JPH10191981A - 制限酵素断片長多型の解析方法 - Google Patents
制限酵素断片長多型の解析方法Info
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- JPH10191981A JPH10191981A JP9001724A JP172497A JPH10191981A JP H10191981 A JPH10191981 A JP H10191981A JP 9001724 A JP9001724 A JP 9001724A JP 172497 A JP172497 A JP 172497A JP H10191981 A JPH10191981 A JP H10191981A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ＤＮＡの制限酵素断片長多型を簡便かつ効率
よく解析し、多型マーカーを選択する方法を提供する。 【解決手段】 制限酵素で切断されたＤＮＡ断片の末端
の一方づつに連結可能な塩基配列を有するアダプターを
連結し、各々のアダプターにアニールしたときに、アダ
プターと塩基対を形成しないヌクレオチドが３’末端側
に突出する構造を有する２種のオリゴヌクレオチドの数
が、同じオリゴヌクレオチドセットに属するものの間で
は等しく、異なるセットに属するものの間では異なる少
なくとも２対のオリゴヌクレオチドセットから、前記突
出するヌクレオチドが少ない順にオリゴヌクレオチドセ
ットを一対づつ選択してプライマーとし、かつ、突出す
るヌクレオチドの数が最も多いオリゴヌクレオチドセッ
トの少なくとも一方のプライマーに蛍光標識されたもの
を用い、順次ポリメラーゼ連鎖反応を行い、この反応産
物を、電気泳動装置により分析する。
よく解析し、多型マーカーを選択する方法を提供する。 【解決手段】 制限酵素で切断されたＤＮＡ断片の末端
の一方づつに連結可能な塩基配列を有するアダプターを
連結し、各々のアダプターにアニールしたときに、アダ
プターと塩基対を形成しないヌクレオチドが３’末端側
に突出する構造を有する２種のオリゴヌクレオチドの数
が、同じオリゴヌクレオチドセットに属するものの間で
は等しく、異なるセットに属するものの間では異なる少
なくとも２対のオリゴヌクレオチドセットから、前記突
出するヌクレオチドが少ない順にオリゴヌクレオチドセ
ットを一対づつ選択してプライマーとし、かつ、突出す
るヌクレオチドの数が最も多いオリゴヌクレオチドセッ
トの少なくとも一方のプライマーに蛍光標識されたもの
を用い、順次ポリメラーゼ連鎖反応を行い、この反応産
物を、電気泳動装置により分析する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、制限酵素断片長多
型の解析方法に関し、特に、植物育種に用いられる多型
マーカーの選択等に有用な制限酵素断片長多型を解析す
る方法に関する。
型の解析方法に関し、特に、植物育種に用いられる多型
マーカーの選択等に有用な制限酵素断片長多型を解析す
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ある遺伝子の有無あるいは遺伝子型を調
べる方法として、制限酵素断片長多型（Restriction fr
agment length polymorphisms ：ＲＦＬＰ）による解析
技術が知られている。ＲＦＬＰは、生物の個体間で遺伝
子の構造の異なる部位に制限酵素部位が存在すると、制
限酵素切断断片の大きさが異なることを利用したもので
ある。多型を示すＤＮＡ領域が特定されている場合に
は、その領域をターゲットとするプローブをマーカーと
することにより、ある遺伝子が由来する個体を特定する
ことができ、これを利用した植物育種は、従来の育種期
間を大幅に短緒することを可能とする重要な技術であ
る。
べる方法として、制限酵素断片長多型（Restriction fr
agment length polymorphisms ：ＲＦＬＰ）による解析
技術が知られている。ＲＦＬＰは、生物の個体間で遺伝
子の構造の異なる部位に制限酵素部位が存在すると、制
限酵素切断断片の大きさが異なることを利用したもので
ある。多型を示すＤＮＡ領域が特定されている場合に
は、その領域をターゲットとするプローブをマーカーと
することにより、ある遺伝子が由来する個体を特定する
ことができ、これを利用した植物育種は、従来の育種期
間を大幅に短緒することを可能とする重要な技術であ
る。
【０００３】しかし、多型を検出し、多型マーカーを選
択することを目的とする場合には、任意の配列を有する
プローブあるいはランダムな配列を有するプローブを用
いる方法が用いられている（Theor. Appl. Genet, 80,
437-448, 1990）が、トマト、コムギ、ワタ、ダイズな
どの植物では、他の植物に比べて品種間での多型が少な
いために、ＲＦＬＰでは十分な多型マーカーが得られな
い。
択することを目的とする場合には、任意の配列を有する
プローブあるいはランダムな配列を有するプローブを用
いる方法が用いられている（Theor. Appl. Genet, 80,
437-448, 1990）が、トマト、コムギ、ワタ、ダイズな
どの植物では、他の植物に比べて品種間での多型が少な
いために、ＲＦＬＰでは十分な多型マーカーが得られな
い。
【０００４】また、遺伝子の検出手段として、ＤＮＡの
増幅法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymera
se Chain Reaction、Science, vol.239, p.487-491 (19
88)）法が用いられるようになってきた。これは、二本
鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの熱変性、増幅を目的とする
部位の両端の配列に相当するオリゴヌクレオチドと前記
熱変性ＤＮＡとのアニーリングと、前記オリゴヌクレオ
チドをプライマーとしたポリメラーゼ反応からなる増幅
サイクルを繰り返すことにより、前記ＤＮＡ配列を指数
関数的に増幅する方法である。増幅された遺伝子断片の
長さの違いにより、遺伝子の識別が可能となっている。
増幅法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymera
se Chain Reaction、Science, vol.239, p.487-491 (19
88)）法が用いられるようになってきた。これは、二本
鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの熱変性、増幅を目的とする
部位の両端の配列に相当するオリゴヌクレオチドと前記
熱変性ＤＮＡとのアニーリングと、前記オリゴヌクレオ
チドをプライマーとしたポリメラーゼ反応からなる増幅
サイクルを繰り返すことにより、前記ＤＮＡ配列を指数
関数的に増幅する方法である。増幅された遺伝子断片の
長さの違いにより、遺伝子の識別が可能となっている。
【０００５】ＰＣＲを用いた多型解析法として、任意の
プライマーを利用したＲＡＰＤ解析法が知られている。
ＲＦＬＰやＲＡＰＤにより、トマトにおいては解像度の
相当高い分子地図（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎａ
ｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｐ）が完成するに至って
いる。
プライマーを利用したＲＡＰＤ解析法が知られている。
ＲＦＬＰやＲＡＰＤにより、トマトにおいては解像度の
相当高い分子地図（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎａ
ｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｐ）が完成するに至って
いる。
【０００６】さらに、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ解析技術以外
に、より有効な多型検出技術がいくつか開発されてきて
いる。それらの方法の一つとして、ＡＦＬＰ（Amplifie
d fragment length polymorphisms：Nucleic Acids Rse
arch, 1995, Vol.23, No.21,4407-4414）解析が知られ
ている。この手法の最大の利点は、一度の解析で１００
領域程度の多型を比較することが可能となるところであ
る。しかしながら、これらの領域を電気泳動で解像分離
させるために、放射性標識したＰＣＲ用プライマーを必
要とし、作業に多くの手間と労力を費やすことが多く、
また、安全性の面でも注意が必要であった。一方、ＤＮ
Ａの塩基配列決定装置として、ダイデオキシ法に用いる
蛍光標識されたプライマーと、蛍光検出手段を備えた電
気泳動装置を用いた自動化装置が知られているが、蛍光
標識したプライマーを用いてＡＦＬＰ解析に成功した例
は知られていない。
に、より有効な多型検出技術がいくつか開発されてきて
いる。それらの方法の一つとして、ＡＦＬＰ（Amplifie
d fragment length polymorphisms：Nucleic Acids Rse
arch, 1995, Vol.23, No.21,4407-4414）解析が知られ
ている。この手法の最大の利点は、一度の解析で１００
領域程度の多型を比較することが可能となるところであ
る。しかしながら、これらの領域を電気泳動で解像分離
させるために、放射性標識したＰＣＲ用プライマーを必
要とし、作業に多くの手間と労力を費やすことが多く、
また、安全性の面でも注意が必要であった。一方、ＤＮ
Ａの塩基配列決定装置として、ダイデオキシ法に用いる
蛍光標識されたプライマーと、蛍光検出手段を備えた電
気泳動装置を用いた自動化装置が知られているが、蛍光
標識したプライマーを用いてＡＦＬＰ解析に成功した例
は知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＤＮＡの制
限酵素断片長多型を簡便かつ効率よく解析し、多型マー
カーを選択する方法を提供することを課題とする。
限酵素断片長多型を簡便かつ効率よく解析し、多型マー
カーを選択する方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、ＤＮＡの切断に
少なくとも２種類の制限酵素を用い、かつ、複数種のプ
ライマーを用いることにより、蛍光標識プライマーを用
いた場合であってもＡＦＬＰ解析が可能であることを見
出し、さらに、ＰＣＲ反応に使用するＤＮＡポリメラー
ゼの濃度を高くすることにより反応が効率よく行われる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
解決するために鋭意研究を行った結果、ＤＮＡの切断に
少なくとも２種類の制限酵素を用い、かつ、複数種のプ
ライマーを用いることにより、蛍光標識プライマーを用
いた場合であってもＡＦＬＰ解析が可能であることを見
出し、さらに、ＰＣＲ反応に使用するＤＮＡポリメラー
ゼの濃度を高くすることにより反応が効率よく行われる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち本発明は、ＤＮＡを少なくとも２
種類の制限酵素で切断して得られるＤＮＡ断片に、この
ＤＮＡ断片の末端の一方ずつに連結可能な塩基配列を有
する少なくとも２種類のアダプターを連結し、前記アダ
プターの各々に相補的な塩基配列を含み、各々のアダプ
ターにアニールしたときに、アダプターと塩基対を形成
しないヌクレオチドが３’末端側に突出する構造を有す
る２種のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチ
ドセットであって、その突出するヌクレオチドの数が、
同じオリゴヌクレオチドセットに属するオリゴヌクレオ
チドの間では等しく、異なるオリゴヌクレオチドセット
に属するオリゴヌクレオチドの間では異なる少なくとも
２対のオリゴヌクレオチドセットから、前記突出するヌ
クレオチドが少ない順にオリゴヌクレオチドセットを一
対づつ選択してプライマーとし、かつ、突出するヌクレ
オチドの数が最も多いオリゴヌクレオチドセットの少な
くとも一方のプライマーに蛍光標識されたものを用い、
前記アダプターを連結したＤＮＡ断片を鋳型として、順
次ポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記反応産物を、蛍光
検出手段を備えた電気泳動装置により分析する、ＤＮＡ
の制限酵素断片長多型の解析法である。
種類の制限酵素で切断して得られるＤＮＡ断片に、この
ＤＮＡ断片の末端の一方ずつに連結可能な塩基配列を有
する少なくとも２種類のアダプターを連結し、前記アダ
プターの各々に相補的な塩基配列を含み、各々のアダプ
ターにアニールしたときに、アダプターと塩基対を形成
しないヌクレオチドが３’末端側に突出する構造を有す
る２種のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチ
ドセットであって、その突出するヌクレオチドの数が、
同じオリゴヌクレオチドセットに属するオリゴヌクレオ
チドの間では等しく、異なるオリゴヌクレオチドセット
に属するオリゴヌクレオチドの間では異なる少なくとも
２対のオリゴヌクレオチドセットから、前記突出するヌ
クレオチドが少ない順にオリゴヌクレオチドセットを一
対づつ選択してプライマーとし、かつ、突出するヌクレ
オチドの数が最も多いオリゴヌクレオチドセットの少な
くとも一方のプライマーに蛍光標識されたものを用い、
前記アダプターを連結したＤＮＡ断片を鋳型として、順
次ポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記反応産物を、蛍光
検出手段を備えた電気泳動装置により分析する、ＤＮＡ
の制限酵素断片長多型の解析法である。
【００１０】また本発明は、前記方法において、異なる
オリゴヌクレオチドセットに属し、同じアダプターに対
して相補的な配列を有する各々のオリゴヌクレオチド
が、長さが重複する部分は同じ配列を有するものである
方法を提供する。本発明はさらに、前記方法において、
前記オリゴヌクレオチドセットが、突出するヌクレオチ
ドの数が１である２種のオリゴヌクレオチドからなる第
１のオリゴヌクレオチドセットと、突出するヌクレオチ
ドの数が２または３である２種のオリゴヌクレオチドか
らなる第２のオリゴヌクレオチドセットであり、第１の
オリゴヌクレオチドセットをプライマーとし、アダプタ
ーを連結したＤＮＡ断片を鋳型としてポリメラーゼ連鎖
反応を行った後に、第２のオリゴヌクレオチドセットを
プライマーとし、前記反応産物を鋳型とするポリメラー
ゼ連鎖反応を行う方法を提供する。
オリゴヌクレオチドセットに属し、同じアダプターに対
して相補的な配列を有する各々のオリゴヌクレオチド
が、長さが重複する部分は同じ配列を有するものである
方法を提供する。本発明はさらに、前記方法において、
前記オリゴヌクレオチドセットが、突出するヌクレオチ
ドの数が１である２種のオリゴヌクレオチドからなる第
１のオリゴヌクレオチドセットと、突出するヌクレオチ
ドの数が２または３である２種のオリゴヌクレオチドか
らなる第２のオリゴヌクレオチドセットであり、第１の
オリゴヌクレオチドセットをプライマーとし、アダプタ
ーを連結したＤＮＡ断片を鋳型としてポリメラーゼ連鎖
反応を行った後に、第２のオリゴヌクレオチドセットを
プライマーとし、前記反応産物を鋳型とするポリメラー
ゼ連鎖反応を行う方法を提供する。
【００１１】さらに、本発明は、上記方法において、最
終回のポリメラーゼ連鎖反応に、０．５単位以上の量の
ＤＮＡポリメラーゼを用いる方法を提供する。以下、本
発明を詳細に説明する。
終回のポリメラーゼ連鎖反応に、０．５単位以上の量の
ＤＮＡポリメラーゼを用いる方法を提供する。以下、本
発明を詳細に説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、ＡＦＬＰ解析、特に、
少なくとも２種類の制限酵素を用い、かつ、少なくとも
２対のプライマーを用いるＡＦＬＰ解析において、プラ
イマーとして蛍光標識したものを用いることを特徴とす
る。また、本発明の好ましい態様においては、ＰＣＲ反
応に好ましくは０．３単位以上、特に好ましくは０．５
単位程度の量のＤＮＡポリメラーゼを用いる。通常０．
５単位程度で頭打ちとなるが、それ以上のＤＮＡポリメ
ラーゼを用いても差し支えない。尚、ここで１単位は、
活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型／プライマーとして用い、
１１．７４℃において、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌ
クレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性をいう。
少なくとも２種類の制限酵素を用い、かつ、少なくとも
２対のプライマーを用いるＡＦＬＰ解析において、プラ
イマーとして蛍光標識したものを用いることを特徴とす
る。また、本発明の好ましい態様においては、ＰＣＲ反
応に好ましくは０．３単位以上、特に好ましくは０．５
単位程度の量のＤＮＡポリメラーゼを用いる。通常０．
５単位程度で頭打ちとなるが、それ以上のＤＮＡポリメ
ラーゼを用いても差し支えない。尚、ここで１単位は、
活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型／プライマーとして用い、
１１．７４℃において、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌ
クレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性をいう。
【００１３】本発明の方法は、用いるプライマー、及び
ＤＮＡポリメラーゼの量を除いては、従来知られている
ＡＦＬＰ手法（Amplified fragment length polymorphi
sms：Nucleic Acids Rsearch, 1995, Vol.23, No.21, 4
407-4414）と特に変わるところはない。
ＤＮＡポリメラーゼの量を除いては、従来知られている
ＡＦＬＰ手法（Amplified fragment length polymorphi
sms：Nucleic Acids Rsearch, 1995, Vol.23, No.21, 4
407-4414）と特に変わるところはない。
【００１４】以下に、ＡＦＬＰ反応の原理を説明する。
始めにゲノムＤＮＡを特定の制限酵素で完全分解する
（図１）。次に切断断片にアダプターを連結し（図１
）、それと相補的なプライマーを用いて切断断片をＰ
ＣＲで増幅する（図１）。この際、プライマーの３’
側には、アダプターと塩基対を形成しないヌクレオチド
（この図では、５’側プライマーではＡ、３’側プライ
マーではＣ）を突出させておくと、この突出したヌクレ
オチドとゲノムＤＮＡとが塩基対を形成するもの、すな
わちアダプターを除くＤＮＡ断片の５’末端の塩基がＡ
であり、３’末端の塩基がＣである断片のみが増幅され
る（図１）。以下、この１回目のＰＣＲを「予備増
幅」という。本発明の方法においては、認識配列の異な
る少なくとも２種類の制限酵素、好ましくは、４塩基認
識の制限酵素と６塩基認識の制限酵素を用いる。これに
より、ＰＣＲが効率よく行える長さの断片が得られる。
１種のみの制限酵素及びアダプターを用いると、ＰＣＲ
反応の際にＤＮＡ断片の両末端が会合して反応が阻害さ
れ、再現性が不十分となる場合が多い。用いる制限酵素
として具体的には、ＥｃｏＲＩとＭｓｅＩ、ＢａｍＨＩ
とＴａｑＩ等の組み合わせが挙げられる。アダプター
は、制限酵素切断末端とコヘッシブ（cohesive）な末端
を有する部分的に一本鎖構造を含む２本鎖ＤＮＡ断片で
あり、通常２０塩基程度の長さのものが用いられる。
始めにゲノムＤＮＡを特定の制限酵素で完全分解する
（図１）。次に切断断片にアダプターを連結し（図１
）、それと相補的なプライマーを用いて切断断片をＰ
ＣＲで増幅する（図１）。この際、プライマーの３’
側には、アダプターと塩基対を形成しないヌクレオチド
（この図では、５’側プライマーではＡ、３’側プライ
マーではＣ）を突出させておくと、この突出したヌクレ
オチドとゲノムＤＮＡとが塩基対を形成するもの、すな
わちアダプターを除くＤＮＡ断片の５’末端の塩基がＡ
であり、３’末端の塩基がＣである断片のみが増幅され
る（図１）。以下、この１回目のＰＣＲを「予備増
幅」という。本発明の方法においては、認識配列の異な
る少なくとも２種類の制限酵素、好ましくは、４塩基認
識の制限酵素と６塩基認識の制限酵素を用いる。これに
より、ＰＣＲが効率よく行える長さの断片が得られる。
１種のみの制限酵素及びアダプターを用いると、ＰＣＲ
反応の際にＤＮＡ断片の両末端が会合して反応が阻害さ
れ、再現性が不十分となる場合が多い。用いる制限酵素
として具体的には、ＥｃｏＲＩとＭｓｅＩ、ＢａｍＨＩ
とＴａｑＩ等の組み合わせが挙げられる。アダプター
は、制限酵素切断末端とコヘッシブ（cohesive）な末端
を有する部分的に一本鎖構造を含む２本鎖ＤＮＡ断片で
あり、通常２０塩基程度の長さのものが用いられる。
【００１５】以上の段階で、用いる制限酵素の選択とプ
ライマーの選択との２回の多型検出の機会がある。すな
わち前者はＲＦＬＰと同様の原理であり、後者はＲＡＰ
Ｄ解析の原理と同じである。さらに本発明では、上記増
幅産物を鋳型として、上記プライマーよりも突出するヌ
クレオチドが多く（図１では、３ヌクレオチド）、突出
する最初のヌクレオチドが上記プライマーと同じ（図１
では、５’側プライマーではＡＡＣ、３’側プライマー
ではＣＡＡ）プライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行
うと、アダプターを除くＤＮＡ断片の５’末端の塩基が
ＡＡＣであり、３’末端の塩基がＣＡＡである断片のみ
が増幅される（図１。以下、）。以下、この２回目の
ＰＣＲを「選択的増幅」という。予備増幅反応を行わ
ず、アダプターを連結した制限酵素切断ＤＮＡ断片を直
接選択的増幅すると、反応産物の検出が不明瞭となり、
再現性に乏しいことが多い。通常、１回の選択的増幅で
満足な結果が得られるが、２回又はそれ以上の選択的増
幅を行ってもよい。その場合は、選択的増幅に用いるプ
ライマーの突出するヌクレオチドの数が、前の回の選択
的増幅に用いるプライマーのそれよりも多くする。ま
た、異なるオリゴヌクレオチドセットに属し、同じアダ
プターに対して相補的な配列を有する各々のオリゴヌク
レオチドは、長さが重複する部分は同じ配列にしておく
と、有効に選択的増幅を行うことができる。
ライマーの選択との２回の多型検出の機会がある。すな
わち前者はＲＦＬＰと同様の原理であり、後者はＲＡＰ
Ｄ解析の原理と同じである。さらに本発明では、上記増
幅産物を鋳型として、上記プライマーよりも突出するヌ
クレオチドが多く（図１では、３ヌクレオチド）、突出
する最初のヌクレオチドが上記プライマーと同じ（図１
では、５’側プライマーではＡＡＣ、３’側プライマー
ではＣＡＡ）プライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行
うと、アダプターを除くＤＮＡ断片の５’末端の塩基が
ＡＡＣであり、３’末端の塩基がＣＡＡである断片のみ
が増幅される（図１。以下、）。以下、この２回目の
ＰＣＲを「選択的増幅」という。予備増幅反応を行わ
ず、アダプターを連結した制限酵素切断ＤＮＡ断片を直
接選択的増幅すると、反応産物の検出が不明瞭となり、
再現性に乏しいことが多い。通常、１回の選択的増幅で
満足な結果が得られるが、２回又はそれ以上の選択的増
幅を行ってもよい。その場合は、選択的増幅に用いるプ
ライマーの突出するヌクレオチドの数が、前の回の選択
的増幅に用いるプライマーのそれよりも多くする。ま
た、異なるオリゴヌクレオチドセットに属し、同じアダ
プターに対して相補的な配列を有する各々のオリゴヌク
レオチドは、長さが重複する部分は同じ配列にしておく
と、有効に選択的増幅を行うことができる。
【００１６】本発明の方法は、上記ＡＦＬＰ反応におい
て、最終的な選択的増幅のプライマーの両方又は一方
に、蛍光標識したものを用いる。蛍光標識に用いる蛍光
色素は、通常、ハイブリダイゼーション用のプローブ
や、塩基配列決定装置用のプライマーに用いられている
もの等を使用することができるが、具体的には、例えば
ＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアネート）、Ｃｙ
５（インドジカルボシアニン色素(indodicarbocyanine
dye)）等が挙げられる。また、これらの色素によるプラ
イマーの標識は、市販のＤＮＡ合成装置を用い、対応す
る色素が結合したヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオ
チドを合成することによって可能である。プライマーの
長さとしては、通常１６〜２０塩基程度のものが用いら
れる。ＡＦＬＰ産物の解析は、蛍光検出手段を備えた電
気泳動装置を用いて行う。特に、解像度の高い装置、例
えば塩基配列決定用の電気泳動装置は、１塩基長さが異
なるだけでもＤＮＡ断片を分離することができるので、
好ましい。また、蛍光標識されたＤＮＡのバンドを検出
することができる自動化装置が市販されており、本発明
に好適に使用することができる。このような装置として
は、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ファル
マシア社製。Ａ．Ｌ．Ｆ．はファルマシア社の商標）が
挙げられる。蛍光の検出を除いては、電気泳動に用いる
ゲルや電気泳動の条件は、通常のＡＦＬＰあるいは塩基
配列決定と特に変わるところはない。
て、最終的な選択的増幅のプライマーの両方又は一方
に、蛍光標識したものを用いる。蛍光標識に用いる蛍光
色素は、通常、ハイブリダイゼーション用のプローブ
や、塩基配列決定装置用のプライマーに用いられている
もの等を使用することができるが、具体的には、例えば
ＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアネート）、Ｃｙ
５（インドジカルボシアニン色素(indodicarbocyanine
dye)）等が挙げられる。また、これらの色素によるプラ
イマーの標識は、市販のＤＮＡ合成装置を用い、対応す
る色素が結合したヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオ
チドを合成することによって可能である。プライマーの
長さとしては、通常１６〜２０塩基程度のものが用いら
れる。ＡＦＬＰ産物の解析は、蛍光検出手段を備えた電
気泳動装置を用いて行う。特に、解像度の高い装置、例
えば塩基配列決定用の電気泳動装置は、１塩基長さが異
なるだけでもＤＮＡ断片を分離することができるので、
好ましい。また、蛍光標識されたＤＮＡのバンドを検出
することができる自動化装置が市販されており、本発明
に好適に使用することができる。このような装置として
は、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ファル
マシア社製。Ａ．Ｌ．Ｆ．はファルマシア社の商標）が
挙げられる。蛍光の検出を除いては、電気泳動に用いる
ゲルや電気泳動の条件は、通常のＡＦＬＰあるいは塩基
配列決定と特に変わるところはない。
【００１７】後述の実施例の解析結果から、本発明の方
法により、１回のＡＦＬＰ反応で１００以上もの領域の
比較が可能であることが判明した（図２）。２種類の品
種を比較すると仮定した場合、例えば電気泳動ゲルのレ
ーン数が４０であると、最大で２０種のプライマーで解
析でき、全体で１０×２０＝２０００領域を１度に検索
することが可能である。１回のＡＦＬＰ解析ですべてラ
ンダムな領域を増幅していると仮定した場合、ターゲッ
ト領域を検出する確率はＰ＝１−（１−ｔ／Ｇ）ｎｘと
いう方程式で表される（G. B. Martin et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA., 88, 2336 (1991)）。ここでト
マトのゲノムサイズ（Ｇ）は９．５×１０8＝ｂｐであ
り（G. B. Martin et al., Science., 262, 1432 (199
3)）、目的領域のサイズ（ｔ）、１回のＡＦＬＰ解析で
検出されるバンド数の平均（ｘ）を１００本と仮定し
て、様々な確率、領域サイズに対して必要な解析回数
（すなわちプライマーの種類）を求めた結果を表１に示
す。
法により、１回のＡＦＬＰ反応で１００以上もの領域の
比較が可能であることが判明した（図２）。２種類の品
種を比較すると仮定した場合、例えば電気泳動ゲルのレ
ーン数が４０であると、最大で２０種のプライマーで解
析でき、全体で１０×２０＝２０００領域を１度に検索
することが可能である。１回のＡＦＬＰ解析ですべてラ
ンダムな領域を増幅していると仮定した場合、ターゲッ
ト領域を検出する確率はＰ＝１−（１−ｔ／Ｇ）ｎｘと
いう方程式で表される（G. B. Martin et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA., 88, 2336 (1991)）。ここでト
マトのゲノムサイズ（Ｇ）は９．５×１０8＝ｂｐであ
り（G. B. Martin et al., Science., 262, 1432 (199
3)）、目的領域のサイズ（ｔ）、１回のＡＦＬＰ解析で
検出されるバンド数の平均（ｘ）を１００本と仮定し
て、様々な確率、領域サイズに対して必要な解析回数
（すなわちプライマーの種類）を求めた結果を表１に示
す。
【００１８】
【表１】
【００１９】ただし、上記計算式では、比較する２種の
ターゲット領域が同じパターンとなる場合を想定してい
ないため、実際に必要な解析回数はより多くなることが
予想される。表１を見ると、例えばターゲット領域のサ
イズが１０6ｂｐ（１０００ｋｂ）のサイズ内に１つの
マーカーを検出するためには、９９．９％の確率では６
６回（６６種類のプライマー）、９０％の確率では２２
回（２２種類のプライマー）のＡＦＬＰ解析を行えばよ
いことになる。
ターゲット領域が同じパターンとなる場合を想定してい
ないため、実際に必要な解析回数はより多くなることが
予想される。表１を見ると、例えばターゲット領域のサ
イズが１０6ｂｐ（１０００ｋｂ）のサイズ内に１つの
マーカーを検出するためには、９９．９％の確率では６
６回（６６種類のプライマー）、９０％の確率では２２
回（２２種類のプライマー）のＡＦＬＰ解析を行えばよ
いことになる。
【００２０】一方、トマトゲノムサイズ９．５×１
０8、トマトゲノムの遺伝学的規模１３００ｃＭ（セン
チモルガン）より、トマトの１ｃＭは約７３０ｋｂに相
当する。従って、ターゲット領域のサイズを１０００ｋ
ｂと仮定した場合の解析回数で１ｃＭ以内の強くリンク
したマーカーが取得でき得ると考えられる。
０8、トマトゲノムの遺伝学的規模１３００ｃＭ（セン
チモルガン）より、トマトの１ｃＭは約７３０ｋｂに相
当する。従って、ターゲット領域のサイズを１０００ｋ
ｂと仮定した場合の解析回数で１ｃＭ以内の強くリンク
したマーカーが取得でき得ると考えられる。
【００２１】本発明の方法により、遺伝子マーカーの取
得が容易になり、特に、ジョイントレス形質とリンクし
たマーカーの単離、さらには優性不稔形質や高色素変異
など、従来の多型解析法では非常に困難が予想されるよ
うな形質についても、単離し得ることが期待される。
得が容易になり、特に、ジョイントレス形質とリンクし
たマーカーの単離、さらには優性不稔形質や高色素変異
など、従来の多型解析法では非常に困難が予想されるよ
うな形質についても、単離し得ることが期待される。
【００２２】
＜１＞トマト全ＤＮＡの調製 ３種のトマト品種、リコペルシコン エスクレンタム
カゴメ７７（Licopersicon esculentum Kagome77）、カ
ゴメ７７の近種のジョイントレス品種であるリコペルシ
コン エスクレンタム ＫＧ２０４を、圃場にて生育さ
せた。
カゴメ７７（Licopersicon esculentum Kagome77）、カ
ゴメ７７の近種のジョイントレス品種であるリコペルシ
コン エスクレンタム ＫＧ２０４を、圃場にて生育さ
せた。
【００２３】生育したトマトから葉を採取し、市販のＡ
ＦＬＰキット（AFLPTM Analysis System I AFLP Starte
r Primer Kit、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、ライフテクノロ
ジー社より購入）を用いて、キットに添付されているマ
ニュアルに推奨されている方法により、全ＤＮＡを調製
した。
ＦＬＰキット（AFLPTM Analysis System I AFLP Starte
r Primer Kit、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、ライフテクノロ
ジー社より購入）を用いて、キットに添付されているマ
ニュアルに推奨されている方法により、全ＤＮＡを調製
した。
【００２４】すなわち、０．３〜０．５ｇのトマト葉を
液体窒素下ですりつぶし、これに５μｌの溶解用緩衝液
〔ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：１％ ＣＴＡＢ（セチル
トリメチルアンモニウムブロミド）、５％ ＰＶＰ（ポ
リビニルピロリドン）、 １．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、３５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕を加
え、６５℃で１０分インキュベートした。これに５ｍｌ
のフェノール・クロロフォルムを加えて攪拌し、３００
０ｒｐｍで５分遠心した後、上層を分取した。これに５
ｍｌのクロロフォルムを加えて攪拌し、３０００ｒｐｍ
で５分遠心した後、上層を分取し、２．５倍量のエタノ
ールを加えた。沈殿を遠心により回収し、７０％エタノ
ールで洗浄後、５０μｌのＴＥに溶解し、全ＤＮＡ試料
とした。
液体窒素下ですりつぶし、これに５μｌの溶解用緩衝液
〔ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：１％ ＣＴＡＢ（セチル
トリメチルアンモニウムブロミド）、５％ ＰＶＰ（ポ
リビニルピロリドン）、 １．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、３５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕を加
え、６５℃で１０分インキュベートした。これに５ｍｌ
のフェノール・クロロフォルムを加えて攪拌し、３００
０ｒｐｍで５分遠心した後、上層を分取した。これに５
ｍｌのクロロフォルムを加えて攪拌し、３０００ｒｐｍ
で５分遠心した後、上層を分取し、２．５倍量のエタノ
ールを加えた。沈殿を遠心により回収し、７０％エタノ
ールで洗浄後、５０μｌのＴＥに溶解し、全ＤＮＡ試料
とした。
【００２５】＜２＞ＡＦＬＰ反応 上記のようにして得られたＤＮＡ、及び前記ＡＦＬＰキ
ットに含まれている栽培種リコペルシコン エスクレン
タム アイルサクレイグ２（Ailsa Claig 2）のＤＮＡ
を鋳型として、ＡＦＬＰ反応を行った。
ットに含まれている栽培種リコペルシコン エスクレン
タム アイルサクレイグ２（Ailsa Claig 2）のＤＮＡ
を鋳型として、ＡＦＬＰ反応を行った。
【００２６】ＡＦＬＰ反応は、前記ＡＦＬＰキットを用
いて、キットに添付されているマニュアルに記載されて
いる方法に準拠して行った。ただし、選択的増幅の際の
Ｔａｑ ポリメラーゼ濃度は、５倍に改変した。また、
ＡＦＬＰ反応に用いたプライマーのうちＦＩＴＣ（フル
オロセインイソチオシアネート）標識したプライマー
は、ファルマシア社に製造依頼した。
いて、キットに添付されているマニュアルに記載されて
いる方法に準拠して行った。ただし、選択的増幅の際の
Ｔａｑ ポリメラーゼ濃度は、５倍に改変した。また、
ＡＦＬＰ反応に用いたプライマーのうちＦＩＴＣ（フル
オロセインイソチオシアネート）標識したプライマー
は、ファルマシア社に製造依頼した。
【００２７】（１）ＤＮＡ試料の制限酵素切断 １．５ｍｌの遠心チューブに、５×反応緩衝液５μｌ、
ＤＮＡ試料２５０μｇ（１８μｌ以下）、制限酵素(Eco
RI/MseI)２μｌを入れ、水(AFLP-grade water)で２５μ
ｌに調整し、緩やかに混合し、軽く遠心してチューブの
底部に集め、37℃で２時間静置した。７０℃で１５分イ
ンキュベートして酵素を失活させた後、軽く遠心してチ
ューブの底部に反応液を集め、氷中に静置した。
ＤＮＡ試料２５０μｇ（１８μｌ以下）、制限酵素(Eco
RI/MseI)２μｌを入れ、水(AFLP-grade water)で２５μ
ｌに調整し、緩やかに混合し、軽く遠心してチューブの
底部に集め、37℃で２時間静置した。７０℃で１５分イ
ンキュベートして酵素を失活させた後、軽く遠心してチ
ューブの底部に反応液を集め、氷中に静置した。
【００２８】（２）アダプターの連結 制限酵素消化したＤＮＡ試料（２５μｌ）に、アダプタ
ー連結溶液（adapterligation solution）２４μｌ、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼ１μｌを加え、室温で緩やかに混合
し、軽く遠心した後、２０℃±２℃で２時間静置した。
ー連結溶液（adapterligation solution）２４μｌ、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼ１μｌを加え、室温で緩やかに混合
し、軽く遠心した後、２０℃±２℃で２時間静置した。
【００２９】上記反応液を１．5ｍｌの遠心チューブに
１０μｌづつ分取し、９０μｌのＴＥ緩衝液を加えて良
く混合して、反応溶液を10倍希釈した。次の反応に用い
る残りは、−２０℃で保存した。
１０μｌづつ分取し、９０μｌのＴＥ緩衝液を加えて良
く混合して、反応溶液を10倍希釈した。次の反応に用い
る残りは、−２０℃で保存した。
【００３０】（３）予備増幅反応（preamplification r
eaction） ０．５ｍｌの遠心チューブに、前記の１０倍希釈したＤ
ＮＡ試料５μｌ、予備増幅反応混合液（pre-amp primer
mix）４０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（AFLP use）５μ
ｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ｌｕ／μｌ）１μｌ
を加え、緩やかに混合して遠心した後、ミネラルオイル
を２〜３滴添加した。尚、予備増幅反応混合液には、Ｅ
ｃｏＲＩアダプターの配列に相補的な配列を含むプライ
マー（配列番号１）（３０ｎｇ）、及びＭｓｅＩアダプ
ターの配列に相補的な配列を含むプライマー（配列番号
２）（３０ｎｇ）を含んでいる。これらのプライマー
は、各々のアダプターにアニールしたときに、アダプタ
ーと塩基対を形成しないヌクレオチド１個が３’末端側
に突出する。突出するヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩでは
Ａ（デオキシアデノシン）、ＭｓｅＩではＣ（デオキシ
シチジン）である。
eaction） ０．５ｍｌの遠心チューブに、前記の１０倍希釈したＤ
ＮＡ試料５μｌ、予備増幅反応混合液（pre-amp primer
mix）４０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（AFLP use）５μ
ｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ｌｕ／μｌ）１μｌ
を加え、緩やかに混合して遠心した後、ミネラルオイル
を２〜３滴添加した。尚、予備増幅反応混合液には、Ｅ
ｃｏＲＩアダプターの配列に相補的な配列を含むプライ
マー（配列番号１）（３０ｎｇ）、及びＭｓｅＩアダプ
ターの配列に相補的な配列を含むプライマー（配列番号
２）（３０ｎｇ）を含んでいる。これらのプライマー
は、各々のアダプターにアニールしたときに、アダプタ
ーと塩基対を形成しないヌクレオチド１個が３’末端側
に突出する。突出するヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩでは
Ａ（デオキシアデノシン）、ＭｓｅＩではＣ（デオキシ
シチジン）である。
【００３１】続いて、９４℃で３０秒の解離反応、５６
℃で６０秒の会合反応、７２℃で６０秒の伸長反応から
なる反応サイクルを２０サイクル繰り返した後、４℃で
反応停止した。反応産物は−２０℃で保存した。
℃で６０秒の会合反応、７２℃で６０秒の伸長反応から
なる反応サイクルを２０サイクル繰り返した後、４℃で
反応停止した。反応産物は−２０℃で保存した。
【００３２】（４）多型解析のための選択的増幅（Sele
ctive AFLP Amplification） ＥｃｏＲＩアダプターに相補的な配列を含むプライマー
（ＥｃｏＲＩプライマー〜、配列番号３〜５）及び
ＭｓｅＩアダプターに相補的な配列を含むプライマー
（ＭｓｅＩプライマー〜、配列番号６〜１３）から
１種づつ選択した。ＥｃｏＲＩプライマーは、ＦＩＴＣ
標識されたものを、ファルマシア社に製造委託した。Ｍ
ｓｅＩプライマーは、キットに添付されているものを使
用した。これらのプライマーは、各々のアダプターにア
ニールしたときに、アダプターと塩基対を形成しないヌ
クレオチド３個が３’末端側に突出する。突出するヌク
レオチドは、ＥｃｏＲＩではＡＡＣ、ＡＣＡ、ＡＣＣで
あり、ＭｓｅＩではＣＡＡ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、
ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴである。
ctive AFLP Amplification） ＥｃｏＲＩアダプターに相補的な配列を含むプライマー
（ＥｃｏＲＩプライマー〜、配列番号３〜５）及び
ＭｓｅＩアダプターに相補的な配列を含むプライマー
（ＭｓｅＩプライマー〜、配列番号６〜１３）から
１種づつ選択した。ＥｃｏＲＩプライマーは、ＦＩＴＣ
標識されたものを、ファルマシア社に製造委託した。Ｍ
ｓｅＩプライマーは、キットに添付されているものを使
用した。これらのプライマーは、各々のアダプターにア
ニールしたときに、アダプターと塩基対を形成しないヌ
クレオチド３個が３’末端側に突出する。突出するヌク
レオチドは、ＥｃｏＲＩではＡＡＣ、ＡＣＡ、ＡＣＣで
あり、ＭｓｅＩではＣＡＡ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、
ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴである。
【００３３】選択したＥｃｏＲＩプライマー（１０ｎｇ
／ｎｌ）５μｌ、ＭｓｅＩプライマー（６．７ｎｇ、ｄ
ＮＴＰ含有）４５μｌを１．５ｍｌの遠心チューブに入
れて混合した。これをＭｉｘ１と記す。また、１．５ｍ
ｌの遠心チューブに、水（AFLP-grade water）７９μ
ｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（AFLP use）２０μｌ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕ／μｌ）１μｌを加えた。
これをＭｉｘ２と記す。前記予備反応産物０．５μｌ、
水（AFLP-grade water）４．５μｌ、Ｍｉｘ１（ｐｒｉ
ｍｅｒ／ｄＮＴＰｓ）５μｌ、Ｍｉｘ２（１０μｌ）を
０．５ｍｌのチューブに加え、ゆるやかに混合して遠心
した後、２〜３滴のミネラルオイルを添加し、以下の条
件で反応１〜１１を連続して行うことにより、ＰＣＲを
行なった。尚、この混合により、１反応当たりのＴａｑ
ポリメラーゼ量は、０．５単位となる。反応液５μｌに
対して、７．５μｌの反応停止緩衝液（Stop Reaction
Buffer：ブルーデキストランを５ｍｇ／ｍｌとなるよう
に脱イオン化したフォルムアミドで溶解したもの）を混
合し、９５℃で２分処理した後に氷冷して、電気泳動用
試料とした。
／ｎｌ）５μｌ、ＭｓｅＩプライマー（６．７ｎｇ、ｄ
ＮＴＰ含有）４５μｌを１．５ｍｌの遠心チューブに入
れて混合した。これをＭｉｘ１と記す。また、１．５ｍ
ｌの遠心チューブに、水（AFLP-grade water）７９μ
ｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（AFLP use）２０μｌ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕ／μｌ）１μｌを加えた。
これをＭｉｘ２と記す。前記予備反応産物０．５μｌ、
水（AFLP-grade water）４．５μｌ、Ｍｉｘ１（ｐｒｉ
ｍｅｒ／ｄＮＴＰｓ）５μｌ、Ｍｉｘ２（１０μｌ）を
０．５ｍｌのチューブに加え、ゆるやかに混合して遠心
した後、２〜３滴のミネラルオイルを添加し、以下の条
件で反応１〜１１を連続して行うことにより、ＰＣＲを
行なった。尚、この混合により、１反応当たりのＴａｑ
ポリメラーゼ量は、０．５単位となる。反応液５μｌに
対して、７．５μｌの反応停止緩衝液（Stop Reaction
Buffer：ブルーデキストランを５ｍｇ／ｍｌとなるよう
に脱イオン化したフォルムアミドで溶解したもの）を混
合し、９５℃で２分処理した後に氷冷して、電気泳動用
試料とした。
【００３４】
【表２】 表２ ───────────────────────────── 解離反応 会合反応 伸長反応 反応 ────────────────── 温度 時間 温度 時間 温度 時間 サイクル (℃）(秒) (℃）(秒) (℃）(秒) (回) ───────────────────────────── 1 94 60 65 60 72 90 1 2 94 60 64 60 72 90 1 3 94 60 63 60 72 90 1 4 94 60 62 60 72 90 1 5 94 60 61 60 72 90 1 6 94 60 60 60 72 90 1 7 94 60 59 60 72 90 1 8 94 60 58 60 72 90 1 9 94 60 57 60 72 90 1 10 94 60 56 60 72 90 1 11 94 30 56 30 72 60 23 ─────────────────────────────
【００３５】＜３＞電気泳動によるＡＦＬＰ反応産物の
解析 上記ＡＦＬＰ反応産物の電気泳動による解析を、蛍光標
識検出により塩基配列解析ができる自動電気泳動装置
（Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ファルマ
シア社製）を用いて、装置の取扱説明書に従って行っ
た。この装置は、装置に付属されている泳動用ソフトウ
エア（Ａ．Ｌ．Ｆ．ｍａｎａｇｅｒ）によって制御する
ことができる。電気泳動は、市販の調製物（ready mix
gel、ファルマシア社製：６％ポリアクリルアミド）を
用いて作製した厚さ０．５ｍｍ、長さ２８ｃｍのゲルを
用い、０．６×ＴＢＥ緩衝液で、１５００Ｖ、３８ｍＡ
の条件で行った。また、泳動物の解析は、解析用ソフト
ウエア（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）を用いて
行った。
解析 上記ＡＦＬＰ反応産物の電気泳動による解析を、蛍光標
識検出により塩基配列解析ができる自動電気泳動装置
（Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ファルマ
シア社製）を用いて、装置の取扱説明書に従って行っ
た。この装置は、装置に付属されている泳動用ソフトウ
エア（Ａ．Ｌ．Ｆ．ｍａｎａｇｅｒ）によって制御する
ことができる。電気泳動は、市販の調製物（ready mix
gel、ファルマシア社製：６％ポリアクリルアミド）を
用いて作製した厚さ０．５ｍｍ、長さ２８ｃｍのゲルを
用い、０．６×ＴＢＥ緩衝液で、１５００Ｖ、３８ｍＡ
の条件で行った。また、泳動物の解析は、解析用ソフト
ウエア（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）を用いて
行った。
【００３６】結果を図２に示す。この図は、蛍光検出に
よるフルオログラムの一部を波形表示したものであり、
最上段は同時に泳動させた鎖長マーカーである。１００
ｂｐから５００ｂｐに集中してＤＮＡ断片が増幅され、
そのうち、ＭｓｅＩプライマー（配列番号６）を使用
した場合に明確な多型が検出された。
よるフルオログラムの一部を波形表示したものであり、
最上段は同時に泳動させた鎖長マーカーである。１００
ｂｐから５００ｂｐに集中してＤＮＡ断片が増幅され、
そのうち、ＭｓｅＩプライマー（配列番号６）を使用
した場合に明確な多型が検出された。
【００３７】
【比較例１】予備増幅反応を行わず、アダプターを連結
した制限酵素切断ＤＮＡ断片を選択的増幅した以外は、
実施例１と同様にしてＡＦＬＰ反応を行った。その結
果、増幅断片の数が増加し、電気泳動パターンがスメア
化して解像度が低下した。
した制限酵素切断ＤＮＡ断片を選択的増幅した以外は、
実施例１と同様にしてＡＦＬＰ反応を行った。その結
果、増幅断片の数が増加し、電気泳動パターンがスメア
化して解像度が低下した。
【００３８】
【比較例２】選択的増幅反応において、０．１単位のＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いた以外は実施例１と同
様にしてＡＦＬＰ反応を行った。その結果、増幅産物は
得られなかった。
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いた以外は実施例１と同
様にしてＡＦＬＰ反応を行った。その結果、増幅産物は
得られなかった。
【００３９】
【実施例２】本発明の方法により、多型パターンとジョ
イントレス形質との連鎖分析を行なった。実施例１に用
いた品種以外に、カゴメ９３２、カゴメ９４１、カゴメ
９５２、９５−１（以上、ジョイントレス品種）、ＫＧ
１３８から実施例１と同様にして染色体ＤＮＡを調製
し、ＡＦＬＰ解析を行った。尚、選択的増幅のプライマ
ーには、ＥｃｏＲＩプライマー、及びＭｓｅＩプライ
マーを用いた。
イントレス形質との連鎖分析を行なった。実施例１に用
いた品種以外に、カゴメ９３２、カゴメ９４１、カゴメ
９５２、９５−１（以上、ジョイントレス品種）、ＫＧ
１３８から実施例１と同様にして染色体ＤＮＡを調製
し、ＡＦＬＰ解析を行った。尚、選択的増幅のプライマ
ーには、ＥｃｏＲＩプライマー、及びＭｓｅＩプライ
マーを用いた。
【００４０】電気泳動の結果を図３に示す。その結果、
９５−１以外はジョイントレス形質と多型パターンが一
致する領域が見出された（図３中、四角形で囲んだ部
分）。さらに、その後の解析で、合計１６種類の栽培種
のうち、１４種類で形質と多型パターンが一致し、この
多型がジョイントレス形質とリンクしていることが示唆
された（表２）。
９５−１以外はジョイントレス形質と多型パターンが一
致する領域が見出された（図３中、四角形で囲んだ部
分）。さらに、その後の解析で、合計１６種類の栽培種
のうち、１４種類で形質と多型パターンが一致し、この
多型がジョイントレス形質とリンクしていることが示唆
された（表２）。
【００４１】
【表３】 表現形質 無：ジョイント無し、有：ジョイント有り 多型パターン ａ：カコ゛メ77と同一のパターン、ｂ：KG204と同一のパターン 連鎖の有無 ○：連鎖有り、×：連鎖無し
【００４２】
【発明の効果】本発明の方法により、ＤＮＡの制限酵素
断片長多型を簡便かつ効率よく解析し、多型マーカーを
選択することができる。その結果、ジョイントレス形質
とリンクしたマーカーの単離、優性不稔形質や高色素変
異など、従来の多型解析法では非常に困難が予想される
ような形質についても、本方法により単離し得ることが
期待される。
断片長多型を簡便かつ効率よく解析し、多型マーカーを
選択することができる。その結果、ジョイントレス形質
とリンクしたマーカーの単離、優性不稔形質や高色素変
異など、従来の多型解析法では非常に困難が予想される
ような形質についても、本方法により単離し得ることが
期待される。
【００４３】
配列番号：１ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACTGCGTAC CAATTCA 17
【００４４】配列番号：２ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATGAGTCCT GAGTAAC 17
【００４５】配列番号：３ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACTGCGTAC CAATTCAAC 19
【００４６】配列番号：４ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACTGCGTACCAATTCACA
【００４７】配列番号：５ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACTGCGTACCAATTCACC 19
【００４８】配列番号：６ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATGAGTCCT GAGTAACAA 19
【００４９】配列番号：７ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATGAGTCCT GAGTAACAC 19
【００５０】配列番号：８ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATGAGTCCT GAGTAACAG 19
【００５１】配列番号：９ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATGAGTCCT GAGTAACAT 19
【００５２】配列番号：１０ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATGAGTCCT GAGTAACTA 19
【００５３】配列番号：１１ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATGAGTCCT GAGTAACTC 19
【００５４】配列番号：１２ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATGAGTCCT GAGTAACTG 19
【００５５】配列番号：１３ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATGAGTCCT GAGTAACTT 19
【図１】 ＡＦＬＰ反応の原理を示す図。
【図２】 実施例１のＡＦＬＰ反応産物の電気泳動によ
る解析の結果を示す図。
る解析の結果を示す図。
【図３】 実施例２のＡＦＬＰ反応産物の電気泳動によ
る解析の結果を示す図。
る解析の結果を示す図。
Claims (4)
- 【請求項１】 ＤＮＡを少なくとも２種類の制限酵素で
切断して得られるＤＮＡ断片に、このＤＮＡ断片の末端
の一方づつに連結可能な塩基配列を有する少なくとも２
種類のアダプターを連結し、 前記アダプターの各々に相補的な塩基配列を含み、各々
のアダプターにアニールしたときに、アダプターと塩基
対を形成しないヌクレオチドが３’末端側に突出する構
造を有する２種のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌ
クレオチドセットであって、その突出するヌクレオチド
の数が、同じオリゴヌクレオチドセットに属するオリゴ
ヌクレオチドの間では等しく、異なるオリゴヌクレオチ
ドセットに属するオリゴヌクレオチドの間では異なる少
なくとも２対のオリゴヌクレオチドセットから、前記突
出するヌクレオチドが少ない順にオリゴヌクレオチドセ
ットを一対づつ選択してプライマーとし、かつ、突出す
るヌクレオチドの数が最も多いオリゴヌクレオチドセッ
トの少なくとも一方のプライマーに蛍光標識されたもの
を用い、前記アダプターを連結したＤＮＡ断片を鋳型と
して、順次ポリメラーゼ連鎖反応を行い、 前記反応産物を、蛍光検出手段を備えた電気泳動装置に
より分析する、ＤＮＡの制限酵素断片長多型の解析法。 - 【請求項２】 異なるオリゴヌクレオチドセットに属
し、同じアダプターに対して相補的な配列を有する各々
のオリゴヌクレオチドが、長さが重複する部分は同じ配
列を有する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記オリゴヌクレオチドセットが、突出
するヌクレオチドの数が１である２種のオリゴヌクレオ
チドからなる第１のオリゴヌクレオチドセットと、突出
するヌクレオチドの数が２または３である２種のオリゴ
ヌクレオチドからなる第２のオリゴヌクレオチドセット
であり、 第１のオリゴヌクレオチドセットをプライマーとし、ア
ダプターを連結したＤＮＡ断片を鋳型としてポリメラー
ゼ連鎖反応を行った後に、第２のオリゴヌクレオチドセ
ットをプライマーとし、前記反応産物を鋳型とするポリ
メラーゼ連鎖反応を行う請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 最終回のポリメラーゼ連鎖反応に、０．
３単位以上の量のＤＮＡポリメラーゼを用いる請求項１
記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9001724A JPH10191981A (ja) | 1997-01-08 | 1997-01-08 | 制限酵素断片長多型の解析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9001724A JPH10191981A (ja) | 1997-01-08 | 1997-01-08 | 制限酵素断片長多型の解析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10191981A true JPH10191981A (ja) | 1998-07-28 |
Family
ID=11509521
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9001724A Pending JPH10191981A (ja) | 1997-01-08 | 1997-01-08 | 制限酵素断片長多型の解析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10191981A (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5532384U (ja) * | 1978-08-25 | 1980-03-01 | ||
| JPS63210611A (ja) * | 1987-02-27 | 1988-09-01 | Omron Tateisi Electronics Co | 紙葉類の厚さ検出装置 |
| JPH05301657A (ja) * | 1992-04-24 | 1993-11-16 | Kofu Nippon Denki Kk | 厚さ検知装置 |
-
1997
- 1997-01-08 JP JP9001724A patent/JPH10191981A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5532384U (ja) * | 1978-08-25 | 1980-03-01 | ||
| JPS63210611A (ja) * | 1987-02-27 | 1988-09-01 | Omron Tateisi Electronics Co | 紙葉類の厚さ検出装置 |
| JPH05301657A (ja) * | 1992-04-24 | 1993-11-16 | Kofu Nippon Denki Kk | 厚さ検知装置 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060905 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070109 |