JPH10179196A - レジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブおよびレジオネラ属に属する細菌の検出方法 - Google Patents
レジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブおよびレジオネラ属に属する細菌の検出方法Info
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- JPH10179196A JPH10179196A JP8340089A JP34008996A JPH10179196A JP H10179196 A JPH10179196 A JP H10179196A JP 8340089 A JP8340089 A JP 8340089A JP 34008996 A JP34008996 A JP 34008996A JP H10179196 A JPH10179196 A JP H10179196A
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- legionella
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- oligonucleotide probe
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- genus legionella
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異
的に高精度で検出することができ、しかも容易に調製す
ることができるレジオネラ属細菌検出用のオリゴヌクレ
オチドプローブを提供し、これを用いてレジオネラ属細
菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異的に高
精度で検出する。 【解決手段】 塩基配列5'GGT GAT GGT ACT ACT ACT GC
3'または5'GAA GGT CACAAA GCA GTT GC3'を有するオリ
ゴヌクレオチドプローブを放射性元素、酵素、蛍光物質
または化学物質で標識してなる標識オリゴヌクレオチド
プローブを、レジオネラ属に属する細菌またはそのＤＮ
Ａに接触させてハイブリダイゼーションを行った後、標
識を指標にしてレジオネラ（Legionella）属に属する細
菌を検出する。
的に高精度で検出することができ、しかも容易に調製す
ることができるレジオネラ属細菌検出用のオリゴヌクレ
オチドプローブを提供し、これを用いてレジオネラ属細
菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異的に高
精度で検出する。 【解決手段】 塩基配列5'GGT GAT GGT ACT ACT ACT GC
3'または5'GAA GGT CACAAA GCA GTT GC3'を有するオリ
ゴヌクレオチドプローブを放射性元素、酵素、蛍光物質
または化学物質で標識してなる標識オリゴヌクレオチド
プローブを、レジオネラ属に属する細菌またはそのＤＮ
Ａに接触させてハイブリダイゼーションを行った後、標
識を指標にしてレジオネラ（Legionella）属に属する細
菌を検出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、レジオネラ（Legi
onella）属に属する細菌（以下、レジオネラ属細菌とい
う場合がある）を検出、同定または定量するためのオリ
ゴヌクレオチドプローブおよび標識オリゴヌクレオチド
プローブ、この標識オリゴヌクレオチドプローブを含む
レジオネラ属細菌検出用試薬、ならびにこれらを用いた
レジオネラ属細菌の検出方法である。
onella）属に属する細菌（以下、レジオネラ属細菌とい
う場合がある）を検出、同定または定量するためのオリ
ゴヌクレオチドプローブおよび標識オリゴヌクレオチド
プローブ、この標識オリゴヌクレオチドプローブを含む
レジオネラ属細菌検出用試薬、ならびにこれらを用いた
レジオネラ属細菌の検出方法である。
【０００２】
【従来の技術】環境中からのレジオネラ検出では、通常
低ｐＨ処理後WYOαなどのレジオネラ選択培地による培
養によりレジオネラの定量を行っている。しかし、レジ
オネラ属に共通でかつ特異的な形態、生化学的性質は報
告されておらず、このためコロニーが形成された後に栄
養要求性やグラム染色、形態観察、抗体との反応性など
を試験し、これらのいくつかの同定試験結果からレジオ
ネラかどうか判断している。
低ｐＨ処理後WYOαなどのレジオネラ選択培地による培
養によりレジオネラの定量を行っている。しかし、レジ
オネラ属に共通でかつ特異的な形態、生化学的性質は報
告されておらず、このためコロニーが形成された後に栄
養要求性やグラム染色、形態観察、抗体との反応性など
を試験し、これらのいくつかの同定試験結果からレジオ
ネラかどうか判断している。
【０００３】すなわち培養による方法では、コロニーが
レジオネラ特有の色、形、その他の特徴を示すまでには
５〜１０日間必要であり、また完全な選択培地ではない
ため、生ずるコロニーの中にはレジオネラと類似するコ
ロニーを形成する菌もあり、コロニーを釣菌して栄養要
求性やグラム染色などの同定が必須である。このためレ
ジオネラ細菌の検出に２週間程度の長期間を要するとい
う問題点がある。またレジオネラが生育していた環境中
の生育条件と、選択培地を用いた生育条件とは大きく異
なり、レジオネラの生理状態によっては培地上でコロニ
ーを形成しない場合も十分考えられるという問題点もあ
る。
レジオネラ特有の色、形、その他の特徴を示すまでには
５〜１０日間必要であり、また完全な選択培地ではない
ため、生ずるコロニーの中にはレジオネラと類似するコ
ロニーを形成する菌もあり、コロニーを釣菌して栄養要
求性やグラム染色などの同定が必須である。このためレ
ジオネラ細菌の検出に２週間程度の長期間を要するとい
う問題点がある。またレジオネラが生育していた環境中
の生育条件と、選択培地を用いた生育条件とは大きく異
なり、レジオネラの生理状態によっては培地上でコロニ
ーを形成しない場合も十分考えられるという問題点もあ
る。
【０００４】レジオネラを検出、定量する別の手段とし
て抗体を用いる方法があるが、レジオネラ属の広い範囲
の種を検出できる抗体は報告されていない。また抗体を
用いる方法は、抗体を得るまでに手間と時間がかかると
いう問題点がある。
て抗体を用いる方法があるが、レジオネラ属の広い範囲
の種を検出できる抗体は報告されていない。また抗体を
用いる方法は、抗体を得るまでに手間と時間がかかると
いう問題点がある。
【０００５】ところで、特開昭61-88900号には、ＤＮＡ
プローブを用いたレジオネラの検出方法が記載されてい
る。しかし、この方法はゲノムＤＮＡを制限酵素で部分
分解して一定の分離操作後に得られるゲノムＤＮＡの断
片混合物を用いているので、全く同様の断片混合物を繰
返し得ることが困難であり、ロットにより特異性に差が
生じるという問題点がある。また、いわゆるin situハ
イブリダイゼーションに用いることができないという問
題点がある。さらに、ゲノムＤＮＡ断片混合物をプロー
ブとして使用する場合、検出対象としている部分が明ら
かではなく、得られた結果の学問的意味付けが困難であ
る。
プローブを用いたレジオネラの検出方法が記載されてい
る。しかし、この方法はゲノムＤＮＡを制限酵素で部分
分解して一定の分離操作後に得られるゲノムＤＮＡの断
片混合物を用いているので、全く同様の断片混合物を繰
返し得ることが困難であり、ロットにより特異性に差が
生じるという問題点がある。また、いわゆるin situハ
イブリダイゼーションに用いることができないという問
題点がある。さらに、ゲノムＤＮＡ断片混合物をプロー
ブとして使用する場合、検出対象としている部分が明ら
かではなく、得られた結果の学問的意味付けが困難であ
る。
【０００６】また特公平5-78319号には、核酸プローブ
を用いて生物を検出、同定または定量する方法が記載さ
れており、その実施例には２３種のレジオネラ種、具体
的にはL. pnueumophila(PHA1), L. micdadei(HEBA), L.
bozemanii(WIGA), L. dumoffi(TEX-KL), L. garmanii
(LS-13), L. jordanis(BL540), L. longbeachae, L. MS
H9, L. oakridgenis(オークリツシ゛10), L. lansing2, L. SC-
32C-C8, L. WA-316, L.WO-44-3C(L. feeleii), L. phoe
nix 1, L. WA-270A, L. PF-209C-C2, L. SC 65C3(ORW),
L. jamestown 26G1-E2, L. MSH-4, L. lansing 3, L.
SC18-C9, L. SC63-C7, L-81-716(L. wadsworthii)を特
異的に検出することができる例証的プローブが記載され
ている。しかし、この核酸プローブも混合物であり、前
記と同様の問題点がある。またプローブの塩基の長さや
配列が明らかではなく、ｒＲＮＡのどの部分を認識して
いるのか不明確であり、検出精度に問題がある。
を用いて生物を検出、同定または定量する方法が記載さ
れており、その実施例には２３種のレジオネラ種、具体
的にはL. pnueumophila(PHA1), L. micdadei(HEBA), L.
bozemanii(WIGA), L. dumoffi(TEX-KL), L. garmanii
(LS-13), L. jordanis(BL540), L. longbeachae, L. MS
H9, L. oakridgenis(オークリツシ゛10), L. lansing2, L. SC-
32C-C8, L. WA-316, L.WO-44-3C(L. feeleii), L. phoe
nix 1, L. WA-270A, L. PF-209C-C2, L. SC 65C3(ORW),
L. jamestown 26G1-E2, L. MSH-4, L. lansing 3, L.
SC18-C9, L. SC63-C7, L-81-716(L. wadsworthii)を特
異的に検出することができる例証的プローブが記載され
ている。しかし、この核酸プローブも混合物であり、前
記と同様の問題点がある。またプローブの塩基の長さや
配列が明らかではなく、ｒＲＮＡのどの部分を認識して
いるのか不明確であり、検出精度に問題がある。
【０００７】また特表平1-503356号には、特定の配列を
有する核酸プローブを用いたレジオネラの検出方法が記
載され、実施例において３種の混合したプローブを用い
て、２１種類（血清型を除く）のレジオネラ種を検出し
ている。対象とされたレジオネラ種を表１に示す。
有する核酸プローブを用いたレジオネラの検出方法が記
載され、実施例において３種の混合したプローブを用い
て、２１種類（血清型を除く）のレジオネラ種を検出し
ている。対象とされたレジオネラ種を表１に示す。
【０００８】
【表１】
【０００９】しかし上記検出方法では、知られている３
８種のレジオネラ（１９９４）の約５５％しか試験され
ておらず、残り４５％を検出できるかどうか不明である
という問題点がある。
８種のレジオネラ（１９９４）の約５５％しか試験され
ておらず、残り４５％を検出できるかどうか不明である
という問題点がある。
【００１０】また特表平5-507206号にも、特定の配列を
有するプローブを用いたレジオネラ種の検出方法が記載
されている。しかしこのプローブは、レジオネラに特異
的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅された配列を検出
するためのものであり、プローブのレジオネラ特異性が
明らかではないという問題点がある。
有するプローブを用いたレジオネラ種の検出方法が記載
されている。しかしこのプローブは、レジオネラに特異
的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅された配列を検出
するためのものであり、プローブのレジオネラ特異性が
明らかではないという問題点がある。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、短時
間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異的に高精度で検
出することができ、しかも容易に調製することができる
レジオネラ属細菌検出用のオリゴヌクレオチドプローブ
を提供し、これを用いてレジオネラ属細菌を短時間で多
数の種のレジオネラ属細菌を特異的に高精度で検出する
ことである。
間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異的に高精度で検
出することができ、しかも容易に調製することができる
レジオネラ属細菌検出用のオリゴヌクレオチドプローブ
を提供し、これを用いてレジオネラ属細菌を短時間で多
数の種のレジオネラ属細菌を特異的に高精度で検出する
ことである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、次のレジオネ
ラ属細菌検出用のオリゴヌクレオチドプローブおよび標
識オリゴヌクレオチドプローブ、この標識オリゴヌクレ
オチドプローブを含むレジオネラ属細菌検出用試薬、な
らびにこれらを用いたレジオネラ属細菌の検出方法であ
る。 （１）レジオネラ（Legionella）属に属する細菌の共通
抗原をコードする遺伝子の一部の配列を持ち、デオキシ
リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなるプロ
ーブであって、塩基配列 5'GGT GAT GGT ACT ACT ACT GC3'または 5'GAA GGT CAC AAA GCA GTT GC3' を有することを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検
出用オリゴヌクレオチドプローブ。 （２）上記（１）記載のオリゴヌクレオチドプローブを
放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質で標識して
なることを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用
標識オリゴヌクレオチドプローブ。 （３）上記（２）記載の標識オリゴヌクレオチドプロー
ブを含むことを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検
出用試薬。 （４）レジオネラ属に属する細菌またはそのＤＮＡを含
む検体に上記（２）記載の標識オリゴヌクレオチドプロ
ーブまたは上記（３）記載の試薬を接触させてハイブリ
ダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出する
ことを特徴とするレジオネラ属に属する細菌の検出方
法。
ラ属細菌検出用のオリゴヌクレオチドプローブおよび標
識オリゴヌクレオチドプローブ、この標識オリゴヌクレ
オチドプローブを含むレジオネラ属細菌検出用試薬、な
らびにこれらを用いたレジオネラ属細菌の検出方法であ
る。 （１）レジオネラ（Legionella）属に属する細菌の共通
抗原をコードする遺伝子の一部の配列を持ち、デオキシ
リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなるプロ
ーブであって、塩基配列 5'GGT GAT GGT ACT ACT ACT GC3'または 5'GAA GGT CAC AAA GCA GTT GC3' を有することを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検
出用オリゴヌクレオチドプローブ。 （２）上記（１）記載のオリゴヌクレオチドプローブを
放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質で標識して
なることを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用
標識オリゴヌクレオチドプローブ。 （３）上記（２）記載の標識オリゴヌクレオチドプロー
ブを含むことを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検
出用試薬。 （４）レジオネラ属に属する細菌またはそのＤＮＡを含
む検体に上記（２）記載の標識オリゴヌクレオチドプロ
ーブまたは上記（３）記載の試薬を接触させてハイブリ
ダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出する
ことを特徴とするレジオネラ属に属する細菌の検出方
法。
【００１３】本発明において5'GGT GAT GGT ACT ACT AC
T GC3'の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ
（以下、第一のプローブという）および5'GAA GGT CAC
AAAGCA GTT GC3'の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドプローブ（以下、第二のプローブという）は、Legion
ella pneumophilaの既知の共通抗原をコードする遺伝子
（58-kDa common antigen(htpB) gene）の塩基配列と、
Legionella micdadeiの既知の共通抗原をコードする遺
伝子の塩基配列と、E. coliおよびP. aeruginosaのヒー
トショック遺伝子（Hsp60）の塩基配列とを比較し、Leg
ionella pneumophilaとLegionella micdadeiの共通抗原
をコードする遺伝子の塩基配列に共通で、E. coliおよ
びP. aeruginosaのHsp60の塩基配列とは異なる塩基配列
を選び出すことによって得られたものである。
T GC3'の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ
（以下、第一のプローブという）および5'GAA GGT CAC
AAAGCA GTT GC3'の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドプローブ（以下、第二のプローブという）は、Legion
ella pneumophilaの既知の共通抗原をコードする遺伝子
（58-kDa common antigen(htpB) gene）の塩基配列と、
Legionella micdadeiの既知の共通抗原をコードする遺
伝子の塩基配列と、E. coliおよびP. aeruginosaのヒー
トショック遺伝子（Hsp60）の塩基配列とを比較し、Leg
ionella pneumophilaとLegionella micdadeiの共通抗原
をコードする遺伝子の塩基配列に共通で、E. coliおよ
びP. aeruginosaのHsp60の塩基配列とは異なる塩基配列
を選び出すことによって得られたものである。
【００１４】PAUL S. HOFFMANらは、論文（Cloning and
Temperature-Dependent Expression in Escherichia c
oli of a Legionella pneumophila Gene Coding for a
geunus-Common 60-Kilodalton Antigen, PAUL S. HOFFM
AN, CHARLES A, BUTLER, ANDFREDERCK D. QUINN, INFEC
TION AND IMMUNITY, June 1989, p. 1731-1739）の中
で、Legionella pneumophilaの60kDaのレジオネラ属共
通抗原蛋白質〔後にJACQUELYN S. SAMPSONらが58kDaと
報告（Nucleotide Sequence of htpB, the Legionella
pneumophila Gene Encoding the 58-Kilodalton(kda) C
ommon Antigen, Formarly Designated the 60kDa Commo
n Antigen, JACQUELYN S. SAMPSON, STEVEN P. OCOMMO
R, BRIAN P. HOLLOWAY, BONNIE B. PLIKAYTIS, GEORGE
M. CARLONE,AND LEONARD W. MAYER, INFECTION AND IMM
UNITY, Sept, 1990, p. 3154-3157〕がヒートショック
蛋白であることを証明し、この蛋白質はE. coliのヒー
トショック蛋白GroELと相同性を示すことを報告してい
る。また、同程度の分子量を持つ抗原蛋白質がLegionel
la micdadeiでも報告されている（Cloning and express
ion of the Legionella micdadei common antigen in E
scherichia coli, J.M. BANGSBORG, M. T. COLLINS, N.
HФIBY AND P. HINDERSSON, APMIS 97: 14-22, 198
9)。これらのことから、共通抗原と呼ばれる蛋白質の中
の60kDa程度の蛋白質とヒートショック蛋白質（Hsp60）
は同類の機能性蛋白質で、その遺伝子は属にまたがって
保存されていると推察し、前記の通り遺伝子を比較する
こととした。
Temperature-Dependent Expression in Escherichia c
oli of a Legionella pneumophila Gene Coding for a
geunus-Common 60-Kilodalton Antigen, PAUL S. HOFFM
AN, CHARLES A, BUTLER, ANDFREDERCK D. QUINN, INFEC
TION AND IMMUNITY, June 1989, p. 1731-1739）の中
で、Legionella pneumophilaの60kDaのレジオネラ属共
通抗原蛋白質〔後にJACQUELYN S. SAMPSONらが58kDaと
報告（Nucleotide Sequence of htpB, the Legionella
pneumophila Gene Encoding the 58-Kilodalton(kda) C
ommon Antigen, Formarly Designated the 60kDa Commo
n Antigen, JACQUELYN S. SAMPSON, STEVEN P. OCOMMO
R, BRIAN P. HOLLOWAY, BONNIE B. PLIKAYTIS, GEORGE
M. CARLONE,AND LEONARD W. MAYER, INFECTION AND IMM
UNITY, Sept, 1990, p. 3154-3157〕がヒートショック
蛋白であることを証明し、この蛋白質はE. coliのヒー
トショック蛋白GroELと相同性を示すことを報告してい
る。また、同程度の分子量を持つ抗原蛋白質がLegionel
la micdadeiでも報告されている（Cloning and express
ion of the Legionella micdadei common antigen in E
scherichia coli, J.M. BANGSBORG, M. T. COLLINS, N.
HФIBY AND P. HINDERSSON, APMIS 97: 14-22, 198
9)。これらのことから、共通抗原と呼ばれる蛋白質の中
の60kDa程度の蛋白質とヒートショック蛋白質（Hsp60）
は同類の機能性蛋白質で、その遺伝子は属にまたがって
保存されていると推察し、前記の通り遺伝子を比較する
こととした。
【００１５】Legionella pneumophilaおよびLegionella
micdadeiの上記共通抗原をコードする遺伝子の一部の
塩基配列、ならびにE. coliおよびP. aeruginosaのヒー
トショック遺伝子（Hsp60）の一部の塩基配列を表２に
示す。
micdadeiの上記共通抗原をコードする遺伝子の一部の
塩基配列、ならびにE. coliおよびP. aeruginosaのヒー
トショック遺伝子（Hsp60）の一部の塩基配列を表２に
示す。
【００１６】
【表２】
【００１７】本発明の第一のプローブの塩基配列（配列
番号１の塩基配列）は、L. pneumophilaの共通抗原をコ
ードする遺伝子（58-kDa common antigen(htpB) gene）
またはLegionella micdadeiの共通抗原をコードする遺
伝子の２５３〜２７２番目の塩基配列に相当する。また
本発明の第二のプローブの塩基配列（配列番号２の塩基
配列）は、L. pneumophilaの共通抗原をコードする遺伝
子（58-kDa common antigen(htpB) gene）またはLegion
ella micdadeiの共通抗原をコードする遺伝子の３０１
〜３２０番目の塩基配列に相当する。従って、本発明の
第一のプローブの配列は、L. pneumophilaの共通抗原を
コードする遺伝子（58-kDa common antigen(htpB) gen
e）またはLegionella micdadeiの共通抗原をコードする
遺伝子の２５３〜２７２番目の相補配列およびこれに類
似する塩基配列をターゲットにし、本発明の第二のプロ
ーブの配列は、上記遺伝子の３０１〜３２０番目の相補
配列およびこれに類似する塩基配列をターゲットにす
る。
番号１の塩基配列）は、L. pneumophilaの共通抗原をコ
ードする遺伝子（58-kDa common antigen(htpB) gene）
またはLegionella micdadeiの共通抗原をコードする遺
伝子の２５３〜２７２番目の塩基配列に相当する。また
本発明の第二のプローブの塩基配列（配列番号２の塩基
配列）は、L. pneumophilaの共通抗原をコードする遺伝
子（58-kDa common antigen(htpB) gene）またはLegion
ella micdadeiの共通抗原をコードする遺伝子の３０１
〜３２０番目の塩基配列に相当する。従って、本発明の
第一のプローブの配列は、L. pneumophilaの共通抗原を
コードする遺伝子（58-kDa common antigen(htpB) gen
e）またはLegionella micdadeiの共通抗原をコードする
遺伝子の２５３〜２７２番目の相補配列およびこれに類
似する塩基配列をターゲットにし、本発明の第二のプロ
ーブの配列は、上記遺伝子の３０１〜３２０番目の相補
配列およびこれに類似する塩基配列をターゲットにす
る。
【００１８】本発明の第一および第二のプローブは、前
記のように塩基配列が明らかで、塩基配列の長さも２０
塩基程度であるため、ヌクレオチドまたはデオキシヌク
レオチドから化学合成により容易に合成することができ
る。このため、同一のプローブを何度でも容易に得るこ
とができ、ロットにより特異性がことなるということは
ない。また本発明の第一および第二のプローブは塩基数
が比較的短いことから、in situハイブリダイゼーショ
ンに用いることもできる。これらの点から、検出試薬と
して優れている。
記のように塩基配列が明らかで、塩基配列の長さも２０
塩基程度であるため、ヌクレオチドまたはデオキシヌク
レオチドから化学合成により容易に合成することができ
る。このため、同一のプローブを何度でも容易に得るこ
とができ、ロットにより特異性がことなるということは
ない。また本発明の第一および第二のプローブは塩基数
が比較的短いことから、in situハイブリダイゼーショ
ンに用いることもできる。これらの点から、検出試薬と
して優れている。
【００１９】本発明のレジオネラ属に属する細菌検出用
標識オリゴヌクレオチドプローブは、前記第一のプロー
ブまたは第二のプローブを放射性元素、酵素、蛍光物質
または化学物質などの標識物質で標識したプローブであ
る。このような標識物質としては従来から使用されてい
る標識物質が使用でき、具体的なものとしては32Ｐ等の
放射性元素；ＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光物質；ジコ
キシゲニン等のハプテン；アルカリフォスファターゼ、
ペルオキシダーゼ等の酵素；ビオチン等の生化学物質な
どがあげられる。これらの標識物質は、公知の方法でプ
ローブに導入することができる。
標識オリゴヌクレオチドプローブは、前記第一のプロー
ブまたは第二のプローブを放射性元素、酵素、蛍光物質
または化学物質などの標識物質で標識したプローブであ
る。このような標識物質としては従来から使用されてい
る標識物質が使用でき、具体的なものとしては32Ｐ等の
放射性元素；ＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光物質；ジコ
キシゲニン等のハプテン；アルカリフォスファターゼ、
ペルオキシダーゼ等の酵素；ビオチン等の生化学物質な
どがあげられる。これらの標識物質は、公知の方法でプ
ローブに導入することができる。
【００２０】本発明のレジオネラ属に属する細菌検出用
試薬は上記標識オリゴヌクレオチドプローブを含むもの
であり、標識オリゴヌクレオチドプローブだけからなっ
ていてもよく、また緩衝液などに溶解したものでもよ
く、またレジオネラ属細菌とのハイブリダイゼーション
を容易に実施することができるようにキット化されたも
のでもよい。
試薬は上記標識オリゴヌクレオチドプローブを含むもの
であり、標識オリゴヌクレオチドプローブだけからなっ
ていてもよく、また緩衝液などに溶解したものでもよ
く、またレジオネラ属細菌とのハイブリダイゼーション
を容易に実施することができるようにキット化されたも
のでもよい。
【００２１】本発明の標識オリゴヌクレオチドプローブ
またはこれを含む試薬は、レジオネラ属細菌またはこの
ＤＮＡを含む検体とハイブリダイゼーションを実施し、
その後標識物質を指標にして検出することにより、例え
ば放射能、発色、蛍光、発光などを指標にして検出する
ことにより、プローブがハイブリダイゼーションしたレ
ジオネラ属細菌を特異的に高精度で、目視や顕微鏡等に
より容易に検出、同定または定量することができる。
またはこれを含む試薬は、レジオネラ属細菌またはこの
ＤＮＡを含む検体とハイブリダイゼーションを実施し、
その後標識物質を指標にして検出することにより、例え
ば放射能、発色、蛍光、発光などを指標にして検出する
ことにより、プローブがハイブリダイゼーションしたレ
ジオネラ属細菌を特異的に高精度で、目視や顕微鏡等に
より容易に検出、同定または定量することができる。
【００２２】本発明のプローブで検出、同定または定量
することができるレジオネラ属細菌の種の種類の一部を
表３に示す。
することができるレジオネラ属細菌の種の種類の一部を
表３に示す。
【００２３】
【表３】
【００２４】表３の注 ＊１ 本発明の第一のプローブ ＊２ 本発明の第二のプローブ ○：検出できる ×：検出できない
【００２５】表３に示すように、本発明のプローブでは
第一および第二の２種のプローブを併用した場合、L. e
rythraを除く全てのレジオネラ細菌種を検出することが
できる。また本発明ではレジオネラとプローブとの反応
性を試験するにあたり、レジオネラ３５種(内L. pneumo
phila サブスピーシズ２種)を供した。その結果、表３
に示されたレジオネラ種に加えてさらに１１種のレジオ
ネラ種を検出することが可能（後記表４参照）であっ
た。これらの結果から、本発明のプローブによって、よ
り多くの種の種類のレジオネラを検出することができる
ことが示された。
第一および第二の２種のプローブを併用した場合、L. e
rythraを除く全てのレジオネラ細菌種を検出することが
できる。また本発明ではレジオネラとプローブとの反応
性を試験するにあたり、レジオネラ３５種(内L. pneumo
phila サブスピーシズ２種)を供した。その結果、表３
に示されたレジオネラ種に加えてさらに１１種のレジオ
ネラ種を検出することが可能（後記表４参照）であっ
た。これらの結果から、本発明のプローブによって、よ
り多くの種の種類のレジオネラを検出することができる
ことが示された。
【００２６】本発明の第一のプローブであるCA/GL253
は、表３の内１５種のレジオネラを検出することがで
き、検出できないレジオネラ種が６種ある。しかし表３
の種に加えて、少なくとも９種のレジオネラを検出する
ことができ（実施例および表４参照）、計２４種以上の
レジオネラ(サブスピーシズを除く)を検出することがで
きる。このように本発明の第一のプローブは、従来のプ
ローブに比べて、より多くの種の種類のレジオネラを検
出することができる。
は、表３の内１５種のレジオネラを検出することがで
き、検出できないレジオネラ種が６種ある。しかし表３
の種に加えて、少なくとも９種のレジオネラを検出する
ことができ（実施例および表４参照）、計２４種以上の
レジオネラ(サブスピーシズを除く)を検出することがで
きる。このように本発明の第一のプローブは、従来のプ
ローブに比べて、より多くの種の種類のレジオネラを検
出することができる。
【００２７】本発明の第二のプローブであるCA/GL301は
表３の内１０種のレジオネラを検出することができる。
さらに表３のレジオネラ種に加えて、少なくとも７種の
レジオネラ(サブスピーシズを除く)を検出することがで
きる（実施例および表４参照）。このように本発明の第
二のプローブは、従来のプローブに比べて、より多くの
種の種類のレジオネラを検出することができる。
表３の内１０種のレジオネラを検出することができる。
さらに表３のレジオネラ種に加えて、少なくとも７種の
レジオネラ(サブスピーシズを除く)を検出することがで
きる（実施例および表４参照）。このように本発明の第
二のプローブは、従来のプローブに比べて、より多くの
種の種類のレジオネラを検出することができる。
【００２８】本発明の検出方法は、前記標識オリゴヌク
レオチドプローブまたは試薬を、レジオネラ属に属する
細菌またはそのＤＮＡを含む検体に接触させてハイブリ
ダイゼーションを行った後、標識を指標にしてレジオネ
ラ属細菌を検出する方法である。ハイブリダイゼーショ
ンは従来と同様の方法により行うことができる。例え
ば、細菌を対象とする場合は、ナイロンフィルターなど
のフィルターに菌体をしみ込ませ、フィルター上で溶菌
操作を行った後、紫外線照射または８０℃以上の高温に
することにより、レジオネラ属細菌のＤＮＡをフィルタ
ー上に固定する。このフィルターをハイブリダイゼーシ
ョン溶液に通常１時間以上浸したのち、さらに標識オリ
ゴヌクレオチドを添加したハイブリダイゼーション溶液
に浸漬し、２〜２４時間反応させる。ハイブリダイゼー
ション時の温度は、十分な特異性および検出感度を示す
温度を選択するのが好ましく、通常プローブのＴｍ値マ
イナス５〜１０℃を目安にする。十分な特異性および検
出感度を示す温度は、予め実験により求めることができ
る。プローブと反応が終了したフィルターは緩衝液で洗
浄し、非特異的な結合をしているプローブを除去する。
洗浄は緩衝液を新しいものに交換して２〜３回行うのが
好ましい。洗浄時の温度は、十分な感度を保つ温度で行
うのが好ましく、通常ハイブリダイゼーションの温度よ
りも低く設定される。十分な感度を保つ温度は、予め実
験により求めることができる。
レオチドプローブまたは試薬を、レジオネラ属に属する
細菌またはそのＤＮＡを含む検体に接触させてハイブリ
ダイゼーションを行った後、標識を指標にしてレジオネ
ラ属細菌を検出する方法である。ハイブリダイゼーショ
ンは従来と同様の方法により行うことができる。例え
ば、細菌を対象とする場合は、ナイロンフィルターなど
のフィルターに菌体をしみ込ませ、フィルター上で溶菌
操作を行った後、紫外線照射または８０℃以上の高温に
することにより、レジオネラ属細菌のＤＮＡをフィルタ
ー上に固定する。このフィルターをハイブリダイゼーシ
ョン溶液に通常１時間以上浸したのち、さらに標識オリ
ゴヌクレオチドを添加したハイブリダイゼーション溶液
に浸漬し、２〜２４時間反応させる。ハイブリダイゼー
ション時の温度は、十分な特異性および検出感度を示す
温度を選択するのが好ましく、通常プローブのＴｍ値マ
イナス５〜１０℃を目安にする。十分な特異性および検
出感度を示す温度は、予め実験により求めることができ
る。プローブと反応が終了したフィルターは緩衝液で洗
浄し、非特異的な結合をしているプローブを除去する。
洗浄は緩衝液を新しいものに交換して２〜３回行うのが
好ましい。洗浄時の温度は、十分な感度を保つ温度で行
うのが好ましく、通常ハイブリダイゼーションの温度よ
りも低く設定される。十分な感度を保つ温度は、予め実
験により求めることができる。
【００２９】ハイブリダイゼーション後の検出は、標識
物質の種類に応じて公知の方法により行うことができ
る。例えば、放射性元素で標識した場合は公知の方法で
放射能を測定することにより検出できる。また酵素で標
識した場合は公知の方法で酵素活性を測定することによ
り検出できる。また螢光物質で標識した場合は公知の方
法により光量を測定することにより検出できる。また抗
原または抗体で標識した場合は、標識した抗原または抗
体と特異的に反応する抗体または抗原を用いて抗原抗体
反応させ、反応生成物を公知の方法により測定すること
により検出できる。
物質の種類に応じて公知の方法により行うことができ
る。例えば、放射性元素で標識した場合は公知の方法で
放射能を測定することにより検出できる。また酵素で標
識した場合は公知の方法で酵素活性を測定することによ
り検出できる。また螢光物質で標識した場合は公知の方
法により光量を測定することにより検出できる。また抗
原または抗体で標識した場合は、標識した抗原または抗
体と特異的に反応する抗体または抗原を用いて抗原抗体
反応させ、反応生成物を公知の方法により測定すること
により検出できる。
【００３０】このように本発明のプローブを用いること
により、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ属の
広範囲のレジオネラ種を特異的に検出することができ
る。このため、従来行っていたレジオネラコロニーの複
数の同定操作を省略することができ、検出を容易に行う
ことができる。すなわち、従来の培養方法では一つ一つ
のコロニーを釣菌して同定に供さなくてはならないが、
本発明のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行うことにより、例えば培地プレートに生育して
いるコロニーすべてについてレジオネラであるかどうか
一度に判別することができる。また、原理的に培養によ
る検出では、培養できないレジオネラは検出対象外であ
ったが、本発明の検出方法では培養できないレジオネラ
種も検出可能である。また、環境中の生物膜や生物組織
中でレジオネラがどのように分布しているかということ
を明らかすることも可能である。さらにプローブがゲノ
ムＤＮＡ断片混合物ではないので、同じ性能のプローブ
を容易に入手できる。
により、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ属の
広範囲のレジオネラ種を特異的に検出することができ
る。このため、従来行っていたレジオネラコロニーの複
数の同定操作を省略することができ、検出を容易に行う
ことができる。すなわち、従来の培養方法では一つ一つ
のコロニーを釣菌して同定に供さなくてはならないが、
本発明のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行うことにより、例えば培地プレートに生育して
いるコロニーすべてについてレジオネラであるかどうか
一度に判別することができる。また、原理的に培養によ
る検出では、培養できないレジオネラは検出対象外であ
ったが、本発明の検出方法では培養できないレジオネラ
種も検出可能である。また、環境中の生物膜や生物組織
中でレジオネラがどのように分布しているかということ
を明らかすることも可能である。さらにプローブがゲノ
ムＤＮＡ断片混合物ではないので、同じ性能のプローブ
を容易に入手できる。
【００３１】
実施例および比較例 １）オリゴヌクレオチドプローブの調製 本発明の第一のプローブおよび第二のプローブを、公知
の固相ホスホロアミダイド法により合成した。合成した
プローブは高速液体クロマトグラフィーにより精製し
た。精製後は凍結乾燥して保管した。その後の操作に
は、脱イオン水に溶解して用いた。
の固相ホスホロアミダイド法により合成した。合成した
プローブは高速液体クロマトグラフィーにより精製し
た。精製後は凍結乾燥して保管した。その後の操作に
は、脱イオン水に溶解して用いた。
【００３２】上記各プローブをDIG oligoprobe tailed
label kit(ベーリンガーマンハイム社製)を用いてジコ
キシゲニンによりラベルした。このジコキシゲニンでラ
ベルしたオリゴヌクレオチドプローブを0.3pmol/mlの濃
度になるように、ハイブリダイゼーション溶液〔0.75M
NaCl, 75mM sodium citrate, 1%(w/v) Blockingreagen
t, 0.1%(w/v)N-lauroylsarkosine, 0.02%(w/v) Sodium
dodesyl sulfate(以下SDS), 0.1mg/l Poly(a)〕に溶解
し、後述のハイブリダイゼーションで使用した。なお上
記ジコキシゲニンはハプテンの１種であり、抗原として
作用する化合物である。
label kit(ベーリンガーマンハイム社製)を用いてジコ
キシゲニンによりラベルした。このジコキシゲニンでラ
ベルしたオリゴヌクレオチドプローブを0.3pmol/mlの濃
度になるように、ハイブリダイゼーション溶液〔0.75M
NaCl, 75mM sodium citrate, 1%(w/v) Blockingreagen
t, 0.1%(w/v)N-lauroylsarkosine, 0.02%(w/v) Sodium
dodesyl sulfate(以下SDS), 0.1mg/l Poly(a)〕に溶解
し、後述のハイブリダイゼーションで使用した。なお上
記ジコキシゲニンはハプテンの１種であり、抗原として
作用する化合物である。
【００３３】２）検体の調製 報告されているレジオネラ属のうち、表３および表４に
示す３５種（うち二種はL. pneumophilaのサブスピーシ
ズ）を入手し、ＤＮＡ抽出後、ドットブロットを実施し
た。なお比較例としては、E. colacal(ATCC 2335)、E.
coli(ATCC 25922)、K. preunhial(ATCC 13883)、P. vul
garis(ATCC 13315)、P. aeruginosa(ATCC 27853)、S. t
yphimurium(ATCC 14028)、S. marcesseus(ATCC 8100)、
S. aureus(ATCC 12600)を用い、レジオネラと同様にＤ
ＮＡを抽出後、ドットブロットに供した。
示す３５種（うち二種はL. pneumophilaのサブスピーシ
ズ）を入手し、ＤＮＡ抽出後、ドットブロットを実施し
た。なお比較例としては、E. colacal(ATCC 2335)、E.
coli(ATCC 25922)、K. preunhial(ATCC 13883)、P. vul
garis(ATCC 13315)、P. aeruginosa(ATCC 27853)、S. t
yphimurium(ATCC 14028)、S. marcesseus(ATCC 8100)、
S. aureus(ATCC 12600)を用い、レジオネラと同様にＤ
ＮＡを抽出後、ドットブロットに供した。
【００３４】すなわち、レジオネラをBCYEα寒天培地
（Buffered charcoal-yeast extractagar supplemented
with α-ketoglutarate、組成；蒸留水1000ml当たり酵
母エキス10.0g、活性炭末1.5g、ＡＣＥＳバッファー10.
0g、寒天15.0g、Ｌ−システイン一塩酸塩0.4g、可溶性
ピロリン酸鉄0.25g、α−ケトグルタル酸一カリウム1.0
gを含有するｐＨ６．９±０．０５の培地）で培養した
後、プレート上から白金耳でかきとり使用した。ＤＮＡ
の抽出はCurrent Protocols in Molecular Biology. 2.
4.1. Preparation of Genomic DNA form Bacteriaに従
って実施した。
（Buffered charcoal-yeast extractagar supplemented
with α-ketoglutarate、組成；蒸留水1000ml当たり酵
母エキス10.0g、活性炭末1.5g、ＡＣＥＳバッファー10.
0g、寒天15.0g、Ｌ−システイン一塩酸塩0.4g、可溶性
ピロリン酸鉄0.25g、α−ケトグルタル酸一カリウム1.0
gを含有するｐＨ６．９±０．０５の培地）で培養した
後、プレート上から白金耳でかきとり使用した。ＤＮＡ
の抽出はCurrent Protocols in Molecular Biology. 2.
4.1. Preparation of Genomic DNA form Bacteriaに従
って実施した。
【００３５】抽出したＤＮＡのA260nmにおける吸収を測
定し、それぞれのＤＮＡを同一濃度になるよう調整した
後、ナイロンフィルターに100ngずつドットブロットし
た。風乾後、次に示す各液で湿らせた濾紙の上に、フィ
ルターを５分間ずつ順次置き、ＤＮＡを変性させた。
（１）0.5N NaOH,0.5M NaCl, （２）1.5M NaCl, 0.5M T
ris-HCl pH7.4, （３）0.3M NaCl, 30mM sodium citora
te pH7.0。その後、120℃で30分間加温してＤＮＡをフ
ィルターに固定し、下記のハイブリダイゼーションに使
用した。
定し、それぞれのＤＮＡを同一濃度になるよう調整した
後、ナイロンフィルターに100ngずつドットブロットし
た。風乾後、次に示す各液で湿らせた濾紙の上に、フィ
ルターを５分間ずつ順次置き、ＤＮＡを変性させた。
（１）0.5N NaOH,0.5M NaCl, （２）1.5M NaCl, 0.5M T
ris-HCl pH7.4, （３）0.3M NaCl, 30mM sodium citora
te pH7.0。その後、120℃で30分間加温してＤＮＡをフ
ィルターに固定し、下記のハイブリダイゼーションに使
用した。
【００３６】３）ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションはDIG oligoprobe tailed labe
l kitのStandard 5 xSSC procedureに基づき実施した。
以下に手順を示す。ＤＮＡを固定した前記フィルターを
プラスチックバッグの中に入れ、100cm2あたり20mlのハ
イブリダイゼーション溶液〔0.75M NaCl, 75mM sodium
citrate, 1%(w/v) Blockingreagent, 0.1%(w/v)N-lauro
ylsarkosine, 0.02%(w/v) Sodium dodesyl sulfate(以
下SDS), 0.1mg/l Poly(a)〕を入れ、気泡を除いてシー
ルした。ハイブリダイゼーションオーブンで緩やかに振
とうしながら68℃で１時間以上反応させた。プレハイブ
リダイゼーション液を捨て、前記１）で調製したオリゴ
ヌクレオチドプローブを0.3pmol/ml濃度で含むハイブリ
ダイゼーション液を100cm2あたり2.5mlになるようプラ
スチックバッグに入れた。気泡を除いてシール後、ハイ
ブリダイゼーションオーブンで緩やかに振とうしながら
50℃で２〜３時間反応させた。
l kitのStandard 5 xSSC procedureに基づき実施した。
以下に手順を示す。ＤＮＡを固定した前記フィルターを
プラスチックバッグの中に入れ、100cm2あたり20mlのハ
イブリダイゼーション溶液〔0.75M NaCl, 75mM sodium
citrate, 1%(w/v) Blockingreagent, 0.1%(w/v)N-lauro
ylsarkosine, 0.02%(w/v) Sodium dodesyl sulfate(以
下SDS), 0.1mg/l Poly(a)〕を入れ、気泡を除いてシー
ルした。ハイブリダイゼーションオーブンで緩やかに振
とうしながら68℃で１時間以上反応させた。プレハイブ
リダイゼーション液を捨て、前記１）で調製したオリゴ
ヌクレオチドプローブを0.3pmol/ml濃度で含むハイブリ
ダイゼーション液を100cm2あたり2.5mlになるようプラ
スチックバッグに入れた。気泡を除いてシール後、ハイ
ブリダイゼーションオーブンで緩やかに振とうしながら
50℃で２〜３時間反応させた。
【００３７】その後、フィルターをプラスチックバッグ
から取出し、0.3M NaCl, 30mM sodium citrate pH7.0,
0.1%SDS溶液をタッパーなどの容器に100cm2あたり50ml
入れ、フィルターを浸漬、振とうして洗浄し、結合の弱
いプローブを除去した。５分後液を入替え、さらに５分
間洗浄した。その後、15mM NaCl, 1.5 mM sodium citra
te pH7.0, 0.1%SDS溶液をタッパーなどの容器に100cm2
あたり50ml入れ、フィルターを浸漬、振とうして洗浄
し、結合の弱いプローブを除去した。1５分後液を入替
え、さらに1５分間洗浄した。
から取出し、0.3M NaCl, 30mM sodium citrate pH7.0,
0.1%SDS溶液をタッパーなどの容器に100cm2あたり50ml
入れ、フィルターを浸漬、振とうして洗浄し、結合の弱
いプローブを除去した。５分後液を入替え、さらに５分
間洗浄した。その後、15mM NaCl, 1.5 mM sodium citra
te pH7.0, 0.1%SDS溶液をタッパーなどの容器に100cm2
あたり50ml入れ、フィルターを浸漬、振とうして洗浄
し、結合の弱いプローブを除去した。1５分後液を入替
え、さらに1５分間洗浄した。
【００３８】フィルターを100mlあたり160mlの100mM Ma
leic acid, 150mM NaCl pH7.5溶液に入れた。次に、フ
ィルターを上記溶液に1% blockingreagentを加えた液に
浸し、緩やかに振とうしながら20分間反応させた。抗ジ
コキシゲニンアルカリフォスファターゼ結合抗体を上記
液量の1/10000量添加し、20分間緩やか振とうしながら
反応させた。フィルターを取出し、新しい容器に100mM
Maleic acid, 150mM NaCl pH7.5, 0.3% tween20を入
れ、フィルターを浸漬し、緩やかに振とうしながら10分
間洗浄した。新しい液に変え、繰返した。再度新しい液
に変え、繰返した。
leic acid, 150mM NaCl pH7.5溶液に入れた。次に、フ
ィルターを上記溶液に1% blockingreagentを加えた液に
浸し、緩やかに振とうしながら20分間反応させた。抗ジ
コキシゲニンアルカリフォスファターゼ結合抗体を上記
液量の1/10000量添加し、20分間緩やか振とうしながら
反応させた。フィルターを取出し、新しい容器に100mM
Maleic acid, 150mM NaCl pH7.5, 0.3% tween20を入
れ、フィルターを浸漬し、緩やかに振とうしながら10分
間洗浄した。新しい液に変え、繰返した。再度新しい液
に変え、繰返した。
【００３９】100mM Tris-HCl pH9.5, 100mM NaCl, 50mM
MgCl2溶液にフィルターを入れ、２分間以上放置した。
CDP-Star(ベーリンガーマンハイム社製)を上記溶液で1
／100に希釈し、フィルターを浸漬し５分間放置した。
フィルターの余分な液を切り、プラスチックバッグに入
れて37℃で10分間反応させた。その後Ｘ線フィルム(ECL
ハイパーフィルム、アマシャム社製)に30分間露光し、
現像した。プローブが反応した部分は黒いシグナルとな
って現れるので、生じたシグナルを目視により、４段階
に分けて反応性を判断した。その結果を表４に示す。
MgCl2溶液にフィルターを入れ、２分間以上放置した。
CDP-Star(ベーリンガーマンハイム社製)を上記溶液で1
／100に希釈し、フィルターを浸漬し５分間放置した。
フィルターの余分な液を切り、プラスチックバッグに入
れて37℃で10分間反応させた。その後Ｘ線フィルム(ECL
ハイパーフィルム、アマシャム社製)に30分間露光し、
現像した。プローブが反応した部分は黒いシグナルとな
って現れるので、生じたシグナルを目視により、４段階
に分けて反応性を判断した。その結果を表４に示す。
【００４０】
【表４】
【００４１】
【表５】
【００４２】
【表６】
【００４３】表４の注 Ｎｏ．１〜３６の菌が実施例、Ｎｏ．１０１〜１０８の
菌が比較例 評価基準 ＋＋：強いシグナルあり ＋：シグナルあり ±：わずかにシグナルが確認される −：反応確認されず ＊１ ＤＮＡが抽出できず、ハイブリダイゼーションは
実施せず
菌が比較例 評価基準 ＋＋：強いシグナルあり ＋：シグナルあり ±：わずかにシグナルが確認される −：反応確認されず ＊１ ＤＮＡが抽出できず、ハイブリダイゼーションは
実施せず
【００４４】表４の結果から、２種の混合プローブを用
いると、試験に供したレジオネラのうちL. erythraを除
く全てのレジオネラから強いシグナルが得られたことが
わかる。供したレジオネラ以外の菌の中では、K. preun
ohialに対して強いシグナルを生じたが、他からはほと
んどシグナルが得られなかった。このことから、本発明
のプローブはほとんどのレジオネラ種を検出することが
可能で、ほぼレジオネラ属特異性があることが確認され
た。
いると、試験に供したレジオネラのうちL. erythraを除
く全てのレジオネラから強いシグナルが得られたことが
わかる。供したレジオネラ以外の菌の中では、K. preun
ohialに対して強いシグナルを生じたが、他からはほと
んどシグナルが得られなかった。このことから、本発明
のプローブはほとんどのレジオネラ種を検出することが
可能で、ほぼレジオネラ属特異性があることが確認され
た。
【００４５】
【発明の効果】本発明のオリゴヌクレオチドプローブ
は、多数の種のレジオネラ属細菌の共通抗原をコードす
る遺伝子と特異的に相補的な塩基対を形成する。このた
め、短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異的に高
精度で検出するためのプローブとして好適に用いること
ができる。また塩基が短いので容易に調製することがで
きる。
は、多数の種のレジオネラ属細菌の共通抗原をコードす
る遺伝子と特異的に相補的な塩基対を形成する。このた
め、短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異的に高
精度で検出するためのプローブとして好適に用いること
ができる。また塩基が短いので容易に調製することがで
きる。
【００４６】本発明の標識オリゴヌクレオチドプローブ
は上記オリゴヌクレオチドプローブを標識物質で標識し
ているので、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ
属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異的
に高精度で検出することができる。
は上記オリゴヌクレオチドプローブを標識物質で標識し
ているので、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ
属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異的
に高精度で検出することができる。
【００４７】本発明の試薬は上記標識オリゴヌクレオチ
ドプローブを含んでいるので、ハイブリダイゼーション
によりレジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネ
ラ属細菌を特異的に高精度で検出することができる。
ドプローブを含んでいるので、ハイブリダイゼーション
によりレジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネ
ラ属細菌を特異的に高精度で検出することができる。
【００４８】本発明の検出方法は上記標識オリゴヌクレ
オチドプローブまたは試薬をレジオネラ属細菌またはそ
のＤＮＡと接触させてハイブリダイゼーションを行った
後、標識を指標にして検出するようにしているので、レ
ジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌
を特異的に高精度で検出することができる。
オチドプローブまたは試薬をレジオネラ属細菌またはそ
のＤＮＡと接触させてハイブリダイゼーションを行った
後、標識を指標にして検出するようにしているので、レ
ジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌
を特異的に高精度で検出することができる。
【００４９】
配列番号：1 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella pneumophila 配列 GGTGATGGTA CTACTACTGC 20
【００５０】配列番号：2 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella pneumophila 配列 GAAGGTCACA AAGCAGTTGC 20
【００５１】配列番号：3 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella pneumophila 配列 CTGGTGATGG TACTACTACT GCAACAGTAT TGGCTCGTTC TATTCTTGTT 50
【００５２】配列番号：4 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella micdadei 配列 CAGGTGATGG TACTACTACT GCTACGGTAT TGGCACGTGC CATTGTCGTT 50
【００５３】配列番号：5 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Escherichia coli 配列 CTGCAGGCGA CGGTACCACC ACTGCAACCG TACTGGCTCA GGCTATCATC 50
【００５４】配列番号：6 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Ps. aeruginosa 配列 CTGCCGGTGA CGGCACCACC ACCGCGACCG TCCTGGCCCA GGCCATCGTC 50
【００５５】配列番号：7 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella pneumophila 配列 GAAGGTCACA AAGCAGTTGC TGCTGGTATG AATCCAATGG ATCTCAAACG 50
【００５６】配列番号：8 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella micdadei 配列 GAAGGCCACA AAGCAGTTGC AGCAGGCATG AACCCAATGG ATTTGAAACG 50
【００５７】配列番号：9 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Escherichia coli 配列 ACTGAAGGTC TGAAAGCTGT TGCTGCGGGC ATGAACCCGA TGGACCTGAA 50
【００５８】配列番号：10 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Ps. aeruginosa 配列 AACGAAGGCC TGAAGGCCGT TGCCGCCGGC ATGAACCCGA TGGACCTGAA 50
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年２月４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】また特公平5-78319号には、核酸プローブ
を用いて生物を検出、同定または定量する方法が記載さ
れており、その実施例には２３種のレジオネラ種、具体
的にはL. pnueumophila(PHA1), L. micdadei(HEBA), L.
bozemanii(WIGA), L. dumoffi(TEX-KL), L. garmanii
(LS-13), L. jordanis(BL540), L. longbeachae, L. MS
H9, L. oakridgenis(オークリツシ゛10), L. lansing2, L. SC-
32C-C8, L. WA-316, L.WO-44-3C(L. feeleii), L. phoe
nix 1, L. WA-270A, L. PF-209C-C2, L. SC 65C3(ORW),
L. jamestown 26G1-E2, L. MSH-4, L. lansing 3, L.
SC18-C9, L. SC63-C7, L-81-716(L. wadsworthii)を特
異的に検出することができる例証的プローブが記載され
ている。しかし、この核酸プローブも混合物であり、前
記と同様の問題点がある。またプローブの塩基の長さや
配列が明らかではなく、ｒＲＮＡのどの部分を認識して
いるのか不明確であり、検出精度に問題がある。
を用いて生物を検出、同定または定量する方法が記載さ
れており、その実施例には２３種のレジオネラ種、具体
的にはL. pnueumophila(PHA1), L. micdadei(HEBA), L.
bozemanii(WIGA), L. dumoffi(TEX-KL), L. garmanii
(LS-13), L. jordanis(BL540), L. longbeachae, L. MS
H9, L. oakridgenis(オークリツシ゛10), L. lansing2, L. SC-
32C-C8, L. WA-316, L.WO-44-3C(L. feeleii), L. phoe
nix 1, L. WA-270A, L. PF-209C-C2, L. SC 65C3(ORW),
L. jamestown 26G1-E2, L. MSH-4, L. lansing 3, L.
SC18-C9, L. SC63-C7, L-81-716(L. wadsworthii)を特
異的に検出することができる例証的プローブが記載され
ている。しかし、この核酸プローブも混合物であり、前
記と同様の問題点がある。またプローブの塩基の長さや
配列が明らかではなく、ｒＲＮＡのどの部分を認識して
いるのか不明確であり、検出精度に問題がある。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】
【表１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】本発明の第一および第二のプローブは、前
記のように塩基配列が明らかで、塩基配列の長さも２０
塩基程度であるため、ヌクレオチドまたはデオキシヌク
レオチドから化学合成により容易に合成することができ
る。このため、同一のプローブを何度でも容易に得るこ
とができ、ロットにより特異性が異なるということはな
い。また本発明の第一および第二のプローブは塩基数が
比較的短いことから、in situハイブリダイゼーション
に用いることもできる。これらの点から、検出試薬とし
て優れている。
記のように塩基配列が明らかで、塩基配列の長さも２０
塩基程度であるため、ヌクレオチドまたはデオキシヌク
レオチドから化学合成により容易に合成することができ
る。このため、同一のプローブを何度でも容易に得るこ
とができ、ロットにより特異性が異なるということはな
い。また本発明の第一および第二のプローブは塩基数が
比較的短いことから、in situハイブリダイゼーション
に用いることもできる。これらの点から、検出試薬とし
て優れている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】
【表３】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】２）検体の調製 報告されているレジオネラ属のうち、表３および表４に
示す３５種（うち二種はL. pneumophilaのサブスピーシ
ズ）を入手し、ＤＮＡ抽出後、ドットブロットを実施し
た。なお比較例としては、Enterobacter cloacae(ATCC
23355)、Escherichia coli(ATCC 25922)、Klebsiella p
neumoniae(ATCC 13883)、Proteus vulgaris(ATCC 1331
5)、Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853)、Salmonella
typhimurium(ATCC 14028)、Serratia marcescens(ATCC
8100)、Staphylococcus aureus(ATCC 12600)を用い、
レジオネラと同様にＤＮＡを抽出後、ドットブロットに
供した。
示す３５種（うち二種はL. pneumophilaのサブスピーシ
ズ）を入手し、ＤＮＡ抽出後、ドットブロットを実施し
た。なお比較例としては、Enterobacter cloacae(ATCC
23355)、Escherichia coli(ATCC 25922)、Klebsiella p
neumoniae(ATCC 13883)、Proteus vulgaris(ATCC 1331
5)、Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853)、Salmonella
typhimurium(ATCC 14028)、Serratia marcescens(ATCC
8100)、Staphylococcus aureus(ATCC 12600)を用い、
レジオネラと同様にＤＮＡを抽出後、ドットブロットに
供した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】フィルターを100mlあたり160mlの100mM Ma
leic acid, 150mM NaCl pH7.5溶液に入れた。次に、フ
ィルターを上記溶液に1% blockingreagentを加えた液に
浸し、緩やかに振とうしながら20分間反応させた。抗ジ
コキシゲニンアルカリフォスファターゼ結合抗体を上記
液量の1/10000量添加し、20分間緩やかに振とうしなが
ら反応させた。フィルターを取出し、新しい容器に100m
M Maleic acid, 150mMNaCl pH7.5, 0.3% tween20を入
れ、フィルターを浸漬し、緩やかに振とうしながら10分
間洗浄した。新しい液に変え、繰返した。再度新しい液
に変え、繰返した。
leic acid, 150mM NaCl pH7.5溶液に入れた。次に、フ
ィルターを上記溶液に1% blockingreagentを加えた液に
浸し、緩やかに振とうしながら20分間反応させた。抗ジ
コキシゲニンアルカリフォスファターゼ結合抗体を上記
液量の1/10000量添加し、20分間緩やかに振とうしなが
ら反応させた。フィルターを取出し、新しい容器に100m
M Maleic acid, 150mMNaCl pH7.5, 0.3% tween20を入
れ、フィルターを浸漬し、緩やかに振とうしながら10分
間洗浄した。新しい液に変え、繰返した。再度新しい液
に変え、繰返した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】
【表６】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】表４の結果から、２種の混合プローブを用
いると、試験に供したレジオネラのうちL. erythraを除
く全てのレジオネラから強いシグナルが得られたことが
わかる。供したレジオネラ以外の菌の中では、K. pneum
oniaeに対して強いシグナルを生じたが、他からはほと
んどシグナルが得られなかった。このことから、本発明
のプローブはほとんどのレジオネラ種を検出することが
可能で、ほぼレジオネラ属特異性があることが確認され
た。
いると、試験に供したレジオネラのうちL. erythraを除
く全てのレジオネラから強いシグナルが得られたことが
わかる。供したレジオネラ以外の菌の中では、K. pneum
oniaeに対して強いシグナルを生じたが、他からはほと
んどシグナルが得られなかった。このことから、本発明
のプローブはほとんどのレジオネラ種を検出することが
可能で、ほぼレジオネラ属特異性があることが確認され
た。
Claims (4)
- 【請求項１】 レジオネラ（Legionella）属に属する細
菌の共通抗原をコードする遺伝子の一部の配列を持ち、
デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから
なるプローブであって、塩基配列 5'GGT GAT GGT ACT ACT ACT GC3'または 5'GAA GGT CAC AAA GCA GTT GC3' を有することを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検
出用オリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項２】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドプロ
ーブを放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質で標
識してなることを特徴とするレジオネラ属に属する細菌
検出用標識オリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項３】 請求項２記載の標識オリゴヌクレオチド
プローブを含むことを特徴とするレジオネラ属に属する
細菌検出用試薬。 - 【請求項４】 レジオネラ属に属する細菌またはそのＤ
ＮＡを含む検体に請求項２記載の標識オリゴヌクレオチ
ドプローブまたは請求項３記載の試薬を接触させてハイ
ブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出
することを特徴とするレジオネラ属に属する細菌の検出
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8340089A JPH10179196A (ja) | 1996-12-19 | 1996-12-19 | レジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブおよびレジオネラ属に属する細菌の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8340089A JPH10179196A (ja) | 1996-12-19 | 1996-12-19 | レジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブおよびレジオネラ属に属する細菌の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10179196A true JPH10179196A (ja) | 1998-07-07 |
Family
ID=18333616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8340089A Pending JPH10179196A (ja) | 1996-12-19 | 1996-12-19 | レジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブおよびレジオネラ属に属する細菌の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10179196A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011062088A (ja) * | 2009-09-15 | 2011-03-31 | Ihi Corp | レジオネラ菌検出方法 |
-
1996
- 1996-12-19 JP JP8340089A patent/JPH10179196A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011062088A (ja) * | 2009-09-15 | 2011-03-31 | Ihi Corp | レジオネラ菌検出方法 |
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Legal Events
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