JPH10191989A - ベータセルリン類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】遺伝子操作技術を用いて、原核細胞で生産した
不活性なＢＴＣを、効率的に活性を回復させ、天然源か
ら単離されたＢＴＣと同じ活性を有する蛋白質を得る方
法を提供する。 【解決手段】遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させ
たＢＴＣ類をレドックスバッファー中でリフォールディ
ングすることを特徴とする活性型ＢＴＣ類の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子操作技術を用
いて、原核細胞中で発現させたベータセルリン（ＢＴ
Ｃ）類をリフォールディングし、薬理的に活性なＢＴＣ
類を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＢＴＣはＨａｎａｈａｎ（サイエンス、
２５９巻、１６０４〜１６０７頁、１９９３年）らによ
って、β細胞腫瘍より見いだされたアミノ酸８０個から
なる分子量約９０００の上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）フ
ァミリーに属する蛋白質で、血管平滑筋細胞、網膜色素
上皮細胞、３Ｔ３細胞等に対して増殖促進作用を有して
いる。また、遺伝子工学的手法により、ＢＴＣを原核細
胞や真核細胞を用いて製造することが知られている（特
開平６−８７８９４）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ＢＴＣ類を原核細胞中
で発現すると、薬理的に活性なＢＴＣ類の収率が低い。
またチャイニーズハムスター細胞（例、ＣＨＯ）、サル
細胞（例、ＣＯＳ−７）等の真核細胞を宿主として発現
すると薬理的に活性なＢＴＣが得られる（特開平６−８
７８９４）ものの、真核細胞用の培地は高価であり、さ
らに蛋白の発現量が低く、工業的規模での製造は適当と
はいえない。したがって、薬理的に活性なＢＴＣ類の工
業的に有利な製造方法が求められている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
欠点を解決すべく、原核細胞の高生産性を利用すると共
に、効率的な活性化方法（再生方法）を提供すべく鋭意
研究を重ねた結果、遺伝子操作技術を用いてＢＴＣ類を
原核細胞において発現後、活性化する方法において、レ
ドックスバッファー中でリフォールディングすることを
初めて試みることによって、予想外にも活性化が工業的
に効率よく行なえることを見出し、本発明を完成したも
のである。即ち、本発明は、遺伝子工学的に原核細胞宿
主中で発現させたＢＴＣ類をレドックスバッファー中で
リフォールディングすることを特徴とする活性型ＢＴＣ
類の製造方法に関するものである。

【０００５】本発明で用いられるＢＴＣ類は、公知のＢ
ＴＣと同様の作用を有するものであって、哺乳動物由来
のＢＴＣや、そのＮ末端にＭｅｔが付加された蛋白（以
下、Ｍｅｔ−ＢＴＣと称することもある）等が挙げら
れ、中でも図１（配列番号：１）の２〜８１番目のアミ
ノ酸配列を有するヒトＢＴＣおよびそのＮ末端にＭｅｔ
が付加された図１（配列番号：１）の１〜８１番目のア
ミノ酸配列を有する蛋白等が好ましい。さらには、ＢＴ
Ｃと同様の作用を有する限り、そのフラグメントでもよ
く、例えば配列番号：１において３番目（Ｇｌｙ）から
８１番目（Ｔｙｒ）のアミノ酸配列を有するものや、さ
らに小さいフラグメントの３０番目（Ｓｅｒ）から８１
番目（Ｔｙｒ）のアミノ酸配列を有するもの等が挙げら
れる。また、ＢＴＣ類は塩として用いられてもよく、塩
酸、臭化水素、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩、
酢酸、フタル酸、フマール酸、酒石酸、マレイン酸、ク
エン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンス
ルホン酸等の有機酸との塩、ナトリウム塩、カリウム塩
等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金
属塩、アンモニウム塩等の薬学的に許容されうる塩や水
和物等が挙げられる。

【０００６】本発明で用いられる原核細胞としては、Es
cherichia coli（大腸菌）等のエシェリヒア属菌、Baci
llus subtilis（枯草菌）等のバチルス属菌、Serratia
marcescens（セラチア）等のセラチア属菌等が挙げら
れ、中でもEscherichia coli等が好ましい。これらの原
核細胞の形質転換、培養等は次に示す方法のほか、常法
に準じて行うこともできる（特開平３−２０４８９７号
参照）。例えば、本発明方法におけるＢＴＣ類をコード
する塩基配列を有するｃＤＮＡを含有する発現型ベクタ
ーは、例えば、（ｉ）ＢＴＣ産生細胞からメッセンジャ
ーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、（ii）該ｍＲＮＡから
単鎖のｃＤＮＡを、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、（ii
i）該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込
み、（iv）得られた組み換えファージまたはプラスミド
で宿主を形質転換し、（v）得られた形質転換体を培養
後、形質転換体から適当な方法、例えばＢＴＣの一部を
コードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
により、あるいは抗ＢＴＣ抗体を用いたイムノアッセイ
法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいは
プラスミドを単離し、（vi）その組み換えＤＮＡから目
的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、（vii）該クロ
ーン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプロモ
ーターの下流に連結する、ことにより製造することがで
きる。

【０００７】ＢＴＣ類をコードするｍＲＮＡは、例えば
膵臓腫瘍細胞（たとえばＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１０５
８５，ＣＲＬ１０８７５）などから得ることができる。
膵臓腫瘍細胞からｍＲＮＡを調製する方法としては、グ
アニジンチオシアネート法〔（ジェー・エム・チルグウィ
ン（J.M.Chirgwin）ら、バイオケミストリー（Biochemi
stry）、１８巻、５２９４頁（１９７９年）〕などが挙
げられる。このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型と
し、逆転写酵素を用いて、例えば岡山（H.Okayama）ら
の方法〔モレキュラ−・アンド・セルラ−・バイオロジ
−（Molecular and Cellular Biology）２巻、１６１頁
（１９８２年）および同誌３巻、２８０頁（１９８３
年）〕に従いｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡをプ
ラスミドに組み込む。ｃＤＮＡを組み込むプラスミドと
しては、たとえば大腸菌由来のｐＢＲ３２２〔ジ−ン
（Gene）、２巻、９５頁（１９７７年）〕、ｐＢＲ３２
５〔ジーン、４巻、１２１頁（１９７８年）〕、ｐＵＣ
１２〔ジーン、１９巻、２５９頁（１９８２年）〕、ｐ
ＵＣ１３〔ジーン、１９巻、２５９頁（１９８２
年）〕、枯草菌由来のｐＵＢ１１０〔バイオケミカル・
バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ
（Biochemical and Biophysical Research Communicati
ons）、１１２巻、６７８頁（１９８３年）〕などが挙
げられるが、その他のものであっても、宿主内で複製増
殖されるものであれば、いずれを用いることもできる。
またｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、た
とえばλｇｔ１１〔ヤング及びデーヴィス（Young, R.
and Davis, R.）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・
ユー・エス・エー（Proc. Natl. Acad. Sci.,U.S.
A.）、８０巻、１１９４頁（１９８３年）〕などが挙げ
られるが、その他のものであっても宿主内で増殖できる
ものであれば用いることができる。プラスミドに組み込
む方法としては、たとえば、ティー・マニアティス（T.M
aniatis）ら、モレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning） コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、２３９頁
（１９８２年）に記載の方法などが挙げられる。またフ
ァージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、た
とえばヒューン（Hyunh,T.V.）らの方法〔ディー・エヌ・
エー・クローニング、ア・プラクティカル・アプローチ
（DNA Cloning, A Practical Approach）１巻、４９頁
（１９８５年）〕などが挙げられる。

【０００８】このようにして得られたプラスミドは、適
当な宿主たとえばエシェリヒア（Escherichia）属菌，
バチルス（Bacillus）属菌などに導入する。上記エシェ
リヒア属菌の例としては、エシェリヒア・コリ（Escher
ichia coli）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A.）６０巻、１６０頁（１９６
８年）〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Nucleic Acids Research）、９巻、３０９頁（１９
８１年）〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕、１２０巻、５１７頁（１９７８年）〕、ＨＢ１
０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー、４１巻、４５９頁（１９６９年）〕、Ｃ６００〔ジ
ェネティックス（Genetics）、３９巻、４４０頁（１９
５４年）〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Nature）、２１
７巻、１１１０頁（１９６８年）〕などが挙げられる。
上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチリ
ス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン、２４
巻、２５５頁（１９８３年）〕、２０７−２１〔ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochem
istry）９５巻、８７頁（１９８４年）〕などが挙げら
れる。プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、
たとえばティー・マニアティス（T．Maniatis）ら，モレ
キュラー・クローニング（Molecular Cloning）、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spr
ing Harbor Laboratory）、２４９頁（１９８２年）に
記載のカルシウムクロライド法あるいはカルシウムクロ
ライド／ルビジウムクロライド法などが挙げられる。ま
たファージ・ベクターを用いる場合には、たとえば増殖
させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて導
入することができる。ＢＴＣ類をコードするｃＤＮＡを
含有するＢＴＣ・ｃＤＮＡライブラリーは上記の方法な
どで得ることが出来るが、市販品として購入することも
可能である。

【０００９】このようにしてクローン化されたＢＴＣ類
をコードするｃＤＮＡは必要があればプラスミド、例え
ばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９などにサ
ブクローニングしてＢＴＣｃＤＮＡを得ることができ
る。このようにして得られたｃＤＮＡの塩基配列を、た
とえばマキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert）法〔Max
am, A. M. and Gilbert, W.、プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
オブ・ザ・ユー・エス・エー（Proc. Natl. Acad. Sc
i.,U.S.A.）、７４巻、５６０頁（１９７７年）〕ある
いはジデオキシ法〔Messing, J.ら、ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）９巻、３
０９頁（１９８１年）〕によって決定し、既知のアミノ
酸配列との比較からＢＴＣｃＤＮＡの存在を確認でき
る。上記のようにして、ＢＴＣ類をコードするｃＤＮＡ
が得られる。上記のようにしてクローン化されたＢＴＣ
類をコードするｃＤＮＡは目的によりそのまま、または
所望により制限酵素やエキソヌクレアーゼで消化して使
用することが出来る。

【００１０】次に、クローン化されたｃＤＮＡから発現
させたい領域を切り出し、発現に適したビークル（ベク
ター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクタ
ーを得ることができる。該ｃＤＮＡはその５’末端に翻
訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端には
翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを
有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止
コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加す
ることもできる。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその
上流にプロモーターを接続する。ベクターとしては、上
記の大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢ
Ｒ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３），枯草菌由来プラ
スミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）な
どが挙げられる。

【００１１】本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ
ーターであればいかなるものでもよい。形質転換する際
の宿主がエシェリキア属菌である場合は、Ｔ７プロモー
ター，ｔｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅ
ｃＡプロモーター，λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモ
ーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ
Ｏ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモーター，ｐｅｎＰプ
ロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキ
ア属菌でプロモーターがＴ７プロモーター，ｔｒｐプロ
モーターまたはλＰＬプロモーターであることが好まし
い。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的である。
このようにして構築されたＢＴＣ類の成熟ペプチドをコ
ードするｃＤＮＡを含有するベクターを用いて、原核細
胞の形質転換体を製造する。

【００１２】上記エシェリキア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA）、６９巻、２１１０頁（１９７２年）やジーン（Ge
ne）、１７巻、１０７頁（１９８２年）などに記載の方
法に従って行なわれる。バチルス属菌を形質転換するに
は、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェ
ネティックス（Molecular & General Genetics）、１６
８巻、１１１頁（１９７９年）などに記載の方法に従っ
て行われる。このようにして、ＢＴＣ類をコードするｃ
ＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された原核細
胞の形質転換体が得られる。宿主としてエシェリヒア属
菌を、プロモーターとしてＴ７プロモーターを用いる場
合、Ｔ７プロモーターの発現効率の向上を目的として、
ＢＴＣ類をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクター
に加え、Ｔ７リゾチーム発現プラスミドを共存させても
よい。

【００１３】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナト
リウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵
母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加しても
よい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒア
属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、
カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller）、ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェ
ネティックス（Journal of Experiments in Molecular
Genetics）、４３１−４３３頁、Cold Spring Harbor L
aboratory, New York 1972〕、ＬＢ培地等が好ましい。
ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、たとえばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）、３β−インドリルアクリル酸のよ
うな薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属
菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間
行い、必要により、通気や攪拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や攪拌を加え
ることもできる。

【００１４】ＢＴＣ類が宿主原核細胞中で封入体を形成
する場合には、培養後、遠心分離等の方法により集菌し
た後、細胞を破砕し、封入体を変性剤を用いて可溶化す
ることによって、ＢＴＣ類を抽出することができる。細
胞の破砕は、常法で、たとえば超音波処理により実施で
きる。懸濁媒体として中性付近のｐＨ値（ｐＨ６．５〜
７．５）に調整した好適な緩衝液（例えばリン酸緩衝液
等）を用いることが好ましい。この際、細胞の破砕を促
進させるためＥＤＴＡを添加してもよい。このようにし
て細胞を破砕した後に、不溶成分（封入体）を任意の方
法で、遠心分離するか、濾過することにより分取する。
原核細胞由来の蛋白質をできる限り除去するため、たと
えば水、リン酸緩衝液を用いて洗浄することが好ましい
が、場合により４Ｍ程度の尿素で洗浄してもよい。得ら
れた沈殿（ペレット）を変性剤を用いて可溶化する際の
変性剤としては、公知の変性剤、特にグアニジンまたは
尿素等を使用することができる。変性剤は通常水溶液と
して用いられ、水溶液中の変性剤の濃度は、グアニジン
では４〜８モル／リットル、好ましくは約６〜７モル／
リットル、尿素では５〜９モル／リットル、好ましくは
約８モル／リットルである。グアニジンは通常グアニジ
ン塩酸塩等のグアニジンの酸付加塩として用いられる。

【００１５】ＢＴＣ類が宿主原核細胞中で封入体を形成
しない場合には、培養後、遠心分離等の方法により集菌
した後、細胞を変性剤を用いて可溶化するか、あるいは
細胞を破砕後変性剤で可溶化することによってＢＴＣ類
を抽出することができる。集菌した細胞の可溶化に用い
られる変性剤としては、例えばグアニジンなどが挙げら
れる。変性剤は通常水溶液として用いられ、水溶液中の
変性剤の濃度は、グアニジンでは通常４〜８モル／リッ
トル、このましくは約６〜７モル／リットルである。グ
アニジンは通常グアニジン塩酸塩等のグアニジンの酸付
加塩として用いられる。細胞の破砕は、常法で、たとえ
ば超音波処理、フレンチ・プレスにより実施できる。破
砕された細胞の可溶化に用いられる変性剤としては、公
知の変性剤、特にグアニジンまたは尿素を使用すること
ができる。変性剤は通常水溶液として用いられ、水溶液
中の変性剤の濃度は、グアニジンでは４〜８モル／リッ
トル、好ましくは約６〜７モル／リットル、尿素では５
〜９モル／リットル、好ましくは約８モル／リットルで
ある。グアニジンは通常グアニジン塩酸塩等のグアニジ
ンの酸付加塩として用いられる。

【００１６】上記のようにして封入体の可溶化を行う
か、あるいは菌体を変性剤で直接可溶化するか、あるい
は細胞を破砕後変性剤で可溶化した後、遠心分離等で不
純物を除去し、得られた上澄液を必要により精製工程や
Ｎ末端Ｍｅｔの除去工程に付した後、ＢＴＣ類のリフォ
ールディング（活性化、再生化）を行うことができる。
リフォールディングは、精製したＢＴＣ類にレドックス
バッファーを添加するか、あるいはＢＴＣ類を含有する
上澄液をレドックスバッファーで希釈することにより行
われる。「この際、たとえばメルカプト基を有さないア
ミノ酸などをレドックスバッファーに含有させておくこ
とが好ましい。」ＢＴＣ類を含有する上澄液をレドック
スバッファーで希釈する場合、変性剤の濃度を活性化に
適した中性ｐＨにおいて不作用濃度まで希釈することが
望ましく、たとえば変性剤がグアジニンである場合には
希釈液中のグアニジンの濃度を０〜２．０モル／リット
ル、好ましくは約１モル／リットル以下まで、変性剤が
尿素である場合には希釈液中の尿素の濃度を０〜４．０
モル／リットル、好ましくは約２モル／リットル以下ま
で希釈することが望ましい。

【００１７】リフォールディングに際してレドックスバ
ッファーに添加されるメルカプト基を有さないアミノ酸
としては、本発明の目的が達成される限り、メルカプト
基を有さないアミノ酸であればいずれのものでもよい
が、アルギニン、アスパラギン酸、バリン、リジン、ア
ラニン、シトルリン等が好ましく、アルギニン等がＢＴ
Ｃ類のリフォールディングにおける収率の点で特に好ま
しく、レドックスバッファー中の該アミノ酸の添加濃度
は、０．１〜１．０モル／リットル、好ましくは０．１
〜０．５モル／リットルである。レドックスバッファー
としては、酸化体と還元体は一般に有機物質が好まし
く、たとえば酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）および還
元型グルタチオン（ＧＳＨ）、システインおよびシスチ
ン、またはシステアミンおよびシスタミンを含有する緩
衝液（例、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝
液）等が好ましいものとして挙げられ、中でもＧＳＳＧ
およびＧＳＨを含有するリン酸緩衝液等が特に好まし
い。レドックスバッファー中の酸化剤および還元剤の濃
度は一般にそれぞれ０．０１〜１００ミリモル／リット
ルおよび０．０１〜１００ミリモル／リットルである。
より具体的には、ＧＳＳＧおよびＧＳＨを用いる場合、
レドックスバッファー中のＧＳＳＧの濃度は０．１〜１
０ミリモル／リットル、好ましくは０．１〜１．０ミリ
モル／リットル、ＧＳＨの濃度は０．１〜１０ミリモル
／リットル、好ましくは０．２〜２．０ミリモル／リッ
トルである。該リフォールディングに当っての温度は０
〜３０℃、好ましくは４〜１５℃、ｐＨは７〜９、好ま
しくはｐＨ７．５〜８．５である。リフォールディング
に要する時間は通常０．５〜７日間、好ましくは１〜３
日間である。

【００１８】なお、可溶化後かつリフォールディングの
前に、例えば抽出、塩析、透析、分配、結晶化、再結
晶、ゲルろ過、クロマトグラフィー等の公知で常用の精
製工程を導入することができ、好ましくは、たとえば
０．１モル／リットル リン酸緩衝液中セファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（ファルマシア バイオ
テク（株））にかけることにより精製することができ
る。変性剤の分離は場合により０．１モル／リットル
リン酸緩衝液に対して透析することによっても可能であ
る。精製工程はリフォールディングに続いて行うことも
できる。一般にそのような精製としては例えば抽出、塩
析、透析、分配、結晶化、再結晶、ゲルろ過、クロマト
グラフィー等が挙げられ、好ましい例として透析や、た
とえばＳＰ−セファロース（ファルマシア バイオテク
（株））、ＳＰ−５ＰＷ（トーソー（株））あるいは、
ＤＥＡＥ−５ＰＷ（トーソー（株））を介したイオン交
換クロマトグラフィー、たとえばＯＤＰ−５０（昭和電
工（株））を用いた逆相クロマトグラフィー等による精
製法が挙げられる。

【００１９】遺伝子工学的に原核細胞中で発現させて得
られるＢＴＣ類は、Ｎ末端にＭｅｔが付加されていない
ＢＴＣである場合もあるが、通常Ｎ末端にＭｅｔが付加
されたＭｅｔ−ＢＴＣである。得られたＢＴＣ類がＭｅ
ｔ−ＢＴＣである場合には、リフォールディングの前あ
るいは後に、Ｎ末端Ｍｅｔ残基の除去を行い、Ｎ末端に
Ｍｅｔが付加されていないＢＴＣを得ることもできる。
Ｎ末端Ｍｅｔ残基の除去は、たとえばＭｅｔ−ＢＴＣと
α−ジケトン類を反応させた後、加水分解することによ
り行うことができる。α−ジケトン類は、Ｍｅｔ−ＢＴ
Ｃのアミノ基転移反応を進行させうるものであればいず
れでもよく、例えば式Ｒ¹−ＣＯ−ＣＯ−Ｒ²〔式中、Ｒ
¹は水素またはカルボキシル基で置換されていてもよい
低級アルキルもしくはフェニル基（好ましくは水素また
はメチル、さらに好ましくは水素）を示し、Ｒ²は水酸
基、低級アルコキシ基または低級アルキルで置換されて
いてもよいアミノ基（好ましくは水酸基）を示す。〕で
表される化合物またはその塩等が挙げられる。上記式
中、Ｒ¹で示される低級アルキル基としては、メチル、
エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル、ｉ−ブチ
ル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル等の炭素数１ないし６
程度のアルキル基等が挙げられ、Ｒ²で示される低級ア
ルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキ
シ、ｉ−プロポキシ、ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓｅｃ
−ブトキシ、ｔ−ブトキシ等の炭素数１ないし６程度の
アルコキシ基等が挙げられる。また、Ｒ²で示される低
級アルキルで置換されていてもよいアミノ基としては、
前記したＲ¹で示される低級アルキル基を１ないし２個
有していてもよいアミノ基等が挙げられる。さらに、塩
としては、上記したＢＴＣ類の塩と同様な無機酸との
塩、有機酸との塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属
塩アンモニウム塩等が挙げられる。α−ジケトン類の具
体例としては、グリオキシル酸、ピルビン酸、オキサル
酢酸、フェニルグリオキシル酸、２−オキソグルタル酸
等が挙げられるが、中でも、グリオキシル酸が好ましく
用いられる。

【００２０】Ｍｅｔ−ＢＴＣとα−ジケトン類とのアミ
ノ基転移反応は、通常、Ｍｅｔ−ＢＴＣ、１モルに対し
て、１ないし１万モル（好ましくは２０００ないし４０
００モル）程度のα−ジケトン類を、約０ないし７０℃
（好ましくは約２０ないし４０℃）で約５分ないし２時
間（好ましくは約１５分ないし１時間）反応させるのが
好ましい。また、反応のｐＨは、約２ないし９、中で
も、約４ないし７、とりわけ約５ないし６に調整して、
Ｍｅｔ−ＢＴＣが変性しない条件下で反応を進行させる
のがよい。反応液のｐＨを調整するため、たとえばリン
酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の緩衝液を用
いてもよい。該アミノ基転移反応を促進させるため、遷
移金属イオンの存在下にα−ジケトン類を反応させるこ
とが好ましく、通常、α−ジケトン類１モルに対して、
０．００１ないし０．１モル（好ましくは０．０１ない
し０．０５モル）程度の遷移金属イオンを用いるのが好
ましい。遷移金属イオンとしては、たとえば、銅イオ
ン、コバルトイオン、ニッケルイオン、鉄イオン、亜鉛
イオン、アルミニウムイオン、マンガンイオン、ガリウ
ムイオン、インジウムイオン、マグネシウムイオン、カ
ルシウムイオン等を用いることができるが、中でも、銅
イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン等、とりわけ
銅イオンが好ましく用いられる。これらの遷移金属イオ
ンは、通常、硫酸、硝酸、塩酸、臭酸、炭酸、過塩素酸
等の無機酸との塩または酢酸、クエン酸等の有機酸との
塩として、反応溶媒に添加することができ、中でも、硫
酸銅、酢酸銅、とりわけ、硫酸銅が好ましく用いられ
る。また、塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させる
ことが好ましく、通常、α−ジケトン類１モルに対し
て、０．１ないし２モル（好ましくは０．５ないし１．
０モル）程度の塩基を用いるのが好ましい。塩基として
は、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン等の
アルキルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジ
ン、ルチジン、コリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリ
ジン、イミダゾール等の芳香族アミン類等の有機塩基等
を用いることができるが、なかでも、芳香族アミン類、
とりわけ、ピリジンが好ましく用いられる。さらに、上
記したアミノ基転移反応は、遷移金属イオンおよび塩基
の存在下にα−ジケトン類を反応させることが好まし
く、実用的には、遷移金属イオン、塩基およびα−ジケ
トン類の３成分（例えば、硫酸銅、ピリジンおよびグリ
オキシル酸等）を含有する混合液を、Ｍｅｔ−ＢＴＣを
含有する、０〜４モル／リットルの尿素を含有する水溶
液に添加して、アミノ基転移反応を進行させる。

【００２１】該アミノ基転移反応により得られたジケト
ン体〔CH₃-S-(CH₂)₂-CO-CO-BTC〕は、ペプチドまたは蛋
白質の精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、再結晶、
クロマトグラフィー等により、反応溶液から単離・精製
することもできるが、そのまま次の加水分解反応に付す
こともできる。加水分解反応に用いる塩基としては、例
えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン等のアルキ
ルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン、ル
チジン、コリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、
イミダゾール等の芳香族アミン類、ｏ−フェニレンジア
ミン、トリレン−３，４−ジアミン、３，４−ジアミノ
安息香酸、２，３−ジアミノフェノール、４−クロロ−
ｏ−フェニレンジアミン等のジアミン類（好ましくは芳
香族ジアミン類、中でも、ｏ−フェニレンジアミン
類）、チオセミカルバジド、アセトンチオセミカルバジ
ド、フェニルチオセミカルバジド等のチオセミカルバジ
ド類、セレノセミカルバジド、アセトンセレノセミカル
バジド等のセレノセミカルバジド類等を用いることがで
きるが、中でも、ジアミン類またはチオセミカルバジド
類が好ましく用いられ、とくに、ｏ−フェニレンジアミ
ンが好ましく用いられる。塩基の量は、通常、ジケトン
体１モルに対して約１ないし１万モル、好ましくは約５
００ないし２０００モルである。加水分解反応は、通
常、約０ないし７０℃（好ましくは約２０ないし４０
℃）で約１ないし５０時間（好ましくは約１０ないし２
５時間）で進行させるのが好ましい。反応には、緩衝液
を溶媒として用いることが好ましく、緩衝液としては、
リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げら
れ、中でも、酢酸緩衝液が好ましい。反応のｐＨは、約
２ないし９、中でも、約３ないし７、とりわけ、約４な
いし６に調整して、得られるＢＴＣが変性しない条件下
で反応を進行させるのがよい。

【００２２】このようにして得られるＢＴＣ類は、公知
の精製手段、例えば、抽出、塩析、透析、分配、結晶
化、再結晶、ゲルろ過、クロマトグラフィー等により、
反応溶液から単離・精製することもできるが、好ましい
例として、例えば、ＳＰ−セファロース（ファルマシア
バイオテク（株））、ＳＰ−５ＰＷ（トーソー
（株））あるいは、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（トーソー
（株））を介したイオン交換クロマトグラフィー、ＯＤ
Ｐ−５０（昭和電工（株））を用いた逆相クロマトグラ
フィー等による精製法が挙げられる。本発明で得られる
ＢＴＣ類は、公知のＢＴＣと同様の作用を有しており、
公知のＢＴＣの使用方法と同様にして用いることができ
る。

【００２３】

【発明の実施の形態】本発明明細書および図面におい
て、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-
IUB Commision on Biochemical Nomenclatureによる略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性
体がありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示す
ものとする。 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：伝令リボ核酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ ：ジチオスレイトール Ｇｌｙ（Ｇ）：グリシン Ａｌａ（Ａ）：アラニン Ｖａｌ（Ｖ）：バリン Ｌｅｕ（Ｌ）：ロイシン Ｉｌｅ（Ｉ）：イソロイシン Ｓｅｒ（Ｓ）：セリン Ｔｈｒ（Ｔ）：スレオニン Ｃｙｓ（Ｃ）：システイン Ｍｅｔ（Ｍ）：メチオニン Ｇｌｕ（Ｅ）：グルタミン酸 Ａｓｐ（Ｄ）：アスパラギン酸 Ｌｙｓ（Ｋ）：リジン Ａｒｇ（Ｒ）：アルギニン Ｈｉｓ（Ｈ）：ヒスチジン Ｐｈｅ（Ｆ）：フェニルアラニン Ｔｙｒ（Ｙ）：チロシン Ｔｒｐ（Ｗ）：トリプトファン Ｐｒｏ（Ｐ）：プロリン Ａｓｎ（Ｎ）：アスパラギン Ｇｌｎ（Ｑ）：グルタミン Ａｓｘ ：Ａｓｐ＋Ａｓｎ Ｇｌｘ ：Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ 以下の参考例および実施例によって本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではな
い。

【００２４】

【実施例】

参考例 （ヒトＭｅｔ−ＢＴＣの製造） 特開平６−８７８９４の実施例４〜６、８および１３に
記載の方法に準じて、下記の方法でヒトＭｅｔ−ＢＴＣ
を製造した。

【００２５】参考例１ （大腸菌のヒトＢＴＣｃＤＮＡ
発現プラスミドの構築） ヒト・プロＢＴＣ（１−１４７アミノ酸残基）をコード
する０．６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、特開
平６−８７８９４の実施例５に記載のプラスミドｐＴＢ
１５１５から単離した。ＡＴＧ翻訳開始コドン（配列番
号２：５’−ＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧ−３’；配列番号
３：５’−ＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡ−３’）を有する
合成アダプターを上記０．６Ｋｂ断片のＥｃｏＲＩ部位
に連結した後、生成した０．６Ｋｂ ＮｄｅＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片を、Ｔ７プロモーター（Ｇｅｎｅ、５６巻、１
２５頁（１９８７年））を含有するプラスミドｐＥＴ−
３ｃ中へ挿入し、プラスミドｐＴＢ１５０５を構築し
た。ヒトＢＴＣの８０アミノ酸残基（特開平６−８７８
９４の図１０−１〜図１０−２の１（Ａｓｐ）から８０
（Ｔｙｒ）まで）をコードするＤＮＡ断片を得るため、
鋳型としてプラスミドｐＴＢ１５０５、プライマーとし
て２個のオリゴヌクレオチド（配列番号４：５’−ＡＴ
ＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡ−３’；配
列番号５：５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣ
ＡＡＧＴＣＡＡＣＴＣＴ−３’）を用いてＰＣＲ（poly
merase chain reaction）を行った。生成物をＮｄｅＩ
およびＢａｍＨＩで消化し、２．０％アガロースゲル電
気泳動で分画し、目的とする０．２５ＫｂＤＮＡ断片を
単離した。この０．２５ＫｂＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片
を、ｐＥＴ−３ｃのＴ７プロモーターの下流にＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結しプラスミドｐＴＢ１５１６を
得た（特開平６−８７８９４の図１３参照）。

【００２６】参考例２ （大腸菌でのヒトＭｅｔ−ＢＴ
Ｃの発現） 大腸菌ＭＭ２９４を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子で組み換えられているラムダファージ（スチュ
ディエ、スプラ）で溶原化した。その後、プラスミドｐ
ＬｙｓＳをこの大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、
大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを得た。この
菌体に上記参考例で得られたプラスミドｐＴＢ１５１６
を導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，
ｐＴＢ１５１６を得た。この形質転換細胞を、５０μｇ
／ｍｌのアンピシリンと１５μｇ／ｍｌのクロラムフェ
ニコールを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母
エキス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２
リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培養し
た。得られた培養液を１９リットルの主発酵培地（１．
６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素
カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化
ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２％
消泡剤、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．０００５％
塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ
酸）を仕込んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、３０
℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００
クレット単位になった時点で、１００ｍｇ／リットル分
のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ
ＰＴＧ）を添加し、さらに培養を続け、７時間後に培養
を終了した。この培養終了液を遠心分離して、約３４０
ｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。

【００２７】この形質転換大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）
／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６は、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−３８３６として通商産業省工業技術院生命工学工
業研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、また受託番号ＩＦＯ
１５２８２として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄
託されている。

【００２８】参考例３ （大腸菌のヒトＢＴＣ５０ｃＤ
ＮＡ発現プラスミドの構築） ｐＥＴ３ｃ（Rosenberg et al., ジーン（Gene），５６
巻，１２５頁（１９８７年）をＮｄｅｌ及びＢａｍＨＩ
で切断し、Ｔ７プロモーター及びアンピシリン耐性遺伝
子を含む約４．６ｋの断片を取得した。Ｎｄｅｌサイト
の下流に、ＡＴＧの翻訳開始コドン、配列番号：１のＭ
ｅｔ−ＢＴＣにおいてＡｒｇ³²からＴｙｒ⁸¹をコードす
る遺伝子（ＢＴＣ５０ｃＤＮＡと称する）、終止コドン
及びＢａｍＨＩサイトを有する断片を、ｐＥＴ３のＮｄ
ｅｌ及びＢａｍＨＩで切断した断片とを、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結し、プラスミドｐＴＢ１９７６を得た（図
４）。

【００２９】参考例４ （大腸菌でのヒトＭｅｔ−ＢＴ
Ｃ５０の発現） 大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳにプラスミド
ｐＴＢ１９７６を導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）
／ｐＬｙｓＳ、ｐＴＢ１９７６を得た。この形質転換細
胞大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ、ｐＴＢ１
９７６は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５０５として１
９９７年１１月６日付で通商産業省工業技術院生命工学
工業研究所に寄託され、また１９９７年１０月１６日付
で受託番号ＩＦＯ １６１２２として財団法人発酵研究
所（ＩＦＯ）に寄託されている。 大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ、ｐＴＢ１９
７６を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地
（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナ
トリウム）１リットルで３０℃、１６時間振盪培養し
た。得られた培養液を２０Ｌの主発酵用培地（１．６８
％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素ナト
リウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナ
トリウム、０．０２４％硫酸マグネシウム、０．０２％
ニューポールＬＢ−６２５、０．０００５％塩化チアミ
ン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込ん
だ５０Ｌ容発酵槽に移植して、３７℃で通気撹拌培養を
開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になっ
た時点で、５．９５ｍｇ／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さら
に培養を続け、４時間後に培養液を遠心分離して、約２
００ｇの菌体を得、−８０℃に凍結保存した。

【００３０】実施例１ （Ｍｅｔ−ＢＴＣの活性化） 参考例２で得られた菌体１０ｇに、１００ｍＭトリス／
ＨＣｌ、７Ｍグアニジン塩酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８．０）２０ｍｌを加えて菌体を溶解した後、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１２０ｍｌを添加し、遠
心分離（１００００ｒｐｍ、１時間）を行った。上澄液
に０．１Ｍアルギニン、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＧＳＳＧ、１ｍＭ ＧＳＨ
（ｐＨ８．０）５リットルを加えて、４℃で一晩活性化
を行った。

【００３１】実施例２ （Ｍｅｔ−ＢＴＣの精製） 実施例１で活性化の終了した再生液をｐＨ６．０に調整
し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化し
たＳＰ−セファロースカラム（２５ｍｍＩＤ×１２０ｍ
ｍＬ）に吸着させた後、５００ｍＭ ＮａＣｌ／１００
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出した。ＢＴＣを
含むフラクションをプールし、続いて０．１％トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化したＯＤＰ−５０（２１．
５ｍｍＩＤ×３００ｍｍＬ、５μ）（昭和電工（株））
に吸着させた後、２０〜６０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニ
トリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で６０分間、５ｍ
ｌ／分の流速で溶出した。Ｍｅｔ−ＢＴＣのフラクショ
ンをプールした後、凍結乾燥を行い、Ｍｅｔ−ＢＴＣ約
１０ｍｇを得た。

【００３２】実施例３ （Ｍｅｔ−ＢＴＣの特徴決定） （ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた
分析 実施例２で得られたＢＴＣを１０ｍＭ ＤＴＴを添加し
たＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ［Laemmli, Nature, 22
7, 680 (1979)］に懸濁し、９５℃で１分間加熱した
後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品）で電気泳動
を行った。泳動後のゲルをクーマシー・ブリリアント・
ブルー（Coomassie brilliant blue）で染色した結果、
約１６Ｋｄに単一バンドの蛋白が認められた。このこと
から精製Ｍｅｔ−ＢＴＣはほぼ単一であり、ＤＴＴによ
る還元条件下でも強固な二量体を形成していることが判
った（図２）。

【００３３】（ｂ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマンシステム６
３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、Ｎ末端にＭｅ
ｔが付加されたＢＴＣのｃＤＮＡの塩基配列から推定さ
れるアミノ酸組成と一致した（表１）。

【表１】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １モル当たりの ＢＴＣの塩基配列 アミノ酸 残基数 から予測される値 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ａｓｘ ７．０ ７ Ｔｈｒ¹⁾ ５．９ ６ Ｓｅｒ¹⁾ ５．３ ５ Ｇｌｘ ９．２ ９ Ｐｒｏ ４．０ ４ Ｇｌｙ ６．９ ７ Ａｌａ ４．０ ４ Ｃｙｓ²⁾ Ｎ．Ｄ． ８ Ｖａｌ ４．０ ４ Ｍｅｔ ０．９ ０ Ｉｌｅ ２．０ ２ Ｌｅｕ ３．１ ３ Ｔｙｒ ４．０ ４ Ｐｈｅ ３．０ ３ Ｈｉｓ ２．６ ２ Ｌｙｓ ５．３ ５ Ａｒｇ ７．１ ７ Ｔｒｐ²⁾ Ｎ．Ｄ． ０ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 酸加水分解（６Ｎ ＨＣｌ−１％フェノール、１１０
℃、２４及び４８時間加水分解の平均値） １）０時間に外挿した値 ２）未検出 約２０μｇを用いて分析を行った。

【００３４】（ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムモデル４７７Ａ）を用いて決定
した。その結果、得られたＢＴＣのＮ末端にはＭｅｔが
付加されていることの他はｃＤＮＡの塩基配列から推定
されたＢＴＣのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表
２）。

【表２】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 検出された ＢＴＣの塩基配列 残基Ｎｏ． ＰＴＨ¹⁾−アミノ酸 から予測される （ｐｍｏｌ） アミノ酸 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １ Ｍｅｔ（５６３） ２ Ａｓｐ（２７１） Ａｓｐ ３ Ｇｌｙ（４９０） Ｇｌｙ ４ Ａｓｎ（４６５） Ａｓｎ ５ Ｓｅｒ（２１７） Ｓｅｒ ６ Ｔｈｒ（３０４） Ｔｈｒ ７ Ａｒｇ（１８４） Ａｒｇ ８ Ｓｅｒ（１２２） Ｓｅｒ ９ Ｐｒｏ（２６８） Ｐｒｏ １０ Ｇｌｕ（１６０） Ｇｌｕ １１ Ｔｈｒ（１５５） Ｔｈｒ １２ Ａｓｎ（１２０） Ａｓｎ １３ Ｇｌｙ（１１４） Ｇｌｙ １４ Ｌｅｕ（２１３） Ｌｅｕ １５ Ｌｅｕ（２３５） Ｌｅｕ １６ Ｎ．Ｄ． Ｃｙｓ １７ Ｇｌｙ（１６５） Ｇｌｙ １８ Ａｓｐ（９４） Ａｓｐ １９ Ｐｒｏ（１３４） Ｐｒｏ ２０ Ｇｌｕ（３７） Ｇｌｕ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １）フェニールチオヒダントイン １ｎｍｏｌを用いて分析を行った。

【００３５】（ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマンシステム
６３００Ｅ）を用いて決定した。得られたＭｅｔ−ＢＴ
ＣはｃＤＮＡの塩基配列から推定されたＣ末端アミノ酸
と一致した（表３）。

【表３】 気相ヒドラジン分解法（１００℃，３．５時間） １５ｎｍｏｌを用いて分析を行った。

【００３６】実施例４ （Ｍｅｔ−ＢＴＣの活性測定） 実施例２で得られた精製Ｍｅｔ−ＢＴＣのＢＡＬＢ／ｃ
３Ｔ３ Ａ３１−７１４クローン４（インターナショ
ナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２巻、４６３
頁（１９７３年））に対する増殖促進効果は、標準品
（特開平６−８７８９４の実施例１３に記載のＢＴＣＩ
の精製品）と同等であった。

【００３７】実施例５ （Ｎ末端Ｍｅｔの除去） Ｎ末端にＭｅｔの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ１０ｍｇを３
Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、５０ｍＭ硫酸銅０．５
ｍｌ、グリオキシル酸０．２５ｇ、ピリジン０．５ｍｌ
の混合液（ｐＨ５．０）を加え、２５℃で１時間反応し
た。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ×
６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ
／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣのジケトン体画分
をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−４Ｍ
酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジアミ
ンを４０ｍＭ濃度となるように添加して、脱気、窒素ガ
スシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応終了
後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平
衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５ｍｍＩＤ
×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を６
ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にＭｅｔの付加してい
ないＢＴＣ画分をプールした。プールしたＢＴＣ画分を
ｐＨ６．０に調整後、１００ｍＭリン酸緩衝液＋２００
ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＰ−５Ｐ
Ｗ（７．５ｍｍＩＤ×７５ｍｍＬ）、東ソー（株））に
吸着した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝１００ｍＭリン酸緩
衝液＋２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．０）の段階勾配
で３０分間、０．８ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ＢＴ
Ｃ画分をプールした、さらに、ＢＴＣ画分を０．１％Ｔ
ＦＡで平衡化したＯＤＰ−５０（１０ｍｍＩＤ×２５０
ｍｍＬ）、昭和電工（株））に吸着した後、２０〜６０
％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の
段階勾配で４０分間、２ｍｌ／分の流速で溶出した。Ｂ
ＴＣのフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、
ＢＴＣ約７６０μｇを得た。

【００３８】実施例６ （ＢＴＣの特徴決定） （ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた
分析 実施例４で得られたＢＴＣを１００ｍＭ ＤＴＴを添加
したＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ［Laemmli, Nature, 2
27, 680 (1970)］に懸濁し、９５℃で１分間加熱した
後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品）で電気泳動
を行った。泳動後のゲルをクーマシー・ブリリアント・
ブルー（Coomassie brilliant blue）で染色した結果、
約１６Ｋｄに単一バンドの蛋白が認められた。このこと
から、精製ＢＴＣはほぼ単一であり、ＤＴＴによる還元
条件下でも強固な二量体を形成していることが判った
（図３）。

【００３９】（ｂ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマンシステム６
３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、ＢＴＣのｃＤ
ＮＡの塩基配列から推定されたアミノ酸組成と一致した
（表４）。

【表４】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １モル当たりの ＢＴＣの塩基配列 アミノ酸 残基数 から予測される値 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ａｓｘ ７．０ ７ Ｔｈｒ¹⁾ ５．９ ６ Ｓｅｒ¹⁾ ４．８ ５ Ｇｌｘ ９．１ ９ Ｐｒｏ ４．０ ４ Ｇｌｙ ７．１ ７ Ａｌａ ４．０ ４ Ｃｙｓ²⁾ Ｎ．Ｄ． ８ Ｖａｌ ４．６ ４ Ｍｅｔ ０ ０ Ｉｌｅ １．９ ２ Ｌｅｕ ３．０ ３ Ｔｙｒ ４．０ ４ Ｐｈｅ ３．０ ３ Ｈｉｓ ２．４ ２ Ｌｙｓ ５．１ ５ Ａｒｇ ７．０ ７ Ｔｒｐ²⁾ Ｎ．Ｄ． ０ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 酸加水分解（６Ｎ ＨＣｌ−１％フェノール、１１０
℃、２４及び４８時間加水分解の平均値） １）０時間に外挿した値 ２）未検出 約２０μｇを用いて分析を行った。

【００４０】（ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムモデル４７７Ａ）を用いて決定
した。その結果、得られたＢＴＣのｃＤＮＡの塩基配列
から推定されたＢＴＣのＮ末端アミノ酸配列と一致した
（表５）。

【表５】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 検出された ＢＴＣの塩基配列 残基Ｎｏ． ＰＴＨ¹⁾−アミノ酸 から予測される （ｐｍｏｌ） アミノ酸 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １ Ａｓｐ（２７１） Ａｓｐ ２ Ｇｌｙ（４３２） Ｇｌｙ ３ Ａｓｎ（２４９） Ａｓｎ ４ Ｓｅｒ（９５） Ｓｅｒ ５ Ｔｈｒ（１５０） Ｔｈｒ ６ Ａｒｇ（９８） Ａｒｇ ７ Ｓｅｒ（８９） Ｓｅｒ ８ Ｐｒｏ（２５５） Ｐｒｏ ９ Ｇｌｕ（１７７） Ｇｌｕ １０ Ｔｈｒ（１４０） Ｔｈｒ １１ Ａｓｎ（１３９） Ａｓｎ １２ Ｇｌｙ（１８７） Ｇｌｙ １３ Ｌｅｕ（２２７） Ｌｅｕ １４ Ｌｅｕ（２８１） Ｌｅｕ １５ Ｎ．Ｄ． Ｃｙｓ １６ Ｇｌｙ（１２６） Ｇｌｙ １７ Ａｓｐ（７０） Ａｓｐ １８ Ｐｒｏ（１００） Ｐｒｏ １９ Ｇｌｕ（４４） Ｇｌｕ ２０ Ｇｌｕ（７５） Ｇｌｕ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １）フェニールチオヒダントイン １ｎｍｏｌを用いて分析を行った。

【００４１】（ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマンシステム
６３００Ｅ）を用いて決定した。得られたＢＴＣはｃＤ
ＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した
（表６）。

【表６】 気相ヒドラジン分解法（１００℃，３．５時間） １５ｎｍｏｌを用いて分析を行った。

【００４２】（ｅ）ＢＴＣの生物活性 モレキュラー・セル・バイオロジー、８巻、５８８頁
（１９８８年）に記載の方法により、ＢＡＬＢ／ｃ ３
Ｔ３ Ａ３１−７１４クローン４（インターナショナル
・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２巻、４６３頁
（１９７３年））を用いた活性測定を行い、精製ＢＴＣ
が標準品（特開平６−８７８９４の実施例１３に記載の
精製ＢＴＣＩ）と同等の細胞増殖促進活性を有すること
を確認した。

【００４３】実施例７ （Ｍｅｔ−ＢＴＣ５０の活性
化） 参考例４で得られた菌体２００ｇに、１００ｍＭトリス
／ＨＣｌ、７Ｍグアニジン塩酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）４００ｍｌを加えて菌体を溶解した後、
遠心分離（１００００ｒｐｍ、１時間）を行った。上澄
液に０．２Ｍアルギニン、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＧＳＳＧ、１ｍＭ ＧＳ
Ｈ（ｐＨ８．０）１０Ｌを加えて、４℃で一晩活性化を
行った。

【００４４】実施例８ （Ｍｅｔ−ＢＴＣ５０の精製） 実施例７で活性化の終了した再生液をペリコンカセット
システム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社限外ろ過膜、分画分
子量１０００）で脱塩・濃縮した後、ｐＨ６．０に調製
した。この脱塩液を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）で平衡化したＳＰ−セファロースカラム（４０ｍｍ
ＩＤ×１００ｍｍＬ）に吸着し、２００ｍＭ ＮａＣｌ
／１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した
後、７００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）で溶出した。ＢＴＣ５０を含むフラクシ
ョンをプールし、蒸留水で３倍に希釈した後、２００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ／１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
で平衡化したＳＰ−５ＰＷ（５５ｍｍＩＤ×３００ｍｍ
L）に吸着し、Ａ＝２００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、Ｂ＝３００ｍＭ ＮａＣ
ｌ／１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）とによる０
〜１００％Ｂの段階勾配で、１００分間、３５ｍｌ／分
の流速で溶出を行ない、ＢＴＣ５０画分を得た。さらに
０．１％ＴＦＡで平衡化したＯＤＳ−１２０Ｔ（２１．
５ｍｍＩＤ×３００ｍｍＬ、５μ）（東ソー（株））に
吸着した後、２０−５０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリ
ル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で５０分間、５ｍｌ／
分の流速で溶出した。Ｍｅｔ−ＢＴＣ５０のフラクショ
ンをプールした後、凍結乾燥を行い、Ｍｅｔ−ＢＴＣ５
０約１００ｍｇを得た。

【００４５】実施例９ （Ｍｅｔ−ＢＴＣ５０の特徴決
定） ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分
析 実施例８で得られたＭｅｔ−ＢＴＣ５０を１００ｍＭ
ＤＴＴを添加したＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＯＶ
ＥＸ社）に懸濁し、９５℃で１分間加熱した後、PEPTID
E-PAGE MINI GEL（ＴＥＦＣＯ社）で電気泳動を行っ
た。泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルー（Co
omassie brilliant blue）で染色したところ、単一バン
ドの蛋白が認められ、精製品は、ほぼ単一であった（図
５）。

【００４６】ｂ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマン システム
６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、Ｎ末端にメ
チオニンが付加されたＢＴＣ５０のｃＤＮＡの塩基配列
から推定したアミノ酸組成と一致した（表７）。

【表７】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １モル当たりの ＢＴＣ５０の塩基配列 アミノ酸 残 基 数 から予測される値 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ａｓｘ ２．１ ２ Ｔｈｒ¹⁾ １．１ １ Ｓｅｒ¹⁾ １．８ ２ Ｇｌｘ ５．０ ５ Ｐｒｏ １．９ ２ Ｇｌｙ ４．１ ４ Ａｌａ ２．０ ２ Ｃｙｓ²⁾ ６ Ｖａｌ ３．７ ４ Ｍｅｔ ０．９ ０ Ｉｌｅ １．９ ２ Ｌｅｕ ０．９ １ Ｔｙｒ ３．８ ４ Ｐｈｅ ３．１ ３ Ｈｉｓ ２．０ ２ Ｌｙｓ ３．８ ４ Ａｒｇ ６．０ ６ Ｔｒｐ²⁾ ０ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 酸加水分解（６Ｎ ＨＣｌ−４％チオグリコール酸、１
１０℃，２４・４８ｈｒ加水分解の平均値） １）０時間に外挿した値 ２）未検出

【００４７】ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステム モデル４７７Ａ）を用いて決
定した。その結果、得られたＢＴＣ５０のＮ末端にはメ
チオニンが付加されていることのほかはｃＤＮＡの塩基
配列から推定したＢＴＣのＮ末端アミノ酸配列と一致し
た（表８）。

【表８】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 検出された ＢＴＣ５０の塩基配列から 残基 Ｎｏ． ＰＴＨ¹⁾−アミノ酸 予測されるアミノ酸 (pmol) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １ Ｍｅｔ (３８８) ２ Ａｒｇ (１９２) Ａｒｇ ３ Ｌｙｓ (７３６) Ｌｙｓ ４ Ｇｌｙ (７６１) Ｇｌｙ ５ Ｈｉｓ (３５０) Ｈｉｓ ６ Ｐｈｅ (５５５) Ｐｈｅ ７ Ｓｅｒ (２１４) Ｓｅｒ ８ Ａｒｇ (３０９) Ａｒｇ ９ Ｎ.Ｄ. Ｃｙｓ １０ Ｐｒｏ (２３１) Ｐｒｏ １１ Ｌｙｓ (２２３) Ｌｙｓ １２ Ｇｌｎ (１７９) Ｇｌｎ １３ Ｔｙｒ (１５８) Ｔｙｒ １４ Ｌｙｓ (２０２) Ｌｙｓ １５ Ｈｉｓ (７２) Ｈｉｓ １６ Ｔｙｒ (１１３) Ｔｙｒ １７ Ｎ.Ｄ. Ｃｙｓ １８ Ｉｌｅ (８５) Ｉｌｅ １９ Ｌｙｓ (８４) Ｌｙｓ ２０ Ｇｌｙ (７５) Ｇｌｙ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １ｎｍｏｌを用いて分析を行った。 １）フェニールチオヒダントイン

【００４８】ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマン システ
ム６３００Ｅ）を用いて決定した。得られたＭｅｔ−Ｂ
ＴＣ５０はｃＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミ
ノ酸と一致した（表９）。

【表９】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｃ末端アミノ酸 回収率 ＢＴＣ５０ （％） −−−−−−−−−−−−−−−− Ｔｙｒ ５５．２ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 気相ヒドラジン分解法（１００℃、３，５ｈｒ）

【００４９】実施例１０ （Ｍｅｔ−ＢＴＣ５０の活性
測定） 実施例８で得られたＭｅｔ−ＢＴＣ５０のＢＡＬＢ／Ｃ
３Ｔ３ Ａ３１−７１４クローン４（インターナショナ
ル・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２、４６３（１
９７３））に対する増殖促進効果は、標準品と同等の活
性を有していた。

【００５０】実施例１１ （ＢＴＣ５０の調製） Ｎ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＴＣ５０ ４
０ｍｇを３Ｍ尿素溶液３．８５ｍｌに溶解した後、０．
１Ｍ硫酸銅０.４ｍｌ、グリオキシル酸０．２５ｇ、ピ
リヂン０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応
した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋２０ｍＭリ
ン酸緩衝液(ｐＨ６.０）で平衡化したセファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１０カラム（２５ｍｍＩＤ×
６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を３ｍｌ
／分の流速で展開し、Ｍｅｔ−ＢＴＣ５０のジケトン体
画分をプールした。続いてこの画分に等量の４Ｍ酢酸−
４Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えた後、ｏ−フェニレンジ
アミンを４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒
素ガスシールを行い、３７℃で１５時間反応した。反応
終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６.０）で平衡化したセファデックスＧ−１０カ
ラム（２５ｍｍＩＤ×６００ｍｍＬ）に通液し、平衡化
に用いた緩衝液を３ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端に
メチオニンの付加していないＢＴＣ５０画分をプールし
た。プールしたＢＴＣ５０画分をｐＨ６．０に調整後、
１００ｍＭリン酸緩衝液＋２００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ
５．０）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ（２１．５ｍｍＩＤ
×１５０ｍｍＬ）に吸着した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝
１００ｍＭリン酸緩衝液＋３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ
９．０）の段階勾配で５０分間、６ｍｌ／分の流速で溶
出を行い、ＢＴＣ５０画分をプールした。さらに、ＢＴ
Ｃ５０画分を０．１％ＴＦＡで平衡化したＯＤＰ−５０
（１０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍＬ、昭和電工（株））に吸
着した後、２０−５０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル
／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で５０分間、２ｍｌ／分
の流速で溶出した。ＢＴＣ５０のフラクションをプール
した後、凍結乾燥を行い、ＢＴＣ５０約４．７ｍｇを得
た。

【００５１】実施例１２ （ＢＴＣ５０の特徴決定） ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分
析 実施例１１で得られたＢＴＣ５０を１００ｍＭ ＤＴＴ
を添加したＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＯＶＥＸ
社）に懸濁し、９５℃で１分間加熱した後、PEPTIDE-PA
GE MINI GEL（ＴＥＦＣＯ社）で電気泳動を行った。泳
動後のゲルをクーマシーブリリアントブルー（Coomassi
e brilliant blue）で染色したところ、単一バンドの蛋
白が認められ、精製品はほぼ単一であった（図６）。

【００５２】ｂ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマン システム
６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、ＢＴＣ５０
のｃＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致
した（表１０）。

【表１０】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １モル当たりの ＢＴＣ５０の塩基配列 アミノ酸 残 基 数 から予測される値 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ａｓｘ ２．１ ２ Ｔｈｒ¹⁾ １．０ １ Ｓｅｒ¹⁾ １．８ ２ Ｇｌｘ ５．０ ５ Ｐｒｏ １．９ ２ Ｇｌｙ ４．１ ４ Ａｌａ １．９ ２ Ｃｙｓ²⁾ ６ Ｖａｌ ３．８ ４ Ｍｅｔ ０ ０ Ｉｌｅ ２．０ ２ Ｌｅｕ ０．９ １ Ｔｙｒ ３．８ ４ Ｐｈｅ ３．１ ３ Ｈｉｓ ２．１ ２ Ｌｙｓ ４．０ ４ Ａｒｇ ６．０ ６ Ｔｒｐ²⁾ ０ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 酸加水分解（６Ｎ ＨＣｌ−４％チオグリコール酸、１
１０℃，２４・４８ｈｒ加水分解の平均値） １）０時間に外挿した値 ２）未検出

【００５３】ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステム モデル４７７Ａ）を用いて決
定した。その結果、得られたＢＴＣ５０のｃＤＮＡの塩
基配列から推定したＢＴＣ５０のＮ末端アミノ酸配列と
一致した（表１１）。

【表１１】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 検出された ＢＴＣ５０の塩基配列から 残基 Ｎｏ． ＰＴＨ¹⁾−アミノ酸 予測されるアミノ酸 (pmol) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １ Ａｒｇ (１４０) Ａｒｇ ２ Ｌｙｓ (１１４４) Ｌｙｓ ３ Ｇｌｙ (１２４２) Ｇｌｙ ４ Ｈｉｓ (２９２) Ｈｉｓ ５ Ｐｈｅ (９９２) Ｐｈｅ ６ Ｓｅｒ (４２５) Ｓｅｒ ７ Ａｒｇ (４０７) Ａｒｇ ８ Ｎ.Ｄ. Ｃｙｓ ９ Ｐｒｏ (５５９) Ｐｒｏ １０ Ｌｙｓ (５９７) Ｌｙｓ １１ Ｇｌｎ (５０５) Ｇｌｎ １２ Ｔｙｒ (４２８) Ｔｙｒ １３ Ｌｙｓ (５３９) Ｌｙｓ １４ Ｈｉｓ (１１５) Ｈｉｓ １５ Ｔｙｒ (４０８) Ｔｙｒ １６ Ｎ.Ｄ. Ｃｙｓ １７ Ｉｌｅ (３８６) Ｉｌｅ １８ Ｌｙｓ (３６８) Ｌｙｓ １９ Ｇｌｙ (３４１) Ｇｌｙ ２０ Ａｒｇ (１８３) Ａｒｇ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １．５ｎｍｏｌを用いて分析を行った。 １）フェニールチオヒダントイン

【００５４】ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマン システ
ム６３００Ｅ）を用いて決定した。得られたＢＴＣ５０
はｃＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一
致した（表１２）。

【表１２】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｃ末端アミノ酸 回収率 ＢＴＣ５０ （％） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｔｙｒ ８６．８ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００５５】ｅ）ＢＴＣ５０の生物活性 精製品はモレキュラー・セル・バイオロジー、８、５８
８（１９８８）に記載の方法により、ＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ
３ Ａ３１−７１４ クローン４（インターナショナル
・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２、４６３、（１
９７３）を用いた活性測定を行い、標準品と同等の活性
を有することを確認した。

【００５６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：８１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys 1 5 10 15 Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg 20 25 30 Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile 35 40 45 Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val 50 55 60 Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe 65 70 75 80 Tyr 81。

【００５７】配列番号：２ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATGGATGGG 10。

【００５８】配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCCCATC CA 12。

【００５９】配列番号：４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATACATATGG ATGGGAATTC CA 22。

【００６０】配列番号：５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGGATCCTA GTAAAACAAG TCAACTCT 28。

【００６１】

【発明の効果】このよにして得られる活性型ＢＴＣ類
は、創傷、潰瘍等の治療、糖尿病、糖尿病性の各種合併
症（例、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症）の
治療に用いることができる。本発明では遺伝子工学を用
いて原核細胞中に発現したＢＴＣ類の不活性体を効率よ
く活性化でき、上記のような作用を有する薬理的に活性
なＢＴＣ類を大量に調製できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｍｅｔ−ＢＴＣのアミノ酸配列を示す。

【図２】精製Ｍｅｔ−ＢＴＣのＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を示す。レーン１は分子量マーカーを、
レーン２は精製Ｍｅｔ−ＢＴＣを示す。

【図３】精製ＢＴＣのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動を示す。レーン１は分子量マーカーを、レーン２
は精製ＢＴＣを示す。

【図４】プラスミドｐＴＢ１９７６の構築図を示す。

【図５】精製Ｍｅｔ−ＢＴＣ５０のＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動を示す。

【図６】精製ＢＴＣ５０のＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 西村 紀 兵庫県川西市大和西１丁目54番地の16

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させ
   たベータセルリン類をレドックスバッファー中でリフォ
   ールディングすることを特徴とする活性型ベータセルリ
   ン類の製造方法。
2. 【請求項２】レドックスバッファーが還元型グルタチオ
   ンおよび酸化型グルタチオンを含有する緩衝液である請
   求項１記載の製造方法。
3. 【請求項３】レドックスバッファーのｐＨが７ないし９
   である請求項１記載の製造方法。
4. 【請求項４】レドックスバッファーがメルカプト基を有
   さないアミノ酸を含有する請求項１記載の製造方法。
5. 【請求項５】メルカプト基を有さないアミノ酸がアルギ
   ニンである請求項４記載の製造方法。
6. 【請求項６】ベータセルリン類を遺伝子工学的に原核細
   胞宿主中で発現させ、細胞を変性剤で可溶化し、ついで
   メルカプト基を有さないアミノ酸を含有するｐＨ７〜９
   のレドックスバッファーで変性剤を不作用濃度まで希釈
   することを特徴とする請求項１記載の製造方法。
7. 【請求項７】変性剤がグアニジンである請求項６記載の
   製造方法。