後の反応液は、十分平衡に達していた（エ
ステル合成率は32.5% であった）。

【００５０】次いで、該反応液からリパーゼを含む水層
を除去して反応混合物を得た。更に、該反応混合物をn-
ヘキサン2.4Lに溶解してから2.4Lの2N-水酸化カリウム
／エタノール溶液を加え、脂肪酸をカリウム塩にするこ
とにより、脂肪酸画分を水−エタノール層（下層）に移
行させた。分離したヘキサン層（上層）に再度1.2Lの2N
-水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて脂肪酸の再
抽出を行った。脂肪酸を抽出した水−エタノール層を合
わせ、これに1.2Lのn-ヘキサンを加えて、4N-塩酸で中
和することによりヘキサン層中に脂肪酸画分を抽出し
た。ロータリーエバポレーターによりn-ヘキサンを留去
して脂肪酸を濃縮したところ、3.0gが得られた。得られ
た脂肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチル
エステル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーに
より脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸1.9%、ス
テアリン酸0.5 % 、オレイン酸2.0%、EPA5.1% 、DHA81.
0%であった。

【００５１】〔比較例１〕マグロ油（ケン化価;184、DH
A22.9%, EPA6.5% ）を常法に従いケン化分解して得られ
た遊離脂肪酸画分（DHA23.0%、EPA6.8%）100g及びラウ
リルアルコール140gを含む反応混液（モル比1:2）に、
リゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリ
パーゼ（田辺製薬（株）製、リパーゼ原末120,000 U/
g）60,000ユニットを溶解した蒸留水60mlを加え（反応
混液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流
下で撹拌しながら30℃で20時間選択的エステル化反応を
行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡に達し
ていた（エステル合成率は68.9%であった。）。次い
で、該反応液からリパーゼを含む水層を除去して反応混
合物を得た。更に、該反応混合物をn-ヘキサン2.4Lに溶
解してから2.4Lの2N-水酸化カリウム／エタノール溶液
を加え、脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪酸
画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。分離し
たヘキサン層（上層）に再度1.2Lの2N-水酸化カリウム
／エタノール溶液を加えて脂肪酸の再抽出を行った。脂
肪酸を抽出した水−エタノール層を合わせ、これに1.2L
のn-ヘキサンを加えて、4N-塩酸で中和することにより
ヘキサン層中に脂肪酸画分を抽出した。ロータリーエバ
ポレーターによりn-ヘキサンを留去して脂肪酸を濃縮し
たところ、27.8gが得られた。得られた脂肪酸を三フッ
化ホウ素−メタノール法によりメチルエステル化してキ
ャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を
分析した結果、パルミチン酸4.3%、ステアリン酸1.1%、
オレイン酸5.0%、EPA6.9%、DHA68.8%であった。

【００５２】ここで、常法（60〜80℃で１〜２時間の還
流下）を用いたケン化分解で得られる脂肪酸は色調が濃
く、リパーゼで分解した脂肪酸は淡いものであった。淡
い色調の脂肪酸は反応工程のダメージが少ないことが予
想され、リパーゼで分解した脂肪酸は、ケン化分解によ
り得られた脂肪酸よりも酸化分解物の含有量が少ない点
で品質に優れている。

【００５３】〔比較例２〕比較例１で得られたω−３系
高度不飽和脂肪酸を濃縮した脂肪酸画分25g及びラウリ
ルアルコール35g を含む反応混液（モル比1:2）に、リ
ゾプス・デレマー（Rhizopus delemer）が生産するリパ
ーゼ（田辺製薬（株）製、タリパーゼ原末120,000 U/
g）12,000ユニットを溶解した蒸留水15mlを加え（反応
混液1g当たり酵素量200 ユニットとした。）、窒素気流
下で撹拌しながら30℃で20時間で再度選択的エステル化
反応を行った。エステル化反応後の反応液は、十分平衡
に達していた（エステル合成率は28.3%であった。）。

【００５４】比較例１と同様にスケールダウンした方法
で脂肪酸画分を抽出し、18.2gが得られた。得られた脂
肪酸を三フッ化ホウ素−メタノール法によりメチルエス
テル化してキャピラリーガスクロマトグラフィーにより
脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸0.7%、オレイ
ン酸0.9%、EPA4.6%、DHA85.1%であった。

【００５５】〔実施例１０〕実施例２で得られたDHA高
純度濃縮脂肪酸混合物を医薬品原体用に更に濃縮するた
め、通常行なわれている塩酸−エタノール法により該脂
肪酸混合物をエチルエステル体に変換した。得られた脂
肪酸エチルエステルを全自動分取型高速液体クロマトグ
ラフィー（三菱化工機（株）製）に装着したDevelosil
ODS-10/20 を充填したカラム（直径50mm×長さ500mm,野
村化学（株）製）に１バッチ当たり4,000μlを自動注入
した。溶離液は100%メタノールで行ない、カラム恒温槽
を30℃に設定しながら、流速40ml/minで流し、分取時間
を50min/バッチでDHAエチルエステルの分取を行なっ
た。

【００５６】ピークの検出は紫外部吸収検出器でUV214n
mでモニターしながら行ない、DHAエチルエステル画分を
3.25g分取した。得られたDHAエチルエステルをキャピラ
リーガスクロマトグラフィーで分析したところ、99.9%
の純度であった。

【００５７】以上の結果を表１に示す。

【００５８】

【表１】

【００５９】表１から明らかなように、ケン化分解で得
られた脂肪酸、リパーゼによる加水分解によって得られ
た脂肪酸ともに、選択的エステル化を行うことによりか
なりEPA含量を下げることは可能である。しかし、本発
明により、リパーゼ処理で得られた脂肪酸原料を用いエ
ステル化反応した方が、脂肪酸画分中のEPA含量をより
低くできた。すなわち、本発明の方法のように、選択的
エステル化反応に供する初発脂肪酸原料をリパーゼを用
いて加水分解することにより、できるだけEPA含量を下
げてDHAを高純度に精製することができるため、本発明
の方法は極めて有効な方法である。このことは、実施例
と比較例とを比較した結果から明らかである。

【００６０】また、本発明の方法は、ケン化分解により
得られた脂肪酸よりも高品質の脂肪酸を得ることができ
る点で優れている。さらに、簡便な工程で脂肪酸画分が
得られるリパーゼを用いた加水分解は、DHAの高純度精
製において効果的に行える極めて有望な方法である。

【００６１】

【発明の効果】本発明により、高度不飽和脂肪酸の精製
方法が提供される。種々の生理活性作用を有するω−３
系高度不飽和脂肪酸を、本発明の方法によって収率よく
高純度に精製できることは、医薬品、生化学試薬等に十
分に利用できることから、本発明は産業上極めて有用で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:39） (72)発明者 富永 嘉男 大阪府大阪市西淀川区歌島２丁目７番２号 (72)発明者 杉原 耿雄 兵庫県伊丹市千僧６丁目87番地 (72)発明者 島田 裕司 大阪府堺市櫛屋町東４丁２番31号

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する油
   脂をリパーゼを用いて加水分解し、得られる脂肪酸の混
   合物を、リパーゼを用いて有機溶媒を含まない反応系で
   直鎖高級アルコールと選択的エステル化反応させること
   を特徴とするω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方法。
2. 【請求項２】 ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する油
   脂をリパーゼを用いて加水分解し、得られる脂肪酸の混
   合物を、リパーゼを用いて有機溶媒を含まない反応系で
   直鎖高級アルコールと選択的エステル化反応させ、得ら
   れる反応産物から脂肪酸混合物を分画し、前記選択的エ
   ステル化反応に用いたリパーゼを用いて再度直鎖高級ア
   ルコールと選択的エステル化反応させることを特徴とす
   るω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方法。
3. 【請求項３】 加水分解に用いられるリパーゼがシュー
   ドモナス属又はキャンディダ属に属する微生物由来のも
   のである請求項１又は２記載のω−３系高度不飽和脂肪
   酸の精製方法。
4. 【請求項４】 シュードモナス属に属する微生物がシュ
   ードモナス・フルオレッセンスである請求項３記載のω
   −３系高度不飽和脂肪酸の精製方法。
5. 【請求項５】 キャンディダ属に属する微生物がキャン
   ディダ・シリンドラシエである請求項３記載のω−３系
   高度不飽和脂肪酸の精製方法。
6. 【請求項６】 選択的エステル化反応に用いられるリパ
   ーゼが、リゾプス属、リゾムコール属、フミコーラ属又
   はフザリウム属に属する微生物が産生するものである請
   求項１又は２記載のω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方
   法。
7. 【請求項７】 ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する油
   脂が魚油である請求項１又は２記載のω−３系高度不飽
   和脂肪酸の精製方法。
8. 【請求項８】 ω−３系高度不飽和脂肪酸がドコサヘキ
   サエン酸である請求項６記載のω−３系高度不飽和脂肪
   酸の精製方法。
9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の精
   製方法により得られるω−３系高度不飽和脂肪酸をカラ
   ムクロマトグラフィーを用いて分取することを特徴とす
   るω−３系高度不飽和脂肪酸の精製方法。