JPH10185782A

JPH10185782A - 蛍光性単一分子を基板表面に並べる方法及び基板表面の構造欠陥を可視化する方法

Info

Publication number: JPH10185782A
Application number: JP26989897A
Authority: JP
Inventors: Mitsuru Ishikawa; 満石川
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 1996-10-24
Filing date: 1997-10-02
Publication date: 1998-07-14

Abstract

(57)【要約】【課題】均一性の高い蛍光性分子の単一分子層を簡単
に基板表面に並べることができる蛍光性単一分子を基板
表面に並べる方法及び基板表面の構造欠陥を可視化する
方法を得る。【解決手段】蛍光性分子例えば吸着色素であるローダ
ミンＢを所定濃度となるようにメタノール溶液に溶解
し、試料溶液７とした。基板５例えばシリコンウエハ上
にレンズクリーニングペーパー６を載置した後、試料溶
液７の１００μｌをレンズクリーニングペーパー６の一
端に滴下した。続いて、有機溶媒が蒸発する前に、試料
溶液７が基板５上を横切るようにレンズクリーニングペ
ーパー６を引っ張った。外部から汚染物を取り込まず、
溶媒や汚染物による妨害を受けずに蛍光測定や散乱光測
定を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光性単一分子を
基板表面に並べる方法、特に、シリコンウエハ等の基板
表面に、蛍光性単一分子を並べる方法、及び基板表面の
構造欠陥を可視化する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】最近の蛍光検出に基づく単一分子画像法
の進歩によって、室温において個々の色素分子の位置、
配向、動き、光化学反応、酵素反応、励起状態の緩和過
程の観察が実現されてきた。特に、走査型近視野顕微法
と走査型共焦点顕微法による個々の色素分子の配向決定
の成功は、色素分子を固定したことに起因する。この場
合、色素分子はポリマー中にドープされている。これに
対して、テレビカメラを備えた通常の光学顕微鏡を用い
ると、機械的な走査なしで、個々の分子を同時に複数個
観察することが可能になる。

【０００３】従来、単一分子の簡便な配列方法として、
スピンコート法が行われており、この方法では、色素を
ポリマーを用いて基板上に展着させて均一に分散させて
いる。なお、ここで単一分子とは、１個の分子の場合の
みならず、１個ずつ区別して数えることができる限り、
複数の分子の場合も含むものである（以下、同様であ
る）。

【０００４】しかし、スピンコート法では、色素をポリ
マーのような粘度の高い不揮発性物質で展着させない
と、色素を均一に分散させることは極めて困難である。
また、ポリマーのような不揮発性物質が介在すると、そ
の物質が外部からの汚染を取り込み易くなる。特に、励
起光が短波長、例えば紫外域になると、外部から取り込
まれた不純物からの蛍光や、場合によってはポリマー自
身の蛍光が単一分子の蛍光測定を妨害する可能性が高く
なるという問題点があった。

【０００５】ところで、シリコンに代表される半導体ウ
エハ表面のサブミクロン以下の欠陥や異物を低減化する
ことは、例えば半導体メモリーの高集積化にとって重要
なことである。その際、半導体ウエハ表面の欠陥や異物
の実態を効率良く認識する方法がいくつか提案され、そ
して実施されている。例えば、光散乱法あるいは光散乱
法と原子間力顕微鏡（以下、ＡＦＭとする）を組み合わ
せた方法が報告されている（例えば藤野ら、応用物理６
６巻第７号、１９９７，７３２−７３３頁）。前者の方
法によって、用いる光の波長程度からその１／１０程度
までの大きさの異物や欠陥が検出されている。また、後
者の方法によって異物や欠陥の検出のみならず、それら
のサイズの評価も可能となっている。

【０００６】光散乱法の特長は、欠陥や異物のサイズ
（サブミクロン以下）と比較して、広いエリア（５０〜
１００ミクロン平方）に散在する欠陥や異物の有無を容
易に検知できることである。しかし、光の回折限界以下
のサイズの異物や欠陥は、その存在を検出できたとして
も実寸を測定することはできない。また、付着した異物
と欠陥の区別は困難であるし、欠陥が周囲の平面に対し
て凸であるか凹であるかの区別はできない。一方、ＡＦ
Ｍでは、光散乱法では不可能な光の回折限界以下のサイ
ズの異物や欠陥の実寸を測定することができる。しか
し、前述のような広いエリアに散在し、しかもどこにあ
るかわからない異物や欠陥を探し出すためには、測定時
間がかかるという困難を抱えている。

【０００７】さらに、光散乱法とＡＦＭを組み合わせる
ことによって両者の欠点を補い長所を生かすことが一部
可能であるが、測定時間がかかるＡＦＭと測定時間がか
からない光散乱法とを組み合わせた場合、結局測定時間
はＡＦＭの測定時間によって律速されてしまう。また、
装置自身のコストの点で、ＡＦＭは有利なものではな
い。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】前述のように、スピン
コート法では、外部から取り込まれた不純物からの蛍光
や、ポリマー自身の蛍光が単一分子の蛍光測定を妨害す
る可能性が高くなるという問題点があった。また、光散
乱法と同程度の簡便さと短い測定時間でかつ異物と欠陥
の区別、欠陥である場合に周囲の平面に対して凸である
か凹であるかに関する情報をもたらす測定手段が望まれ
ていた。

【０００９】そこで本発明は、粘度の低い揮発性溶媒を
用いても均一に個々の分子を分散させることができる単
一分子を基板表面に並べる方法及び基板表面の構造欠陥
を可視化する方法を得ることを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の請求項１に記載
の発明は、蛍光性分子の蛍光計測を行う際に、揮発性の
有機溶媒に蛍光性分子を所定濃度で溶解して試料溶液を
調製し、蛍光計測が行われる基板上に紙片を載置し、基
板上に載置された紙片上に試料溶液を滴下し、次いで有
機溶媒が蒸発する前に、この滴下された試料溶液が基板
表面を横切るように紙片を引っ張ることを特徴とする蛍
光性単一分子を基板表面に並べる方法である。

【００１１】この発明によれば、揮発性有機溶媒に蛍光
性分子を溶解させるので、外部から汚染物を取り込み難
くなり、溶媒や汚染物による蛍光測定の妨害を防止する
ことができる。また、紙片に滴下された試料溶液を基板
表面を横切るように引っ張るため、均一性の高い蛍光性
分子の単一分子層を簡単に基板表面に並べることができ
る。

【００１２】請求項２に記載の発明は、有機溶媒がアル
コール類、エーテル類又はアセトンであることを特徴と
する。

【００１３】請求項３に記載の発明は、紙片がレンズク
リーニングペーパー、カーボン原紙又は薄葉紙からなる
紙片であることを特徴とする。

【００１４】請求項４に記載の発明は、蛍光性分子の濃
度が１０^-4Ｍ以下であることを特徴とする。

【００１５】請求項５に記載の発明は、蛍光性分子の蛍
光計測を行う際に、揮発性の有機溶媒に蛍光性分子を所
定濃度で溶解して試料溶液を調製し、蛍光計測が行われ
る基板上に紙片を載置し、基板上に載置された紙片上に
試料溶液を滴下し、有機溶媒が蒸発する前に、この滴下
された試料溶液が基板表面を横切るように紙片を引っ張
ることにより蛍光性単一分子を基板表面に並べ、蛍光性
単一分子が並べられた基板表面にレーザー光を照射し、
次いで基板表面で発生した蛍光を測定し、測定した蛍光
から蛍光輝点を求めることを特徴とする基板表面の構造
欠陥を可視化する方法である。

【００１６】この発明によれば、基板表面に並べられた
均一性の高い蛍光性分子の単一分子層を測定するので、
正確な蛍光計測を行うことができ、蛍光輝点から基板表
面の構造欠陥を可視化することができる。

【００１７】請求項６に記載の発明は、蛍光性分子が付
着した基板表面の散乱光計測を行う際に、揮発性の有機
溶媒に蛍光性分子を所定濃度で溶解して試料溶液を調製
し、散乱光計測が行われる基板上に紙片を載置し、基板
上に載置された紙片上に試料溶液を滴下し、有機溶媒が
蒸発する前に、この滴下された試料溶液が基板表面を横
切るように紙片を引っ張ることにより蛍光性単一分子を
基板表面に並べ、蛍光性単一分子が並べられた基板表面
にレーザー光を照射し、次いで基板表面で発生した散乱
光を測定し、測定した散乱光から散乱光輝点を求めるこ
とを特徴とする基板表面の構造欠陥を可視化する方法で
ある。この場合、付着した蛍光性分子の単一分子層は均
一性が高いので、蛍光性分子それ自身は散乱光に寄与し
ない。

【００１８】この発明によれば、基板表面に並べられた
均一性の高い蛍光性分子の単一分子層が付着した基板表
面を観察するので、色素分子それ自身による散乱光では
なくて、基板表面それ自身の凹凸に起因する散乱光を正
確に計測することができる。この発明によって得られた
散乱光輝点の位置と、散乱光観測に用いたものと同じ試
料の同じ視野で蛍光輝点の位置を比較することによっ
て、基板表面の構造欠陥を可視化することができる。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下、添付図面に基づき、本発明
の実施形態について説明する。図１は、本発明の実施形
態による蛍光性単一分子を基板表面に並べる方法を示す
概略説明図であり、（ａ）はそのフローチャート、
（ｂ）は基板及び紙片であるレンズクリーニングペーパ
ーの斜視図である。

【００２０】まず、同図（ａ）の工程１により、蛍光性
分子の蛍光計測に用いる試料溶液を調製する。試料溶液
は、蛍光計測の測定対象となる蛍光性分子を、所定の濃
度となるように揮発性の有機溶媒に溶解する。本発明に
おいて使用できる蛍光性分子としては、例えばローダミ
ンＢ、各種クマリン系色素、ローダミン６Ｇ、ローダミ
ン１１０、スルホローダミン６４０、フルオレセイン、
ウラニン、ナイルブルー、クレジルバイオレット、アク
リジンオレンジや、マラカイトグリーン及びクリスタル
バイオレットに代表されるトリフェニルメタン系色素、
シアニン系色素等である。特に、メタノールに溶ける蛍
光物質であれば、特に制約なく使用できる。

【００２１】このような蛍光性分子を好適には１０^-4Ｍ
以下の濃度、最適では１０^-5Ｍの濃度になるように有機
溶媒に溶解する。蛍光性分子の濃度が１０^-4Ｍを越える
と、蛍光性分子が固まる傾向が見られるため望ましくな
いからである。更に好適には、蛍光性分子の濃度を１０
^-7Ｍ以上となるようにするのが望ましい。蛍光性分子の
濃度が１０^-7Ｍ未満であると、基板５のピットに蛍光性
分子が行き渡らなくなるからである。揮発性の有機溶媒
としては、例えばメタノール、エタノール等のアルコー
ル類やエーテル類、アセトン、エチレングリコール等が
好適に使用できる。

【００２２】次に、工程２において、基板５例えばシリ
コンウエハ上に、レンズクリーニングペーパー６を載置
する。基板５は、表面が平滑であれは特に限定されるも
のではなく、種々の板状の部材が使用できる。また、本
実施形態ではレンズクリーニングペーパー６を好適な紙
片の例として使用しているが、ある程度の強度及び浸透
性があり、パーティクルの出ないものであれれば種々の
紙片が使用できる。例えば、日本工業規格におけるカー
ボン原紙（ＪＩＳＰ３９０１）や薄葉紙（機械ズキ和
紙、ＪＩＳＰ４５００）が好適に使用できる。

【００２３】すなわち、前記ＪＩＳＰ３９０１に記載
されているように、引っ張り強さが縦１．３ｋｇ以上、
横０．６ｋｇ以上、破裂強さ０．３ｋｇ／ｃｍ²以上で
あるカーボン紙と同等な特性を有する紙片が本発明にお
いて使用できる。また、前記ＪＩＳＰ４５００に記載
されているように、裂断長が縦４．０ｋｍ以上、横１．
３ｋｍ以上である薄葉紙と同等な特性を有する紙片が本
発明において使用できる。

【００２４】次に、工程３において、工程１で調製した
試料溶液７をレンズクリーニングペーパー６の一端に滴
下する。試料溶液７の滴下量は、基板５の直径が２イン
チの場合、例えば２０μｌ〜２００μｌが好適であり、
使用するレンズクリーニングペーパー６や基板５の大き
さにより適宜変更できる。滴下された試料溶液７は、毛
細管現象によりレンズクリーニングペーパー６上で広が
ると共に、レンズクリーニングペーパー６の裏面に浸透
し、基板５の表面に達する。

【００２５】次いで、工程４において、有機溶媒が蒸発
する前に、滴下された試料溶液７が基板５の表面を横切
るようにレンズクリーニングペーパー６の他端を引っ張
り、基板５の表面に試料溶液７を塗布する。そして、レ
ンズクリーニングペーパー６を基板５から除去して試料
溶液７を乾燥させれば、蛍光性分子の単一層を基板５の
表面に並べることができる。このような方法によれば、
従来のスピンコート法を用いた場合より均一性の高い単
一分子層が得られる。

【００２６】

【実施例】さらに、実施例に基づいて、本発明をさらに
詳細に説明する。実施例１まず、蛍光性分子の試料溶液７を、次のような手順で調
製した。蛍光性分子としては、吸着色素であるローダミ
ンＢを使用し、所定濃度となるようにローダミンＢをメ
タノール溶液に溶解し、試料溶液７とした。また、基板
５として直径２インチのシリコンウエハを使用し、この
基板５上にレンズクリーニングペーパー６を載置した
後、図１に示すように、試料溶液７の１００μｌをレン
ズクリーニングペーパー６の一端に滴下した。続いて、
メタノール溶液が蒸発する前に、試料溶液７が基板５上
を横切るようにレンズクリーニングペーパー６を引っ張
った。

【００２７】次に、図２に示す蛍光光子計測装置を使用
し、単一光子計数法により蛍光光子数の定量的評価を行
った。図２は、蛍光光子計測装置を画像処理装置等を含
めて示した概略図である。図において、光源８として用
いたレーザーは、モード同期アルゴンイオンレーザー励
起によるキャビティダンパー付きシンクロナスモード同
期色素レーザーである。このレーザーは、パルス半値幅
１０ｐｓ、発振波長５４０ｎｍであり、繰り返して４Ｍ
Ｈｚ、平均出力１４ｍＷで使用した。試料分子の配向の
問題を避けるために、バビネ・ソレイユ補償器９を用い
て励起光を直線偏光から円偏光に変換し、レンズ１０を
介して基板５に入射させた。なお、基板５は、３次元に
移動可能なステージ１１上に搭載されている。

【００２８】単一光子計数テレビカメラシステムは、単
一光子計数用のカメラヘッド１２、イメージ・インテン
シファイア(II)コントローラ（以下、単にコントローラ
とする）１３、画像処理装置１４、そしてコンピュータ
１５から構成されている。カメラヘッド１２は、リレー
レンズ１６を介して落射照明蛍光顕微鏡と結合されてお
り、この顕微鏡は２枚のレンズ１７，１８を備えてい
る。蛍光は、１００倍の倍率を有する対物レンズ２１を
用いて集められる。

【００２９】この対物レンズ２１は、ニコン（株）製商
品名「ニコンＣＦＭＰｌａｎＳＬＷＤ」であり、開
口数０．７５、作動距離４．７ｍｍである。なお、基板
５上の試料表面からの励起光を遮断するために、ロング
パスフィルター１９（ニコン（株）製商品名「ニコンＢ
Ａ５８０」）と二色フィルター２０（ニコン（株）製商
品名「ニコンＤＭ５１０」）を用いた。これらのフィル
ターは、緑色励起光を用いた場合の標準的な組み合わせ
である。

【００３０】また、画像処理装置１４上でデジタル化さ
れた１画素の画像は、５１２×４８３ピクセルであり、
１ピクセル＝０．１２μｍである。レンズ１８の焦点距
離を１００ｍｍとし、試料表面上での励起光強度が〜
１．８Ｗ／ｃｍ²となった。得られたデータは、光子計
数カメラの最大感度で３０秒間積算した。なお、前述し
たすべての装置は、清浄度がクラス１０００のクリーン
・ブース内に設置した。後述する図６に関連した実験を
除いて、すべての実験は大気中２９６Ｋで行った。

【００３１】吸着色素が存在する表面内の蛍光強度分布
は、後述する図４に示すように均一ではない。しかし、
１枚の画像の全エリア（５１２×４８３ピクセル）につ
いて足し合わされた全光子数は、１．４７×１０^-7Ｍの
場合を除いておよそファクター３の範囲内で均一となっ
た。ここに、「ファクター３」とは、バラツキの程度が
３倍という意味であり、図３の場合、試料溶液の濃度が
１．４７×１０^-6Ｍのときの全蛍光光子数のバラツキ
は、ほぼ５０００カウント〜１５０００カウントの範囲
に収まっている。これを「ファクター３」の範囲で一定
と称した。

【００３２】この全光子数は、図３に示すように、試料
溶液７の調製に用いた色素濃度に対して、近似的に直線
関係を示した。図３は、試料溶液濃度と全蛍光光子数と
の関係を示す線図である。なお、全蛍光光子数とは、画
面（５１２×４８３ピクセル）全体の蛍光光子数とバッ
クグランドの光子数を加えたものである。吸着の均一性
の尺度は、測定した多数の画像における全光子数のバラ
ツキから評価した。

【００３３】評価に用いた画像の数は、それぞれ１．４
７×１０^-4Ｍの場合は１０枚、１．４７×１０^-5Ｍの場
合は１５枚、１．４７×１０^-6Ｍの場合は６４枚、１．
４７×１０^-7Ｍの場合は５０枚であった。求められたバ
ラツキは、１．４７×１０^-4Ｍ、１．４７×１０^-5Ｍ、
及び１．４７×１０^-6Ｍの場合ではファクター３以内で
あった。一方、１．４７×１０^-7Ｍの場合には、ファク
ター〜１５となった。

【００３４】この大きなバラツキの原因は、後述する図
４（ｄ）に示すように、１．４７×１０^-7Ｍの場合、１
画素当たりに含まれる輝点の数がまばらなためである。
また、カメラヘッド１２の光電面に蛍光が入らないよう
に、図２に示した顕微鏡のレンズ１６とレンズ１７の間
にある窓を閉じた時、観測されたダークカウントは、〜
５０カウント／３０秒／全画素であった。なお、カメラ
の感度は最大に設定してある。さらに、窓を開けた時の
このダークカウントを含む全バックグランドは、〜３３
０カウント／３０秒／全画素であった。但し、バックグ
ランド測定の時には、基板５上には試料溶液７は付着し
ていない。

【００３５】図４は、各濃度の試料溶液７を基板５に固
定させた場合における蛍光輝点の顕微鏡写真をトレース
した図である。試料溶液の濃度は、同図（ａ）では１．
４７×１０^-4Ｍ、同図（ｂ）では１．４７×１０^-5Ｍ、
同図（ｃ）では１．４７×１０^-6Ｍ、同図（ｄ）では
１．４７×１０^-7Ｍであった。これらの図において、輝
点の数は試料溶液７の濃度の増加と共に増加し、同図
（ｄ）〜（ａ）でそれぞれ３、１４、７８、１１７とな
った。但し、同図（ａ）では、背景蛍光が増大するの
で、輝点の同定は曖昧となっている。

【００３６】同図（ａ）から同図（ｂ）にかけて、輝点
の数は明らかに飽和している。この結果は、蛍光輝点が
色素の吸着に都合の良いサイト上で形成されている可能
性を示唆している。さらに、これらの画像から、１．４
７×１０^-5Ｍ以上の濃度では、輝点に寄与しないバック
グランド的な蛍光光子が現れてくることが判る。この過
剰な蛍光は、試料溶液の溶媒や空気中の汚染物によるも
のではなく、色素そのものによるものである。

【００３７】なぜならば、１画素当たりの全蛍光光子数
（輝点の蛍光＋過剰蛍光）と試料溶液濃度とは、図３に
示したように、比例関係にあるからである。もしこの過
剰な蛍光が何らかの汚染物に起因するならば、過剰な蛍
光は試料溶液の濃度によらずに図４のすべての画像に共
通して見出されるはずだからである。従って、本発明で
は揮発性の溶媒を使用しているため、外部から汚染物を
取り込み難いことが判る。

【００３８】図５は、個々の蛍光輝点に寄与している蛍
光光子数を数えて、その蛍光光子数の出現頻度数の統計
分布を示すヒストグラムである。同図（ａ）〜（ｃ）
は、それぞれ１．４７×１０^-5Ｍ、１．４７×１０
^-6Ｍ、１．４７×１０^-7Ｍの試料溶液を使用した場合に
対応している。なお、背景蛍光が増大するために輝点の
同定が曖昧になるので、１．４７×１０^-4Ｍの試料溶液
についてのヒストグラムは作成しなかった。得られた蛍
光蛍光カウント数は、２０カウントおきに丸めてヒスト
グラムを作成した。また、１０００カウント以上の輝点
が見出される場合があるが、それらはヒストグラムから
除外している。

【００３９】これらの図に示される３つのヒストグラム
は、すべて１００カウント間隔で極大を示している。１
００カウントの量子化は、吸着色素の調製に用いた試料
溶液の濃度に依存しないで現れたものであることを強調
しておく。この結果は、１００カウントが、本発明の実
施形態で設定した実験条件下で１個の色素分子に起因し
ていることを示している。

【００４０】この他に、１００カウントが１個の色素分
子に起因していることを示す２つの実験事実がある。そ
れは、色素の光退色が階段状になって進行し、そのステ
ップがほぼ１００カウントあるいはその整数倍で起こっ
ていること（データはここに示していない）、及び所定
の実験条件下で１個の色素分子から観測可能な蛍光光子
数がほぼ１００カウントになることである。従って、図
５に示した１００カウントおきに量子化された蛍光光子
数は、１個から８個までの色素分子に対応していること
になる。

【００４１】ところが、図４（ｂ）の場合、輝点に着目
すると、１００カウント及びその整数倍のカウント数
は、面積７８〜１１３ピクセルのサークル内に局在化し
ている。一方、輝点以外の背景部分で１００カウントを
得るためには、面積が約１２００ピクセルのサークルを
設定しなければならない。この結果から、図４（ａ）及
び（ｂ）に見られる輝点以外の過剰な背景蛍光は非局在
化した、おそらく動いている蛍光分子に因るものと考え
ざるを得ない。

【００４２】この推測を確かめるために、蛍光画像の形
態の温度依存性を調べた。すなわち、温度を下げると分
子を駆動している熱エネルギーが減少するので、非局在
化したバックグランドが消えて局在化した輝点が現れる
ことが予想される。図６は、１．４７×１０^-4Ｍの試料
溶液を用い、温度を変化させた場合における蛍光輝点の
顕微鏡写真をトレースした図である。同図（ａ）は６６
Ｋで観測された蛍光輝点を示し、同図（ｂ）は３００Ｋ
に昇温して観測された蛍光輝点を示し、さらに、同図
（ｃ）は再び６６Ｋに降温して観測された蛍光輝点を示
している。

【００４３】同図（ａ）で観測された蛍光輝点は同図
（ｂ）では消滅し、同図（ｃ）で再び観測された。従っ
て、前述した図４（ａ）及び（ｂ）に示したような非局
在化した蛍光は、「動いている色素分子によるもの」と
いう考え方が裏付けられた。これにより、基板５の表面
には蛍光性分子の単一分子層が形成されていることが判
る。

【００４４】なお、図６の蛍光輝点観測の詳細は次の通
りである。同図（ａ）において、いくつかの蛍光輝点が
ぼんやりとした輪郭の蛍光像の内部に見出された。同図
（ｂ）では、ひとつの例外を除いて６６Ｋで観測された
蛍光輝点はほぼ消えてしまった。さらに、同図（ｃ）で
は、いくつかの蛍光輝点が再び現れた。しかし、輝点の
数と輝点のコントラストは同図（ａ）の場合から変化し
ている場合がある。特に、矢印Ａで示した輝点は、完全
に消滅している。また、矢印Ｂで示した輝点（これには
ぼんやりとした輪郭の蛍光像の背景を伴っていない）
は、３つの画像に共通して見出された。但し、３００Ｋ
の場合は（同図（ｂ））、幾分縦長になって観測され
た。よって、この輝点は色素吸着に都合の良いサイトか
らのものと思われる。

【００４５】また、ここで用いた実験条件は、図４の場
合とは異なる点がある。すなわち、光学顕微鏡用のクラ
イオスタットをステージ１１上に追加した。また、試料
が並べられた基板５の雰囲気は、大気圧ではなく１０^-6
〜１０^-7Ｔｏｒｒとした。対物レンズ２１は、倍率２０
倍、開口数０．４、作動距離２０ｍｍの対物レンズ（ニ
コン（株）製商品名「ニコンＣＦＭＰｌａｎＳＬ
ＷＤ」）を用いた。低倍率の対物レンズを用いた理由
は、クライオスタットの厚さ１．５ｍｍの石英製の窓に
起因する光学的収差の影響をみかけ上小さくするために
である。

【００４６】このように、実験条件を変更したので、図
６で測定した光子数と図３〜図５で測定した光子数の定
量的な比較はできないので、ここでは蛍光画面の温度依
存性のみに注目した。画像全体の総光子カウント数は、
図６（ａ）では６９６１８、同図（ｂ）では２９１４
１、同図（ｃ）では４９０１２となり、同図（ａ）と同
図（ｃ）では再現しなかった。

【００４７】一方、矢印Ｂで示した輝点に注目すると、
そのカウント数は、図６（ａ）では７９７、同図（ｂ）
では４７８、同図（ｃ）では７６９となり、同図（ａ）
と同図（ｃ）では再現した。画像全体では、同図（ａ）
から同図（ｃ）へとカウント数が減ったのは、雰囲気の
気圧が減少しているために色素分子が基板５から脱着し
たためと考えられる。

【００４８】この結果は、吸着色素には弱く基板５に吸
着しているものも存在するという考えを支持している。
一方、カウント数が再現していることから、矢印Ｂで示
した輝点は、色素吸着に都合の良いサイトからのものと
いう考えを支持している。なお、この輝点のカウント数
が３００Ｋ（同図（ｂ））では６６Ｋ（同図（ａ）、
（ｃ））よりも小さくなるメカニズムについては、既に
報告されている事実によって説明可能である（例えばKe
mnitz, K., Tamai, N., Yamazaki, I., Nakashima, N.,
Yoshihara, K. J. Phys. Chem. 1986, 90, 5094-510
1）。

【００４９】以上から、固体表面になんら固定化処理を
しないで吸着させた色素分子は、局在化と非局在化とい
う２つの異なった状態を採っていることが判る。すなわ
ち、（１）局在化している蛍光光子はクラスターを形成して
いて、そのクラスターは色々な数（１個から数個）の色
素分子から構成されている。この結果は吸着色素の調製
に用いた試料溶液の濃度には依存しない。（２）一方、
非局在化した蛍光光子は、１．４７×１０^-5Ｍよりも高
い濃度の試料溶液を用いて吸着色素を調製した場合に見
出された。これは色素分子が動いていることに起因す
る。このような新規に見出された事実は、吸着状態にあ
る色素分子の物理的性質を今まで以上に詳細に理解する
のに貢献することが期待される。

【００５０】一般に、基板等の表面で起こる多くの化学
現象は、吸着分子の２次元配置や動きに敏感であると考
えられる。例えば基板等の表面での反応や触媒作用は、
分子同士あるいは分子と基板表面が都合の良い反応経路
に適合するように遭遇したときにのみ起こる。表面化学
にとって、その解明は本質的に吸着系の分子の動きを理
解することに依存するものと考えられる。吸着系におけ
るこれまでの膨大な研究では、分子が一様に分布して固
定化されているという描像が仮定されてきた。しかし、
このような仮定は必ずしも正しくないということが本発
明によって実証された。本発明による蛍光性分子を基板
表面に並べる方法、いわば、蛍光単一分子イメージング
法が適用できる分子は、蛍光性のものに限られている
が、重要な応用が考えられる。

【００５１】その応用は、近い将来の分析化学に見出さ
れるものと考えられる。そこでは、１個を極限とする少
数の蛍光ラベル化された、あるいは自己蛍光性の標的分
子がシリコンウエハのような基板表面に準備されること
になるだろう。本発明方法は、固体表面上に光リソグラ
フィー技術によって施された微細構造を利用するタイプ
のミニチュア化された分析化学システムにおける蛍光計
測のキーテクノロジーとしてさらに発展させる必要があ
る。今日、分析化学システムのミニチュア化は、分析化
学において急速に発展しつつあるテクノロジーである。
本発明で明らかにされた表面上の個々の色素分子の局在
性や運動性を理解することは、個体表面を利用する将来
の単一分子分析システムに要求されるであろう分子の移
動や固定を考えるための出発点になると考えられる。

【００５２】実施例２次に、蛍光輝点が選択的にローダミンＢを吸着するよう
な穴の位置と一致するという可能性を明らかにするため
の実験を行った。試料溶液７の調製、基板５への単一分
子層の形成等は、実施例１と同様に行った。実施例２で
は、基板５にレーザー光を照射し、後述する実験条件に
より、基板５表面からの散乱光を三次元的に捕らえ、そ
の散乱強度分布から基板５表面上の欠陥や異物の実態を
認識する光散乱法を採用している。散乱光の強度測定
は、検出器にレーザー光を直接入射した時に得られる出
力を１とした時、散乱光強度を１〜１０^-8の範囲で測定
できる。

【００５３】前述の図４（ｄ）に示したような観測結果
から、蛍光輝点が観測された位置は、主として自然酸化
膜で覆われた基板５上に元々存在する穴が存在すると推
定した。このような推定の背後にある可能な解釈は、次
の通りである。すなわち、試料溶液７を調製するのに用
いた吸着色素であるローダミンＢ溶液の濃度が１０^-7，
１０^-6，１０^-5Ｍと増えるにつれて蛍光輝点の数が増え
るのは、基板５上の穴がしだいにローダミンＢで埋まっ
てゆくからである。

【００５４】一方、吸着色素の試料を調製するのに用い
たローダミンＢ溶液の濃度が１０^-5Ｍで蛍光輝点の数が
ほぼ飽和して、１０^-4Ｍでは輝点を形成しない蛍光が増
加しているのは、穴がローダミンＢで埋めつくされて、
穴に入りきれなかったローダミンＢが溢れたためであ
る。そこで、以下の実験では、１０^-5ＭのローダミンＢ
溶液を用いて調製した吸着試料を用いた。なぜならば、
前述の推定が正しいとすれば、この試料では蛍光輝点の
位置と穴の位置の間の相関が高いことが予想されるから
である。

【００５５】図２に示した蛍光光子計測装置を使用し、
吸着試料をレーザー励起して、蛍光測定のときに用いた
励起光をカットして蛍光を透過するロングパスフィルタ
ー（ＬＰ）１９を顕微鏡からはずして観測したところ、
緑色のレーザー光の散乱によるスポットを見出した。こ
の顕微鏡写真をトレースした図を図７（Ａ）に示す。図
７（Ａ）は、１０^-5ＭのローダミンＢ溶液を用いて調製
した試料溶液７を蛍光観測用フィルターであるロングパ
スフィルター１９がない状態で散乱光を観測した顕微鏡
写真である。

【００５６】この図から明らかなように、レーザーの散
乱に起因する輝点のみが観測された。なお、用いたレー
ザーは連続発振のアルゴンイオンレーザー（５１４．５
ｎｍ）で、パワー密度は〜０．０５Ｗ／ｃｍ²であっ
た。画像測定に用いた光子計数カメラの感度は最小に設
定した。図中の赤の矢印は、蛍光輝点の位置と一致した
レーザー散乱光輝点を示す。一方、緑の矢印は蛍光輝点
の位置と一致しないレーザー散乱光輝点を示す。

【００５７】次に、ロングパスフィルター１９を装着し
て図７（Ａ）の画像を観測したのと同じ視野で蛍光画像
を観測した。この時の顕微鏡写真をトレースした図を図
７（Ｂ）に示す。図７（Ｂ）では、連続発振のアルゴン
イオンレーザー（５１４．５ｎｍ）のパワー密度は〜５
Ｗ／ｃｍ²であり、画像測定に用いた光子計数カメラの
感度を最大に設定した。赤の矢印はレーザー散乱光輝点
の位置と一致しない蛍光輝点を示す。この結果は、ロー
ダミンＢそれ自身がレーザー散乱光輝点の原因ではない
ことを示している。ここで用いた光子計数カメラの感度
は、画像（Ａ）の場合よりも〜１０⁴大きい。なお、こ
こで示した画像からレーザー散乱光輝点の位置と蛍光輝
点の位置を詳しく比較することは困難なので、図７
（Ａ），（Ｂ）は共に輝点の選別は原顕微鏡写真を用い
て行った。

【００５８】図７（Ａ），（Ｂ）の画像を比較すると、
レーザー光による輝点の位置と蛍光輝点の位置の間に高
い相関があることがわかる。この実験結果は、蛍光輝点
が観測された位置は主として自然酸化膜で覆われた基板
５上に元々存在する穴である、という推定を支持するも
のである。もちろんレーザー光による散乱光の輝点の原
因として、基板５に付着した粒子の可能性を完全に否定
することはできない。

【００５９】しかし、クリーニングペーパーを用いて拭
き取ることが可能な粒子で汚染された基板５を用いる、
すなわち、レンズクリーニングペーパー６による拭き取
りをしない場合には、図８（Ａ），（Ｂ）に示すよう
に、レーザー散乱光の輝点の位置と蛍光輝点の位置の相
関は図７（Ａ），（Ｂ）と比較して良くない。なお、図
８（Ａ），（Ｂ）は、共に図７（Ａ），（Ｂ）の測定条
件とそれぞれ同一であり、顕微鏡写真をトレースした図
である。また、図８（Ａ）に蛍光輝点の位置と一致した
散乱光輝点は、矢印で指し示す黒丸で示してある。

【００６０】レーザー散乱光を観測することにより、穴
と粒子すなわち、凹部と凸部とが共に観測され、蛍光を
観測することにより穴すなわち凹部が観測されるため、
図８（Ａ），（Ｂ）では相関が良くなかったものであ
る。従って、レーザー散乱光と蛍光の観測結果を勘案す
ることにより、凹部のみの計測が可能となる。すなわ
ち、レーザー散乱光のスポットが異物であるか欠陥であ
るかの識別が可能となる。特に、周囲の平面に対して凹
である欠陥の検出が容易となる。このように、蛍光輝点
及び散乱光輝点から、基板表面の構造欠陥を可視化する
ことが可能となる。

【００６１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
揮発性有機溶媒に蛍光性分子を溶解させるので、外部か
ら汚染物を取り込まず、溶媒や汚染物による妨害を受け
ずに蛍光測定を行うことができる。また、レンズクリー
ニングペーパーに滴下された試料溶液を基板表面を横切
るように引っ張るので、均一性の高い蛍光性分子の単一
分子層を簡単に基板表面に並べることができる。

【００６２】また、基板表面に並べられた均一性の高い
蛍光性分子の単一分子層を測定するので、正確な蛍光計
測を行うことができ、蛍光輝点から基板表面の構造欠陥
を可視化することができる。さらに、基板表面に並べら
れた均一性の高い蛍光性分子の単一分子層が付着した基
板表面を観察するので、色素分子それ自身による散乱光
ではなくて、基板表面それ自身の凹凸に起因する散乱光
を正確に計測することができる。この発明によって得ら
れた散乱光輝点の位置と、散乱光観測に用いたものと同
じ試料の同じ視野で蛍光輝点の位置を比較することによ
って、基板表面の構造欠陥を可視化することができると
いう効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施形態による蛍光性単一分子を基板
表面に並べる方法を示す概略説明図であり、（ａ）はそ
のフローチャート、（ｂ）は基板及びレンズクリーニン
グペーパーの斜視図である。

【図２】本発明の実施形態で使用する蛍光光子計測装置
を画像処理装置等を含めて示した概略図である。

【図３】試料溶液濃度と全蛍光光子数との関係を示す線
図である。

【図４】各濃度の試料溶液を基板に固定させた場合にお
ける蛍光輝点の顕微鏡写真をトレースした図であり、
（ａ）は１．４７×１０^-4Ｍ、（ｂ）は１．４７×１０
^-5Ｍ、（ｃ）は１．４７×１０^-6Ｍ、（ｄ）は１．４７
×１０^-7Ｍの試料溶液を使用した場合をそれぞれ示して
いる。

【図５】個々の蛍光輝点に寄与している蛍光光子数を数
えて、その蛍光光子数の出現頻度数の統計分布を示すヒ
ストグラムであり、（ａ）は１．４７×１０^-5Ｍ、
（ｂ）は１．４７×１０^-6Ｍ、（ｃ）は１．４７×１０
^-7Ｍの試料溶液を使用した場合をそれぞれ示している。

【図６】１．４７×１０^-4Ｍの試料溶液を用い、温度を
変化させた場合における蛍光輝点の顕微鏡写真をトレー
スした図であり、（ａ）は６６Ｋで観測された蛍光輝点
を示し、（ｂ）は３００Ｋに昇温して観測された蛍光輝
点を示し、（ｃ）は再び６６Ｋに降温して観測された蛍
光輝点を示している。

【図７】図２に示した蛍光光子計測装置を使用して試料
溶液を基板に固定させた場合の顕微鏡写真をトレースし
た図であり、（Ａ）は顕微鏡からロングパスフィルター
をはずして観測した散乱光輝点を示し、（Ｂ）は顕微鏡
にロングパスフィルターを取り付けた状態で（Ａ）と同
じ視野で観測した蛍光輝点を示している。

【図８】図２に示した蛍光光子計測装置を使用して、試
料溶液をレンズクリーニングペーパーによる拭き取りを
せずに基板に固定させた場合の顕微鏡写真をトレースし
た図であり、（Ａ）は顕微鏡からロングパスフィルター
をはずして観測した散乱光輝点を示し、（Ｂ）は顕微鏡
にロングパスフィルターを取り付けた状態で（Ａ）と同
じ視野で観測した蛍光輝点を示している。

【符号の説明】

５…基板、６…レンズクリーニングペーパー、７…試料
溶液、８…光源、９…バビネ・ソレイユ補償器、１０，
１７，１８…レンズ、１１…ステージ、１２…カメラヘ
ッド、１３…コントローラ、１４…画像処理装置、１５
…コンピュータ、１６…リレーレンズ、１９…ロングパ
スフィルター、２０…二色フィルター、２１…対物レン
ズ、Ａ，Ｂ…矢印。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛍光性分子の蛍光計測を行う際に、揮発
性の有機溶媒に前記蛍光性分子を所定濃度で溶解して試
料溶液を調製し、蛍光計測が行われる基板上に紙片を載置し、前記基板上に載置された前記紙片上に前記試料溶液を滴
下し、次いで前記有機溶媒が蒸発する前に、この滴下さ
れた試料溶液が前記基板表面を横切るように前記紙片を
引っ張ることを特徴とする蛍光性単一分子を基板表面に
並べる方法。
【請求項２】前記有機溶媒は、アルコール類、エーテ
ル類又はアセトンであることを特徴とする請求項１記載
の蛍光性単一分子を基板表面に並べる方法。
【請求項３】前記紙片は、レンズクリーニングペーパ
ー、カーボン原紙又は薄葉紙からなる紙片であることを
特徴とする請求項１記載の蛍光性単一分子を基板表面に
並べる方法。
【請求項４】前記蛍光性分子の濃度は、１０^-4Ｍ以下
であることを特徴とする請求項１記載の蛍光性単一分子
を基板表面に並べる方法。
【請求項５】蛍光性分子の蛍光計測を行う際に、揮発
性の有機溶媒に前記蛍光性分子を所定濃度で溶解して試
料溶液を調製し、蛍光計測が行われる基板上に紙片を載置し、前記基板上に載置された前記紙片上に前記試料溶液を滴
下し、前記有機溶媒が蒸発する前に、この滴下された試料溶液
が前記基板表面を横切るように前記紙片を引っ張ること
により蛍光性単一分子を基板表面に並べ、前記蛍光性単一分子が並べられた前記基板表面にレーザ
ー光を照射し、次いで前記基板表面で発生した蛍光を測
定し、測定した蛍光から蛍光輝点を求めることを特徴とする基
板表面の構造欠陥を可視化する方法。
【請求項６】蛍光性分子が付着した基板表面の散乱光
計測を行う際に、揮発性の有機溶媒に前記蛍光性分子を
所定濃度で溶解して試料溶液を調製し、散乱光計測が行われる基板上に紙片を載置し、前記基板上に載置された前記紙片上に前記試料溶液を滴
下し、前記有機溶媒が蒸発する前に、この滴下された試料溶液
が前記基板表面を横切るように前記紙片を引っ張ること
により蛍光性単一分子を基板表面に並べ、前記蛍光性単一分子が並べられた前記基板表面にレーザ
ー光を照射し、次いで前記基板表面で発生した散乱光を
測定し、測定した散乱光から散乱光輝点を求めることを特徴とす
る基板表面の構造欠陥を可視化する方法。