JPH10179197A - 隣接してアニーリングしたプローブの三重らせん形成を用いる核酸の同定方法 - Google Patents
隣接してアニーリングしたプローブの三重らせん形成を用いる核酸の同定方法Info
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- JPH10179197A JPH10179197A JP9349704A JP34970497A JPH10179197A JP H10179197 A JPH10179197 A JP H10179197A JP 9349704 A JP9349704 A JP 9349704A JP 34970497 A JP34970497 A JP 34970497A JP H10179197 A JPH10179197 A JP H10179197A
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、小さい配列の特性である優れ
たミスマッチの識別性と、より長いヌクレオ塩基配列の
統計的特異性とを結び付けることによって、この問題を
回避する方法を提供することにある。 【解決手段】（ａ）配列Ａ１に相補的な配列Ｂ１および
三重らせん構造に関与可能な配列Ｂ２を有する第１核酸
類似体Ｂ、および三重らせん構造に関与可能な配列Ｃ１
および配列Ａ２に相補的な配列Ｃ２を有する第２核酸類
似体Ｃと核酸Ａを接触させる工程、および（ｂ）核酸
Ａ、核酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃを含む複合体の形
成を測定する工程を含む、隣接して結合した配列Ａ１お
よび配列Ａ２を有する核酸Ａの同定方法、ならびに該同
定方法に用いる組成物および試薬キット。
たミスマッチの識別性と、より長いヌクレオ塩基配列の
統計的特異性とを結び付けることによって、この問題を
回避する方法を提供することにある。 【解決手段】（ａ）配列Ａ１に相補的な配列Ｂ１および
三重らせん構造に関与可能な配列Ｂ２を有する第１核酸
類似体Ｂ、および三重らせん構造に関与可能な配列Ｃ１
および配列Ａ２に相補的な配列Ｃ２を有する第２核酸類
似体Ｃと核酸Ａを接触させる工程、および（ｂ）核酸
Ａ、核酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃを含む複合体の形
成を測定する工程を含む、隣接して結合した配列Ａ１お
よび配列Ａ２を有する核酸Ａの同定方法、ならびに該同
定方法に用いる組成物および試薬キット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、三重らせん構造の
形成に関与可能な少なくとも２つの隣接してアニーリン
グしたプローブを用いた核酸の同定方法、ならびに該核
酸および該プローブを含む組成物、ならびに該核酸およ
び該プローブの他にも第３プローブを含む組成物に関す
る。
形成に関与可能な少なくとも２つの隣接してアニーリン
グしたプローブを用いた核酸の同定方法、ならびに該核
酸および該プローブを含む組成物、ならびに該核酸およ
び該プローブの他にも第３プローブを含む組成物に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】核酸分子の検出および定量は、いくつか
の診断技術において基礎的な要素を構成する。かかる技
術の本質的な面は、プローブ（核酸または核酸類似体）
の相補的な核酸配列に特異的にハイブリダイズする能力
である。ハイブリダイゼーションを起こすためにいくつ
かの標準的な条件は、塩濃度、温度等の点を合わせなけ
ればならないが、主要な決定因子は、２つのハイブリダ
イズする鎖のハイブリッドにおける完全にマッチしたヌ
クレオ塩基の数である。比較的短い長さ、例えば６〜１
０塩基対のハイブリッドでは、１つの塩基対のミスマッ
チが温度安定性の劇的な減少を生じ、１つの塩基対のミ
スマッチ（または欠失／挿入）により起きる安定性の相
対的な低下は、ハイブリッドの長さを増加させるにつれ
て徐々に小さくなる。
の診断技術において基礎的な要素を構成する。かかる技
術の本質的な面は、プローブ（核酸または核酸類似体）
の相補的な核酸配列に特異的にハイブリダイズする能力
である。ハイブリダイゼーションを起こすためにいくつ
かの標準的な条件は、塩濃度、温度等の点を合わせなけ
ればならないが、主要な決定因子は、２つのハイブリダ
イズする鎖のハイブリッドにおける完全にマッチしたヌ
クレオ塩基の数である。比較的短い長さ、例えば６〜１
０塩基対のハイブリッドでは、１つの塩基対のミスマッ
チが温度安定性の劇的な減少を生じ、１つの塩基対のミ
スマッチ（または欠失／挿入）により起きる安定性の相
対的な低下は、ハイブリッドの長さを増加させるにつれ
て徐々に小さくなる。
【０００３】診断目的で、問題の遺伝子内または生物内
にしか存在せず、試料中に存在するかもしれないいかな
るバックグラウンド核酸には存在しないヌクレオ塩基の
配列を同定することが、しばしば望ましい。ヒトゲノム
のような典型的な試料中で統計的にユニークであるヌク
レオ塩基のいかなる配列について、配列の長さは、１８
〜２０塩基の範囲でなければならず、これは、一方、い
かなる主要な温度安定性の損失もなく、ミスマッチを適
応させる能力を促進するであろう。このように、より小
さなプローブは統計的にユニークでないという短所を有
し、一方、より長いプローブは、ハイブリッド全体の安
定性が有意には影響を受けないため、ミスマッチを識別
できないという短所を有する。
にしか存在せず、試料中に存在するかもしれないいかな
るバックグラウンド核酸には存在しないヌクレオ塩基の
配列を同定することが、しばしば望ましい。ヒトゲノム
のような典型的な試料中で統計的にユニークであるヌク
レオ塩基のいかなる配列について、配列の長さは、１８
〜２０塩基の範囲でなければならず、これは、一方、い
かなる主要な温度安定性の損失もなく、ミスマッチを適
応させる能力を促進するであろう。このように、より小
さなプローブは統計的にユニークでないという短所を有
し、一方、より長いプローブは、ハイブリッド全体の安
定性が有意には影響を受けないため、ミスマッチを識別
できないという短所を有する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、小さ
い配列の特性である優れたミスマッチの識別性と、より
長いヌクレオ塩基配列の統計的特異性とを結び付けるこ
とによって、この問題を回避する方法を提供することに
ある。
い配列の特性である優れたミスマッチの識別性と、より
長いヌクレオ塩基配列の統計的特異性とを結び付けるこ
とによって、この問題を回避する方法を提供することに
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、同定対象の核
酸に隣接して位置する比較的短い標的配列にハイブリダ
イズする２つの異なる核酸類似体を用いる。２つのプロ
ーブのそれぞれは、標的核酸に結合する配列に加えて、
相補的な核酸または核酸類似体と共に三重らせん構造を
形成可能な第２ヌクレオ塩基を含む。三重らせん形成
は、２つのプローブが正確に結合した時、つまり互いに
隣接しているときに非常に促進され、形成された複合体
は、同定対象の核酸上の結合した標的部位の存在の間接
的証拠となる。
酸に隣接して位置する比較的短い標的配列にハイブリダ
イズする２つの異なる核酸類似体を用いる。２つのプロ
ーブのそれぞれは、標的核酸に結合する配列に加えて、
相補的な核酸または核酸類似体と共に三重らせん構造を
形成可能な第２ヌクレオ塩基を含む。三重らせん形成
は、２つのプローブが正確に結合した時、つまり互いに
隣接しているときに非常に促進され、形成された複合体
は、同定対象の核酸上の結合した標的部位の存在の間接
的証拠となる。
【０００６】本発明の主旨は、配列Ａ１に相補的な配列
Ｂ１および三重らせん構造に関与可能な配列Ｂ２を有す
る第１核酸類似体Ｂ、三重らせん構造に関与可能な配列
Ｃ１（および好ましくは配列Ａ２に相補的な配列Ｃ２）
を有する第２核酸類似体Ｃ、およびさらに好ましくはさ
らに他の（配列Ｂ２および配列Ｃ１と共に三重らせん形
成可能な配列Ｄ１、およびハイブリダイゼーションに有
用なさらなるヌクレオ塩基配列または当該分野において
公知のいかなる種類の標識を含むセグメントＤ２を有す
る）核酸または核酸類似体Ｄと核酸Ａを接触させる工
程、ならびに核酸Ａ、核酸類似体Ｂ、核酸類似体Ｃおよ
び好ましくは核酸または核酸類似体Ｄを含む複合体の形
成を測定する工程を含む、隣接して結合した配列Ａ１お
よび配列Ａ２を有する核酸Ａの同定方法に関する。本発
明のさらなる要旨は、この複合体形成における中間産物
または可能な形成前プローブ化合物、および本発明の方
法において使用される試薬キットである。
Ｂ１および三重らせん構造に関与可能な配列Ｂ２を有す
る第１核酸類似体Ｂ、三重らせん構造に関与可能な配列
Ｃ１（および好ましくは配列Ａ２に相補的な配列Ｃ２）
を有する第２核酸類似体Ｃ、およびさらに好ましくはさ
らに他の（配列Ｂ２および配列Ｃ１と共に三重らせん形
成可能な配列Ｄ１、およびハイブリダイゼーションに有
用なさらなるヌクレオ塩基配列または当該分野において
公知のいかなる種類の標識を含むセグメントＤ２を有す
る）核酸または核酸類似体Ｄと核酸Ａを接触させる工
程、ならびに核酸Ａ、核酸類似体Ｂ、核酸類似体Ｃおよ
び好ましくは核酸または核酸類似体Ｄを含む複合体の形
成を測定する工程を含む、隣接して結合した配列Ａ１お
よび配列Ａ２を有する核酸Ａの同定方法に関する。本発
明のさらなる要旨は、この複合体形成における中間産物
または可能な形成前プローブ化合物、および本発明の方
法において使用される試薬キットである。
【０００７】すなわち、本発明の要旨は、 （１） （ａ）配列Ａ１に相補的な配列Ｂ１および三重
らせん構造に関与可能な配列Ｂ２を有する第１核酸類似
体Ｂ、ならびに三重らせん構造に関与可能な配列Ｃ１お
よび配列Ａ２に相補的な配列Ｃ２を有する第２核酸類似
体Ｃと核酸Ａを接触させる工程、ならびに（ｂ）核酸
Ａ、核酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃを含む複合体の形
成を測定する工程を含む、隣接して結合した配列Ａ１お
よび配列Ａ２を有する核酸Ａの同定方法、 （２） さらに、第１核酸類似体および第２核酸類似体
の配列Ｂ２および配列Ｃ１も含む三重らせん構造に関与
可能な配列Ｄ１を含む核酸または核酸類似体Ｄの使用、
ならびに核酸Ａ、核酸類似体Ｂ、核酸類似体Ｃおよび核
酸または核酸類似体Ｄを含む該複合体の形成を測定する
工程からなる、前記（１）記載の同定方法、 （３） 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ２が検
出できるように標識され、該複合体中の該標識を検出す
ることにより該複合体の形成が測定される、前記（２）
記載の同定方法、 （４） 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ２が検
出できるように標識され、該核酸Ａが固定できるように
標識され、固定された検出可能標識を検出することによ
り該複合体が測定される、前記（２）記載の同定方法、 （５） 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ２が固
定できるように標識され、該核酸Ａが検出できるように
標識され、固定された検出可能標識を検出することによ
り該複合体が測定される、前記（２）記載の同定方法、 （６） 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ２が検
出できるように標識され、該核酸類似体Ｂまたは該核酸
類似体Ｃの１つが固定できるように標識され、固定され
た検出可能標識を検出することにより該複合体が測定さ
れる、前記（２）記載の同定方法、 （７） 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ２が固
定できるように標識され、該核酸類似体Ｂまたは該核酸
類似体Ｃの１つが検出できるように標識され、固定され
た検出可能標識を検出することにより該複合体が測定さ
れる、前記（２）記載の同定方法、 （８） 該核酸類似体Ｂまたは該核酸類似体Ｃの１つが
固定できるように標識され、他の核酸類似体（該核酸類
似体Ｂまたは該核酸類似体Ｃ）が検出できるように標識
され、固定された検出可能標識を検出することにより該
複合体が測定される、前記（２）記載の同定方法、 （９） ａ）隣接して結合した配列Ａ１および配列Ａ２
を有する核酸Ａ、 ｂ）配列Ａ１に相補的な配列Ｂ１および相補的な核酸ま
たは核酸類似体を含む三重らせん構造に関与可能な配列
Ｂ２を有する第１核酸類似体Ｂ、ならびに ｃ）三重らせん構造に関与可能な配列Ｃ１および配列Ａ
２に相補的な配列Ｃ２を有する第２核酸類似体Ｃ、を含
んでなる組成物、 （１０） さらに、 ｄ）第１核酸類似体の配列Ｂ２および第２核酸類似体の
配列Ｃ１を含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｄ１を
含む、核酸または核酸類似体Ｄ、または ｅ）第１核酸類似体の配列Ｂ２および第２核酸類似体の
配列Ｃ１を含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｄ１、
ならびに塩基対形成により１以上の第２プローブを結合
可能な配列Ｄ２を含む核酸または核酸類似体Ｄ、を含有
してなる請求項９記載の組成物、 （１１） ａ）配列Ｄ１を有する核酸または核酸類似体
Ｄ、 ｂ）配列Ｂ１、および配列Ｄ１を含む三重らせん構造に
関与可能な配列Ｂ２を有する第１核酸類似体Ｂ、ならび
に ｃ）配列Ｄ１を含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｃ
１を有する第２核酸類似体Ｃ、を含んでなる組成物、 （１２） 請求項９〜１１いずれか記載の組成物の成分
Ｂ、成分Ｃおよび成分Ｄを、１以上の容器に含んでなる
核酸Ａの測定用試薬キットに関する。
らせん構造に関与可能な配列Ｂ２を有する第１核酸類似
体Ｂ、ならびに三重らせん構造に関与可能な配列Ｃ１お
よび配列Ａ２に相補的な配列Ｃ２を有する第２核酸類似
体Ｃと核酸Ａを接触させる工程、ならびに（ｂ）核酸
Ａ、核酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃを含む複合体の形
成を測定する工程を含む、隣接して結合した配列Ａ１お
よび配列Ａ２を有する核酸Ａの同定方法、 （２） さらに、第１核酸類似体および第２核酸類似体
の配列Ｂ２および配列Ｃ１も含む三重らせん構造に関与
可能な配列Ｄ１を含む核酸または核酸類似体Ｄの使用、
ならびに核酸Ａ、核酸類似体Ｂ、核酸類似体Ｃおよび核
酸または核酸類似体Ｄを含む該複合体の形成を測定する
工程からなる、前記（１）記載の同定方法、 （３） 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ２が検
出できるように標識され、該複合体中の該標識を検出す
ることにより該複合体の形成が測定される、前記（２）
記載の同定方法、 （４） 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ２が検
出できるように標識され、該核酸Ａが固定できるように
標識され、固定された検出可能標識を検出することによ
り該複合体が測定される、前記（２）記載の同定方法、 （５） 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ２が固
定できるように標識され、該核酸Ａが検出できるように
標識され、固定された検出可能標識を検出することによ
り該複合体が測定される、前記（２）記載の同定方法、 （６） 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ２が検
出できるように標識され、該核酸類似体Ｂまたは該核酸
類似体Ｃの１つが固定できるように標識され、固定され
た検出可能標識を検出することにより該複合体が測定さ
れる、前記（２）記載の同定方法、 （７） 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ２が固
定できるように標識され、該核酸類似体Ｂまたは該核酸
類似体Ｃの１つが検出できるように標識され、固定され
た検出可能標識を検出することにより該複合体が測定さ
れる、前記（２）記載の同定方法、 （８） 該核酸類似体Ｂまたは該核酸類似体Ｃの１つが
固定できるように標識され、他の核酸類似体（該核酸類
似体Ｂまたは該核酸類似体Ｃ）が検出できるように標識
され、固定された検出可能標識を検出することにより該
複合体が測定される、前記（２）記載の同定方法、 （９） ａ）隣接して結合した配列Ａ１および配列Ａ２
を有する核酸Ａ、 ｂ）配列Ａ１に相補的な配列Ｂ１および相補的な核酸ま
たは核酸類似体を含む三重らせん構造に関与可能な配列
Ｂ２を有する第１核酸類似体Ｂ、ならびに ｃ）三重らせん構造に関与可能な配列Ｃ１および配列Ａ
２に相補的な配列Ｃ２を有する第２核酸類似体Ｃ、を含
んでなる組成物、 （１０） さらに、 ｄ）第１核酸類似体の配列Ｂ２および第２核酸類似体の
配列Ｃ１を含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｄ１を
含む、核酸または核酸類似体Ｄ、または ｅ）第１核酸類似体の配列Ｂ２および第２核酸類似体の
配列Ｃ１を含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｄ１、
ならびに塩基対形成により１以上の第２プローブを結合
可能な配列Ｄ２を含む核酸または核酸類似体Ｄ、を含有
してなる請求項９記載の組成物、 （１１） ａ）配列Ｄ１を有する核酸または核酸類似体
Ｄ、 ｂ）配列Ｂ１、および配列Ｄ１を含む三重らせん構造に
関与可能な配列Ｂ２を有する第１核酸類似体Ｂ、ならび
に ｃ）配列Ｄ１を含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｃ
１を有する第２核酸類似体Ｃ、を含んでなる組成物、 （１２） 請求項９〜１１いずれか記載の組成物の成分
Ｂ、成分Ｃおよび成分Ｄを、１以上の容器に含んでなる
核酸Ａの測定用試薬キットに関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明において形成された複合体
の成分のそれぞれの少なくとも１つのセグメントは、ヌ
クレオ塩基配列により同定され、該ヌクレオ塩基を有し
ている。配列は、特異的であってもよく、非特異的であ
ってもよく、本発明の方法のセグメントまたは成分の使
用により測定される。ヌクレオ塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ
およびＵのような天然ヌクレオ塩基であってもよく、７
−デアザ−Ｇのような非天然塩基あってもよく、または
それらの混合物であってもよい。
の成分のそれぞれの少なくとも１つのセグメントは、ヌ
クレオ塩基配列により同定され、該ヌクレオ塩基を有し
ている。配列は、特異的であってもよく、非特異的であ
ってもよく、本発明の方法のセグメントまたは成分の使
用により測定される。ヌクレオ塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ
およびＵのような天然ヌクレオ塩基であってもよく、７
−デアザ−Ｇのような非天然塩基あってもよく、または
それらの混合物であってもよい。
【０００９】「核酸類似体」という用語は、分子が起源
および非天然構造の骨格を含むことを意味する。非天然
骨格に加えて、核酸類似体の一部は、さらに天然核酸骨
格、つまり糖リン酸部分からなる骨格を含んでもよい。
核酸類似体が天然核酸中に存在するような糖リン酸部分
を含まない骨格を含むことが好ましい場合である。
および非天然構造の骨格を含むことを意味する。非天然
骨格に加えて、核酸類似体の一部は、さらに天然核酸骨
格、つまり糖リン酸部分からなる骨格を含んでもよい。
核酸類似体が天然核酸中に存在するような糖リン酸部分
を含まない骨格を含むことが好ましい場合である。
【００１０】核酸Ａは、それぞれ、少なくとも５塩基の
長さであるヌクレオ塩基の２つの配列を含むいかなる分
子であってもよい。ヌクレオ塩基は、分子Ａに含まれる
塩基の配列に相補的な塩基配列を含む核酸または核酸類
似体と塩基対形成することによって、分子が結合するこ
とができるような直線的な方法で、骨格に共有結合して
いることが好ましい。分子Ａの例としては、ＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ等の核酸、またはその派生物、および核酸類似体が
ある。さらに、分子Ａは、例えば、いかなる種類の標識
等の追加の分子部分を含んでいてもよい。
長さであるヌクレオ塩基の２つの配列を含むいかなる分
子であってもよい。ヌクレオ塩基は、分子Ａに含まれる
塩基の配列に相補的な塩基配列を含む核酸または核酸類
似体と塩基対形成することによって、分子が結合するこ
とができるような直線的な方法で、骨格に共有結合して
いることが好ましい。分子Ａの例としては、ＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ等の核酸、またはその派生物、および核酸類似体が
ある。さらに、分子Ａは、例えば、いかなる種類の標識
等の追加の分子部分を含んでいてもよい。
【００１１】核酸Ａの本質的な面は、隣接して結合した
配列Ａ１および配列Ａ２を有していることである。通
常、配列Ａ１は、測定対象の核酸Ａの必須部分であり、
それゆえ変更できない。本発明によれば、配列Ａ１は変
更することができないので、核酸類似体Ｂの配列Ｂ１
（後述）は配列Ａ１に相補的であるように選択され、こ
のように、配列Ａ１は核酸類似体Ｂの配列Ｂ１との特異
的関係により定義される。配列Ａ２は、同様に核酸類似
体Ｃの配列Ｃ２との関係により定義される。通常、配列
Ａ２は変更することができないので、配列Ｃ２は配列Ａ
２に相補的であるように選択される。本発明によると、
核酸の同定のためには、配列Ａ１および配列Ａ２は、明
白な同定に必要とされる特異性を有するように選択され
る。配列Ａ１および配列Ａ２は、核酸Ａの同じ鎖上に位
置する。特異性は、測定の環境に依存するであろう。非
常に特異的な核酸Ａを、他の核酸を含まないが、蛋白質
等の他の生物学的成分を含む試料で測定する必要がある
ならば、適当な配列Ａ１および配列Ａ２の広範囲の調査
は必要でない。しかしながら、試料中にさらに異なる核
酸種が存在するならば、配列Ａ１および配列Ａ２は、核
酸Ａ以外のいかなる核酸上で互いに隣接して見られない
ように選択されるべきである。最も好ましくは、配列Ａ
１および配列Ａ２のいずれも核酸Ａ以外のいかなる核酸
上にも発生すべきではない。好ましい態様において、核
酸Ａ上の配列Ａ１および配列Ａ２間の鎖上に０〜５ヌク
レオ塩基が存在する。最も好ましくは、配列Ａ１および
配列Ａ２間にヌクレオ塩基がないか１つしか存在しな
い。配列Ａ１および配列Ａ２は、同じ長さを有していて
もよいし、長さが異なっていてもよく、好ましくは、互
いに６〜１５塩基長である。
配列Ａ１および配列Ａ２を有していることである。通
常、配列Ａ１は、測定対象の核酸Ａの必須部分であり、
それゆえ変更できない。本発明によれば、配列Ａ１は変
更することができないので、核酸類似体Ｂの配列Ｂ１
（後述）は配列Ａ１に相補的であるように選択され、こ
のように、配列Ａ１は核酸類似体Ｂの配列Ｂ１との特異
的関係により定義される。配列Ａ２は、同様に核酸類似
体Ｃの配列Ｃ２との関係により定義される。通常、配列
Ａ２は変更することができないので、配列Ｃ２は配列Ａ
２に相補的であるように選択される。本発明によると、
核酸の同定のためには、配列Ａ１および配列Ａ２は、明
白な同定に必要とされる特異性を有するように選択され
る。配列Ａ１および配列Ａ２は、核酸Ａの同じ鎖上に位
置する。特異性は、測定の環境に依存するであろう。非
常に特異的な核酸Ａを、他の核酸を含まないが、蛋白質
等の他の生物学的成分を含む試料で測定する必要がある
ならば、適当な配列Ａ１および配列Ａ２の広範囲の調査
は必要でない。しかしながら、試料中にさらに異なる核
酸種が存在するならば、配列Ａ１および配列Ａ２は、核
酸Ａ以外のいかなる核酸上で互いに隣接して見られない
ように選択されるべきである。最も好ましくは、配列Ａ
１および配列Ａ２のいずれも核酸Ａ以外のいかなる核酸
上にも発生すべきではない。好ましい態様において、核
酸Ａ上の配列Ａ１および配列Ａ２間の鎖上に０〜５ヌク
レオ塩基が存在する。最も好ましくは、配列Ａ１および
配列Ａ２間にヌクレオ塩基がないか１つしか存在しな
い。配列Ａ１および配列Ａ２は、同じ長さを有していて
もよいし、長さが異なっていてもよく、好ましくは、互
いに６〜１５塩基長である。
【００１２】核酸Ａ（分析対象核酸ともいう）の起源お
よび機能は、測定の目的により定義される。それは、ウ
イルスまたは細菌等の特定の感染因子の核酸であっても
よく、例えば癌または遺伝性遺伝子病等の疾患の傾向を
測定する等の配列が確認対象である、ゲノムの一部であ
ってもよい。核酸は、精製、単離または増幅等の前の調
製工程の対象物であったものでもよい。好ましくは、核
酸は細胞破片から分離されたものであり、核酸の特異的
または非特異的部分は、例えば、培養またはポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されたものであっても
よい。それは、この分子の存在および／または量は、測
定および分析される予定の試料から発生した分子であっ
てもよく、それはそれ自身その他の分析対象物の測定に
用いられる予定のプローブまたはプローブユニットであ
ってもよい。さらに、核酸Ａの量は、例えば、試料中の
分析対象物として核酸Ａを測定方法においては知られて
いなくてもよく、または、例えば、核酸Ａとは異なる第
２の分析対象物（例えば、蛋白質、抗体、ハプテン等）
を測定する労力の一部として試料に規定された量の核酸
Ａが添加されているならば、核酸Ａの量は、知られてい
てもよい。
よび機能は、測定の目的により定義される。それは、ウ
イルスまたは細菌等の特定の感染因子の核酸であっても
よく、例えば癌または遺伝性遺伝子病等の疾患の傾向を
測定する等の配列が確認対象である、ゲノムの一部であ
ってもよい。核酸は、精製、単離または増幅等の前の調
製工程の対象物であったものでもよい。好ましくは、核
酸は細胞破片から分離されたものであり、核酸の特異的
または非特異的部分は、例えば、培養またはポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されたものであっても
よい。それは、この分子の存在および／または量は、測
定および分析される予定の試料から発生した分子であっ
てもよく、それはそれ自身その他の分析対象物の測定に
用いられる予定のプローブまたはプローブユニットであ
ってもよい。さらに、核酸Ａの量は、例えば、試料中の
分析対象物として核酸Ａを測定方法においては知られて
いなくてもよく、または、例えば、核酸Ａとは異なる第
２の分析対象物（例えば、蛋白質、抗体、ハプテン等）
を測定する労力の一部として試料に規定された量の核酸
Ａが添加されているならば、核酸Ａの量は、知られてい
てもよい。
【００１３】第１核酸類似体Ｂは、配列Ａ１に相補的な
配列Ｂ１および相補的な核酸を含む三重らせん構造に関
与可能な配列Ｂ２を含有すると定義される。このよう
に、ヌクレオ塩基配列Ｂ１は、核酸Ａの配列Ａ１に相補
的であるように選択され、配列の特異的選択は、核酸の
測定に必要な特異性に依存する。いくつかの場合では、
例えば、他の核酸に対する識別が必要とされない場合、
配列Ａ１と１００％同一である配列は必要とされないで
あろう。しかしながら、本発明によると、相補性は、２
つの鎖のヌクレオ塩基配列が少なくとも６０％、より好
ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも
９０％同一であることを意味する。最も好ましくは、配
列Ｂ１は、三重らせん形成ではなく二重らせん形成によ
り配列Ａ１に結合するように選択される。通常、配列Ｂ
１は、４つの天然ヌクレオ塩基全てを含み、配列Ｂ１は
天然骨格を含んでもよい。しかしながら、配列Ｂ１が、
天然骨格を有する対応する配列よりも核酸Ａに対して高
い親和性を有する骨格を含むことが好ましく、好ましく
は、配列Ｂ１はペプチド核酸からなる。配列Ｂ２は、相
補的な核酸を含む三重らせん構造に関与可能である。そ
れゆえ、三重らせん構造に関与可能なヌクレオ塩基のみ
が、この配列に含まれることが許容される。配列Ｃ１
は、配列および性質により選択される。
配列Ｂ１および相補的な核酸を含む三重らせん構造に関
与可能な配列Ｂ２を含有すると定義される。このよう
に、ヌクレオ塩基配列Ｂ１は、核酸Ａの配列Ａ１に相補
的であるように選択され、配列の特異的選択は、核酸の
測定に必要な特異性に依存する。いくつかの場合では、
例えば、他の核酸に対する識別が必要とされない場合、
配列Ａ１と１００％同一である配列は必要とされないで
あろう。しかしながら、本発明によると、相補性は、２
つの鎖のヌクレオ塩基配列が少なくとも６０％、より好
ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも
９０％同一であることを意味する。最も好ましくは、配
列Ｂ１は、三重らせん形成ではなく二重らせん形成によ
り配列Ａ１に結合するように選択される。通常、配列Ｂ
１は、４つの天然ヌクレオ塩基全てを含み、配列Ｂ１は
天然骨格を含んでもよい。しかしながら、配列Ｂ１が、
天然骨格を有する対応する配列よりも核酸Ａに対して高
い親和性を有する骨格を含むことが好ましく、好ましく
は、配列Ｂ１はペプチド核酸からなる。配列Ｂ２は、相
補的な核酸を含む三重らせん構造に関与可能である。そ
れゆえ、三重らせん構造に関与可能なヌクレオ塩基のみ
が、この配列に含まれることが許容される。配列Ｃ１
は、配列および性質により選択される。
【００１４】本発明は、さらに、配列Ｃ１および配列Ｃ
２を有する第２核酸類似体Ｃを必要とする。核酸類似体
Ｃは、その配列Ｃ２が核酸Ａの異なる部分、すなわち配
列Ａ２に結合しなければならない点で、核酸類似体Ｂと
異なる。それゆえ、配列Ｃ２は、配列Ａ２に相補的であ
るように選択される。最も好ましい配列Ａ１および配列
Ａ２は、核酸Ａにおいて重複しないが、前記定義のよう
に互いに隣接している。さらに、配列Ｃ２は、配列Ｂ１
のようにペプチド核酸であることが好ましい。配列Ｃ１
の配列は、相補的な核酸を含む三重らせん構造に関与可
能なように選択される。配列Ｃ１は、配列Ｂ２上の隣接
する塩基と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８
０％、最も好ましくは少なくとも９０％同一である配列
を有することが好ましい。配列Ｃ１および配列Ｂ２は、
５〜３０塩基、好ましくは６〜２０塩基の長さを有して
いてもよい。部分Ｂ１および部分Ｂ２ならびに部分Ｃ１
および部分Ｃ２は、直接結合することができるし、所望
の複合体の形成を妨げないいかなるリンカーまたはスペ
ーサーを含むことができる、特定の数の塩基または特定
の距離で分離されてもよい。特に、配列Ａ１と配列Ａ２
の間に０塩基を超える距離があるとき、部分Ｂ１と部分
Ｂ２および部分Ｃ１と部分Ｃ２の間に、それぞれ結合部
分を含むことが適している。
２を有する第２核酸類似体Ｃを必要とする。核酸類似体
Ｃは、その配列Ｃ２が核酸Ａの異なる部分、すなわち配
列Ａ２に結合しなければならない点で、核酸類似体Ｂと
異なる。それゆえ、配列Ｃ２は、配列Ａ２に相補的であ
るように選択される。最も好ましい配列Ａ１および配列
Ａ２は、核酸Ａにおいて重複しないが、前記定義のよう
に互いに隣接している。さらに、配列Ｃ２は、配列Ｂ１
のようにペプチド核酸であることが好ましい。配列Ｃ１
の配列は、相補的な核酸を含む三重らせん構造に関与可
能なように選択される。配列Ｃ１は、配列Ｂ２上の隣接
する塩基と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８
０％、最も好ましくは少なくとも９０％同一である配列
を有することが好ましい。配列Ｃ１および配列Ｂ２は、
５〜３０塩基、好ましくは６〜２０塩基の長さを有して
いてもよい。部分Ｂ１および部分Ｂ２ならびに部分Ｃ１
および部分Ｃ２は、直接結合することができるし、所望
の複合体の形成を妨げないいかなるリンカーまたはスペ
ーサーを含むことができる、特定の数の塩基または特定
の距離で分離されてもよい。特に、配列Ａ１と配列Ａ２
の間に０塩基を超える距離があるとき、部分Ｂ１と部分
Ｂ２および部分Ｃ１と部分Ｃ２の間に、それぞれ結合部
分を含むことが適している。
【００１５】核酸または核酸類似体Ｄは、第１および第
２核酸類似体の配列Ｂ２および配列Ｃ１を含む三重らせ
ん構造に関与可能な配列Ｄ１を含む。それゆえ、この配
列は、三重らせん構造形成しやすいように、配列Ｂ２お
よび配列Ｃ１とワトソン−クリック塩基対およびフーグ
スティーン塩基対の両方を形成可能な塩基を含むように
設計される。３本鎖形成の条件は、他に記載する。ま
た、核酸または核酸類似体Ｄは、三重らせん構造形成に
関与しない、他の対（セグメントＤ２という）を含んで
もよく。これは、２次プローブの結合に利用可能な追加
のヌクレオ塩基配列であってもよく、例えば、ジゴキシ
ゲニン、ビオチン、蛍光またはルゼニウムビスピリジン
複合体等のいかなる検出可能または固定可能な標識部分
であってもよい。これらの部分は、直接検出してもよ
く、検出に好適な酵素結合抗体等の化合物とのさらなる
反応により可視化されてもよい。別法としては、固体支
持体上で、核酸または核酸類似体Ｄ自身あるいは核酸ま
たは核酸類似体Ｄを含む任意の複合体いずれかの捕捉体
に標識を用いてもよい。特別な例として、核酸または核
酸類似体Ｄは固体支持体に共有結合していてもよい。
２核酸類似体の配列Ｂ２および配列Ｃ１を含む三重らせ
ん構造に関与可能な配列Ｄ１を含む。それゆえ、この配
列は、三重らせん構造形成しやすいように、配列Ｂ２お
よび配列Ｃ１とワトソン−クリック塩基対およびフーグ
スティーン塩基対の両方を形成可能な塩基を含むように
設計される。３本鎖形成の条件は、他に記載する。ま
た、核酸または核酸類似体Ｄは、三重らせん構造形成に
関与しない、他の対（セグメントＤ２という）を含んで
もよく。これは、２次プローブの結合に利用可能な追加
のヌクレオ塩基配列であってもよく、例えば、ジゴキシ
ゲニン、ビオチン、蛍光またはルゼニウムビスピリジン
複合体等のいかなる検出可能または固定可能な標識部分
であってもよい。これらの部分は、直接検出してもよ
く、検出に好適な酵素結合抗体等の化合物とのさらなる
反応により可視化されてもよい。別法としては、固体支
持体上で、核酸または核酸類似体Ｄ自身あるいは核酸ま
たは核酸類似体Ｄを含む任意の複合体いずれかの捕捉体
に標識を用いてもよい。特別な例として、核酸または核
酸類似体Ｄは固体支持体に共有結合していてもよい。
【００１６】本発明によると、プローブは、測定対象の
分子に対するいかなる種類の標識を結合させるのにも用
いられる存在である。この結合は、直接または間接であ
ってもよい。全分子にわたって１種類の骨格しか含まな
いプローブ分子Ｂ、プローブ分子Ｃおよびプローブ分子
Ｄ等のプローブ分子の使用は、これらのプローブ分子の
容易な合成という利点を有する。分子はその後の続く結
合工程の必要なしに、モノマーユニットから、全体にわ
たって容易に合成することができる。一方、例えば、セ
グメントが異なる骨格を含む場合、またはセグメントが
反対方向の場合、２つの異なるセグメントを結合するリ
ンカーを用いることが望ましい。次に、セグメントを独
立に合成し、次に続く工程においてそれらを結合させる
ことは有利である。
分子に対するいかなる種類の標識を結合させるのにも用
いられる存在である。この結合は、直接または間接であ
ってもよい。全分子にわたって１種類の骨格しか含まな
いプローブ分子Ｂ、プローブ分子Ｃおよびプローブ分子
Ｄ等のプローブ分子の使用は、これらのプローブ分子の
容易な合成という利点を有する。分子はその後の続く結
合工程の必要なしに、モノマーユニットから、全体にわ
たって容易に合成することができる。一方、例えば、セ
グメントが異なる骨格を含む場合、またはセグメントが
反対方向の場合、２つの異なるセグメントを結合するリ
ンカーを用いることが望ましい。次に、セグメントを独
立に合成し、次に続く工程においてそれらを結合させる
ことは有利である。
【００１７】特に、セグメントが異なる骨格を含む場
合、核酸類似体のセグメントは独立に合成されてもよ
い。ＰＮＡの合成は、国際公開第９２／２０７０２号パ
ンフレットに記載され、一方、リボおよびデオキシリボ
ヌクレオチドの合成は、ホスポラミダイトを経る化学合
成からなる広範な方法、または特により長い配列におい
ては、例えば、鋳型依存ポリメラーゼ反応等の酵素を含
む方法により可能である。続く工程において、２つのセ
グメントはリンカーにより結合される。リンカーとして
は、アミノ酸残基、８−アミノ−ジオキサ−オクタン酸
（Ａｄｏ、独国特許出願公開第３９４３５２２号明細
書）、またはヘキサメチレン等のいかなる分子ユニット
も含んでよい。別法として、末端基の１つがリン酸基
で、他のセグメントのものがアミノ基である場合、かか
るセグメントのキメラは、例えば、１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾールの存在下、ＥＤＣ等のカルボジイミドの
使用により直接製造され得る。ＰＮＡおよびＤＮＡセグ
メントを含む核酸類似体の場合、好ましい結合方法は、
ＰＮＡセグメントの１つのアミノまたはカルボキシル基
を有するＤＮＡセグメントのヒドロキシル基を結合させ
る（図１）。核酸および核酸類似体のセグメントを含む
分子は、国際公開第９５／０８５５６号パンフレットお
よび国際公開第９５／１４７０６号パンフレットに記載
されている。
合、核酸類似体のセグメントは独立に合成されてもよ
い。ＰＮＡの合成は、国際公開第９２／２０７０２号パ
ンフレットに記載され、一方、リボおよびデオキシリボ
ヌクレオチドの合成は、ホスポラミダイトを経る化学合
成からなる広範な方法、または特により長い配列におい
ては、例えば、鋳型依存ポリメラーゼ反応等の酵素を含
む方法により可能である。続く工程において、２つのセ
グメントはリンカーにより結合される。リンカーとして
は、アミノ酸残基、８−アミノ−ジオキサ−オクタン酸
（Ａｄｏ、独国特許出願公開第３９４３５２２号明細
書）、またはヘキサメチレン等のいかなる分子ユニット
も含んでよい。別法として、末端基の１つがリン酸基
で、他のセグメントのものがアミノ基である場合、かか
るセグメントのキメラは、例えば、１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾールの存在下、ＥＤＣ等のカルボジイミドの
使用により直接製造され得る。ＰＮＡおよびＤＮＡセグ
メントを含む核酸類似体の場合、好ましい結合方法は、
ＰＮＡセグメントの１つのアミノまたはカルボキシル基
を有するＤＮＡセグメントのヒドロキシル基を結合させ
る（図１）。核酸および核酸類似体のセグメントを含む
分子は、国際公開第９５／０８５５６号パンフレットお
よび国際公開第９５／１４７０６号パンフレットに記載
されている。
【００１８】三重らせん構造または３本鎖は、分子の三
本鎖からなり、各分子鎖は、塩基対形成可能なヌクレオ
塩基を含む。好ましくは、３つの鎖の間の結合の様式
は、ワトソン／クリック塩基対およびフーグスティーン
塩基対形成の両方を伴う。三重らせん構造の形成は、通
常、伴われる２つの鎖の第３の鎖に対する高程度の配列
相補性を必要とする。好ましい三重らせん構造において
は、鎖の２つはピリミジンヌクレオ塩基からなるが、、
一方、第３の鎖は、対応するプリンヌクレオ塩基からな
る。このように、三重らせん構造の各鎖は、好ましく
は、それぞれ少なくとも６つのプリンまたは６つのピリ
ミジンヌクレオ塩基の長さを有する。各プリン鎖は、同
一のプリン塩基または異なるプリン塩基の混合物のいず
れかからなり、類似の変異体はピリミジン鎖の中で許容
される。
本鎖からなり、各分子鎖は、塩基対形成可能なヌクレオ
塩基を含む。好ましくは、３つの鎖の間の結合の様式
は、ワトソン／クリック塩基対およびフーグスティーン
塩基対形成の両方を伴う。三重らせん構造の形成は、通
常、伴われる２つの鎖の第３の鎖に対する高程度の配列
相補性を必要とする。好ましい三重らせん構造において
は、鎖の２つはピリミジンヌクレオ塩基からなるが、、
一方、第３の鎖は、対応するプリンヌクレオ塩基からな
る。このように、三重らせん構造の各鎖は、好ましく
は、それぞれ少なくとも６つのプリンまたは６つのピリ
ミジンヌクレオ塩基の長さを有する。各プリン鎖は、同
一のプリン塩基または異なるプリン塩基の混合物のいず
れかからなり、類似の変異体はピリミジン鎖の中で許容
される。
【００１９】ペプチド核酸（ＰＮＡ）が核酸と３本鎖構
造を形成する能力を有することは、国際公開第９５／０
１３７０号パンフレットに示されている。それゆえ、三
重らせんを形成する基準は、この特許出願から除く。Ｐ
ＮＡおよびその合成は、国際公開第９２／２０７０２号
パンフレットおよび国際公開第９４／２５４７７号パン
フレットに開示されている。１つの態様において、ＰＮ
Ａの骨格はエチルアミノグリシン部分の繰り返しユニッ
トからなり、ここでは、ヌクレオ塩基はグリシンアミノ
基に結合している。それゆえ、この定義におけるＰＮＡ
は、アミノ末端（ＮＨ2 ）およびカルボン酸末端（−Ｃ
ＯＯＨ）を含む。これらの末端は、他の部分の付加また
は基の脱落により修飾されてもよい。
造を形成する能力を有することは、国際公開第９５／０
１３７０号パンフレットに示されている。それゆえ、三
重らせんを形成する基準は、この特許出願から除く。Ｐ
ＮＡおよびその合成は、国際公開第９２／２０７０２号
パンフレットおよび国際公開第９４／２５４７７号パン
フレットに開示されている。１つの態様において、ＰＮ
Ａの骨格はエチルアミノグリシン部分の繰り返しユニッ
トからなり、ここでは、ヌクレオ塩基はグリシンアミノ
基に結合している。それゆえ、この定義におけるＰＮＡ
は、アミノ末端（ＮＨ2 ）およびカルボン酸末端（−Ｃ
ＯＯＨ）を含む。これらの末端は、他の部分の付加また
は基の脱落により修飾されてもよい。
【００２０】本発明は、核酸Ａの存在および／または量
の尺度として、核酸Ａ、第１核酸類似体Ｂおよび第２核
酸類似体Ｃ間の複合体の形成を用いる。３つの成分間の
塩基対形成により形成されるこの複合体において、成分
は、特異的な定義された方法で結合しなければならな
い。例えば、核酸Ａに結合したとき、セグメントＢ１お
よびセグメントＣ２の方向は、セグメントＢ２およびセ
グメントＣ１が三重らせん形成に共に関与可能であるよ
うでなければならない。２つのプローブ部分の正しい結
合のこの要求は、測定の特異性を高める。さらに、配列
Ｂ２および配列Ｃ１は直接核酸Ａと塩基対形成せず、配
列Ｂ１および配列Ｃ２は互いに塩基対形成しないか、互
いに三重らせん形成により結合することが必要である。
セグメントＢ１およびセグメントＣ２は、分子Ａの相互
に排他的なセグメントＡ１およびセグメントＡ２に結合
するように設計され、これらのセグメントは同じ分子の
セグメントＢ２およびセグメントＣ１と塩基対形成によ
り結合（分子内結合）すべきでない。核酸類似体Ｂおよ
び核酸類似体Ｃの配列のいずれもが、いかなる実質的程
度に、同じ試料中の他のいかなる核酸にも結合しないこ
とが多少好ましい。
の尺度として、核酸Ａ、第１核酸類似体Ｂおよび第２核
酸類似体Ｃ間の複合体の形成を用いる。３つの成分間の
塩基対形成により形成されるこの複合体において、成分
は、特異的な定義された方法で結合しなければならな
い。例えば、核酸Ａに結合したとき、セグメントＢ１お
よびセグメントＣ２の方向は、セグメントＢ２およびセ
グメントＣ１が三重らせん形成に共に関与可能であるよ
うでなければならない。２つのプローブ部分の正しい結
合のこの要求は、測定の特異性を高める。さらに、配列
Ｂ２および配列Ｃ１は直接核酸Ａと塩基対形成せず、配
列Ｂ１および配列Ｃ２は互いに塩基対形成しないか、互
いに三重らせん形成により結合することが必要である。
セグメントＢ１およびセグメントＣ２は、分子Ａの相互
に排他的なセグメントＡ１およびセグメントＡ２に結合
するように設計され、これらのセグメントは同じ分子の
セグメントＢ２およびセグメントＣ１と塩基対形成によ
り結合（分子内結合）すべきでない。核酸類似体Ｂおよ
び核酸類似体Ｃの配列のいずれもが、いかなる実質的程
度に、同じ試料中の他のいかなる核酸にも結合しないこ
とが多少好ましい。
【００２１】セグメントＢ２およびセグメントＣ１を伴
う三重らせんの形成は、セグメントＢ２およびセグメン
トＣ１との３本鎖構造を形成可能な核酸または核酸類似
体Ｄを用いて測定することができる。こうして、核酸Ａ
に間接的に結合するとき、核酸または核酸類似体Ｄは、
核酸Ａの存在および／または量の尺度として用いる。分
子構造および組成に依存した、核酸または核酸類似体Ｄ
を測定する多くの方法がある。３本鎖形成に関与するセ
グメントＤ１に加えて、核酸または核酸類似体Ｄは、形
成された複合体を標識または固定するヌクレオ塩基配列
またはタグのいずれかを含んでもよいセグメントＤ２を
含んでもよい。核酸または核酸類似体Ｄは、反応混合物
に、または反応試薬の１つにいかなる時点で加えてもよ
い。
う三重らせんの形成は、セグメントＢ２およびセグメン
トＣ１との３本鎖構造を形成可能な核酸または核酸類似
体Ｄを用いて測定することができる。こうして、核酸Ａ
に間接的に結合するとき、核酸または核酸類似体Ｄは、
核酸Ａの存在および／または量の尺度として用いる。分
子構造および組成に依存した、核酸または核酸類似体Ｄ
を測定する多くの方法がある。３本鎖形成に関与するセ
グメントＤ１に加えて、核酸または核酸類似体Ｄは、形
成された複合体を標識または固定するヌクレオ塩基配列
またはタグのいずれかを含んでもよいセグメントＤ２を
含んでもよい。核酸または核酸類似体Ｄは、反応混合物
に、または反応試薬の１つにいかなる時点で加えてもよ
い。
【００２２】最初の態様において、成分Ａ、成分Ｂおよ
び成分Ｃのインキュベーションの開始から、核酸または
核酸類似体Ｄは反応混合物に添加される。核酸または核
酸類似体Ｄの量は、成分Ａ、成分Ｂおよび成分Ｃ間で形
成される複合体の期待される量を超えるように選ばれ
る。
び成分Ｃのインキュベーションの開始から、核酸または
核酸類似体Ｄは反応混合物に添加される。核酸または核
酸類似体Ｄの量は、成分Ａ、成分Ｂおよび成分Ｃ間で形
成される複合体の期待される量を超えるように選ばれ
る。
【００２３】第２の態様において、核酸または核酸類似
体Ｄは、核酸Ａならびに核酸類似体Ｂおよび核酸類似体
Ｃの間で複合体の形成後に、反応混合物に添加する。核
酸Ａ、核酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃ間の複合体の形
成は、２本鎖形成に好ましい条件下で行なわれるが、核
酸または核酸類似体Ｄとの反応は、好ましくは、さらに
三重らせん複合体の形成に好ましい条件下で行なわれ
る。
体Ｄは、核酸Ａならびに核酸類似体Ｂおよび核酸類似体
Ｃの間で複合体の形成後に、反応混合物に添加する。核
酸Ａ、核酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃ間の複合体の形
成は、２本鎖形成に好ましい条件下で行なわれるが、核
酸または核酸類似体Ｄとの反応は、好ましくは、さらに
三重らせん複合体の形成に好ましい条件下で行なわれ
る。
【００２４】核酸Ａ、核酸類似体Ｂ、核酸類似体Ｃおよ
び核酸または核酸類似体Ｄの複合体における核酸または
核酸類似体Ｄの存在の測定は、当該分野において公知の
標識方法に類似して行なうことができる。測定は、好ま
しくは、既知の量の核酸Ａを含む反応混合物に対して同
一の反応順序で行なうことによる系の較正を含む。
び核酸または核酸類似体Ｄの複合体における核酸または
核酸類似体Ｄの存在の測定は、当該分野において公知の
標識方法に類似して行なうことができる。測定は、好ま
しくは、既知の量の核酸Ａを含む反応混合物に対して同
一の反応順序で行なうことによる系の較正を含む。
【００２５】標識は、それ自身が固定可能もしくは検出
可能である部分、または追加の部分にカップリングする
ことにより固定され得る／検出され得る部分として、通
常公知である。標識の例としては、蛍光部分（例えば、
フルオレセインもしくはローダミン）、酵素（例えば、
ペルオキシダーゼもしくはホスファターゼ）、ハプテン
（例えば、ジゴキシゲニン）等の免疫活性基質、または
蛋白質結合タグ（例えば、ビオチン）等がある。
可能である部分、または追加の部分にカップリングする
ことにより固定され得る／検出され得る部分として、通
常公知である。標識の例としては、蛍光部分（例えば、
フルオレセインもしくはローダミン）、酵素（例えば、
ペルオキシダーゼもしくはホスファターゼ）、ハプテン
（例えば、ジゴキシゲニン）等の免疫活性基質、または
蛋白質結合タグ（例えば、ビオチン）等がある。
【００２６】１つの態様において、核酸または核酸類似
体Ｄの測定は、核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ
２に相補的な配列を含む１以上の二次プローブ、および
標識を介する。二次プローブは、好ましくは、さらに反
応混合物に含まれる他の配列に相補的なヌクレオ塩基配
列を含まない。
体Ｄの測定は、核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ
２に相補的な配列を含む１以上の二次プローブ、および
標識を介する。二次プローブは、好ましくは、さらに反
応混合物に含まれる他の配列に相補的なヌクレオ塩基配
列を含まない。
【００２７】２番目の態様において、核酸Ｄの測定は、
核酸Ｄの直接標識を介する。この態様において、セグメ
ントＤ２は、それ自身検出可能または固定可能標識であ
ってもよい。こうして、核酸または核酸類似体Ｄは、核
酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃと共に三重らせん形成に
おいて、セグメントＤ１により、直接関与するプローブ
として働く。
核酸Ｄの直接標識を介する。この態様において、セグメ
ントＤ２は、それ自身検出可能または固定可能標識であ
ってもよい。こうして、核酸または核酸類似体Ｄは、核
酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃと共に三重らせん形成に
おいて、セグメントＤ１により、直接関与するプローブ
として働く。
【００２８】複合体ＡＢＣＤの測定は、他のフォーマッ
ト態様を経て作製され得る。例えば、インキュベーショ
ン後の成分の混合物は、電気泳動に付される。それによ
って、形成された複合体は、原料化合物から分離され、
異なる移動度の特性により識別され得る。原料化合物の
移動挙動を知るか、または／および核酸Ａが存在するこ
とが知られる対照構成中の移動挙動を独立に測定するか
いずれかして、複合体を含むスポットを区別することが
できる。
ト態様を経て作製され得る。例えば、インキュベーショ
ン後の成分の混合物は、電気泳動に付される。それによ
って、形成された複合体は、原料化合物から分離され、
異なる移動度の特性により識別され得る。原料化合物の
移動挙動を知るか、または／および核酸Ａが存在するこ
とが知られる対照構成中の移動挙動を独立に測定するか
いずれかして、複合体を含むスポットを区別することが
できる。
【００２９】他のより日常的な方法において、複合体Ａ
ＢＣＤのいずれか１つの成分が検出できるように標識さ
れてもよいし、他の成分が固定できるように標識されて
もよい。この態様において、ハイブリダイゼーションの
条件は、４つの成分全部が発生するいかなる複合体形成
においても存在しなければならない方法で制御されなけ
ればならない。これは、各成分の適したヌクレオ塩基配
列の選択、および／または例えば温度、イオン強度等の
反応環境を制御することにより達成され得る。
ＢＣＤのいずれか１つの成分が検出できるように標識さ
れてもよいし、他の成分が固定できるように標識されて
もよい。この態様において、ハイブリダイゼーションの
条件は、４つの成分全部が発生するいかなる複合体形成
においても存在しなければならない方法で制御されなけ
ればならない。これは、各成分の適したヌクレオ塩基配
列の選択、および／または例えば温度、イオン強度等の
反応環境を制御することにより達成され得る。
【００３０】本発明は、三重らせん構造の形成が強く結
合した高度に特異的な構造の形成を許容するという考え
を通常、利用する。本発明によると、単一の一般的な配
列Ｄ１を、セグメントＤ２に含まれる通常の一般の標
識、またはセグメントＤ２に結合している一般的もしく
は種特異的いずれかの２次プローブにより検出される多
数の異なる分析対象核酸Ａ用に用いることができる。後
者の場合、２次プローブは、異なる標識を有する。別法
として、セグメントＤ１の配列は、異なるプローブＢお
よびプローブＣを伴う複合体を通じて、異なる分析対象
物Ａの検出を許容するように変化させることができる。
また、この別法は、１度に１つの核酸Ａのみを測定すべ
きならば一般的検出方法、または同時により多くの分析
対象核酸を測定すべきならば異なる検出方法のいずれか
と組み合わせることができる。第１のアプローチは、異
なる配列のプローブＤ分子を合成する必要がないという
利点を有するが、第２のアプローチは、特異的な要求に
対する反応をより適合させる可能性の利点を有する。以
下に、特に好ましい態様を記載する。
合した高度に特異的な構造の形成を許容するという考え
を通常、利用する。本発明によると、単一の一般的な配
列Ｄ１を、セグメントＤ２に含まれる通常の一般の標
識、またはセグメントＤ２に結合している一般的もしく
は種特異的いずれかの２次プローブにより検出される多
数の異なる分析対象核酸Ａ用に用いることができる。後
者の場合、２次プローブは、異なる標識を有する。別法
として、セグメントＤ１の配列は、異なるプローブＢお
よびプローブＣを伴う複合体を通じて、異なる分析対象
物Ａの検出を許容するように変化させることができる。
また、この別法は、１度に１つの核酸Ａのみを測定すべ
きならば一般的検出方法、または同時により多くの分析
対象核酸を測定すべきならば異なる検出方法のいずれか
と組み合わせることができる。第１のアプローチは、異
なる配列のプローブＤ分子を合成する必要がないという
利点を有するが、第２のアプローチは、特異的な要求に
対する反応をより適合させる可能性の利点を有する。以
下に、特に好ましい態様を記載する。
【００３１】本発明の好ましいモードにおいて、目下分
析対象核酸と呼ぶ、測定対象の核酸は、好ましくは、例
えば、尿、唾液、血液またはそれらから得た液体（血清
もしくは血漿等）の体液由来の粗調製物において少なく
とも単離される。例えば、細胞中に含まれる場合等、核
酸が容易に入手できない場合、例えば、核酸を放出させ
るための細胞壁の溶解等の数段階の前調製工程が行なわ
れる。次に、測定対象の核酸またはその一部は、例え
ば、ＰＣＲを用いるなどして増幅されてもよい。増幅さ
れた分析対象物のセグメントは、後に用いられるセグメ
ントＡ１およびセグメントＡ２を含むべきである。ｉｎ
ｖｉｔｒｏ増幅技術が用いられる場合、標識モノヌク
レオシド三リン酸または標識プライマーの使用により、
固定可能または検出可能いずれかの標識を、これらの増
幅産物に取り込むことが可能で、該増幅産物は、その後
本発明の真の核酸Ａとして用いられる。試料の適当な調
製後、少なくとも１本鎖の分析対象物Ａ（または、本発
明の核酸Ａと同等に作用する増幅産物）を、変性より入
手可能にする。もしあるにしても、核酸Ａに用いられる
標識の種類に依存して、検出できるようにまたは固定で
きるようにいずれかが標識されてもよい核酸類似体Ｂ、
核酸類似体Ｃおよび核酸または類似体Ｄは、反応混合物
に添加される。本発明の２本鎖構造および３本鎖構造の
形成を好む条件下で、成分をインキュベートする。次
に、複合体をクラマトグラフィーもしくは電気泳動等
の、単一成分からの複合体の分離を許容する様々な技術
により直接検出してもよいし、または複合体を固体支持
体に固定してもよい。固定された場合、非結合成分およ
び反応混合物の他の構成成分は、固相に結合した複合体
から分離される。特に、過剰の検出可能な標識核酸また
は核酸類似体は、複合体から除去すべきである。次に、
結合した複合体を検出可能標識等で検出する。固相上の
複合体の存在は、元の分析対象核酸Ａの存在の尺度であ
る。
析対象核酸と呼ぶ、測定対象の核酸は、好ましくは、例
えば、尿、唾液、血液またはそれらから得た液体（血清
もしくは血漿等）の体液由来の粗調製物において少なく
とも単離される。例えば、細胞中に含まれる場合等、核
酸が容易に入手できない場合、例えば、核酸を放出させ
るための細胞壁の溶解等の数段階の前調製工程が行なわ
れる。次に、測定対象の核酸またはその一部は、例え
ば、ＰＣＲを用いるなどして増幅されてもよい。増幅さ
れた分析対象物のセグメントは、後に用いられるセグメ
ントＡ１およびセグメントＡ２を含むべきである。ｉｎ
ｖｉｔｒｏ増幅技術が用いられる場合、標識モノヌク
レオシド三リン酸または標識プライマーの使用により、
固定可能または検出可能いずれかの標識を、これらの増
幅産物に取り込むことが可能で、該増幅産物は、その後
本発明の真の核酸Ａとして用いられる。試料の適当な調
製後、少なくとも１本鎖の分析対象物Ａ（または、本発
明の核酸Ａと同等に作用する増幅産物）を、変性より入
手可能にする。もしあるにしても、核酸Ａに用いられる
標識の種類に依存して、検出できるようにまたは固定で
きるようにいずれかが標識されてもよい核酸類似体Ｂ、
核酸類似体Ｃおよび核酸または類似体Ｄは、反応混合物
に添加される。本発明の２本鎖構造および３本鎖構造の
形成を好む条件下で、成分をインキュベートする。次
に、複合体をクラマトグラフィーもしくは電気泳動等
の、単一成分からの複合体の分離を許容する様々な技術
により直接検出してもよいし、または複合体を固体支持
体に固定してもよい。固定された場合、非結合成分およ
び反応混合物の他の構成成分は、固相に結合した複合体
から分離される。特に、過剰の検出可能な標識核酸また
は核酸類似体は、複合体から除去すべきである。次に、
結合した複合体を検出可能標識等で検出する。固相上の
複合体の存在は、元の分析対象核酸Ａの存在の尺度であ
る。
【００３２】本発明の主題である、好ましい組成物は、
隣接して結合した配列Ａ１および配列Ａ２を有する核酸
Ａ、配列Ａ１に相補的な配列Ｂ１および相補的な核酸ま
たは核酸類似体Ｄを含む三重らせん構造に関与可能な配
列Ｂ２を有する第１核酸類似体Ｂ、ならびに該相補的な
核酸または核酸類似体Ｄを含む三重らせん構造に関与可
能な配列Ｃ１および配列Ａ２に相補的な配列Ｃ２を有す
る第２核酸類似体Ｃを含む。本発明の組成物は、好まし
くは該成分間で形成された複合体の型であり、各複合体
は各成分の１分子を含み、核酸類似体Ｂおよび核酸類似
体Ｃは二重らせん形成により核酸Ａに結合し、三重らせ
ん形成により核酸または核酸類似体Ｄに結合している。
隣接して結合した配列Ａ１および配列Ａ２を有する核酸
Ａ、配列Ａ１に相補的な配列Ｂ１および相補的な核酸ま
たは核酸類似体Ｄを含む三重らせん構造に関与可能な配
列Ｂ２を有する第１核酸類似体Ｂ、ならびに該相補的な
核酸または核酸類似体Ｄを含む三重らせん構造に関与可
能な配列Ｃ１および配列Ａ２に相補的な配列Ｃ２を有す
る第２核酸類似体Ｃを含む。本発明の組成物は、好まし
くは該成分間で形成された複合体の型であり、各複合体
は各成分の１分子を含み、核酸類似体Ｂおよび核酸類似
体Ｃは二重らせん形成により核酸Ａに結合し、三重らせ
ん形成により核酸または核酸類似体Ｄに結合している。
【００３３】核酸または核酸類似体Ｄは、第１核酸類似
体の配列Ｂ２およびおよび第２核酸類似体の配列Ｃ１も
含む三重らせん構造に関与可能な配列を含む。この３本
鎖は、好ましくは配列Ｄ１により作られる。核酸または
核酸類似体Ｄは、さらに例えば配列Ｄ２等のセグメント
を含んでいてもよい。ここでＡＢＣＤと呼ぶ、核酸Ａ、
核酸類似体Ｂ、核酸類似体Ｃおよび核酸または核酸類似
体Ｄから形成される複合体は、核酸Ａの測定または分析
方法の好ましい最終産物である。前記方法において与え
られる全ての特異的態様および定義は、組成物に適用さ
れる。
体の配列Ｂ２およびおよび第２核酸類似体の配列Ｃ１も
含む三重らせん構造に関与可能な配列を含む。この３本
鎖は、好ましくは配列Ｄ１により作られる。核酸または
核酸類似体Ｄは、さらに例えば配列Ｄ２等のセグメント
を含んでいてもよい。ここでＡＢＣＤと呼ぶ、核酸Ａ、
核酸類似体Ｂ、核酸類似体Ｃおよび核酸または核酸類似
体Ｄから形成される複合体は、核酸Ａの測定または分析
方法の好ましい最終産物である。前記方法において与え
られる全ての特異的態様および定義は、組成物に適用さ
れる。
【００３４】本発明のさらなる主題は、隣接して結合し
た配列Ａ１および配列Ａ２を有する核酸Ａ、配列Ａ１に
相補的な配列Ｂ１および相補的な核酸または核酸類似体
Ｄを含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｂ２を有する
第１核酸類似体Ｂ、ならびに該相補的な核酸または核酸
類似体を含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｃ１およ
び配列Ａ２に相補的な配列Ｃ２を有する第２核酸類似体
Ｃを含む組成物である。組成物は、好ましくは、該成分
Ａ、成分Ｂおよび成分Ｃ間で形成される複合体の型であ
り、各複合体は各成分の１分子を含み、核酸類似体Ｂお
よび核酸類似体Ｃは二重らせん形成により核酸Ａに結合
している。それは、核酸Ａの測定の間に形成された中間
産物としての好ましい使用を有する。
た配列Ａ１および配列Ａ２を有する核酸Ａ、配列Ａ１に
相補的な配列Ｂ１および相補的な核酸または核酸類似体
Ｄを含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｂ２を有する
第１核酸類似体Ｂ、ならびに該相補的な核酸または核酸
類似体を含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｃ１およ
び配列Ａ２に相補的な配列Ｃ２を有する第２核酸類似体
Ｃを含む組成物である。組成物は、好ましくは、該成分
Ａ、成分Ｂおよび成分Ｃ間で形成される複合体の型であ
り、各複合体は各成分の１分子を含み、核酸類似体Ｂお
よび核酸類似体Ｃは二重らせん形成により核酸Ａに結合
している。それは、核酸Ａの測定の間に形成された中間
産物としての好ましい使用を有する。
【００３５】本発明のさらなる主題は、配列Ｂ１および
核酸または核酸類似体Ｄを含む三重らせん構造に関与可
能な配列Ｂ２を有する第１核酸類似体Ｂ、ならびに核酸
または核酸類似体Ｄを含む三重らせん構造に関与可能な
配列Ｃ１、および配列Ｃ２を有する第２核酸類似体Ｃを
含む組成物である。この組成物は、核酸Ａの測定用多成
分プローブシステムとして用いることができ、ここで、
配列Ｂ１および配列Ｃ２は、核酸Ａの配列Ａ１および配
列Ａ２に結合可能である。多成分複合体において、核酸
または核酸類似体Ｄ、核酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃ
は、配列Ｂ２、配列Ｃ１および核酸または核酸類似体Ｄ
のセグメントＤ１により形成される三重らせん構造によ
り共に結合する。
核酸または核酸類似体Ｄを含む三重らせん構造に関与可
能な配列Ｂ２を有する第１核酸類似体Ｂ、ならびに核酸
または核酸類似体Ｄを含む三重らせん構造に関与可能な
配列Ｃ１、および配列Ｃ２を有する第２核酸類似体Ｃを
含む組成物である。この組成物は、核酸Ａの測定用多成
分プローブシステムとして用いることができ、ここで、
配列Ｂ１および配列Ｃ２は、核酸Ａの配列Ａ１および配
列Ａ２に結合可能である。多成分複合体において、核酸
または核酸類似体Ｄ、核酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃ
は、配列Ｂ２、配列Ｃ１および核酸または核酸類似体Ｄ
のセグメントＤ１により形成される三重らせん構造によ
り共に結合する。
【００３６】本発明のさらなる主題は、１以上の容器
に、第１核酸類似体Ｂ、第２核酸類似体Ｃおよび核酸ま
たは核酸類似体Ｄを含む、核酸Ａの測定用試薬キットで
ある。前記定義が適用される。本試薬キットは、前記方
法の成分を、全成分が別々の容器にある場合は特に、安
定な型で、保存するために用いることができる。２以上
の成分、特に核酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃが共通の
容器にある場合、有利である。次に、より小さい容器が
必要で、本方法を行なうとき、ピペッティング工程の量
が減少される。
に、第１核酸類似体Ｂ、第２核酸類似体Ｃおよび核酸ま
たは核酸類似体Ｄを含む、核酸Ａの測定用試薬キットで
ある。前記定義が適用される。本試薬キットは、前記方
法の成分を、全成分が別々の容器にある場合は特に、安
定な型で、保存するために用いることができる。２以上
の成分、特に核酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃが共通の
容器にある場合、有利である。次に、より小さい容器が
必要で、本方法を行なうとき、ピペッティング工程の量
が減少される。
【００３７】
【実施例】以下、実施例により、本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定
されるものではない。
説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定
されるものではない。
【００３８】一般 ＰＮＡを、国際公開第９２／２０７０２号パンフレット
に従い合成する。適用可能であれば、ＰＮＡが保護さ
れ、固相上に存在する間に、修飾基を結合させる。固体
支持体の選択および続く固相からＰＮＡを脱カップリン
グする方法のため、ＰＮＡは−ＣＯＯＨ末端にアミド官
能基を有する。従って、この場合、Ｃ末端を−ＣＯＮＨ
2 と表示する。アミノ末端は、−Ｈと表示する。ＤＮＡ
オリゴヌクレオチドは、自動化合成機で化学的に合成さ
れる。
に従い合成する。適用可能であれば、ＰＮＡが保護さ
れ、固相上に存在する間に、修飾基を結合させる。固体
支持体の選択および続く固相からＰＮＡを脱カップリン
グする方法のため、ＰＮＡは−ＣＯＯＨ末端にアミド官
能基を有する。従って、この場合、Ｃ末端を−ＣＯＮＨ
2 と表示する。アミノ末端は、−Ｈと表示する。ＤＮＡ
オリゴヌクレオチドは、自動化合成機で化学的に合成さ
れる。
【００３９】実施例（１） ３本鎖形成条件の分析 より高いｐＨでは、フーグスティーン塩基対形成は不可
能であるため、ＰＮＡプローブＢおよびＰＮＡプローブ
Ｃの３本鎖形成能を見積もるために、融点（Ｔｍ）をｐ
Ｈ５．０および９．５で測定した。全体で、所望のｐＨ
の０．１Ｍリン酸緩衝液を含む１ｍｌの溶液である、９
μＭ ＰＮＡおよび４．５μＭ ＤＮＡの溶液を、１０
分間９５℃に加温し、２２℃で１８時間ゆっくり冷やし
た。続いて、２ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液を添加し、
０．５℃／ｍｉｎで２５℃から９５℃に温度を上昇させ
ながら、光学密度を測定した。ｐＨ５．０で、合成核酸
Ｄとの、セグメントＢ２およびセグメントＣ１のＴｍは
６２．６℃であったが、一方、ｐＨ９．５で、Ｔｍは推
定できなかった。かかるｐＨ依存性は、フーグスティー
ン塩基対形成がハイブリダイゼーション複合体の安定性
に有意に寄与すること、および３本鎖形成がｐＨ９．５
で起きなかったことを示す。また、２本鎖形成は、ｐＨ
５．０で分析され、合成核酸Ａとの、セグメントＢ１お
よびセグメントＣ２のＴｍは、それぞれ６５．６℃およ
び６４．６℃であった。
能であるため、ＰＮＡプローブＢおよびＰＮＡプローブ
Ｃの３本鎖形成能を見積もるために、融点（Ｔｍ）をｐ
Ｈ５．０および９．５で測定した。全体で、所望のｐＨ
の０．１Ｍリン酸緩衝液を含む１ｍｌの溶液である、９
μＭ ＰＮＡおよび４．５μＭ ＤＮＡの溶液を、１０
分間９５℃に加温し、２２℃で１８時間ゆっくり冷やし
た。続いて、２ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液を添加し、
０．５℃／ｍｉｎで２５℃から９５℃に温度を上昇させ
ながら、光学密度を測定した。ｐＨ５．０で、合成核酸
Ｄとの、セグメントＢ２およびセグメントＣ１のＴｍは
６２．６℃であったが、一方、ｐＨ９．５で、Ｔｍは推
定できなかった。かかるｐＨ依存性は、フーグスティー
ン塩基対形成がハイブリダイゼーション複合体の安定性
に有意に寄与すること、および３本鎖形成がｐＨ９．５
で起きなかったことを示す。また、２本鎖形成は、ｐＨ
５．０で分析され、合成核酸Ａとの、セグメントＢ１お
よびセグメントＣ２のＴｍは、それぞれ６５．６℃およ
び６４．６℃であった。
【００４０】実施例（２） 合成オリゴマーの測定 複合体形成を見積もるために、図３に記載の組み合わせ
で、成分Ａ、成分Ｂ、成分Ｃおよび成分Ｄを用いて、実
験をセットアップした。分析対象核酸Ａとして、１ｐｍ
ｏｌの32Ｐ標識ＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号：
１）を用いた。第一核酸類似体Ｂおよび第２核酸類似体
Ｃとして、１０ｐｍｏｌの各ＰＮＡ１９５およびＰＮＡ
２８６配列を用いた。成分Ｄとして、１ｐｍｏｌの32Ｐ
標識ＤＮＡオロゴヌクレオチド（配列番号：２）を用い
た。 配列番号１： ５’−ＡＡＡ−ＧＡＣ−ＡＡＴ−ＧＧＡ
−ＴＴＡ−ＣＣＴ−ＡＴＡ−ＡＣＴ−ＧＴＡ−ＧＡＣ−
ＴＣＧ−ＧＣＴ−ＴＧＧ−Ｇ−３’ ＰＮＡ１９５：Ｈ−Ｌｙｓ−ＧＡＧ−ＴＣＴ−ＡＣＡ−
ＧＴＴ−Ｌｙｓ−ＴＴＣ−ＴＣＣ−ＴＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ
2 ＰＮＡ２８６：Ｈ−Ｌｙｓ−ＴＴＣ−ＣＴＣ−ＴＴ−Ｌ
ｙｓ−ＡＴＡ−ＧＧＴ−ＡＡＴ−ＣＣＡ−Ｌｙｓ−ＮＨ
2 配列番号２： ５’−ＴＡＧ−ＴＴＧ−ＴＧＡ−ＣＧＴ
−ＡＣＡ−ＧＡＡ−ＧＧＡ−ＧＡＡ
で、成分Ａ、成分Ｂ、成分Ｃおよび成分Ｄを用いて、実
験をセットアップした。分析対象核酸Ａとして、１ｐｍ
ｏｌの32Ｐ標識ＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号：
１）を用いた。第一核酸類似体Ｂおよび第２核酸類似体
Ｃとして、１０ｐｍｏｌの各ＰＮＡ１９５およびＰＮＡ
２８６配列を用いた。成分Ｄとして、１ｐｍｏｌの32Ｐ
標識ＤＮＡオロゴヌクレオチド（配列番号：２）を用い
た。 配列番号１： ５’−ＡＡＡ−ＧＡＣ−ＡＡＴ−ＧＧＡ
−ＴＴＡ−ＣＣＴ−ＡＴＡ−ＡＣＴ−ＧＴＡ−ＧＡＣ−
ＴＣＧ−ＧＣＴ−ＴＧＧ−Ｇ−３’ ＰＮＡ１９５：Ｈ−Ｌｙｓ−ＧＡＧ−ＴＣＴ−ＡＣＡ−
ＧＴＴ−Ｌｙｓ−ＴＴＣ−ＴＣＣ−ＴＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ
2 ＰＮＡ２８６：Ｈ−Ｌｙｓ−ＴＴＣ−ＣＴＣ−ＴＴ−Ｌ
ｙｓ−ＡＴＡ−ＧＧＴ−ＡＡＴ−ＣＣＡ−Ｌｙｓ−ＮＨ
2 配列番号２： ５’−ＴＡＧ−ＴＴＧ−ＴＧＡ−ＣＧＴ
−ＡＣＡ−ＧＡＡ−ＧＧＡ−ＧＡＡ
【００４１】これらの成分を、下記を含む１０μＬの緩
衝液中でインキュベートした。 １００ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ；
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ５．０
衝液中でインキュベートした。 １００ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ；
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ５．０
【００４２】試料を９５℃で５分間変性させ、続いて室
温（ＲＴ）で２０分間インキュベーションを行なった。
負荷緩衝液（５０％グリセロール）の添加後、試料を２
０％ＰＡＧＥで分析した。
温（ＲＴ）で２０分間インキュベーションを行なった。
負荷緩衝液（５０％グリセロール）の添加後、試料を２
０％ＰＡＧＥで分析した。
【００４３】図４は、ゲルのオートラジオグラムを示
し、ここで、最も高分子量の化合物が明らかに図２に描
く産物であることが分かる。図４レーン１〜７に、放射
線標識されたＤＮＡ検出オリゴ（Ｄ）が、５７相対移動
度（ｒＭ）に強いバンドとして、３７ｒＭにより弱いバ
ンドとして（オリゴヌクレオチド合成 副産物）見られ
る。また、放射線標識された分析対象ＤＮＡオリゴ
（Ａ）は、レーン１１に５０．５ｒＭに強いバンドとし
て見られ、また、レーン５〜１０にも見られる。ＰＮＡ
プローブ（Ｂ）およびＰＮＡプローブ（Ｃ）は、単独
（レーン２および３）または組み合わせ（レーン４）い
ずれにおいてもＤＮＡ検出オリゴ（Ｄ）と安定複合体を
形成しない（即ち、ゲルに入らない）。しかしながら、
それらはＤＮＡ分析対象（Ａ）と複合体を形成し、３
１．５ｒＭ（レーン５）および３６ｒＭ（レーン６）ま
で、それぞれゲルに入る。これらのバンドは、レーン９
および１０のバンド（それぞれ、１つのＰＮＡを含む分
析対象（Ａ））に対応し、そのことは、レーン５および
６に存在する検出プローブ（Ｄ）が、レーン９および１
０に見られるハイブリッド（Ａ／Ｂ、またはＡ／Ｃ）の
いずれかと複合体を形成しないことを示す。両ＰＮＡプ
ローブ（ＢおよびＣ）が分析対象（Ａ）にハイブリダイ
ズするときのみ（レーン８の２２ｒＭに見られる）、そ
れらはレーン７の１４ｒＭに見られ得るように検出プロ
ーブ（Ｄ）と安定複合体を形成する。それゆえ、４つの
成分Ａ、成分Ｂ、成分Ｃおよび成分Ｄを含むこの複合体
の形成は、分析対象Ａの特異的な証明である。
し、ここで、最も高分子量の化合物が明らかに図２に描
く産物であることが分かる。図４レーン１〜７に、放射
線標識されたＤＮＡ検出オリゴ（Ｄ）が、５７相対移動
度（ｒＭ）に強いバンドとして、３７ｒＭにより弱いバ
ンドとして（オリゴヌクレオチド合成 副産物）見られ
る。また、放射線標識された分析対象ＤＮＡオリゴ
（Ａ）は、レーン１１に５０．５ｒＭに強いバンドとし
て見られ、また、レーン５〜１０にも見られる。ＰＮＡ
プローブ（Ｂ）およびＰＮＡプローブ（Ｃ）は、単独
（レーン２および３）または組み合わせ（レーン４）い
ずれにおいてもＤＮＡ検出オリゴ（Ｄ）と安定複合体を
形成しない（即ち、ゲルに入らない）。しかしながら、
それらはＤＮＡ分析対象（Ａ）と複合体を形成し、３
１．５ｒＭ（レーン５）および３６ｒＭ（レーン６）ま
で、それぞれゲルに入る。これらのバンドは、レーン９
および１０のバンド（それぞれ、１つのＰＮＡを含む分
析対象（Ａ））に対応し、そのことは、レーン５および
６に存在する検出プローブ（Ｄ）が、レーン９および１
０に見られるハイブリッド（Ａ／Ｂ、またはＡ／Ｃ）の
いずれかと複合体を形成しないことを示す。両ＰＮＡプ
ローブ（ＢおよびＣ）が分析対象（Ａ）にハイブリダイ
ズするときのみ（レーン８の２２ｒＭに見られる）、そ
れらはレーン７の１４ｒＭに見られ得るように検出プロ
ーブ（Ｄ）と安定複合体を形成する。それゆえ、４つの
成分Ａ、成分Ｂ、成分Ｃおよび成分Ｄを含むこの複合体
の形成は、分析対象Ａの特異的な証明である。
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば、小さい配列の特性であ
る優れたミスマッチの識別性と、より長いヌクレオ塩基
配列の統計的特異性とを結び付けることによって、小さ
なプローブは統計的にユニークでないという問題点およ
び、長いプローブはミスマッチを識別できないという問
題点が同時に解消される。
る優れたミスマッチの識別性と、より長いヌクレオ塩基
配列の統計的特異性とを結び付けることによって、小さ
なプローブは統計的にユニークでないという問題点およ
び、長いプローブはミスマッチを識別できないという問
題点が同時に解消される。
【００４５】
配列番号：１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド） 配列： AAAGACAATG GATTACCTAT AACTGTAGAC TCGGCTTGGG 40
ド） 配列： AAAGACAATG GATTACCTAT AACTGTAGAC TCGGCTTGGG 40
【００４６】配列番号：２ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド） 配列： TAGTTGTGAC GTACAGAAGG AGAA 24
ド） 配列： TAGTTGTGAC GTACAGAAGG AGAA 24
【図１】図１は、好ましい逆平行モードでＤＮＡに結合
している例示のペプチド核酸（ＰＮＡ）の構造を概略的
に示した図である。
している例示のペプチド核酸（ＰＮＡ）の構造を概略的
に示した図である。
【図２】図２は、セグメントＡ１およびセグメントＡ２
を含む核酸Ａ、セグメントＢ１およびセグメントＢ２を
含む第１核酸類似体Ｂ、ならびにセグメントＣ１および
セグメントＣ２を含む第２核酸類似体Ｃの配置を概略的
に示した図であり、ここで、セグメントＢ２およびセグ
メントＣ１は、核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ
１と共に３本鎖構造に関与している。セグメントＤ２
は、例えば、検出もしくは固定に用いてもよく、または
存在しなくてもよい。この複合体は、本発明の組成物に
おいて、核酸Ａの測定方法の結果であってもよい。
を含む核酸Ａ、セグメントＢ１およびセグメントＢ２を
含む第１核酸類似体Ｂ、ならびにセグメントＣ１および
セグメントＣ２を含む第２核酸類似体Ｃの配置を概略的
に示した図であり、ここで、セグメントＢ２およびセグ
メントＣ１は、核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ
１と共に３本鎖構造に関与している。セグメントＤ２
は、例えば、検出もしくは固定に用いてもよく、または
存在しなくてもよい。この複合体は、本発明の組成物に
おいて、核酸Ａの測定方法の結果であってもよい。
【図３】図３は、成分Ａ、成分Ｂ、成分Ｃおよび成分Ｄ
の可能な組み合わせ、ならびに理論的に形成された複合
体を示した図である。
の可能な組み合わせ、ならびに理論的に形成された複合
体を示した図である。
【図４】図４は、ＰＡＧＥで泳動した、図３に示された
成分のオートラジオグラムを示す電気泳動の写真であ
る。
成分のオートラジオグラムを示す電気泳動の写真であ
る。
Claims (12)
- 【請求項１】 （ａ）配列Ａ１に相補的な配列Ｂ１およ
び三重らせん構造に関与可能な配列Ｂ２を有する第１核
酸類似体Ｂ、ならびに三重らせん構造に関与可能な配列
Ｃ１および配列Ａ２に相補的な配列Ｃ２を有する第２核
酸類似体Ｃと核酸Ａを接触させる工程、ならびに（ｂ）
核酸Ａ、核酸類似体Ｂおよび核酸類似体Ｃを含む複合体
の形成を測定する工程を含む、隣接して結合した配列Ａ
１および配列Ａ２を有する核酸Ａの同定方法。 - 【請求項２】 さらに、第１核酸類似体および第２核酸
類似体の配列Ｂ２および配列Ｃ１をも含む三重らせん構
造に関与可能な配列Ｄ１を含む核酸または核酸類似体Ｄ
の使用、ならびに核酸Ａ、核酸類似体Ｂ、核酸類似体Ｃ
および核酸または核酸類似体Ｄを含む複合体の形成を測
定する工程からなる、請求項１記載の同定方法。 - 【請求項３】 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ
２が検出できるように標識され、該複合体中の該標識を
検出することにより該複合体の形成が測定される、請求
項２記載の同定方法。 - 【請求項４】 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ
２が検出できるように標識され、該核酸Ａが固定できる
ように標識され、固定された検出可能標識を検出するこ
とにより該複合体が測定される、請求項２記載の同定方
法。 - 【請求項５】 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ
２が固定できるように標識され、該核酸Ａが検出できる
ように標識され、固定された検出可能標識を検出するこ
とにより該複合体が測定される、請求項２記載の同定方
法。 - 【請求項６】 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ
２が検出できるように標識され、該核酸類似体Ｂまたは
該核酸類似体Ｃの１つが固定できるように標識され、固
定された検出可能標識を検出することにより該複合体が
測定される、請求項２記載の同定方法。 - 【請求項７】 核酸または核酸類似体ＤのセグメントＤ
２が固定できるように標識され、該核酸類似体Ｂまたは
該核酸類似体Ｃの１つが検出できるように標識され、固
定された検出可能標識を検出することにより該複合体が
測定される、請求項２記載の同定方法。 - 【請求項８】 該核酸類似体Ｂまたは該核酸類似体Ｃの
１つが固定できるように標識され、他の核酸類似体（該
核酸類似体Ｃまたは該核酸類似体Ｂ）が検出できるよう
に標識され、固定された検出可能標識を検出することに
より該複合体が測定される、請求項２記載の同定方法。 - 【請求項９】 ａ）隣接して結合した配列Ａ１および配
列Ａ２を有する核酸Ａ、 ｂ）配列Ａ１に相補的な配列Ｂ１および相補的な核酸ま
たは核酸類似体を含む三重らせん構造に関与可能な配列
Ｂ２を有する第１核酸類似体Ｂ、ならびに ｃ）三重らせん構造に関与可能な配列Ｃ１および配列Ａ
２に相補的な配列Ｃ２を有する第２核酸類似体Ｃ、を含
んでなる組成物。 - 【請求項１０】 さらに、 ｄ）第１核酸類似体の配列Ｂ２および第２核酸類似体の
配列Ｃ１を含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｄ１を
含む、核酸または核酸類似体Ｄ、または ｅ）第１核酸類似体の配列Ｂ２および第２核酸類似体の
配列Ｃ１を含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｄ１、
ならびに塩基対形成により１以上の第２プローブと結合
可能な配列Ｄ２を含む核酸または核酸類似体Ｄ、を含有
してなる請求項９記載の組成物。 - 【請求項１１】 ａ）配列Ｄ１を有する核酸または核酸
類似体Ｄ、 ｂ）配列Ｂ１、および配列Ｄ１を含む三重らせん構造に
関与可能な配列Ｂ２を有する第１核酸類似体Ｂ、ならび
に ｃ）配列Ｄ１を含む三重らせん構造に関与可能な配列Ｃ
１を有する第２核酸類似体Ｃ、を含んでなる組成物。 - 【請求項１２】 請求項９〜１１いずれか記載の組成物
の成分Ｂ、成分Ｃおよび成分Ｄを、１以上の容器に含ん
でなる核酸Ａの測定用試薬キット。
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