JPH10179179A - 特定遺伝子配列の定量方法及び定量試薬 - Google Patents
特定遺伝子配列の定量方法及び定量試薬Info
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- JPH10179179A JPH10179179A JP9302529A JP30252997A JPH10179179A JP H10179179 A JPH10179179 A JP H10179179A JP 9302529 A JP9302529 A JP 9302529A JP 30252997 A JP30252997 A JP 30252997A JP H10179179 A JPH10179179 A JP H10179179A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 特定の配列を有する遺伝子を検出又は定量す
る方法及びそのための検出又は定量試薬に関する。 【解決手段】 試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子
配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補
的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着
しにくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又は介
さず結合している担体結合ＤＮＡプローブと試料中のＤ
ＮＡ断片とをハイブリダイズし、該担体結合ＤＮＡプロ
ーブとハイブリダイズした試料中のＤＮＡ断片を検出又
は定量することからなる試薬及び標識化合物の検出又は
定量試薬からなる特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ
断片の検出又は定量用試薬キット。
る方法及びそのための検出又は定量試薬に関する。 【解決手段】 試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子
配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補
的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着
しにくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又は介
さず結合している担体結合ＤＮＡプローブと試料中のＤ
ＮＡ断片とをハイブリダイズし、該担体結合ＤＮＡプロ
ーブとハイブリダイズした試料中のＤＮＡ断片を検出又
は定量することからなる試薬及び標識化合物の検出又は
定量試薬からなる特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ
断片の検出又は定量用試薬キット。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子型及び遺伝
子の突然変異等を早期に診断するための簡便な検出又は
定量方法及びそれに用いる検出又は定量用試薬に関す
る。
子の突然変異等を早期に診断するための簡便な検出又は
定量方法及びそれに用いる検出又は定量用試薬に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】癌は、各種画像診断や生化学的診断によ
り早期発見が可能となりつつある。しかしある程度進行
してからでないと発見できない場合が多い。また、膵臓
癌は、胃癌や大腸癌のように生検が容易に行えないた
め、慢性膵炎との鑑別が困難な例も少なくなく、治療を
困難にする例もある。
り早期発見が可能となりつつある。しかしある程度進行
してからでないと発見できない場合が多い。また、膵臓
癌は、胃癌や大腸癌のように生検が容易に行えないた
め、慢性膵炎との鑑別が困難な例も少なくなく、治療を
困難にする例もある。
【０００３】近年、癌に関する分子生物学的研究の進歩
により、ヒト膵癌の大部分を占める膵管癌では、Ｋ−ｒ
ａｓコドン１２の点突然変異が高率に発現することが判
明し、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction 、ポリメラ
ーゼ連鎖反応）法を用いたこの点突然変異の検出が膵癌
の鑑別診断法として注目されている。しかし、ＰＣＲ法
は高感度ではあるが、コストが高く、また遺伝子のコン
タミネーションを起こしやすく手技が煩雑である等のこ
とより、この方法は膵癌の鑑別診断法としては、まだ広
く普及していない。
により、ヒト膵癌の大部分を占める膵管癌では、Ｋ−ｒ
ａｓコドン１２の点突然変異が高率に発現することが判
明し、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction 、ポリメラ
ーゼ連鎖反応）法を用いたこの点突然変異の検出が膵癌
の鑑別診断法として注目されている。しかし、ＰＣＲ法
は高感度ではあるが、コストが高く、また遺伝子のコン
タミネーションを起こしやすく手技が煩雑である等のこ
とより、この方法は膵癌の鑑別診断法としては、まだ広
く普及していない。
【０００４】また、特異的な親和性を利用した物質の精
製方法に関しては、例えば担体に結合したＤＮＡプロー
ブを用いて、該プローブＤＮＡに特異的に吸着する蛋白
質を精製する方法（特開平３−６１４９３号公報）が知
られている。また、非特異的吸着を示さない担体を用い
て該担体に結合したＤＮＡプローブを用いて該プローブ
に特異的に結合するＤＮＡ又はＲＮＡを濃縮又は精製す
る方法［ジャーナル・オブ・コロイド・アンド・インタ
ーフェース・サイエンス（J. Colloid and Interface S
ci. ），１７７，２４５（１９９６）］が知られてい
る。
製方法に関しては、例えば担体に結合したＤＮＡプロー
ブを用いて、該プローブＤＮＡに特異的に吸着する蛋白
質を精製する方法（特開平３−６１４９３号公報）が知
られている。また、非特異的吸着を示さない担体を用い
て該担体に結合したＤＮＡプローブを用いて該プローブ
に特異的に結合するＤＮＡ又はＲＮＡを濃縮又は精製す
る方法［ジャーナル・オブ・コロイド・アンド・インタ
ーフェース・サイエンス（J. Colloid and Interface S
ci. ），１７７，２４５（１９９６）］が知られてい
る。
【０００５】しかし、ハイブリダイゼーション法を用い
た１塩基ミスマッチの排除が可能な特定遺伝子断片の検
出又は定量方法は知られていない。
た１塩基ミスマッチの排除が可能な特定遺伝子断片の検
出又は定量方法は知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、特定
遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片をハイブリダイゼ
ーション法を用いて検出又は定量する方法及びそれに用
いる検出又は定量試薬を提供することである。該方法
は、癌等の各種疾患に関与して生じる点突然変異等の検
出又は定量に有用である。
遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片をハイブリダイゼ
ーション法を用いて検出又は定量する方法及びそれに用
いる検出又は定量試薬を提供することである。該方法
は、癌等の各種疾患に関与して生じる点突然変異等の検
出又は定量に有用である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、試料中
の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖Ｄ
ＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的な配列を有する一本
鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着しにくい物質からなる
担体とがスペーサーを介し又は介さず結合している担体
結合ＤＮＡプローブと試料中のＤＮＡ断片とをハイブリ
ダイズし、該担体結合ＤＮＡプローブとハイブリダイズ
した試料中のＤＮＡ断片を検出又は定量することからな
る特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は
定量方法が提供される。
の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖Ｄ
ＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的な配列を有する一本
鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着しにくい物質からなる
担体とがスペーサーを介し又は介さず結合している担体
結合ＤＮＡプローブと試料中のＤＮＡ断片とをハイブリ
ダイズし、該担体結合ＤＮＡプローブとハイブリダイズ
した試料中のＤＮＡ断片を検出又は定量することからな
る特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は
定量方法が提供される。
【０００８】また、試料中の検出又は定量すべき特定遺
伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と
相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを
吸着しにくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又
は介さず結合している担体結合ＤＮＡプローブ及び試料
中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖
ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列以外の部分配列と相補的な
配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブを共に試料中のＤＮ
Ａ断片にハイブリダイズし、該担体結合ＤＮＡ及び該一
本鎖ＤＮＡプローブにハイブリダイズした試料中のＤＮ
Ａ断片を検出又は定量することからなる特定遺伝子配列
を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方法が提供さ
れる。
伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と
相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを
吸着しにくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又
は介さず結合している担体結合ＤＮＡプローブ及び試料
中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖
ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列以外の部分配列と相補的な
配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブを共に試料中のＤＮ
Ａ断片にハイブリダイズし、該担体結合ＤＮＡ及び該一
本鎖ＤＮＡプローブにハイブリダイズした試料中のＤＮ
Ａ断片を検出又は定量することからなる特定遺伝子配列
を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方法が提供さ
れる。
【０００９】更に、試料中の検出又は定量すべき特定遺
伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と
相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを
吸着しにくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又
は介さず結合している担体結合ＤＮＡプローブと試料中
のＤＮＡ断片とをハイブリダイズし、次いで一本鎖ＤＮ
Ａ断片を切断する酵素を作用させた後、該担体結合ＤＮ
Ａプローブとハイブリダイズしている試料中のＤＮＡ断
片を検出又は定量することからなる特定遺伝子配列を有
する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方法が提供され
る。
伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と
相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを
吸着しにくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又
は介さず結合している担体結合ＤＮＡプローブと試料中
のＤＮＡ断片とをハイブリダイズし、次いで一本鎖ＤＮ
Ａ断片を切断する酵素を作用させた後、該担体結合ＤＮ
Ａプローブとハイブリダイズしている試料中のＤＮＡ断
片を検出又は定量することからなる特定遺伝子配列を有
する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方法が提供され
る。
【００１０】また本発明によれば、試料中の検出又は定
量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特
定遺伝子配列と相補的な配列を有する１０〜３０ｍｅｒ
の一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着しにくい担体が
スペーサを介し又は介さず結合している担体結合ＤＮＡ
プローブが提供される。本発明によれば、検出又は定量
すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定
遺伝子配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプロー
ブとＤＮＡを吸着しにくい担体がスペーサを介し又は介
さず結合している担体結合ＤＮＡプローブ及び試料中の
検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮ
Ａ断片の特定遺伝子配列以外の部分配列と相補的な配列
を有する一本鎖ＤＮＡプローブと標識化合物が結合して
いる標識結合ＤＮＡプローブからなる試薬及び標識化合
物の検出又は定量試薬からなる特定遺伝子配列を有する
一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量用試薬キットが提供さ
れる。
量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特
定遺伝子配列と相補的な配列を有する１０〜３０ｍｅｒ
の一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着しにくい担体が
スペーサを介し又は介さず結合している担体結合ＤＮＡ
プローブが提供される。本発明によれば、検出又は定量
すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定
遺伝子配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプロー
ブとＤＮＡを吸着しにくい担体がスペーサを介し又は介
さず結合している担体結合ＤＮＡプローブ及び試料中の
検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮ
Ａ断片の特定遺伝子配列以外の部分配列と相補的な配列
を有する一本鎖ＤＮＡプローブと標識化合物が結合して
いる標識結合ＤＮＡプローブからなる試薬及び標識化合
物の検出又は定量試薬からなる特定遺伝子配列を有する
一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量用試薬キットが提供さ
れる。
【００１１】また、検出又は定量すべき特定遺伝子配列
を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的な
配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブと標識化合物が結合
している標識結合ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着しにく
い担体がスペーサを介し又は介さず結合している担体結
合標識ＤＮＡプローブが提供される。また、検出又は定
量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特
定遺伝子配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプロ
ーブと標識化合物が結合している標識結合ＤＮＡプロー
ブとＤＮＡを吸着しにくい担体がスペーサを介し又は介
さず結合している担体結合標識ＤＮＡプローブからなる
試薬、一本鎖ＤＮＡを切断する酵素からなる試薬及び標
識化合物の検出又は定量試薬からなる特定遺伝子配列を
有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量用試薬キットが
提供される。
を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的な
配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブと標識化合物が結合
している標識結合ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着しにく
い担体がスペーサを介し又は介さず結合している担体結
合標識ＤＮＡプローブが提供される。また、検出又は定
量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特
定遺伝子配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプロ
ーブと標識化合物が結合している標識結合ＤＮＡプロー
ブとＤＮＡを吸着しにくい担体がスペーサを介し又は介
さず結合している担体結合標識ＤＮＡプローブからなる
試薬、一本鎖ＤＮＡを切断する酵素からなる試薬及び標
識化合物の検出又は定量試薬からなる特定遺伝子配列を
有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量用試薬キットが
提供される。
【００１２】 〔発明の詳細な説明〕本発明では、試料中の検出又は定
量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特
定遺伝子配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプロ
ーブとＤＮＡを吸着しにくい担体がスペーサを介し又は
介さず結合している担体結合ＤＮＡプローブを用いる。
量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特
定遺伝子配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプロ
ーブとＤＮＡを吸着しにくい担体がスペーサを介し又は
介さず結合している担体結合ＤＮＡプローブを用いる。
【００１３】担体の形状は特に制限はなく、例えばプレ
ート状の担体や粒子状の担体があげられ、粒子状の担体
が単位体積あたりＤＮＡプローブを多く結合できるので
好ましい。粒子状の担体の粒径としては、０．０１〜１
００μｍが好ましく、０．０５〜２０μｍが特に好まし
い。担体表面はＤＮＡを吸着しにくい物質で覆われてい
るものが好ましい。ＤＮＡを吸着しにくい物質とは表面
が親水性の官能基を多く有する物質であり、天然高分子
でも合成高分子化合物でも用い得る。天然高分子として
は、例えばキトサン、ヒアルロン酸等の多糖類があげら
れる。合成高分子化合物としては、例えば側鎖に水酸基
やアミド基を含む合成高分子化合物があげられる。
ート状の担体や粒子状の担体があげられ、粒子状の担体
が単位体積あたりＤＮＡプローブを多く結合できるので
好ましい。粒子状の担体の粒径としては、０．０１〜１
００μｍが好ましく、０．０５〜２０μｍが特に好まし
い。担体表面はＤＮＡを吸着しにくい物質で覆われてい
るものが好ましい。ＤＮＡを吸着しにくい物質とは表面
が親水性の官能基を多く有する物質であり、天然高分子
でも合成高分子化合物でも用い得る。天然高分子として
は、例えばキトサン、ヒアルロン酸等の多糖類があげら
れる。合成高分子化合物としては、例えば側鎖に水酸基
やアミド基を含む合成高分子化合物があげられる。
【００１４】これら、合成高分子化合物を構成するモノ
マーとしては、例えばエチレングリコール（メタ）アク
リレート、トリエチレングリコール（メタ）アクリレー
ト等のエチレンオキサイド含有（メタ）アクリル酸エス
テル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシメチル、（メタ）
アクリル酸ヒドロキシプロピル等のヒドロキシル基含有
（メタ）アクリル酸エステル、グリシジル（メタ）アク
リレート等のエポキシ基含有（メタ）アクリル酸エステ
ル、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アク
リレート等のアルキル（メタ）アクリル酸エステル、ア
クリルアミド、メタクリルアミド、ジアセトアクリルア
ミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド等のモノエ
チレン性不飽和アミド、アクリロニトリル、メタクリロ
ニトリル等のエチレン性不飽和ニトリル化合物があげら
れる。
マーとしては、例えばエチレングリコール（メタ）アク
リレート、トリエチレングリコール（メタ）アクリレー
ト等のエチレンオキサイド含有（メタ）アクリル酸エス
テル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシメチル、（メタ）
アクリル酸ヒドロキシプロピル等のヒドロキシル基含有
（メタ）アクリル酸エステル、グリシジル（メタ）アク
リレート等のエポキシ基含有（メタ）アクリル酸エステ
ル、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アク
リレート等のアルキル（メタ）アクリル酸エステル、ア
クリルアミド、メタクリルアミド、ジアセトアクリルア
ミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド等のモノエ
チレン性不飽和アミド、アクリロニトリル、メタクリロ
ニトリル等のエチレン性不飽和ニトリル化合物があげら
れる。
【００１５】合成高分子化合物としては、これらのモノ
マー１種からなるポリマー及び２種以上からなる共重合
体ポリマーがあげられる。また、これらポリマーを反応
により親水化させた高分子化合物が好適に用いられる。
具体的に好適な高分子化合物としては、例えばグリシジ
ルメタクリレートのポリマーがあげられる。これら合成
高分子化合物はプレート又は粒子の少なくとも表面の層
を形成すればよく、内部は例えばポリスチレン、ポリビ
ニル等の疎水性高分子であってもよい。プレート又は粒
子の表面は特に、エポキシ基を多く含むように調製され
ることが好ましい。このような粒子としては、例えばポ
リスチレン・ポリグリシジルメタクリレートのコア・シ
ェル構造を持つ粒子があげられる。
マー１種からなるポリマー及び２種以上からなる共重合
体ポリマーがあげられる。また、これらポリマーを反応
により親水化させた高分子化合物が好適に用いられる。
具体的に好適な高分子化合物としては、例えばグリシジ
ルメタクリレートのポリマーがあげられる。これら合成
高分子化合物はプレート又は粒子の少なくとも表面の層
を形成すればよく、内部は例えばポリスチレン、ポリビ
ニル等の疎水性高分子であってもよい。プレート又は粒
子の表面は特に、エポキシ基を多く含むように調製され
ることが好ましい。このような粒子としては、例えばポ
リスチレン・ポリグリシジルメタクリレートのコア・シ
ェル構造を持つ粒子があげられる。
【００１６】該高分子化合物の合成は、モノマーの種類
及び高分子化合物の種類によって異なるが、公知の方法
で合成できる。特に粒子を製造する場合は、例えば懸濁
重合法、乳化重合法等が用いられる。懸濁重合法による
合成する場合、反応には分散安定剤として、例えばポリ
アクリルアミド及びその限定加水分解物、ポリアクリル
酸、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロー
ス、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリ酢
酸ビニル等の水溶性高分子を用いることができる。重合
開始剤としては、アゾビスイソブチロニトリル、２，
２’−アゾビス（２−アミノプロパン）ジヒドロクロラ
イド等のアゾ系開始剤、過酸化ベンゾイル等の過酸化物
等を用いることができる。乳化重合における重合開始剤
としても、通常の乳化重合で使用されるものであれば特
に限定されない。乳化重合法における重合法は、バッチ
式、セミバッチ式、連続式等の各方式が用いられる。乳
化重合法としては、粒子表面をクリーンな面とし吸着物
質を持ち込まない様にするため、水、モノマー、重合開
始剤からなる、ソープフリー乳化重合法を用いることが
好ましく、特に２段階ソープフリー重合法が好ましい。
及び高分子化合物の種類によって異なるが、公知の方法
で合成できる。特に粒子を製造する場合は、例えば懸濁
重合法、乳化重合法等が用いられる。懸濁重合法による
合成する場合、反応には分散安定剤として、例えばポリ
アクリルアミド及びその限定加水分解物、ポリアクリル
酸、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロー
ス、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリ酢
酸ビニル等の水溶性高分子を用いることができる。重合
開始剤としては、アゾビスイソブチロニトリル、２，
２’−アゾビス（２−アミノプロパン）ジヒドロクロラ
イド等のアゾ系開始剤、過酸化ベンゾイル等の過酸化物
等を用いることができる。乳化重合における重合開始剤
としても、通常の乳化重合で使用されるものであれば特
に限定されない。乳化重合法における重合法は、バッチ
式、セミバッチ式、連続式等の各方式が用いられる。乳
化重合法としては、粒子表面をクリーンな面とし吸着物
質を持ち込まない様にするため、水、モノマー、重合開
始剤からなる、ソープフリー乳化重合法を用いることが
好ましく、特に２段階ソープフリー重合法が好ましい。
【００１７】スペーサーとは、ＤＮＡを吸着しにくい物
質からなる担体と試料中の検出又は定量すべき特定遺伝
子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相
補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブを結合するも
のである。該スペーサーとしては、例えばポリエチレン
グリコールジグリシジルエーテル鎖、一本鎖ＤＮＡ鎖、
一本鎖ＲＮＡ鎖等をあげることができる。ポリエチレン
グリコールジグリシジルエーテル鎖長としては、エチレ
ン単位が１〜１０が好ましく、１〜５がより好ましい。
また、一本鎖ＤＮＡ鎖及び一本鎖ＲＮＡ鎖をスペーサに
用いる場合の該鎖の塩基配列はいかなるものでもよい
が、塩基にアミノ基をもつ、アデニン（Ａ）、グアニン
（Ｇ）、シトシン（Ｃ）を末端に有するものが好まし
い。これらの一本鎖ＤＮＡ鎖及び一本鎖ＲＮＡ鎖の長さ
としては、５〜４０ｍｅｒが好ましく、１０〜２０ｍｅ
ｒがより好ましい。
質からなる担体と試料中の検出又は定量すべき特定遺伝
子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相
補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブを結合するも
のである。該スペーサーとしては、例えばポリエチレン
グリコールジグリシジルエーテル鎖、一本鎖ＤＮＡ鎖、
一本鎖ＲＮＡ鎖等をあげることができる。ポリエチレン
グリコールジグリシジルエーテル鎖長としては、エチレ
ン単位が１〜１０が好ましく、１〜５がより好ましい。
また、一本鎖ＤＮＡ鎖及び一本鎖ＲＮＡ鎖をスペーサに
用いる場合の該鎖の塩基配列はいかなるものでもよい
が、塩基にアミノ基をもつ、アデニン（Ａ）、グアニン
（Ｇ）、シトシン（Ｃ）を末端に有するものが好まし
い。これらの一本鎖ＤＮＡ鎖及び一本鎖ＲＮＡ鎖の長さ
としては、５〜４０ｍｅｒが好ましく、１０〜２０ｍｅ
ｒがより好ましい。
【００１８】試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配
列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的
な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブのＤＮＡ断片の長
さとしては、１０〜５０塩基、より好ましくは１０〜３
０塩基、特に好ましくは１５〜２５塩基である。検出又
は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片
の特定遺伝子配列としては、各種の形質に関与する遺伝
子、疾患に関与する遺伝子等に由来するＤＮＡ断片があ
げられる。例えば各種の形質に関与する遺伝子として
は、ＰＳ１（プリセリニン１）遺伝子、ＰＳ２（プリセ
リニン２）遺伝子、ＡＰＰ（ベーターアミロイドプレカ
ーサー蛋白質）遺伝子、リポプロテイン遺伝子、ＨＬＡ
（ヒト白血球抗原）遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、ｈＭＳＨ２遺伝子等があげら
れる。また、疾患に関与する遺伝子としてはＫ−ｒａｓ
遺伝子、ｐ５３遺伝子等があげられる。Ｋ−ｒａｓ遺伝
子の変異については、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ
・キャンサー・リサーチ（Jpn. J. Cancer Res. ），８
４，９６１（１９９３）、同８５，１４７（１９９
４）、同８５，１２４０（１９９４）、同８５，１００
５（１９９４）、同８６，１１５０（１９９５）、同８
６，７３７（１９９５）、同８７，４６６（１９９
６）、同８７，１０５６（１９９６）、同８７，７９３
（１９９６）等に記載されている。また、ｐ５３遺伝子
の変異については、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・
キャンサー・リサーチ（Jpn. J. Cancer Res. ），８
５，１０８７（１９９４）、同８５，１２４７（１９９
４）、同８６，１１４３（１９９５）、同８６，５７
（１９９５）、同８６，１７４（１９９５）、同８６，
７３０（１９９５）、同８７，９３０（１９９６）等に
記載されている。ｈＭＳＨ２遺伝子については、ジャパ
ニーズ・ジャーナル・オブ・キャンサー・リサーチ（Jp
n. J. Cancer Res. ），８７，２７９（１９９６）等に
記載されている。
列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的
な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブのＤＮＡ断片の長
さとしては、１０〜５０塩基、より好ましくは１０〜３
０塩基、特に好ましくは１５〜２５塩基である。検出又
は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片
の特定遺伝子配列としては、各種の形質に関与する遺伝
子、疾患に関与する遺伝子等に由来するＤＮＡ断片があ
げられる。例えば各種の形質に関与する遺伝子として
は、ＰＳ１（プリセリニン１）遺伝子、ＰＳ２（プリセ
リニン２）遺伝子、ＡＰＰ（ベーターアミロイドプレカ
ーサー蛋白質）遺伝子、リポプロテイン遺伝子、ＨＬＡ
（ヒト白血球抗原）遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、ｈＭＳＨ２遺伝子等があげら
れる。また、疾患に関与する遺伝子としてはＫ−ｒａｓ
遺伝子、ｐ５３遺伝子等があげられる。Ｋ−ｒａｓ遺伝
子の変異については、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ
・キャンサー・リサーチ（Jpn. J. Cancer Res. ），８
４，９６１（１９９３）、同８５，１４７（１９９
４）、同８５，１２４０（１９９４）、同８５，１００
５（１９９４）、同８６，１１５０（１９９５）、同８
６，７３７（１９９５）、同８７，４６６（１９９
６）、同８７，１０５６（１９９６）、同８７，７９３
（１９９６）等に記載されている。また、ｐ５３遺伝子
の変異については、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・
キャンサー・リサーチ（Jpn. J. Cancer Res. ），８
５，１０８７（１９９４）、同８５，１２４７（１９９
４）、同８６，１１４３（１９９５）、同８６，５７
（１９９５）、同８６，１７４（１９９５）、同８６，
７３０（１９９５）、同８７，９３０（１９９６）等に
記載されている。ｈＭＳＨ２遺伝子については、ジャパ
ニーズ・ジャーナル・オブ・キャンサー・リサーチ（Jp
n. J. Cancer Res. ），８７，２７９（１９９６）等に
記載されている。
【００１９】第１表及び第２表は、それぞれＫ−ｒａｓ
遺伝子及びｐ５３遺伝子配列において癌化に伴い変異を
起こすことが知られている塩基配列の部分変化の一例を
示したものである。これら既知の変異部分の塩基配列を
含む特定遺伝子配列と相補的なＤＮＡ断片がプローブＤ
ＮＡ配列となる。
遺伝子及びｐ５３遺伝子配列において癌化に伴い変異を
起こすことが知られている塩基配列の部分変化の一例を
示したものである。これら既知の変異部分の塩基配列を
含む特定遺伝子配列と相補的なＤＮＡ断片がプローブＤ
ＮＡ配列となる。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【表２】
【００２２】第３表及び第４表は、それぞれヒトＣ型肝
炎ウイルス及びヒト白血球抗原の遺伝子の一部配列を示
したものである。これら配列を含む特定遺伝子配列と相
補的ＤＮＡ断片がプローブＤＮＡとなる。
炎ウイルス及びヒト白血球抗原の遺伝子の一部配列を示
したものである。これら配列を含む特定遺伝子配列と相
補的ＤＮＡ断片がプローブＤＮＡとなる。
【００２３】
【表３】
【００２４】
【表４】
【００２５】このように、一本鎖ＤＮＡプローブの配列
はこれら公知の配列に基づいて設計すればよい。本発明
で特に好適に適応できる検出又は定量すべき遺伝子配列
としては、既知配列の内点突然変異を起こしていること
が知られている配列である。この場合、変異を起こして
いる塩基と相補的な塩基のＤＮＡプローブ中の位置とし
ては、ＤＮＡプローブの両端の３塩基以上内側が好まし
く、ＤＮＡプローブの中央から２塩基以内が特に好まし
い。
はこれら公知の配列に基づいて設計すればよい。本発明
で特に好適に適応できる検出又は定量すべき遺伝子配列
としては、既知配列の内点突然変異を起こしていること
が知られている配列である。この場合、変異を起こして
いる塩基と相補的な塩基のＤＮＡプローブ中の位置とし
ては、ＤＮＡプローブの両端の３塩基以上内側が好まし
く、ＤＮＡプローブの中央から２塩基以内が特に好まし
い。
【００２６】試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配
列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的
な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブは、ＤＮＡの化学
合成反応をシリカ等の担体を用いた固相法により自動化
したＤＮＡ合成機等を用いて合成できる。反応基質に
は、塩基のアミノ基及びリボースの５’−ＯＨを保護基
で保護し、リボースの３’−ＯＨにジイソプロピルホス
ホアミダイトを結合させたヌクレオチド誘導体を用い
る。塩基のアミノ基の保護基としては、ベンゾイル基又
はイソブチル基等が、リボースの５’−ＯＨの保護基と
しては、ジメトキシトリチル基等があげられる。塩基配
列に従って、アミノ基及び５’−ＯＨ基を保護されたア
デニン、チミジン（Ｔ）、シトシン、グアニンのいずれ
かのヌクレオチドを３’−ＯＨを介して支持体に固定し
たカラムを出発材料とし、酸によるトリチル基の除去
（５’−ＯＨの形成）後、３’末端にホスホアミダイト
基を持つ上述のヌクレオチド誘導体のをテトラゾールな
ど適当な縮合剤のもとに付加する。さらに両者の結合を
ヨウ素と水で安定なリン酸トリエステル結合に変換す
る。この脱トリチル化と縮合反応のサイクルを繰り返
し、最後にアンモニア処理により脱保護基及び支持体か
らの切断を行う。以上の操作で目的のＤＮＡプローブを
合成できる。また、スペーサーが一本鎖ＤＮＡの場合は
更にその配列を連続して合成すればよい。これにより、
ＤＮＡのスペーサーを持つＤＮＡプローブが合成でき
る。
列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的
な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブは、ＤＮＡの化学
合成反応をシリカ等の担体を用いた固相法により自動化
したＤＮＡ合成機等を用いて合成できる。反応基質に
は、塩基のアミノ基及びリボースの５’−ＯＨを保護基
で保護し、リボースの３’−ＯＨにジイソプロピルホス
ホアミダイトを結合させたヌクレオチド誘導体を用い
る。塩基のアミノ基の保護基としては、ベンゾイル基又
はイソブチル基等が、リボースの５’−ＯＨの保護基と
しては、ジメトキシトリチル基等があげられる。塩基配
列に従って、アミノ基及び５’−ＯＨ基を保護されたア
デニン、チミジン（Ｔ）、シトシン、グアニンのいずれ
かのヌクレオチドを３’−ＯＨを介して支持体に固定し
たカラムを出発材料とし、酸によるトリチル基の除去
（５’−ＯＨの形成）後、３’末端にホスホアミダイト
基を持つ上述のヌクレオチド誘導体のをテトラゾールな
ど適当な縮合剤のもとに付加する。さらに両者の結合を
ヨウ素と水で安定なリン酸トリエステル結合に変換す
る。この脱トリチル化と縮合反応のサイクルを繰り返
し、最後にアンモニア処理により脱保護基及び支持体か
らの切断を行う。以上の操作で目的のＤＮＡプローブを
合成できる。また、スペーサーが一本鎖ＤＮＡの場合は
更にその配列を連続して合成すればよい。これにより、
ＤＮＡのスペーサーを持つＤＮＡプローブが合成でき
る。
【００２７】試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配
列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的
な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着し
にくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又は介さ
ず結合している担体結合ＤＮＡプローブの調製法につい
て説明する。スペーサーの種類及び担体の種類により、
担体、スペーサー及び一本鎖ＤＮＡプローブの各結合方
法を決定できる。一般的にはＤＮＡプローブ末端の塩基
がもつアミノ基と担体又はスペーサーのエポキシ基、カ
ルボキシル基、アルデヒド基、水酸基等を結合させるこ
とにより行う。
列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的
な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着し
にくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又は介さ
ず結合している担体結合ＤＮＡプローブの調製法につい
て説明する。スペーサーの種類及び担体の種類により、
担体、スペーサー及び一本鎖ＤＮＡプローブの各結合方
法を決定できる。一般的にはＤＮＡプローブ末端の塩基
がもつアミノ基と担体又はスペーサーのエポキシ基、カ
ルボキシル基、アルデヒド基、水酸基等を結合させるこ
とにより行う。
【００２８】スペーサーが一本鎖ＤＮＡであり、担体が
表面にエポキシ基を有する場合、該ＤＮＡプローブと担
体の結合は、例えば以下のように行う。前述のＤＮＡ合
成法に従い、ＤＮＡのスペーサーを持つＤＮＡプローブ
及び該プローブと相補的配列を有し、スペーサー配列は
有しない一本鎖ＤＮＡを合成する。次いで両者をハイブ
リダイズさせ二本鎖にし、検出又は定量すべき遺伝子配
列の塩基が有するアミノ基を保護し、遊離のスペーサー
部分の塩基が有するアミノ基と担体のエポキシ基を結合
させる。担体に結合させた後、プローブと相補的配列を
有しスペーサー配列を有しない一本鎖ＤＮＡを解離し、
目的の担体結合ＤＮＡプローブを調製することができ
る。
表面にエポキシ基を有する場合、該ＤＮＡプローブと担
体の結合は、例えば以下のように行う。前述のＤＮＡ合
成法に従い、ＤＮＡのスペーサーを持つＤＮＡプローブ
及び該プローブと相補的配列を有し、スペーサー配列は
有しない一本鎖ＤＮＡを合成する。次いで両者をハイブ
リダイズさせ二本鎖にし、検出又は定量すべき遺伝子配
列の塩基が有するアミノ基を保護し、遊離のスペーサー
部分の塩基が有するアミノ基と担体のエポキシ基を結合
させる。担体に結合させた後、プローブと相補的配列を
有しスペーサー配列を有しない一本鎖ＤＮＡを解離し、
目的の担体結合ＤＮＡプローブを調製することができ
る。
【００２９】ハイブリダイズは、必要に応じてホルムア
ミド、塩、蛋白質、安定剤、緩衝剤等を含む水溶液で行
う。以下この溶液をハイブリダイゼーション溶液とい
う。ホルムアミド濃度は０〜６０％、好ましくは１０〜
５０％、より好ましくは２０〜３０％である。塩として
は塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩、クエン酸
ナトリウム、シュウ酸ナトリウム等の有機酸塩があげら
れ、塩濃度としては０〜２．０Ｍ、好ましくは０．１５
〜１．０Ｍである。蛋白質としては血清アルブミン等が
あげられる。安定剤としてはフィコール等があげられ
る。緩衝剤としては、リン酸緩衝剤等があげられ、濃度
としては１〜１００ｍＭが好ましい。前述の相補的な２
種のＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイ
ゼーション溶液中にそれぞれ合成した一本鎖ＤＮＡを等
モル濃度となるように添加し、６０〜９０℃で１〜６０
分加温した後、０〜４０℃まで１〜２４時間かけて徐々
に冷却することにより行うことができる。こうして、一
本鎖ポリヌクレオチドのスペーサーを持つ部分２本鎖Ｄ
ＮＡが調製される。
ミド、塩、蛋白質、安定剤、緩衝剤等を含む水溶液で行
う。以下この溶液をハイブリダイゼーション溶液とい
う。ホルムアミド濃度は０〜６０％、好ましくは１０〜
５０％、より好ましくは２０〜３０％である。塩として
は塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩、クエン酸
ナトリウム、シュウ酸ナトリウム等の有機酸塩があげら
れ、塩濃度としては０〜２．０Ｍ、好ましくは０．１５
〜１．０Ｍである。蛋白質としては血清アルブミン等が
あげられる。安定剤としてはフィコール等があげられ
る。緩衝剤としては、リン酸緩衝剤等があげられ、濃度
としては１〜１００ｍＭが好ましい。前述の相補的な２
種のＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイ
ゼーション溶液中にそれぞれ合成した一本鎖ＤＮＡを等
モル濃度となるように添加し、６０〜９０℃で１〜６０
分加温した後、０〜４０℃まで１〜２４時間かけて徐々
に冷却することにより行うことができる。こうして、一
本鎖ポリヌクレオチドのスペーサーを持つ部分２本鎖Ｄ
ＮＡが調製される。
【００３０】担体との結合は、エポキシ基を有する担体
粒子を１〜１００ｍＭのリン酸緩衝液で洗浄し、粒子を
平衡化した後、洗浄に用いた緩衝液と同じ溶液中で担体
と上述の方法で作成した一本鎖ＤＮＡのスペーサーを持
つ部分２本鎖ＤＮＡを混合し、５〜５０時間、２０〜５
０℃に保温することにより行う。未反応のＤＮＡを１〜
３Ｍの塩化ナトリウム等の塩類を含む水溶液で洗浄する
ことにより取り除いた後、担体上に存在する未反応のエ
ポキシ基を、トリス−塩酸緩衝液を加え室温で５〜５０
時間保温し開環させる。このようにして担体に結合した
二本鎖ＤＮＡが調製される。
粒子を１〜１００ｍＭのリン酸緩衝液で洗浄し、粒子を
平衡化した後、洗浄に用いた緩衝液と同じ溶液中で担体
と上述の方法で作成した一本鎖ＤＮＡのスペーサーを持
つ部分２本鎖ＤＮＡを混合し、５〜５０時間、２０〜５
０℃に保温することにより行う。未反応のＤＮＡを１〜
３Ｍの塩化ナトリウム等の塩類を含む水溶液で洗浄する
ことにより取り除いた後、担体上に存在する未反応のエ
ポキシ基を、トリス−塩酸緩衝液を加え室温で５〜５０
時間保温し開環させる。このようにして担体に結合した
二本鎖ＤＮＡが調製される。
【００３１】この担体結合二本鎖ＤＮＡをハイブリダイ
ゼーション用溶液中で７０〜９０℃の条件で洗浄するこ
とにより、担体結合一本鎖ＤＮＡを調製できる。洗浄は
ハイブリダイゼーション溶液を用い、７０〜９０℃で、
数千〜数万ｇの遠心で数回行う。スペーサーがポリエチ
レングリコールジグリシジルであり、担体が表面にエポ
キシ基を有する場合、ＤＮＡプローブと担体の結合は、
例えば以下のように行うことができる。担体粒子に水酸
化アンモニウム又はヘキサメチレンジアミン塩酸塩をエ
ポキシ基の１０〜１００倍モル量加え、６０〜７０℃で
ｐＨ１０〜１２で０．５〜２日反応させ、粒子表面をア
ミノ化する。反応後、遠心分離により洗浄し、必要に応
じてイオン交換水により透析をおこない未反応の水酸化
アンモニウム又はヘキサメチレンジアミン塩酸塩を除
く。アミノ基を導入した担体に、アミノ基の５０〜２０
０倍モル量のポリエチレングリコールジグリシジルを加
えｐＨ１０〜１２、温度２０〜４０℃で０．５〜２日反
応することで結合させる。こうして、スペーサーが担体
と結合する。スペーサーのもつエポキシ基とプローブＤ
ＮＡの結合は前述の方法に従って行う。
ゼーション用溶液中で７０〜９０℃の条件で洗浄するこ
とにより、担体結合一本鎖ＤＮＡを調製できる。洗浄は
ハイブリダイゼーション溶液を用い、７０〜９０℃で、
数千〜数万ｇの遠心で数回行う。スペーサーがポリエチ
レングリコールジグリシジルであり、担体が表面にエポ
キシ基を有する場合、ＤＮＡプローブと担体の結合は、
例えば以下のように行うことができる。担体粒子に水酸
化アンモニウム又はヘキサメチレンジアミン塩酸塩をエ
ポキシ基の１０〜１００倍モル量加え、６０〜７０℃で
ｐＨ１０〜１２で０．５〜２日反応させ、粒子表面をア
ミノ化する。反応後、遠心分離により洗浄し、必要に応
じてイオン交換水により透析をおこない未反応の水酸化
アンモニウム又はヘキサメチレンジアミン塩酸塩を除
く。アミノ基を導入した担体に、アミノ基の５０〜２０
０倍モル量のポリエチレングリコールジグリシジルを加
えｐＨ１０〜１２、温度２０〜４０℃で０．５〜２日反
応することで結合させる。こうして、スペーサーが担体
と結合する。スペーサーのもつエポキシ基とプローブＤ
ＮＡの結合は前述の方法に従って行う。
【００３２】次に検出又は定量すべき特定遺伝子配列を
有する一本鎖ＤＮＡ断片の調製方法について説明する。
検出又は定量に用いる生体検査試料は各種臓器、組織、
血液等から公知のＤＮＡ抽出方法により調製できる。単
離したＤＮＡは特定の制限酵素で切断し検出又は定量す
べき特定遺伝子配列を含む１０〜２００ｍｅｒ、好まし
くは２０〜１００ｍｅｒの長さを有する一本鎖ＤＮＡ断
片に調製する。例えば、細胞から抽出したＤＮＡを制限
酵素ＤｄｅｌとＨｉｎｆＩを用いて処理するとＫ−ｒａ
ｓのコドン１２を含む７０塩基長のＤＮＡ断片が調製で
きる。本発明においては、検出又は定量すべき特定遺伝
子配列を有するようにＤＮＡを断片化するだけでよい。
有する一本鎖ＤＮＡ断片の調製方法について説明する。
検出又は定量に用いる生体検査試料は各種臓器、組織、
血液等から公知のＤＮＡ抽出方法により調製できる。単
離したＤＮＡは特定の制限酵素で切断し検出又は定量す
べき特定遺伝子配列を含む１０〜２００ｍｅｒ、好まし
くは２０〜１００ｍｅｒの長さを有する一本鎖ＤＮＡ断
片に調製する。例えば、細胞から抽出したＤＮＡを制限
酵素ＤｄｅｌとＨｉｎｆＩを用いて処理するとＫ−ｒａ
ｓのコドン１２を含む７０塩基長のＤＮＡ断片が調製で
きる。本発明においては、検出又は定量すべき特定遺伝
子配列を有するようにＤＮＡを断片化するだけでよい。
【００３３】標識化合物を標識する対象ＤＮＡとして
は、検出又は定量方法に応じて、試料中のＤＮＡ断片全
て、試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有す
る一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列以外の部分配列と
相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブ、試料中の
検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮ
Ａ断片の特定遺伝子配列と相補的な配列を有する一本鎖
ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着しにくい物質からなる担
体とがスペーサーを介し又は介さず結合している担体結
合ＤＮＡプローブの一本鎖ＤＮＡプローブ部分のいずれ
かがあげられる。
は、検出又は定量方法に応じて、試料中のＤＮＡ断片全
て、試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有す
る一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列以外の部分配列と
相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブ、試料中の
検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮ
Ａ断片の特定遺伝子配列と相補的な配列を有する一本鎖
ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着しにくい物質からなる担
体とがスペーサーを介し又は介さず結合している担体結
合ＤＮＡプローブの一本鎖ＤＮＡプローブ部分のいずれ
かがあげられる。
【００３４】試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配
列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列以外の部
分配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブに
標識化合物を標識したものを以下の説明では単に標識結
合ＤＮＡプローブという。また、試料中の検出又は定量
すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定
遺伝子配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプロー
ブとＤＮＡを吸着しにくい物質からなる担体とがスペー
サーを介し又は介さず結合している担体結合ＤＮＡプロ
ーブの一本鎖ＤＮＡプローブ部分に標識化合物を標識し
たものを以下の説明では単に担体結合標識ＤＮＡプロー
ブという。
列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列以外の部
分配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブに
標識化合物を標識したものを以下の説明では単に標識結
合ＤＮＡプローブという。また、試料中の検出又は定量
すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定
遺伝子配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプロー
ブとＤＮＡを吸着しにくい物質からなる担体とがスペー
サーを介し又は介さず結合している担体結合ＤＮＡプロ
ーブの一本鎖ＤＮＡプローブ部分に標識化合物を標識し
たものを以下の説明では単に担体結合標識ＤＮＡプロー
ブという。
【００３５】ＤＮＡを標識する標識化合物としては、直
接又は間接的に検出又は定量できるものであればいずれ
の標識化合物でも用いることができる。例えば熱に安定
な抗原、ビオチンがあげられ、共有結合により結合され
る。また、標識結合ＤＮＡプローブ及び担体結合標識Ｄ
ＮＡプローブの標識化合物としては、放射性同位元素、
発色試薬、蛍光試薬、発光試薬等熱に安定な標識化合物
があげられ、特に、ビオチンが好ましい。
接又は間接的に検出又は定量できるものであればいずれ
の標識化合物でも用いることができる。例えば熱に安定
な抗原、ビオチンがあげられ、共有結合により結合され
る。また、標識結合ＤＮＡプローブ及び担体結合標識Ｄ
ＮＡプローブの標識化合物としては、放射性同位元素、
発色試薬、蛍光試薬、発光試薬等熱に安定な標識化合物
があげられ、特に、ビオチンが好ましい。
【００３６】ＤＮＡとビオチンの結合方法について述べ
る。ＤＮＡの３’末端のビオチン化は、ビオチン結合デ
オキシリボヌクレオシド三リン酸を用いて、例えば３’
末端標識法、バイオ−ブリッジ（Ｂｉｏ−Ｂｒｉｄｇ
ｅ）法、ニックトランスレーション法等により酵素的に
結合させることができる。ビオチン結合デオキシリボヌ
クレオシド三リン酸としては、例えばＢｉｏ−１１−ｄ
ＵＴＰ、Ｂｉｏ−１６−ｄＵＴＰ、Ｂｉｏ−１１−ｄＣ
ＴＰがあげられ、エンゾ（Ｅｎｚｏ）社等から市販品と
して入手できる。ＤＮＡが合成ＤＮＡの場合は、シアノ
エチルホスホアミダイト法による自動合成機で、５’末
端ビオチン標識ＤＮＡを合成することもできる。ビオチ
ン化ＤＮＡは、セファデックスＧ−５０を用いたスピン
カラム法等のゲルろ過等で精製できる。
る。ＤＮＡの３’末端のビオチン化は、ビオチン結合デ
オキシリボヌクレオシド三リン酸を用いて、例えば３’
末端標識法、バイオ−ブリッジ（Ｂｉｏ−Ｂｒｉｄｇ
ｅ）法、ニックトランスレーション法等により酵素的に
結合させることができる。ビオチン結合デオキシリボヌ
クレオシド三リン酸としては、例えばＢｉｏ−１１−ｄ
ＵＴＰ、Ｂｉｏ−１６−ｄＵＴＰ、Ｂｉｏ−１１−ｄＣ
ＴＰがあげられ、エンゾ（Ｅｎｚｏ）社等から市販品と
して入手できる。ＤＮＡが合成ＤＮＡの場合は、シアノ
エチルホスホアミダイト法による自動合成機で、５’末
端ビオチン標識ＤＮＡを合成することもできる。ビオチ
ン化ＤＮＡは、セファデックスＧ−５０を用いたスピン
カラム法等のゲルろ過等で精製できる。
【００３７】標識化合物の検出又は定量試薬は、標識化
合物を検出又は定量できるものであればいかなる試薬で
も用いうる。標識化合物がビオチンである場合は、検出
又は定量試薬としては、標識酵素結合アビジン及び該標
識酵素活性検出又は定量試薬からなる。標識酵素として
は、例えばパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
等があげられる。
合物を検出又は定量できるものであればいかなる試薬で
も用いうる。標識化合物がビオチンである場合は、検出
又は定量試薬としては、標識酵素結合アビジン及び該標
識酵素活性検出又は定量試薬からなる。標識酵素として
は、例えばパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
等があげられる。
【００３８】標識酵素がパーオキシダーゼの場合の酵素
活性検出又は定量試薬としては、例えば過酸化水素と
３，３’−ジアミノベンジジン、ｏ−ジアニシジン、４
−メトキシ−１−ナフトール、２，２’−アジノ−ビス
（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（Ａ
ＢＴＳ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジ
メチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、
１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ジ
メチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’
−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウ
ム（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）
ジフェニルアミンもしくはビス［３−ビス（４−クロロ
フェニル）メチル−４−ジメチル−アミノフェニル］ア
ミン（ＢＣＭＡ）等の発色試薬からなる試薬又は過酸化
水素とホモバニリン酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸も
しくはジアセチルフルオレスシン誘導体（ジアセチルフ
ルオレスシン、ジアセチルジクロロフルオレスシン等）
等の蛍光試薬からなる試薬又は過酸化水素とルミノー
ル、イソルミノール、ピロガロールもしくはビス（２，
４，６−トリクロロフェニル）オキザレート等の発光試
薬からなる試薬があげられる。
活性検出又は定量試薬としては、例えば過酸化水素と
３，３’−ジアミノベンジジン、ｏ−ジアニシジン、４
−メトキシ−１−ナフトール、２，２’−アジノ−ビス
（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（Ａ
ＢＴＳ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジ
メチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、
１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ジ
メチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’
−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウ
ム（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）
ジフェニルアミンもしくはビス［３−ビス（４−クロロ
フェニル）メチル−４−ジメチル−アミノフェニル］ア
ミン（ＢＣＭＡ）等の発色試薬からなる試薬又は過酸化
水素とホモバニリン酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸も
しくはジアセチルフルオレスシン誘導体（ジアセチルフ
ルオレスシン、ジアセチルジクロロフルオレスシン等）
等の蛍光試薬からなる試薬又は過酸化水素とルミノー
ル、イソルミノール、ピロガロールもしくはビス（２，
４，６−トリクロロフェニル）オキザレート等の発光試
薬からなる試薬があげられる。
【００３９】また、４−メトキシ−１−ナフトール等の
１−ナフトール誘導体の発色試薬、ユウロピウム等のラ
ンタニド蛍光試薬、アクリジニウム等の発光試薬からな
る検出又は定量試薬があげられる。標識酵素がアルカリ
ホスファターゼの場合の検出又は定量試薬としては、パ
ラニトロフェニルリン酸塩等のリン酸エステル、アダマ
ンチルオキセタン誘導体の発光試薬からなる検出又は定
量試薬があげられる。
１−ナフトール誘導体の発色試薬、ユウロピウム等のラ
ンタニド蛍光試薬、アクリジニウム等の発光試薬からな
る検出又は定量試薬があげられる。標識酵素がアルカリ
ホスファターゼの場合の検出又は定量試薬としては、パ
ラニトロフェニルリン酸塩等のリン酸エステル、アダマ
ンチルオキセタン誘導体の発光試薬からなる検出又は定
量試薬があげられる。
【００４０】特に、アルカリホスファターゼの検出又は
定量試薬としては、ＮＡＤＰ、ＩＮＴ−バイオレット、
ＮＡＤＨ、エタノール、ダイアフォラーゼ及びアルコー
ルデヒドロゲナーゼからなる検出又は定量試薬が好まし
い。これら酵素活性検出又は定量試薬には、必要に応じ
て、緩衝液、他の基質、他の酵素、界面活性剤、酵素の
安定化剤等が添加されていてもよい。該酵素活性検出又
は定量試薬は、必要に応じて二つ以上の試薬からなるキ
ットとして調製されていてもよい。
定量試薬としては、ＮＡＤＰ、ＩＮＴ−バイオレット、
ＮＡＤＨ、エタノール、ダイアフォラーゼ及びアルコー
ルデヒドロゲナーゼからなる検出又は定量試薬が好まし
い。これら酵素活性検出又は定量試薬には、必要に応じ
て、緩衝液、他の基質、他の酵素、界面活性剤、酵素の
安定化剤等が添加されていてもよい。該酵素活性検出又
は定量試薬は、必要に応じて二つ以上の試薬からなるキ
ットとして調製されていてもよい。
【００４１】一本鎖ＤＮＡを切断する酵素としては、例
えばＳ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ等の
ヌクレアーゼがあげられる。検出又は定量すべき特定遺
伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と
相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを
吸着しにくい担体がスペーサを介し又は介さず結合して
いる担体結合ＤＮＡプローブ及び試料中の検出又は定量
すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定
遺伝子配列以外の部分配列と相補的な配列を有する一本
鎖ＤＮＡプローブと標識化合物が結合している標識結合
ＤＮＡプローブからなる試薬及び検出又は定量すべき特
定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配
列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブと標識
化合物が結合している標識結合ＤＮＡプローブとＤＮＡ
を吸着しにくい担体がスペーサを介し又は介さず結合し
ている担体結合標識ＤＮＡプローブからなる試薬には必
要に応じて、例えば前述のハイブリダイゼーション溶液
等が添加されていることが好ましい。
えばＳ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ等の
ヌクレアーゼがあげられる。検出又は定量すべき特定遺
伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と
相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを
吸着しにくい担体がスペーサを介し又は介さず結合して
いる担体結合ＤＮＡプローブ及び試料中の検出又は定量
すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定
遺伝子配列以外の部分配列と相補的な配列を有する一本
鎖ＤＮＡプローブと標識化合物が結合している標識結合
ＤＮＡプローブからなる試薬及び検出又は定量すべき特
定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配
列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブと標識
化合物が結合している標識結合ＤＮＡプローブとＤＮＡ
を吸着しにくい担体がスペーサを介し又は介さず結合し
ている担体結合標識ＤＮＡプローブからなる試薬には必
要に応じて、例えば前述のハイブリダイゼーション溶液
等が添加されていることが好ましい。
【００４２】次に、試料中の検出又は定量すべき特定遺
伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と
相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを
吸着しにくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又
は介さず結合している担体結合ＤＮＡプローブと試料中
のＤＮＡ断片とをハイブリダイズし、該担体結合ＤＮＡ
プローブとハイブリダイズした試料中のＤＮＡ断片を検
出又は定量することからなる特定遺伝子配列を有する一
本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方法について述べる。ハ
イブリダイズは、前述のハイブリダイゼーション溶液を
用いて厳格な条件下で行う。例えば、担体結合ＤＮＡプ
ローブとＤＮＡ断片を含む試料を該ハイブリダイゼーシ
ョン溶液に添加し、７０〜９０℃、好ましくは８０〜８
５℃で１〜２０分間、好ましくは５〜１５分間加熱した
後、０．５〜２４時間、好ましくは１〜６時間かけて徐
々に２０〜５０℃、好ましくは２０〜３０℃まで冷却す
ることにより行う。次いで担体に粒子を用いる場合は遠
心操作等により、担体にプレートを用いる場合は洗浄操
作によりしハイブリダイズしていない試料中のＤＮＡ断
片を除去する。担体結合ＤＮＡプローブにハイブリダイ
ズしたＤＮＡ断片の検出又は定量は、ハイブリダイズし
た状態又は担体プローブから単離した後、ＤＮＡを検出
又は定量する方法で行うことができる。
伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と
相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを
吸着しにくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又
は介さず結合している担体結合ＤＮＡプローブと試料中
のＤＮＡ断片とをハイブリダイズし、該担体結合ＤＮＡ
プローブとハイブリダイズした試料中のＤＮＡ断片を検
出又は定量することからなる特定遺伝子配列を有する一
本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方法について述べる。ハ
イブリダイズは、前述のハイブリダイゼーション溶液を
用いて厳格な条件下で行う。例えば、担体結合ＤＮＡプ
ローブとＤＮＡ断片を含む試料を該ハイブリダイゼーシ
ョン溶液に添加し、７０〜９０℃、好ましくは８０〜８
５℃で１〜２０分間、好ましくは５〜１５分間加熱した
後、０．５〜２４時間、好ましくは１〜６時間かけて徐
々に２０〜５０℃、好ましくは２０〜３０℃まで冷却す
ることにより行う。次いで担体に粒子を用いる場合は遠
心操作等により、担体にプレートを用いる場合は洗浄操
作によりしハイブリダイズしていない試料中のＤＮＡ断
片を除去する。担体結合ＤＮＡプローブにハイブリダイ
ズしたＤＮＡ断片の検出又は定量は、ハイブリダイズし
た状態又は担体プローブから単離した後、ＤＮＡを検出
又は定量する方法で行うことができる。
【００４３】このハイブリダイズしたＤＮＡ断片の検出
又は定量は、標識化合物を用いて行うことが好ましい。
まず、試料ＤＮＡ全てを標識して行う場合の検出又は定
量方法を述べる。前述の方法に従って試料中のＤＮＡ断
片を全て標識化する。次いで、担体結合ＤＮＡプローブ
と該標識ＤＮＡをハイブリダイズする。ハイブリダイゼ
ーションの条件は前述の厳格なハイブリダイゼーション
条件と同様である。ハイブリダイズしたＤＮＡ断片の検
出又は定量は、ハイブリしていないＤＮＡ断片を除去し
た後、担体結合ＤＮＡプローブにハイブリダイズした標
識ＤＮＡ試料の標識を検出又は定量することにより行
う。
又は定量は、標識化合物を用いて行うことが好ましい。
まず、試料ＤＮＡ全てを標識して行う場合の検出又は定
量方法を述べる。前述の方法に従って試料中のＤＮＡ断
片を全て標識化する。次いで、担体結合ＤＮＡプローブ
と該標識ＤＮＡをハイブリダイズする。ハイブリダイゼ
ーションの条件は前述の厳格なハイブリダイゼーション
条件と同様である。ハイブリダイズしたＤＮＡ断片の検
出又は定量は、ハイブリしていないＤＮＡ断片を除去し
た後、担体結合ＤＮＡプローブにハイブリダイズした標
識ＤＮＡ試料の標識を検出又は定量することにより行
う。
【００４４】また、標識ＤＮＡプローブを用いる場合の
検出又は定量方法を述べる。試料ＤＮＡ、担体結合ＤＮ
Ａプローブ及び標識結合ＤＮＡプローブを上記ハイブリ
ダイゼーション条件下でハイブリダイズする。ハイブリ
ダイゼーションの条件は前述の厳格なハイブリダイゼー
ション条件と同様である。次いで、担体結合ＤＮＡプロ
ーブにハイブリダイズしていない試料ＤＮＡ断片及び標
識結合ＤＮＡプローブを遠心等による洗浄により除去す
る。ハイブリダイズしたＤＮＡ断片の検出又は定量は、
担体結合ＤＮＡプローブにハイブリダイズした試料ＤＮ
Ａ断片に更にハイブリダイズした標識結合ＤＮＡプロー
ブの標識を検出又は定量することにより行う。
検出又は定量方法を述べる。試料ＤＮＡ、担体結合ＤＮ
Ａプローブ及び標識結合ＤＮＡプローブを上記ハイブリ
ダイゼーション条件下でハイブリダイズする。ハイブリ
ダイゼーションの条件は前述の厳格なハイブリダイゼー
ション条件と同様である。次いで、担体結合ＤＮＡプロ
ーブにハイブリダイズしていない試料ＤＮＡ断片及び標
識結合ＤＮＡプローブを遠心等による洗浄により除去す
る。ハイブリダイズしたＤＮＡ断片の検出又は定量は、
担体結合ＤＮＡプローブにハイブリダイズした試料ＤＮ
Ａ断片に更にハイブリダイズした標識結合ＤＮＡプロー
ブの標識を検出又は定量することにより行う。
【００４５】さらに、担体結合ＤＮＡ標識プローブを用
いる場合検出又は定量方法を述べる。試料ＤＮＡ断片と
担体結合標識ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせる。
ハイブリダイゼーションの条件は特に限定されず、完全
に相補的なＤＮＡ断片がハイブリダイズすれば、１塩基
ミスマッチをもつＤＮＡ断片がハイブリダイズする条件
でもよい。次いで、Ｓ１ヌクレアーゼ等一本鎖ＤＮＡを
切断する酵素を作用させ二本鎖ＤＮＡを形成していない
標識結合ＤＮＡプローブを切断する。完全に相補的でな
いＤＮＡ断片がプローブＤＮＡにハイブリダイズし、部
分的に１本鎖となったプローブＤＮＡは本酵素反応によ
り切断される。完全にハイブリダイズしたＤＮＡの断片
の検出又は定量は、担体結合標識ＤＮＡプローブの標識
を検出又は定量することにより行う。この担体結合ＤＮ
Ａ標識プローブを用いる場合は、ＤＮＡプローブと担体
を結合するスペーサーは使用しないか又はＤＮＡ鎖以外
のものを用いることが好ましい。スペーサーとしては、
例えば前述のポリエチレングリコールジグリシジルエー
テル鎖が好ましい。本方法では、ミスマッチを伴って結
合している試料ＤＮＡ断片が生じているとしてもこれを
排除でき、プローブＤＮＡに完全に相補的な配列を有す
る試料ＤＮＡのみを検出できる点で特に好ましい。
いる場合検出又は定量方法を述べる。試料ＤＮＡ断片と
担体結合標識ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせる。
ハイブリダイゼーションの条件は特に限定されず、完全
に相補的なＤＮＡ断片がハイブリダイズすれば、１塩基
ミスマッチをもつＤＮＡ断片がハイブリダイズする条件
でもよい。次いで、Ｓ１ヌクレアーゼ等一本鎖ＤＮＡを
切断する酵素を作用させ二本鎖ＤＮＡを形成していない
標識結合ＤＮＡプローブを切断する。完全に相補的でな
いＤＮＡ断片がプローブＤＮＡにハイブリダイズし、部
分的に１本鎖となったプローブＤＮＡは本酵素反応によ
り切断される。完全にハイブリダイズしたＤＮＡの断片
の検出又は定量は、担体結合標識ＤＮＡプローブの標識
を検出又は定量することにより行う。この担体結合ＤＮ
Ａ標識プローブを用いる場合は、ＤＮＡプローブと担体
を結合するスペーサーは使用しないか又はＤＮＡ鎖以外
のものを用いることが好ましい。スペーサーとしては、
例えば前述のポリエチレングリコールジグリシジルエー
テル鎖が好ましい。本方法では、ミスマッチを伴って結
合している試料ＤＮＡ断片が生じているとしてもこれを
排除でき、プローブＤＮＡに完全に相補的な配列を有す
る試料ＤＮＡのみを検出できる点で特に好ましい。
【００４６】本発明においては、あらかじめ既知量の試
料ＤＮＡを用いて検量線を作成することにより、試料中
の検出又は定量すべきＤＮＡ濃度を検出又は定量するこ
とができる。次に、標識化合物の検出又は定量方法につ
いて述べる。標識化合物としてビオチンを用いた場合、
ビオチンは例えば標識酵素結合アビジンをビオチンに結
合させた後、ビオチンに結合した標識酵素結合アビジン
の酵素活性を検出又は定量することにより検出又は定量
できる。
料ＤＮＡを用いて検量線を作成することにより、試料中
の検出又は定量すべきＤＮＡ濃度を検出又は定量するこ
とができる。次に、標識化合物の検出又は定量方法につ
いて述べる。標識化合物としてビオチンを用いた場合、
ビオチンは例えば標識酵素結合アビジンをビオチンに結
合させた後、ビオチンに結合した標識酵素結合アビジン
の酵素活性を検出又は定量することにより検出又は定量
できる。
【００４７】ビオチンと標識酵素結合アビジンの結合
は、例えば界面活性剤、塩類、緩衝液等を含む溶液中
で、室温で０．５〜２時間放置することにより行い、ビ
オチンに結合していない標識酵素結合アビジンは遠心又
は洗浄により除去する。アビジンに結合している酵素の
活性は、前述の酵素活性検出又は定量試薬を用いて常法
により行うことができる。
は、例えば界面活性剤、塩類、緩衝液等を含む溶液中
で、室温で０．５〜２時間放置することにより行い、ビ
オチンに結合していない標識酵素結合アビジンは遠心又
は洗浄により除去する。アビジンに結合している酵素の
活性は、前述の酵素活性検出又は定量試薬を用いて常法
により行うことができる。
【００４８】ビオチン結合標識酵素がアルカリホスファ
ターゼの場合は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びダイ
アフォラーゼを用いた増感系［（Ann. Biol. clin ），
４７, ５２７（１９８９）］を用いる方法が好ましい。
検出又は定量は、アルカリホスファターゼにより生成し
たＮＡＤとエタノールにアルコールデヒドロゲナーゼを
作用しＮＡＤＨを生成させ、生成したＮＡＤＨとＩＮＴ
−バイオレット等のダイアフォラーゼの基質にダイアフ
ォラーゼを作用し生成する色素例えば、フォルマザンを
４９２ｎｍで比色することにより行うことができる。
ターゼの場合は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びダイ
アフォラーゼを用いた増感系［（Ann. Biol. clin ），
４７, ５２７（１９８９）］を用いる方法が好ましい。
検出又は定量は、アルカリホスファターゼにより生成し
たＮＡＤとエタノールにアルコールデヒドロゲナーゼを
作用しＮＡＤＨを生成させ、生成したＮＡＤＨとＩＮＴ
−バイオレット等のダイアフォラーゼの基質にダイアフ
ォラーゼを作用し生成する色素例えば、フォルマザンを
４９２ｎｍで比色することにより行うことができる。
【００４９】
実施例１（担体結合ＤＮＡプローブの合成） （１）一本鎖ＤＮＡの合成 下記のＫ−ｒａｓ突然変異配列を有するＤＮＡ鎖、 ５’−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−
３’（２０ｍｅｒ；配列番号１、変異点は１０番目の
Ｃ） 及び配列番号１の相補的配列に連続したＧを１０塩基持
つＤＮＡ、 ５’−ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＧＡ
ＧＣＴＣＣＡＡＣ−３’（３０ｍｅｒ；配列番号２） をＤＮＡ合成機で合成した。 （２）担体の合成 ２００ｍｌの撹拌装置を持つ四つ口フラスコ中に、スチ
レン１．２ｇ、グリシジルメタクリレート１．０ｇ、ジ
ビニルベンゼン０．０４ｇを秤取り、水１１０ｍｌに分
散させ７０℃の恒温層にセットし、窒素ガス置換した。
回転数２００ｒｐｍでこの溶液を撹拌しながら、重合開
始剤である２，２’−アゾビス（２−アミノプロパン）
ジヒドロクロライドを０．０６ｇ添加し重合を開始し
た。２時間後、グリシジルメタクリレート０．３ｇを添
加しさらに２２時間反応させた。この反応液を遠心（３
０，０００ｇ、１０分）し沈澱を蒸留水で３回洗浄し精
製し、担体粒子を得た。本法により作成された粒子を以
下ＳＧ粒子と略記する。作成した粒子は単分散で粒径は
約０．２μｍであった。 （３）ＤＮＡの担体への固定 上記（２）で作成したＳＧ粒子を、１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）で遠心により洗浄し粒子を平衡化し
た。上記（１）で作成した２本鎖ＤＮＡを８μｇと３０
ｍｇの平衡化したＳＧ粒子を４００μｌのリン酸緩衝液
中で３７℃、２４時間反応させ固定化した。２．５Ｍ塩
化ナトリウム水溶液で遠心により３回洗浄し、非結合Ｄ
ＮＡを除いた。次いでＳＧ粒子表面に残っているエポキ
シ基を開環するため１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．９）１ｍｌ中で室温で２４時間反応させた。 （４）担体結合ＤＮＡプローブの作成 上記（３）で得られたＳＧ粒子２ｍｇに固定化された２
本鎖ＤＮＡを、２５％ホルムアミド、０．７５Ｍ塩化ナ
トリウム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、１％牛血
清アルブミン、１％ポリビニルピロリドン、１％フィコ
ールからなるハイブリダイゼーション溶液４００ｍｌ中
に添加し、８０℃で５分間処理しこの温度条件下で５回
洗浄することで、配列番号２の塩基配列の５’末端とＳ
Ｇ担体が結合したプローブを得た。
３’（２０ｍｅｒ；配列番号１、変異点は１０番目の
Ｃ） 及び配列番号１の相補的配列に連続したＧを１０塩基持
つＤＮＡ、 ５’−ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＧＡ
ＧＣＴＣＣＡＡＣ−３’（３０ｍｅｒ；配列番号２） をＤＮＡ合成機で合成した。 （２）担体の合成 ２００ｍｌの撹拌装置を持つ四つ口フラスコ中に、スチ
レン１．２ｇ、グリシジルメタクリレート１．０ｇ、ジ
ビニルベンゼン０．０４ｇを秤取り、水１１０ｍｌに分
散させ７０℃の恒温層にセットし、窒素ガス置換した。
回転数２００ｒｐｍでこの溶液を撹拌しながら、重合開
始剤である２，２’−アゾビス（２−アミノプロパン）
ジヒドロクロライドを０．０６ｇ添加し重合を開始し
た。２時間後、グリシジルメタクリレート０．３ｇを添
加しさらに２２時間反応させた。この反応液を遠心（３
０，０００ｇ、１０分）し沈澱を蒸留水で３回洗浄し精
製し、担体粒子を得た。本法により作成された粒子を以
下ＳＧ粒子と略記する。作成した粒子は単分散で粒径は
約０．２μｍであった。 （３）ＤＮＡの担体への固定 上記（２）で作成したＳＧ粒子を、１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）で遠心により洗浄し粒子を平衡化し
た。上記（１）で作成した２本鎖ＤＮＡを８μｇと３０
ｍｇの平衡化したＳＧ粒子を４００μｌのリン酸緩衝液
中で３７℃、２４時間反応させ固定化した。２．５Ｍ塩
化ナトリウム水溶液で遠心により３回洗浄し、非結合Ｄ
ＮＡを除いた。次いでＳＧ粒子表面に残っているエポキ
シ基を開環するため１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．９）１ｍｌ中で室温で２４時間反応させた。 （４）担体結合ＤＮＡプローブの作成 上記（３）で得られたＳＧ粒子２ｍｇに固定化された２
本鎖ＤＮＡを、２５％ホルムアミド、０．７５Ｍ塩化ナ
トリウム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、１％牛血
清アルブミン、１％ポリビニルピロリドン、１％フィコ
ールからなるハイブリダイゼーション溶液４００ｍｌ中
に添加し、８０℃で５分間処理しこの温度条件下で５回
洗浄することで、配列番号２の塩基配列の５’末端とＳ
Ｇ担体が結合したプローブを得た。
【００５０】該担体１粒子当たり配列番号２のＤＮＡ断
片は、２６０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定し
た結果平均数十個であった。
片は、２６０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定し
た結果平均数十個であった。
【００５１】実施例２ （標識ＤＮＡプローブ法の試
薬） （１）ビオチン標識ＤＮＡプローブの作成 下記の検出又は定量する領域以外のＫ−ｒａｓ配列に相
補的な１６塩基配列に連続したＧを４塩基を持つＤＮ
Ａ、 ５’−ＣＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＣＴＣＡＧＧＧＧ−
３’（２０ｍｅｒ；配列番号３） をＤＮＡ合成機で合成した。
薬） （１）ビオチン標識ＤＮＡプローブの作成 下記の検出又は定量する領域以外のＫ−ｒａｓ配列に相
補的な１６塩基配列に連続したＧを４塩基を持つＤＮ
Ａ、 ５’−ＣＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＣＴＣＡＧＧＧＧ−
３’（２０ｍｅｒ；配列番号３） をＤＮＡ合成機で合成した。
【００５２】次いで、該合成ＤＮＡ１５μｇとビオチン
化ｄＵＴＰ［エンゾ（Ｅｎｚｏ）社製］）１５μｇを同
社の３’末端標識キットを用いて該標準反応緩衝液中で
ターミナルトランスフェラーゼ存在下で反応させ、３’
−末端にビオチンを結合させた。未反応のビオチン化ｄ
ＵＴＰをセファデックスＧ−５０を用いスピンカラム法
で除去し目的のビオチン結合ＤＮＡプローブを得た。 （２）検出試薬の調製 下記の組成の、Ｋ−ｒａｓ突然変異検出キットを作成し
た。 第１試薬：実施例１で作成したＳＧ粒子結合ＤＮＡプロ
ーブ（配列番号２のＤＮＡを有する）２０ｍｇ／ｍｌと
上記（１）で作成したビオチン標識ＤＮＡプローブ（配
列番号３のＤＮＡを有する）６μｇ／ｍｌを含む１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）。 第２試薬：１００Ｕ／ｍｌのアビジン結合アルカリホス
ファターゼを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）。 第３試薬：ＡＭＰＡＫ（商標）試薬、ダコ（ＤＡＫＯ）
社製。
化ｄＵＴＰ［エンゾ（Ｅｎｚｏ）社製］）１５μｇを同
社の３’末端標識キットを用いて該標準反応緩衝液中で
ターミナルトランスフェラーゼ存在下で反応させ、３’
−末端にビオチンを結合させた。未反応のビオチン化ｄ
ＵＴＰをセファデックスＧ−５０を用いスピンカラム法
で除去し目的のビオチン結合ＤＮＡプローブを得た。 （２）検出試薬の調製 下記の組成の、Ｋ−ｒａｓ突然変異検出キットを作成し
た。 第１試薬：実施例１で作成したＳＧ粒子結合ＤＮＡプロ
ーブ（配列番号２のＤＮＡを有する）２０ｍｇ／ｍｌと
上記（１）で作成したビオチン標識ＤＮＡプローブ（配
列番号３のＤＮＡを有する）６μｇ／ｍｌを含む１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）。 第２試薬：１００Ｕ／ｍｌのアビジン結合アルカリホス
ファターゼを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）。 第３試薬：ＡＭＰＡＫ（商標）試薬、ダコ（ＤＡＫＯ）
社製。
【００５３】実施例３ （Ｋ−ｒａｓ突然変異遺伝子配
列の検出） 配列番号１のＤＮＡをＤＮＡ合成機で合成した後、５’
末端をシアノエチルホスホアミダイト法に従ってビオチ
ン標識した。実施例１で作成した担体結合ＤＮＡプロー
ブ２ｍｇを１／５０の界面活性剤（非イオン性界面活性
剤を含む中性洗浄液、協和メデックス社製）１Ｍ塩化ナ
トリウム、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）からな
る溶液１ｍｌに試料として種々の量の該ビオチン標識Ｄ
ＮＡ及び１００Ｕ／ｍｌのアビジン結合パーオキシダー
ゼを５０μｌ添加し室温で６０分静置した。その後、同
組成の溶液で遠心し３回洗浄した。担体を回収し１００
μｌの溶媒に分散させ、１００μＭ ＭＣＤＰ（協和メ
デックス製）及び１μＭ過酸化水素を添加し、３７℃で
３０分間反応し、反応前後の吸光度の変化を６２０ｎｍ
で測定した。結果を図１に示す。
列の検出） 配列番号１のＤＮＡをＤＮＡ合成機で合成した後、５’
末端をシアノエチルホスホアミダイト法に従ってビオチ
ン標識した。実施例１で作成した担体結合ＤＮＡプロー
ブ２ｍｇを１／５０の界面活性剤（非イオン性界面活性
剤を含む中性洗浄液、協和メデックス社製）１Ｍ塩化ナ
トリウム、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）からな
る溶液１ｍｌに試料として種々の量の該ビオチン標識Ｄ
ＮＡ及び１００Ｕ／ｍｌのアビジン結合パーオキシダー
ゼを５０μｌ添加し室温で６０分静置した。その後、同
組成の溶液で遠心し３回洗浄した。担体を回収し１００
μｌの溶媒に分散させ、１００μＭ ＭＣＤＰ（協和メ
デックス製）及び１μＭ過酸化水素を添加し、３７℃で
３０分間反応し、反応前後の吸光度の変化を６２０ｎｍ
で測定した。結果を図１に示す。
【００５４】図１に示す通り、ＤＮＡを定量できる。
【００５５】実施例４ （１塩基ミスマッチの検出） 下記のＫ−ｒａｓ配列をもつＤＮＡ、 ５’−ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧ−
３’（２０ｍｅｒ；配列番号４） 及び任意配列、 ５’−ＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣ−
３’（２０ｍｅｒ；配列番号５） をＤＮＡ合成機で合成し、実施例３と同様な方法でビオ
チンで標識し、実施例３で調製した配列番号１のビオチ
ン標識ＤＮＡとともに試料に用いた。実施例１で調製し
た担体結合ＤＮＡプローブ２ｍｇ及び上記ビオチン標識
ＤＮＡを各０．６μｇ含む試料を第５表に示すように調
製し、各試料をハイブリダイゼーション溶液で８０℃１
０分保温した後３時間かけて２５℃に冷却した。１００
Ｕ／ｍｌのアビジン結合パーオキシダーゼを５０μｌ添
加し室温で６０分静置した後、担体にあるパーオキシダ
ーゼ活性を実施例３に従って測定した。結果を第５表に
記す。
３’（２０ｍｅｒ；配列番号４） 及び任意配列、 ５’−ＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣ−
３’（２０ｍｅｒ；配列番号５） をＤＮＡ合成機で合成し、実施例３と同様な方法でビオ
チンで標識し、実施例３で調製した配列番号１のビオチ
ン標識ＤＮＡとともに試料に用いた。実施例１で調製し
た担体結合ＤＮＡプローブ２ｍｇ及び上記ビオチン標識
ＤＮＡを各０．６μｇ含む試料を第５表に示すように調
製し、各試料をハイブリダイゼーション溶液で８０℃１
０分保温した後３時間かけて２５℃に冷却した。１００
Ｕ／ｍｌのアビジン結合パーオキシダーゼを５０μｌ添
加し室温で６０分静置した後、担体にあるパーオキシダ
ーゼ活性を実施例３に従って測定した。結果を第５表に
記す。
【００５６】
【表５】
【００５７】その結果完全に相補的なＤＮＡを持つ試料
のみ吸光度の変化が認められ、１塩基ミスマッチ配列を
含む試料ではほとんど吸光度の変化が認められなかっ
た。
のみ吸光度の変化が認められ、１塩基ミスマッチ配列を
含む試料ではほとんど吸光度の変化が認められなかっ
た。
【００５８】実施例５ （標識結合ＤＮＡプローブ法） 下記のＫ−ｒａｓ突然変異配列を持つＤＮＡ、 ５’−ＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴ
ＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧ
ＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧ−
３’（７０ｍｅｒ；配列番号６、変異点は２９番目の
Ｃ） 、Ｋ−ｒａｓ配列をもつＤＮＡ、 ５’−ＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴ
ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧ
ＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧ−
３’（７０ｍｅｒ：配列番号７） 及び一部任意配列に改変したＤＮＡ配列、 ５’−ＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＡＡ
ＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＣＡＡＧＡＧＴＧ
ＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧ−
３’（７０ｍｅｒ；配列番号８、任意配列は２０番目か
ら３９番目の２０塩基） をＤＮＡ合成機で合成した。次いで上記配列番号６〜８
のいずれか２種の合成ＤＮＡ各２μｇ含む１２０μｌの
ハイブリダイゼーション溶液（実施例１と同一の組成）
を調製し検出すべきＤＮＡ配列の試料とした。
ＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧ
ＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧ−
３’（７０ｍｅｒ；配列番号６、変異点は２９番目の
Ｃ） 、Ｋ−ｒａｓ配列をもつＤＮＡ、 ５’−ＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴ
ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧ
ＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧ−
３’（７０ｍｅｒ：配列番号７） 及び一部任意配列に改変したＤＮＡ配列、 ５’−ＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＡＡ
ＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＣＡＡＧＡＧＴＧ
ＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧ−
３’（７０ｍｅｒ；配列番号８、任意配列は２０番目か
ら３９番目の２０塩基） をＤＮＡ合成機で合成した。次いで上記配列番号６〜８
のいずれか２種の合成ＤＮＡ各２μｇ含む１２０μｌの
ハイブリダイゼーション溶液（実施例１と同一の組成）
を調製し検出すべきＤＮＡ配列の試料とした。
【００５９】２ｍｌマイクロチューブに、実施例２で合
成した第１試薬１２０μｌと上記試料１２０μｌを添加
し、８０℃で１０分処理した後、３時間かけて２５℃ま
で徐々に冷却した。２．５Ｍ塩化ナトリウム溶液４００
μｌで２回遠心により洗浄した。洗浄後、実施例２で作
成した第２試薬２０μｌを遠心管に添加し室温で１時間
静置した。４００μｌの、１／５０の界面活性剤（非イ
オン性界面活性剤を含む中性洗浄液、協和メデックス社
製）１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）からなる溶液で３回洗浄した後、担体を含む画
分に実施例２で調製した第３試薬５００μｌ添加し、３
７℃で３０分間反応し、４９２ｎｍの吸光度を測定し
た。結果を第６表に示す。
成した第１試薬１２０μｌと上記試料１２０μｌを添加
し、８０℃で１０分処理した後、３時間かけて２５℃ま
で徐々に冷却した。２．５Ｍ塩化ナトリウム溶液４００
μｌで２回遠心により洗浄した。洗浄後、実施例２で作
成した第２試薬２０μｌを遠心管に添加し室温で１時間
静置した。４００μｌの、１／５０の界面活性剤（非イ
オン性界面活性剤を含む中性洗浄液、協和メデックス社
製）１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）からなる溶液で３回洗浄した後、担体を含む画
分に実施例２で調製した第３試薬５００μｌ添加し、３
７℃で３０分間反応し、４９２ｎｍの吸光度を測定し
た。結果を第６表に示す。
【００６０】
【表６】
【００６１】完全に一致した配列を持つＤＮＡ試料のみ
が有意な吸光度の増加が認められた。
が有意な吸光度の増加が認められた。
【００６２】実施例６ 配列番号１及び配列番号４をＤＮＡ合成機で合成し、実
施例３と同様な方法でビオチンで標識した。実施例１で
調製した担体結合ＤＮＡプローブ２ｍｇ及び上記の各ビ
オチン標識ＤＮＡをプローブＤＮＡに対し第７表に示す
モル数割合で混合し試料とした。各試料をハイブリダイ
ゼーション溶液で８０℃１０分保温した後３時間かけて
２５℃に冷却した。１００Ｕ／ｍｌのアビジン結合パー
オキシダーゼを５０μｌ添加し室温で６０分静置した
後、担体に結合しているパーオキシダーゼの活性を実施
例３に従って測定し吸光度を求めた。結果を第７表に記
す。
施例３と同様な方法でビオチンで標識した。実施例１で
調製した担体結合ＤＮＡプローブ２ｍｇ及び上記の各ビ
オチン標識ＤＮＡをプローブＤＮＡに対し第７表に示す
モル数割合で混合し試料とした。各試料をハイブリダイ
ゼーション溶液で８０℃１０分保温した後３時間かけて
２５℃に冷却した。１００Ｕ／ｍｌのアビジン結合パー
オキシダーゼを５０μｌ添加し室温で６０分静置した
後、担体に結合しているパーオキシダーゼの活性を実施
例３に従って測定し吸光度を求めた。結果を第７表に記
す。
【００６３】
【表７】
【００６４】その結果、１塩基ミスマッチ配列が完全相
補配列の１００倍のモル数が存在する試料でも、完全相
補配列を検出できることが示された。
補配列の１００倍のモル数が存在する試料でも、完全相
補配列を検出できることが示された。
【００６５】実施例７（担体結合標識ＤＮＡプローブの
合成） 実施例１と同様な方法で配列番号２の塩基配列の５’末
端とＳＧ担体が結合した担体結合ＤＮＡプローブを作成
した。次いで実施例２と同様な方法で３’末端にビオチ
ンを結合させ、担体結合標識ＤＮＡプローブを作成し
た。該ＳＧ粒子１ｍｇには、約０．０６μｇのプローブ
ＤＮＡが結合していた。
合成） 実施例１と同様な方法で配列番号２の塩基配列の５’末
端とＳＧ担体が結合した担体結合ＤＮＡプローブを作成
した。次いで実施例２と同様な方法で３’末端にビオチ
ンを結合させ、担体結合標識ＤＮＡプローブを作成し
た。該ＳＧ粒子１ｍｇには、約０．０６μｇのプローブ
ＤＮＡが結合していた。
【００６６】実施例８（担体結合標識ＤＮＡプローブ法
の試薬） 下記の、第４試薬〜第７試薬からなるキットを作成し
た。 第４試薬：実施例７で作成した担体結合標識ＤＮＡプロ
ーブ２７．８ｍｇ／ｍｌ、２．８Ｍ塩化ナトリウム、１
０ｍＭ硫酸亜鉛及び３００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．
６）を含む試薬溶液。
の試薬） 下記の、第４試薬〜第７試薬からなるキットを作成し
た。 第４試薬：実施例７で作成した担体結合標識ＤＮＡプロ
ーブ２７．８ｍｇ／ｍｌ、２．８Ｍ塩化ナトリウム、１
０ｍＭ硫酸亜鉛及び３００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．
６）を含む試薬溶液。
【００６７】第５試薬：３００Ｕ／ｍｌＳ１ヌクレアー
ゼ（ライフテックオリエンタル社製）、１５０ｍＭ塩化
ナトリウム、０．０５ｍＭ硫酸亜鉛、５０％グリセロー
ル及び１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）を含む試薬。 第６試薬：１００Ｕ／ｍｌのアビジン結合アルカリホス
ファターゼを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）。
ゼ（ライフテックオリエンタル社製）、１５０ｍＭ塩化
ナトリウム、０．０５ｍＭ硫酸亜鉛、５０％グリセロー
ル及び１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）を含む試薬。 第６試薬：１００Ｕ／ｍｌのアビジン結合アルカリホス
ファターゼを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）。
【００６８】第７試薬：ＡＭＰＡＫ（商標）試薬、ダコ
（ＤＡＫＯ）社製。
（ＤＡＫＯ）社製。
【００６９】実施例９（担体結合標識ＤＮＡプローブ
法） 配列番号１のＫ−ｒａｓ突然変異配列を持つＤＮＡ及び
配列番号４のＫ−ｒａｓ配列をもつＤＮＡを各２μｇを
１２０μｌの水に溶解し検出すべきＤＮＡ試料とした。
２ｍｌマイクロチューブに、実施例８で合成した第４試
薬１２０μｌと上記ＤＮＡ試料１２０μｌを添加し、８
０℃で１０分処理した後、３時間かけて２５℃まで徐々
に冷却した。２．５Ｍ塩化ナトリウム溶液４００μｌで
２回遠心により洗浄した。次いで、沈殿画分に実施例８
で作成した第５試薬１００μｌ添加し、３７℃又は４５
℃に保温し１時間保持しＳ１ヌクレアーゼを作用させ
た。
法） 配列番号１のＫ−ｒａｓ突然変異配列を持つＤＮＡ及び
配列番号４のＫ−ｒａｓ配列をもつＤＮＡを各２μｇを
１２０μｌの水に溶解し検出すべきＤＮＡ試料とした。
２ｍｌマイクロチューブに、実施例８で合成した第４試
薬１２０μｌと上記ＤＮＡ試料１２０μｌを添加し、８
０℃で１０分処理した後、３時間かけて２５℃まで徐々
に冷却した。２．５Ｍ塩化ナトリウム溶液４００μｌで
２回遠心により洗浄した。次いで、沈殿画分に実施例８
で作成した第５試薬１００μｌ添加し、３７℃又は４５
℃に保温し１時間保持しＳ１ヌクレアーゼを作用させ
た。
【００７０】反応終了後、２．５Ｍ塩化ナトリウム溶液
４００μｌで２回遠心により洗浄した後、沈殿画分に実
施例８で作成した第６試薬２０μｌを添加し室温で１時
間静置した。４００μｌの、１／５０の界面活性剤（非
イオン性界面活性剤を含む中性洗浄液、協和メデックス
社製）１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）からなる溶液で３回洗浄した後、担体を含む
画分に実施例８で調製した第７試薬５００μｌ添加し、
３７℃で３０分間反応し、４９２ｎｍの吸光度を測定し
た。
４００μｌで２回遠心により洗浄した後、沈殿画分に実
施例８で作成した第６試薬２０μｌを添加し室温で１時
間静置した。４００μｌの、１／５０の界面活性剤（非
イオン性界面活性剤を含む中性洗浄液、協和メデックス
社製）１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）からなる溶液で３回洗浄した後、担体を含む
画分に実施例８で調製した第７試薬５００μｌ添加し、
３７℃で３０分間反応し、４９２ｎｍの吸光度を測定し
た。
【００７１】その結果、配列番号１を用いて得られた吸
光度を１００％とした場合、配列番号４を用いた場合で
は、３７℃でＳ１ヌクレアーゼを作用させたとき８．２
％、４５℃でＳ１ヌクレアーゼを作用させたとき０％の
相対吸光度が得られた。この結果は、一塩基ミスマッチ
配列を検出すること無く、完全相補的ＤＮＡ断片の検出
又は定量が可能なことを示している。
光度を１００％とした場合、配列番号４を用いた場合で
は、３７℃でＳ１ヌクレアーゼを作用させたとき８．２
％、４５℃でＳ１ヌクレアーゼを作用させたとき０％の
相対吸光度が得られた。この結果は、一塩基ミスマッチ
配列を検出すること無く、完全相補的ＤＮＡ断片の検出
又は定量が可能なことを示している。
【００７２】試験例１ 下記のＫ−ｒａｓ突然変異配列を有するＤＮＡ鎖、 ５’−ＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴ
ＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧ
ＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧ−
３’（７０ｍｅｒ；配列番号６、変異点は２９番目の
Ｃ） 、配列番号６に相補的な配列にＧを９塩基付加したＤＮ
Ａ、 ５’−ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴ
ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣ
ＣＡＣＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴ
ＡＴＡＣＴＣＡ−３’（７９ｍｅｒ；配列番号９） 及びＫ−ｒａｓ配列、 ５’−ＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴ
ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧ
ＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧ−
３’（７０ｍｅｒ；配列番号７）をＤＮＡ合成機で合成
した。
ＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧ
ＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧ−
３’（７０ｍｅｒ；配列番号６、変異点は２９番目の
Ｃ） 、配列番号６に相補的な配列にＧを９塩基付加したＤＮ
Ａ、 ５’−ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴ
ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣ
ＣＡＣＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴ
ＡＴＡＣＴＣＡ−３’（７９ｍｅｒ；配列番号９） 及びＫ−ｒａｓ配列、 ５’−ＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴ
ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧ
ＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧ−
３’（７０ｍｅｒ；配列番号７）をＤＮＡ合成機で合成
した。
【００７３】配列番号２のプローブと配列番号１（完全
に相補的な組み合わせ）及び配列番号２のプローブと配
列番号４（１塩基ミスマッチをもつ組み合わせ）をそれ
ぞれ、２５％ホルムアミド、０．７５Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、１％牛血清アル
ブミン、１％ポリビニルピロリドン、１％フィコールか
らなるハイブリダイゼーション溶液に添加しアニーリン
グしＤＮＡの溶解曲線を得た。その結果を図２に示す。
同様に、配列番号９のプローブと配列番号６（完全に相
補的な組み合わせ）及び配列番号９のプローブと配列番
号７（１塩基ミスマッチをもつ組み合わせ）も同様に試
験しＤＮＡの溶解曲線を得た。その結果を図３に示す。
この結果、プローブの長さが７０ｍｅｒ場合は融解温度
の差がほとんど認められないのに対し、プローブの長さ
が２０ｍｅｒでは融解温度の差が約５℃認められる。こ
の結果は、プローブの長さが大きく影響することを示し
ている。即ち、プローブＤＮＡの長さとしては７０未満
で１塩基ミスマッチが分離できることを示唆している。
に相補的な組み合わせ）及び配列番号２のプローブと配
列番号４（１塩基ミスマッチをもつ組み合わせ）をそれ
ぞれ、２５％ホルムアミド、０．７５Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、１％牛血清アル
ブミン、１％ポリビニルピロリドン、１％フィコールか
らなるハイブリダイゼーション溶液に添加しアニーリン
グしＤＮＡの溶解曲線を得た。その結果を図２に示す。
同様に、配列番号９のプローブと配列番号６（完全に相
補的な組み合わせ）及び配列番号９のプローブと配列番
号７（１塩基ミスマッチをもつ組み合わせ）も同様に試
験しＤＮＡの溶解曲線を得た。その結果を図３に示す。
この結果、プローブの長さが７０ｍｅｒ場合は融解温度
の差がほとんど認められないのに対し、プローブの長さ
が２０ｍｅｒでは融解温度の差が約５℃認められる。こ
の結果は、プローブの長さが大きく影響することを示し
ている。即ち、プローブＤＮＡの長さとしては７０未満
で１塩基ミスマッチが分離できることを示唆している。
【００７４】試験例２ 配列番号２４のＤＮＡ鎖（配列番号２２のＤＮＡ鎖に対
して７塩基長の完全相補的配列を有し、５’末端側に１
０塩基長のポリＧ配列を有する、１７ｍｅｒ）に対し，
５’末端にビオチンを結合させた配列番号２２（配列番
号２４のＤＮＡ鎖に完全相補鎖を有する、７ｍｅｒ）の
ＤＮＡ鎖及び５’末端にビオチンを結合させた配列番号
２３（配列番号２４のＤＮＡ鎖に対し不完全相補鎖（１
塩基ミスマッチを有する）を有する、７ｍｅｒ）のＤＮ
Ａ鎖をそれぞれ試験例１と同様な方法でアニーリングし
ＤＮＡの融解曲線を得た。
して７塩基長の完全相補的配列を有し、５’末端側に１
０塩基長のポリＧ配列を有する、１７ｍｅｒ）に対し，
５’末端にビオチンを結合させた配列番号２２（配列番
号２４のＤＮＡ鎖に完全相補鎖を有する、７ｍｅｒ）の
ＤＮＡ鎖及び５’末端にビオチンを結合させた配列番号
２３（配列番号２４のＤＮＡ鎖に対し不完全相補鎖（１
塩基ミスマッチを有する）を有する、７ｍｅｒ）のＤＮ
Ａ鎖をそれぞれ試験例１と同様な方法でアニーリングし
ＤＮＡの融解曲線を得た。
【００７５】２０℃での２６０ｎｍの吸光度を１とした
ときの３５℃での相対吸光度を求めた。１塩基ミスマッ
チのある組合わせ（配列番号２３と配列番号２４）の相
対吸光度と完全相補的な配列の組合わせ（配列番号２２
と配列番号２４）の相対吸光度との差を求めた。同様に
５’末端にビオチンを結合した配列番号２５（１５ｍｅ
ｒ）と配列番号２７（２５ｍｅｒ）［完全相補配列を有
する］及び５’末端にビオチンを結合した配列番号２６
（１５ｍｅｒ）と配列番号２７（２５ｍｅｒ）［１塩基
ミスマッチ配列を有する］、５’末端にビオチンを結合
した配列番号１（２０ｍｅｒ）と配列番号２（３０ｍｅ
ｒ）［完全相補配列を有する］及び５’末端にビオチン
を結合した配列番号４（２０ｍｅｒ）と配列番号２（３
０ｍｅｒ）［１塩基ミスマッチ配列を有する］、５’末
端にビオチンを結合した配列番号２８（２５ｍｅｒ）と
配列番号３０（３５ｍｅｒ）［完全相補配列を有する］
及び５’末端にビオチンを結合した配列番号２９（２５
ｍｅｒ）と配列番号３０（３５ｍｅｒ）［１塩基ミスマ
ッチ配列を有する］、５’末端にビオチンを結合した配
列番号３１（３０ｍｅｒ）と配列番号３３（４０ｍｅ
ｒ）［完全相補配列を有する］及び５’末端にビオチン
を結合した配列番号３２（３０ｍｅｒ）と配列番号３３
（４０ｍｅｒ）［１塩基ミスマッチ配列を有する］並び
に５’末端にビオチンを結合した配列番号６（７０ｍｅ
ｒ）と配列番号９（７９ｍｅｒ）［完全相補配列を有す
る］及び５’末端にビオチンを結合した配列番号７（７
０ｍｅｒ）と配列番号９（７９ｍｅｒ）［１塩基ミスマ
ッチ配列を有する］についても同様に相対吸光度の差を
求めた。
ときの３５℃での相対吸光度を求めた。１塩基ミスマッ
チのある組合わせ（配列番号２３と配列番号２４）の相
対吸光度と完全相補的な配列の組合わせ（配列番号２２
と配列番号２４）の相対吸光度との差を求めた。同様に
５’末端にビオチンを結合した配列番号２５（１５ｍｅ
ｒ）と配列番号２７（２５ｍｅｒ）［完全相補配列を有
する］及び５’末端にビオチンを結合した配列番号２６
（１５ｍｅｒ）と配列番号２７（２５ｍｅｒ）［１塩基
ミスマッチ配列を有する］、５’末端にビオチンを結合
した配列番号１（２０ｍｅｒ）と配列番号２（３０ｍｅ
ｒ）［完全相補配列を有する］及び５’末端にビオチン
を結合した配列番号４（２０ｍｅｒ）と配列番号２（３
０ｍｅｒ）［１塩基ミスマッチ配列を有する］、５’末
端にビオチンを結合した配列番号２８（２５ｍｅｒ）と
配列番号３０（３５ｍｅｒ）［完全相補配列を有する］
及び５’末端にビオチンを結合した配列番号２９（２５
ｍｅｒ）と配列番号３０（３５ｍｅｒ）［１塩基ミスマ
ッチ配列を有する］、５’末端にビオチンを結合した配
列番号３１（３０ｍｅｒ）と配列番号３３（４０ｍｅ
ｒ）［完全相補配列を有する］及び５’末端にビオチン
を結合した配列番号３２（３０ｍｅｒ）と配列番号３３
（４０ｍｅｒ）［１塩基ミスマッチ配列を有する］並び
に５’末端にビオチンを結合した配列番号６（７０ｍｅ
ｒ）と配列番号９（７９ｍｅｒ）［完全相補配列を有す
る］及び５’末端にビオチンを結合した配列番号７（７
０ｍｅｒ）と配列番号９（７９ｍｅｒ）［１塩基ミスマ
ッチ配列を有する］についても同様に相対吸光度の差を
求めた。
【００７６】図４にプローブ長に対する相対吸光度の差
を示す。この結果、７〜７０ｍｅｒ、特に１５〜２５で
顕著な相対吸光度の差が認めらられる。
を示す。この結果、７〜７０ｍｅｒ、特に１５〜２５で
顕著な相対吸光度の差が認めらられる。
【００７７】
【発明の効果】本発明により、検出又は定量すべき遺伝
子配列を簡便に検出又は定量することができる。またこ
れにより突然変異遺伝子簡便な手技による高感度定量が
可能となる。
子配列を簡便に検出又は定量することができる。またこ
れにより突然変異遺伝子簡便な手技による高感度定量が
可能となる。
【００７８】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTTGGAGCTC GTGGCGTAGG 20
【００７９】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGGGGGGGG CCTACGCCAC GAGCTCCAAC 30
【００８０】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CACAAGTTTA TACTCAGGGG 20
【００８１】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTTGGAGCTG GTGGCGTAGG 20
【００８２】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAAGAGTGCC TTGACGATAC 20
【００８３】配列番号：６ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGAGTATAAA CTTGTGGTAG TTGGAGCTCG TGGCGTAGGC AAGAGTGCCT TGACGATACA GCTAATTCAG 70
【００８４】配列番号：７ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGAGTATAAA CTTGTGGTAG TTGGAGCTGG TGGCGTAGGC AAGAGTGCCT TGACGATACA GCTAATTCAG 70
【００８５】配列番号：８ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGAGTATAAA CTTGTGGTAC AAGAGTGCCT TGACGATACC AAGAGTGCCT TGACGATACA GCTAATTCAG 70
【００８６】配列番号：９ 配列の長さ：７９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGGGGGGGC TGAATTAGCT GTATCGTCAA GGCACTCTTG CCTACGCCAC GAGCTCCAAC TACCACAAGT TTATACTCA 79
【００８７】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGATAGGCTG ACGTCTACCT 20
【００８８】配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGCCATCCT GCCCACCCCA 20
【００８９】配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCAAGAGGGA CGGGAACCTC 20
【００９０】配列番号：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACCCTCGTTT CCGTACAGAG 20
【００９１】配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCTGAGCCCA GGACCGGTCT 20
【００９２】配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCTTGTGGC AGCTTAAGTT 20
【００９３】配列番号：１６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCCTGTGGC AGCCTAAGAG G 21
【００９４】配列番号：１７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTTTCTTGGA GCAGGTTAAA C 21
【００９５】配列番号：１８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGTTCCTGGA AAGACTCTTC T 21
【００９６】配列番号：１９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTTGCTGGA AAGACGCGTC C 21
【００９７】配列番号：２０ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATTCCCCGC AGAGGATTTC G 21
【００９８】配列番号：２１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CACCTGCAGT GCGGAGCTCC AACTGGTA 28
【００９９】配列番号：２２ 配列の長さ：７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCTCGTG 7
【０１００】配列番号：２３ 配列の長さ：７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCTGGTG 7
【０１０１】配列番号：２４ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGGGGGGGG CACGAGC 17
【０１０２】配列番号：２５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGAGCTCGT GGCGT 15
【０１０３】配列番号：２６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGAGCTGGT GGCGT 15
【０１０４】配列番号：２７ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGGGGGGGG ACGCCACGAG CTCCA 25
【０１０５】配列番号：２８ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTAGTTGGAG CTCCTGGCGT AGGCA 25
【０１０６】配列番号：２９ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTAGTTGGAG CTGGTGGCGT AGGCA 25
【０１０７】配列番号：３０ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGGGGGGGG TGCCTACGCC ACGAGCTCCA ACTAC 35
【０１０８】配列番号：３１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGTAGTTGG AGCTCGTGGC GTAGGCAAGA 30
【０１０９】配列番号：３２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGTAGTTGG AGCTGGTGGC GTAGGCAAGA 30
【０１１０】配列番号：３３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGGGGGGGG TCTTGCCTAC GCCACGAGCT CCAACTACCA 40
【図１】 ＤＮＡ量の検量線
【図２】 プローブの長さが２０ｍｅｒの場合のＤＮＡ
溶解曲線
溶解曲線
−●−配列番号２と配列番号１（完全に相補的配列） −▲−配列番号２と配列番号４（１塩基ミスマッチ）
【図３】 プローブの長さが７０ｍｅｒの場合のＤＮＡ
溶解曲線
溶解曲線
−●−配列番号９と配列番号６（完全に相補的配列） −○−配列番号９と配列番具７（１塩基ミスマッチ）
【図４】 プローブ長に対する相対吸光度の差
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/547 Ｇ０１Ｎ 33/547 33/566 33/566 33/58 33/58 Ａ (72)発明者 久保田 亜伊子 神奈川県横浜市保土ヶ谷区狩場町164−35 グリーンヒルズ横浜Ｄ−411 (72)発明者 福井 正憲 兵庫県姫路市緑台１丁目28−12
Claims (23)
- 【請求項１】 試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子
配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補
的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着
しにくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又は介
さず結合している担体結合ＤＮＡプローブと試料中のＤ
ＮＡ断片とをハイブリダイズし、該担体結合ＤＮＡプロ
ーブとハイブリダイズした試料中のＤＮＡ断片を検出又
は定量することからなる特定遺伝子配列を有する一本鎖
ＤＮＡ断片の検出又は定量方法。 - 【請求項２】 試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子
配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補
的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着
しにくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又は介
さず結合している担体結合ＤＮＡプローブ及び試料中の
検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮ
Ａ断片の特定遺伝子配列以外の部分配列と相補的な配列
を有する一本鎖ＤＮＡプローブを共に試料中のＤＮＡ断
片にハイブリダイズし、該担体結合ＤＮＡ及び該一本鎖
ＤＮＡプローブにハイブリダイズした試料中のＤＮＡ断
片を検出又は定量することからなる特定遺伝子配列を有
する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方法。 - 【請求項３】 試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子
配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補
的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着
しにくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又は介
さず結合している担体結合ＤＮＡプローブと試料中のＤ
ＮＡ断片とをハイブリダイズし、次いで一本鎖ＤＮＡ断
片を切断する酵素を作用させた後、該担体結合ＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズしている試料中のＤＮＡ断片を
検出又は定量することからなる特定遺伝子配を列有する
一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方法。 - 【請求項４】 試料中のＤＮＡ断片を標識化合物で標識
し、担体結合ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたＤＮ
Ａ断片の検出又は定量を該試料中のＤＮＡ断片の標識化
合物を検出又は定量するにより行う請求項１記載の特定
遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方
法。 - 【請求項５】 試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子
配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列以外の
部分配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブ
を標識化合物で標識したＤＮＡプローブであり、該担体
結合ＤＮＡ及び該一本鎖ＤＮＡプローブにハイブリダイ
ズしたＤＮＡ断片の検出又は定量が該ＤＮＡプローブの
標識化合物の検出又は定量により行う請求項２記載の特
定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量
方法。 - 【請求項６】 試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子
配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補
的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着
しにくい物質からなる担体とがスペーサーを介し又は介
さず結合している担体結合ＤＮＡプローブの一本鎖ＤＮ
Ａプローブ部分を標識化合物で標識し、該担体結合標識
ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片の検出
又は定量を該担体結合標識ＤＮＡプローブの標識化合物
の検出又は定量により行う請求項３記載の特定遺伝子配
列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方法。 - 【請求項７】 検出又は定量すべき遺伝子配列が点突然
変異遺伝子である請求項１から６いずれかに記載の特定
遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方
法。 - 【請求項８】 試料中の検出又は定量すべき遺伝子配列
と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブが１０〜
３０ｍｅｒである請求項１から６いずれかに記載の特定
遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方
法。 - 【請求項９】 スペーサーがポリエチレングリコールジ
グリシジルエーテル、一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡで
ある請求項１から６いずれかに記載の特定遺伝子配列を
有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方法。 - 【請求項１０】 ＤＮＡを吸着しにくい担体が、スチレ
ン−グリシジルメタクリレートのコアシェル構造を持つ
粒子である請求項１から６いずれかに記載の特定遺伝子
配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量方法。 - 【請求項１１】 標識化合物がビオチンであり、標識化
合物の検出又は定量がアビジン結合酵素を標識化合物ビ
オチンに結合させた後、結合した酵素の酵素活性を検出
又は定量することにより行われる請求項４から６いずれ
かに記載の特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の
検出又は定量方法。 - 【請求項１２】 酵素活性の検出又は定量方法が酵素サ
イクリングによる増幅を組み入れた方法である請求項１
１記載の特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検
出又は定量方法。 - 【請求項１３】 試料中の検出又は定量すべき特定遺伝
子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相
補的な配列を有する１０〜３０ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡプ
ローブとＤＮＡを吸着しにくい担体がスペーサを介し又
は介さず結合している担体結合ＤＮＡプローブ。 - 【請求項１４】 ＤＮＡを吸着しにくい担体が、スチレ
ン−グリシジルメタクリレートのコアシェル構造を持つ
粒子である請求項１３記載の担体結合ＤＮＡプローブ。 - 【請求項１５】 検出又は定量すべき特定遺伝子配列を
有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的な配
列を有する一本鎖ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着しにく
い担体がスペーサを介し又は介さず結合している担体結
合ＤＮＡプローブ及び試料中の検出又は定量すべき特定
遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列
以外の部分配列と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプ
ローブと標識化合物が結合している標識結合ＤＮＡプロ
ーブからなる試薬及び標識化合物の検出又は定量試薬か
らなる特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出
又は定量用試薬キット。 - 【請求項１６】 担体結合ＤＮＡプローブが１０〜３０
ｍｅｒであり、標識結合ＤＮＡプローブが１０〜３０ｍ
ｅｒである請求項１５記載の特定遺伝子配列を有する一
本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量用試薬キット。 - 【請求項１７】 標識結合ＤＮＡプローブの標識化合物
がビオチンであり、標識化合物の検出又は定量試薬がア
ビジン結合酵素の酵素活性検出又は定量試薬である請求
項１５又は１６記載の特定遺伝子配列を有する一本鎖Ｄ
ＮＡ断片の検出又は定量用試薬キット。 - 【請求項１８】 アビジン結合酵素がアルカリホスファ
ターゼであり、アビジン結合酵素の酵素活性検出又は定
量試薬が、ＮＡＤＰ、ＩＮＴ−バイオレット、ＮＡＤ
Ｈ、エタノール、ダイアフォラーゼ及びアルコールデヒ
ドロゲナーゼからなる請求項１７記載の特定遺伝子配列
を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量用試薬キッ
ト。 - 【請求項１９】 検出又は定量すべき特定遺伝子配列を
有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的な配
列を有する一本鎖ＤＮＡプローブと標識化合物が結合し
ている標識結合ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着しにくい
担体がスペーサを介し又は介さず結合している担体結合
標識ＤＮＡプローブからなる試薬、一本鎖ＤＮＡを切断
する酵素からなる試薬及び標識化合物の検出又は定量試
薬からなる特定遺伝子配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片の
検出又は定量用試薬キット。 - 【請求項２０】 担体結合標識ＤＮＡプローブが１０〜
３０ｍｅｒである請求項１９記載の特定遺伝子配列を有
する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量用試薬キット。 - 【請求項２１】 担体結合標識ＤＮＡプローブの標識化
合物がビオチンであり、標識化合物の検出又は定量試薬
がアビジン結合酵素の酵素活性検出又は定量試薬である
請求項１９又は２０記載の特定遺伝子を配列を有する一
本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量用試薬キット。 - 【請求項２２】 アビジン結合酵素がアルカリホスファ
ターゼであり、アビジン結合酵素の酵素活性検出又は定
量試薬が、ＮＡＤＰ、ＩＮＴ−バイオレット、ＮＡＤ
Ｈ、エタノール、ダイアフォラーゼ及びアルコールデヒ
ドロゲナーゼからなる請求項２１記載の特定遺伝子配列
を有する一本鎖ＤＮＡ断片の検出又は定量用試薬キッ
ト。 - 【請求項２３】 検出又は定量すべき特定遺伝子配列を
有する一本鎖ＤＮＡ断片の特定遺伝子配列と相補的な配
列を有する一本鎖ＤＮＡプローブと標識化合物が結合し
ている標識結合ＤＮＡプローブとＤＮＡを吸着しにくい
担体がスペーサを介し又は介さず結合している担体結合
標識ＤＮＡプローブ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9302529A JPH10179179A (ja) | 1996-11-08 | 1997-11-05 | 特定遺伝子配列の定量方法及び定量試薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29696396 | 1996-11-08 | ||
| JP8-296963 | 1996-11-08 | ||
| JP9302529A JPH10179179A (ja) | 1996-11-08 | 1997-11-05 | 特定遺伝子配列の定量方法及び定量試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10179179A true JPH10179179A (ja) | 1998-07-07 |
Family
ID=26560933
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9302529A Withdrawn JPH10179179A (ja) | 1996-11-08 | 1997-11-05 | 特定遺伝子配列の定量方法及び定量試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10179179A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999058716A1 (fr) * | 1998-05-08 | 1999-11-18 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Procede servant a quantifier une sequence specifique de genes et reactif de quantification |
| JP2003526791A (ja) * | 2000-03-09 | 2003-09-09 | サーモディックス，インコーポレイティド | エポキシドポリマーの表面 |
| JP2004527258A (ja) * | 2001-05-04 | 2004-09-09 | ベーイーオー・メリュー | Ｄｎａを標識化および断片化する方法 |
| JPWO2005075997A1 (ja) * | 2004-02-03 | 2007-10-11 | 旭化成株式会社 | 磁気ビーズを用いた被検物質の検出方法 |
| JP2013511986A (ja) * | 2009-11-25 | 2013-04-11 | ジェニスフィア・エルエルシー | 核酸分子検出のための方法、試薬およびキット |
-
1997
- 1997-11-05 JP JP9302529A patent/JPH10179179A/ja not_active Withdrawn
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP5005869B2 (ja) * | 2000-03-09 | 2012-08-22 | サーモディクス，インコーポレイティド | エポキシドポリマーの表面 |
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| JP4646003B2 (ja) * | 2004-02-03 | 2011-03-09 | 旭化成株式会社 | 磁気ビーズを用いた被検物質の検出方法 |
| JP2013511986A (ja) * | 2009-11-25 | 2013-04-11 | ジェニスフィア・エルエルシー | 核酸分子検出のための方法、試薬およびキット |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20050201 |