JPH10194976A - 免疫抑制剤 - Google Patents
免疫抑制剤Info
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- JPH10194976A JPH10194976A JP652497A JP652497A JPH10194976A JP H10194976 A JPH10194976 A JP H10194976A JP 652497 A JP652497 A JP 652497A JP 652497 A JP652497 A JP 652497A JP H10194976 A JPH10194976 A JP H10194976A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 重篤な副作用のない免疫抑制剤の提供。
【解決手段】 加熱処理したβ−１,３−グルコシド結
合からなる直鎖の糖類を有効成分とする免疫抑制剤。
合からなる直鎖の糖類を有効成分とする免疫抑制剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、重篤な副作用のな
い免疫抑制剤に関する。
い免疫抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、
ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御
に重要な役割を果たしており、その主要な機構は、Ｔリ
ンパ球およびＢリンパ球が、これらの微生物や腫瘍を、
抗原受容体を介して認識することにより刺激を受け、抗
原特異的に活性化し、これの異物を排除する能力を高め
ることである。しかし、自己免疫疾患や、臓器移植の拒
否反応などの治療、抑制においては、免疫応答を抑制す
ることが必要であり、そのために免疫抑制剤が使用され
る。現在、免疫抑制剤としては、抗原非特異性のステロ
イド剤や核酸合成系に作用する薬剤が多く使用されてい
るが、これらは、重篤な副作用を生ずることがある。ま
た、シクロスポリン等、臓器移植の拒否反応の抑制に使
用される免疫抑制剤にも、様々な副作用を伴うものがあ
る。
ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御
に重要な役割を果たしており、その主要な機構は、Ｔリ
ンパ球およびＢリンパ球が、これらの微生物や腫瘍を、
抗原受容体を介して認識することにより刺激を受け、抗
原特異的に活性化し、これの異物を排除する能力を高め
ることである。しかし、自己免疫疾患や、臓器移植の拒
否反応などの治療、抑制においては、免疫応答を抑制す
ることが必要であり、そのために免疫抑制剤が使用され
る。現在、免疫抑制剤としては、抗原非特異性のステロ
イド剤や核酸合成系に作用する薬剤が多く使用されてい
るが、これらは、重篤な副作用を生ずることがある。ま
た、シクロスポリン等、臓器移植の拒否反応の抑制に使
用される免疫抑制剤にも、様々な副作用を伴うものがあ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、重篤な副作
用なしに優れた免疫抑制作用を示す免疫抑制剤を提供す
ることを目的とする。
用なしに優れた免疫抑制作用を示す免疫抑制剤を提供す
ることを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、糖類およ
び免疫に関する研究を進める上で、加熱処理した直鎖の
β−１,３グルカンが、リンパ球抑制作用を示すことを
見いだした。かかる加熱処理β−１,３グルカンは、免
疫担当細胞が抗原特異的および抗原非特異的な刺激を受
けたときのＢおよびＴリンパ球の活性化を抑制する作用
を有する。すなわち、該加熱処理β−１,３グルカンを
脾臓細胞の培養系に添加すると、マイトジェン刺激を加
えずに培養したときの生細胞数および細胞代謝活性はそ
れほど損なわず、Ｂリンパ球マイトジェン刺激下で培養
したときのリンパ球の生細胞数、特に、Ｂリンパ球の生
細胞数の増加および細胞代謝活性の上昇を強度に抑制
し、Ｔリンパ球マイトジェン刺激下で培養したときの細
胞代謝活性の上昇を強度に抑制した。この抑制作用は、
リンパ球が活性化されるときにより選択的に働くことか
ら、従来の免疫抑制剤が示した非特異性な作用とは異な
ることを示しており、また、Ｂリンパ球の活性化を強度
に抑制することから、近年提案された免疫抑制剤のＴリ
ンパ球に対する選択的な作用とも異なることを示してい
る。そのため、公知のステロイド剤に認められる様々な
副作用、核酸合成系に作用する薬剤に認められる造血器
などの重篤な副作用、また、シクロスポリン、ＦＫ５０
６に認められる腎障害、肝障害等の副作用はないと考え
られる。また、該加熱処理β−１,３グルカンはＢリン
パ球の活性化を強度に抑制するため、Ｂリンパ球の異常
によって引き起こされる悪性リンパ腫、全身性エリテマ
トーデス、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患またはア
レルギー疾患の治療にきわめて有用である。さらにＴリ
ンパ球の活性化も抑制するため、臓器移植の拒絶反応の
予防にも有用であると考えられる。
び免疫に関する研究を進める上で、加熱処理した直鎖の
β−１,３グルカンが、リンパ球抑制作用を示すことを
見いだした。かかる加熱処理β−１,３グルカンは、免
疫担当細胞が抗原特異的および抗原非特異的な刺激を受
けたときのＢおよびＴリンパ球の活性化を抑制する作用
を有する。すなわち、該加熱処理β−１,３グルカンを
脾臓細胞の培養系に添加すると、マイトジェン刺激を加
えずに培養したときの生細胞数および細胞代謝活性はそ
れほど損なわず、Ｂリンパ球マイトジェン刺激下で培養
したときのリンパ球の生細胞数、特に、Ｂリンパ球の生
細胞数の増加および細胞代謝活性の上昇を強度に抑制
し、Ｔリンパ球マイトジェン刺激下で培養したときの細
胞代謝活性の上昇を強度に抑制した。この抑制作用は、
リンパ球が活性化されるときにより選択的に働くことか
ら、従来の免疫抑制剤が示した非特異性な作用とは異な
ることを示しており、また、Ｂリンパ球の活性化を強度
に抑制することから、近年提案された免疫抑制剤のＴリ
ンパ球に対する選択的な作用とも異なることを示してい
る。そのため、公知のステロイド剤に認められる様々な
副作用、核酸合成系に作用する薬剤に認められる造血器
などの重篤な副作用、また、シクロスポリン、ＦＫ５０
６に認められる腎障害、肝障害等の副作用はないと考え
られる。また、該加熱処理β−１,３グルカンはＢリン
パ球の活性化を強度に抑制するため、Ｂリンパ球の異常
によって引き起こされる悪性リンパ腫、全身性エリテマ
トーデス、慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患またはア
レルギー疾患の治療にきわめて有用である。さらにＴリ
ンパ球の活性化も抑制するため、臓器移植の拒絶反応の
予防にも有用であると考えられる。
【０００５】本発明は、かかる知見に基づいて完成され
たものであって、加熱処理されたβ−１,３−グルコシ
ド結合からなる直鎖の糖類を有効成分とする免疫抑制剤
を提供するものである。用いるβ−１,３−グルコシド
結合からなる直鎖の糖類としては、カードラン加水分解
物が挙げられる。特に、酸加水分解物、とりわけ蟻酸加
水分解物や、β−１,３−グルカナーゼのような酵素に
よる加水分解物で、数平均分子量が３４０から４０００
の範囲にあるものが好ましい。加熱処理としては、水溶
液中で８０℃以上での加熱が好ましい。本発明の免疫賦
活剤は、副作用がなく、常用に適しており、免疫抑制用
の医薬として好適である。
たものであって、加熱処理されたβ−１,３−グルコシ
ド結合からなる直鎖の糖類を有効成分とする免疫抑制剤
を提供するものである。用いるβ−１,３−グルコシド
結合からなる直鎖の糖類としては、カードラン加水分解
物が挙げられる。特に、酸加水分解物、とりわけ蟻酸加
水分解物や、β−１,３−グルカナーゼのような酵素に
よる加水分解物で、数平均分子量が３４０から４０００
の範囲にあるものが好ましい。加熱処理としては、水溶
液中で８０℃以上での加熱が好ましい。本発明の免疫賦
活剤は、副作用がなく、常用に適しており、免疫抑制用
の医薬として好適である。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明において、加熱処理に供さ
れるβ−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類と
しては、グルコース分子が分岐せずに、β−１,３−グ
ルコシド結合により結合したオリゴ糖ないしは多糖であ
り、代表的な例としては、アルカリゲネス（Alkaligene
s）属又はアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細
菌が産生する、β−１,３−グルコシド結合を有する多
糖類であるカードランの加水分解物が挙げられる。以
下、カードランの加水分解物を例として本発明を説明す
る。カードランの加水分解物は、自体公知の多糖類の加
水分解法により調製できるが、得られる加水分解物の免
疫抑制活性から、蟻酸、酢酸のような有機酸、塩酸、硫
酸のような無機酸、特に、蟻酸あるいはβ−１,３−グ
ルカナーゼのような酵素で行うことが好ましく、数平均
分子量が、３４０〜４０００の範囲のものが好ましい。
れるβ−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類と
しては、グルコース分子が分岐せずに、β−１,３−グ
ルコシド結合により結合したオリゴ糖ないしは多糖であ
り、代表的な例としては、アルカリゲネス（Alkaligene
s）属又はアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細
菌が産生する、β−１,３−グルコシド結合を有する多
糖類であるカードランの加水分解物が挙げられる。以
下、カードランの加水分解物を例として本発明を説明す
る。カードランの加水分解物は、自体公知の多糖類の加
水分解法により調製できるが、得られる加水分解物の免
疫抑制活性から、蟻酸、酢酸のような有機酸、塩酸、硫
酸のような無機酸、特に、蟻酸あるいはβ−１,３−グ
ルカナーゼのような酵素で行うことが好ましく、数平均
分子量が、３４０〜４０００の範囲のものが好ましい。
【０００７】本明細書における数平均分子量は、以下の
条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により
測定したものである。測定装置としては、東ソー（株）
製の高速液体クロマトグラフィー装置を使用した。 検出器：ＲＩ−８０２２ ポンプ：ＣＣＰＭ−ＩＩ カラムオーブン：ＣＯ−８０２０ 脱気装置：ＳＤ−８０２２ オートサンプラー：ＡＳ−８０２０ 測定カラムは、ＴＳＫゲルのカラム（Ｇ−ＯＬＩＧＯ−
ＰＷまたはＧ−３０００ＰＷＸＬ、７.８φmm×３０c
m）を用い、流速０.６〜０.７ml／分、温度４０℃で測
定した。試料の０.０２％水溶液を調製し、その２００
μlを用いた。溶出は純水で行った。一方、分子量既知
のプルラン標準品を同様に測定して較正曲線を作成し、
この較正曲線を基に、東ソー（株）のＧＰＣ−ＬＡＬＬ
Ｓプログラムとマイクロソフト（株）の計算プログラム
「エクセル」によって分子量分布関数を求め、数平均分
子量として換算した。
条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により
測定したものである。測定装置としては、東ソー（株）
製の高速液体クロマトグラフィー装置を使用した。 検出器：ＲＩ−８０２２ ポンプ：ＣＣＰＭ−ＩＩ カラムオーブン：ＣＯ−８０２０ 脱気装置：ＳＤ−８０２２ オートサンプラー：ＡＳ−８０２０ 測定カラムは、ＴＳＫゲルのカラム（Ｇ−ＯＬＩＧＯ−
ＰＷまたはＧ−３０００ＰＷＸＬ、７.８φmm×３０c
m）を用い、流速０.６〜０.７ml／分、温度４０℃で測
定した。試料の０.０２％水溶液を調製し、その２００
μlを用いた。溶出は純水で行った。一方、分子量既知
のプルラン標準品を同様に測定して較正曲線を作成し、
この較正曲線を基に、東ソー（株）のＧＰＣ−ＬＡＬＬ
Ｓプログラムとマイクロソフト（株）の計算プログラム
「エクセル」によって分子量分布関数を求め、数平均分
子量として換算した。
【０００８】酸加水分解は、例えば、１〜８５重量％程
度の酸を含有するカードランの０.５〜５.０重量％水溶
液を、７０〜１００℃にて１０分〜３時間加熱すること
により行うことができる。加水分解反応液を水酸化ナト
リウム等のアルカリ剤で中和し、遠心分離して上澄を
得、必要に応じて、活性炭処理、透析、溶媒分画、加熱
によるホルミル基の除去等の自体公知の方法で精製する
ことにより、所望の加水分解物が得られる。酵素による
加水分解は、例えば、用いる酵素に適したpＨ、温度で
所定時間、カードランの０.５〜３重量％水溶液を酵素
処理することにより行うことができる。ついで、酵素を
失活させた後、遠心分離して上澄を得、必要に応じて活
性炭処理、透析、溶媒分画等の自体公知の方法で精製す
ることにより、所望の加水分解物が得られる。
度の酸を含有するカードランの０.５〜５.０重量％水溶
液を、７０〜１００℃にて１０分〜３時間加熱すること
により行うことができる。加水分解反応液を水酸化ナト
リウム等のアルカリ剤で中和し、遠心分離して上澄を
得、必要に応じて、活性炭処理、透析、溶媒分画、加熱
によるホルミル基の除去等の自体公知の方法で精製する
ことにより、所望の加水分解物が得られる。酵素による
加水分解は、例えば、用いる酵素に適したpＨ、温度で
所定時間、カードランの０.５〜３重量％水溶液を酵素
処理することにより行うことができる。ついで、酵素を
失活させた後、遠心分離して上澄を得、必要に応じて活
性炭処理、透析、溶媒分画等の自体公知の方法で精製す
ることにより、所望の加水分解物が得られる。
【０００９】得られた加水分解物は、水溶液の状態で加
熱処理に付される。加熱処理は、一般に、８０℃以上、
好ましくは、９０〜１２０℃にて、通常、１０〜３０分
間加熱することにより行う。加熱手段は、特に限定する
ものではなく、加熱後、直ちに室温まで冷却する。
熱処理に付される。加熱処理は、一般に、８０℃以上、
好ましくは、９０〜１２０℃にて、通常、１０〜３０分
間加熱することにより行う。加熱手段は、特に限定する
ものではなく、加熱後、直ちに室温まで冷却する。
【００１０】加熱処理されたカードラン加水分解物は、
そのまま本発明の免疫抑制剤として使用できる。また、
自体公知の医薬担体または賦形剤と自体公知の方法で合
して、免疫抑制用の医薬とすることができる。用いる、
医薬担体または賦形剤は特に限定するものではなく、当
該免疫抑制剤の具体的用途に応じて当業者が適宜選択で
きる。また、免疫抑制剤の形態も特に限定する物ではな
く、具体的用途に応じて、種々の固体や液体の形態とす
ることができる。本発明の免疫抑制剤は、経口投与、非
経口投与いずれでもよく、その投与量は、カードラン加
水分解物の固形分量として１日当たり４mg〜４０gであ
る。本発明の免疫抑制剤は、ステロイド剤に認められる
様々な副作用、核酸合成系に作用する薬剤に認められる
造血器などの重篤な副作用、また、シクロスポリン、Ｆ
Ｋ５０６に認められる腎障害、肝障害等の副作用はな
く、また、本発明はＢリンパ球の活性化を強度に抑制す
るため、Ｂリンパ球の異常によって引き起こされる悪性
リンパ腫、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ
等の自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療にきわめ
て有用である。さらにＴリンパ球の活性化も抑制するた
め、臓器移植の拒絶反応の予防にも有用である。
そのまま本発明の免疫抑制剤として使用できる。また、
自体公知の医薬担体または賦形剤と自体公知の方法で合
して、免疫抑制用の医薬とすることができる。用いる、
医薬担体または賦形剤は特に限定するものではなく、当
該免疫抑制剤の具体的用途に応じて当業者が適宜選択で
きる。また、免疫抑制剤の形態も特に限定する物ではな
く、具体的用途に応じて、種々の固体や液体の形態とす
ることができる。本発明の免疫抑制剤は、経口投与、非
経口投与いずれでもよく、その投与量は、カードラン加
水分解物の固形分量として１日当たり４mg〜４０gであ
る。本発明の免疫抑制剤は、ステロイド剤に認められる
様々な副作用、核酸合成系に作用する薬剤に認められる
造血器などの重篤な副作用、また、シクロスポリン、Ｆ
Ｋ５０６に認められる腎障害、肝障害等の副作用はな
く、また、本発明はＢリンパ球の活性化を強度に抑制す
るため、Ｂリンパ球の異常によって引き起こされる悪性
リンパ腫、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ
等の自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療にきわめ
て有用である。さらにＴリンパ球の活性化も抑制するた
め、臓器移植の拒絶反応の予防にも有用である。
【００１１】
【実施例】つぎに、実施例および試験例を挙げて、本発
明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限
定されるものではない。 実施例１ 酵素によるカードラン加水分解物の調製 カードラン４gを０.０５Ｍ酢酸緩衝液２００mlに分散
し、ヒイロタケ酵素１８ユニット／mlを添加した。これ
を４０℃に昇温し、４時間インキュベートした後沸騰水
浴中に１５分間保持して酵素を失活させた。ついで、冷
却、遠心分離して沈澱部分を除去し、上澄を直径５cmの
高さ３０cmのカラムに詰めた活性炭に吸着させ、１００
０mlの水で洗浄後、さらに４％エタノール２０００mlで
洗浄した。ついで、２０％エタノール２０００mlで吸着
成分を溶出し、これをエバポレーターで濃縮した後、凍
結乾燥した。このものはＨＰＬＣで測定したときの数平
均分子量が３４０（プルラン換算値）であった。このも
のを、水溶液中で、１００℃にて、１０分間加熱し、つ
いで冷却して免疫抑制剤を得た。
明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限
定されるものではない。 実施例１ 酵素によるカードラン加水分解物の調製 カードラン４gを０.０５Ｍ酢酸緩衝液２００mlに分散
し、ヒイロタケ酵素１８ユニット／mlを添加した。これ
を４０℃に昇温し、４時間インキュベートした後沸騰水
浴中に１５分間保持して酵素を失活させた。ついで、冷
却、遠心分離して沈澱部分を除去し、上澄を直径５cmの
高さ３０cmのカラムに詰めた活性炭に吸着させ、１００
０mlの水で洗浄後、さらに４％エタノール２０００mlで
洗浄した。ついで、２０％エタノール２０００mlで吸着
成分を溶出し、これをエバポレーターで濃縮した後、凍
結乾燥した。このものはＨＰＬＣで測定したときの数平
均分子量が３４０（プルラン換算値）であった。このも
のを、水溶液中で、１００℃にて、１０分間加熱し、つ
いで冷却して免疫抑制剤を得た。
【００１２】実施例２ 蟻酸によるカードラン加水分解物の調製 カードラン３０グラムを８５％蟻酸３０００ml中に分散
し、９０℃まで加温して２０分間保持した。ついで、容
器ごと冷水にさらして室温まで冷却し、エバポレーター
で濃縮した後、５Ｎ ＮaＯＨで中和してpＨ７とし、遠
心分離した。上澄はホルミル基を除去するため沸騰水浴
中で１２０分間加熱したが、このとき、pＨが低下した
ので、２Ｎ ＮaＯＨを添加して７に戻した。このものを
ビスキングチューブ中にいれ純水１０リットルに対して
一夜透析し、透析内液を凍結乾燥した。このものをＨＰ
ＬＣで測定したときの数平均分子量はプルラン換算で約
２８００であった。このものを、水溶液中で１００℃に
て１０分間加熱し、ついで冷却して免疫抑制剤を得た。
し、９０℃まで加温して２０分間保持した。ついで、容
器ごと冷水にさらして室温まで冷却し、エバポレーター
で濃縮した後、５Ｎ ＮaＯＨで中和してpＨ７とし、遠
心分離した。上澄はホルミル基を除去するため沸騰水浴
中で１２０分間加熱したが、このとき、pＨが低下した
ので、２Ｎ ＮaＯＨを添加して７に戻した。このものを
ビスキングチューブ中にいれ純水１０リットルに対して
一夜透析し、透析内液を凍結乾燥した。このものをＨＰ
ＬＣで測定したときの数平均分子量はプルラン換算で約
２８００であった。このものを、水溶液中で１００℃に
て１０分間加熱し、ついで冷却して免疫抑制剤を得た。
【００１３】試験例１ 実施例１で得た酵素分解カードランおよび実施例２で得
た蟻酸分解カードランを用いて、マウス脾臓リンパ球増
殖反応に対する酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸
分解カードラン熱処理品の作用を調べることにより、酵
素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱
処理品のリンパ球代謝活性上昇およびリンパ球増殖の抑
制効果を検証した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、１４
週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培
地中で脾臓を押しつぶし、２００メッシュの篩に通し脾
臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血
球計測装置により測定した後、細胞数を５×１０6／ml
の濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培
養プレートに１穴あたり１００マイクロリットルを播種
した。Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッカライド
を２００マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０
培地に溶解した液、Ｔリンパ球増殖刺激物質のコンカナ
バリンＡを８マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６
４０培地に溶解した液、あるいはＲＰＭＩ１６４０培地
を、それぞれ１穴当たり５０マイクロリットル播種した
脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｂリンパ球刺激群、Ｔリンパ
球刺激群、無刺激群とした。これらの３群にリン酸緩衝
生理食塩水を１００℃、１０分間加熱して冷却した液
（対照）あるいは酵素分解カードランを８mg／mlの濃度
でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し１００℃、１０分間加
熱して冷却した液、蟻酸分解カードランを８mg／mlの濃
度でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し１００℃、１０分間
加熱して冷却した液をそれぞれ１穴当たり５０マイクロ
リットル加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間
培養し、培養後の生細胞数と細胞代謝活性を調べた。
た蟻酸分解カードランを用いて、マウス脾臓リンパ球増
殖反応に対する酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸
分解カードラン熱処理品の作用を調べることにより、酵
素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱
処理品のリンパ球代謝活性上昇およびリンパ球増殖の抑
制効果を検証した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、１４
週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培
地中で脾臓を押しつぶし、２００メッシュの篩に通し脾
臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血
球計測装置により測定した後、細胞数を５×１０6／ml
の濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培
養プレートに１穴あたり１００マイクロリットルを播種
した。Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッカライド
を２００マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０
培地に溶解した液、Ｔリンパ球増殖刺激物質のコンカナ
バリンＡを８マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６
４０培地に溶解した液、あるいはＲＰＭＩ１６４０培地
を、それぞれ１穴当たり５０マイクロリットル播種した
脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｂリンパ球刺激群、Ｔリンパ
球刺激群、無刺激群とした。これらの３群にリン酸緩衝
生理食塩水を１００℃、１０分間加熱して冷却した液
（対照）あるいは酵素分解カードランを８mg／mlの濃度
でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し１００℃、１０分間加
熱して冷却した液、蟻酸分解カードランを８mg／mlの濃
度でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し１００℃、１０分間
加熱して冷却した液をそれぞれ１穴当たり５０マイクロ
リットル加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間
培養し、培養後の生細胞数と細胞代謝活性を調べた。
【００１４】生細胞数の測定は、培養細胞液の細胞数を
自動血球計測装置で測定した後に、培養細胞液２００マ
イクロリットルにＲ−フィコエリトリンで標識したマウ
スＢリンパ球に対する特異抗体の抗マウスＣＤ４５Ｒ抗
体を１マイクログラム、フルオロセインイソチオシアネ
ートで標識したマウスＴリンパ球に対する特異抗体の抗
マウスＴ細胞レセプター（アルファ／ベータ）抗体を１
マイクログラム、および死細胞を特異的に染色する７−
アミノアクチノマイシンＤを１マイクログラム加え、５
℃で３０分間放置した後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄
し、フローサイトメーターで総細胞に占めるＢリンパ球
およびＴリンパ球の割合ならびにＢリンパ球およびＴリ
ンパ球に占める死細胞の割合を測定し、Ｂリンパ球およ
びＴリンパ球の生細胞数を算出した。細胞代謝活性は、
培養の終わる３時間前に臭化３−（４,５−ジメチル−
２−チアゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾ
リウムを５mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解
した液を１穴当たり１０マイクロリットル加え、培養終
了時に２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり
５０マイクロリットル加え、３７℃で１日放置後、マイ
クロプレートリーダーで培養液の吸光度５５０nmを測定
することにより細胞代謝活性を求めた。表１にその結果
を示す。
自動血球計測装置で測定した後に、培養細胞液２００マ
イクロリットルにＲ−フィコエリトリンで標識したマウ
スＢリンパ球に対する特異抗体の抗マウスＣＤ４５Ｒ抗
体を１マイクログラム、フルオロセインイソチオシアネ
ートで標識したマウスＴリンパ球に対する特異抗体の抗
マウスＴ細胞レセプター（アルファ／ベータ）抗体を１
マイクログラム、および死細胞を特異的に染色する７−
アミノアクチノマイシンＤを１マイクログラム加え、５
℃で３０分間放置した後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄
し、フローサイトメーターで総細胞に占めるＢリンパ球
およびＴリンパ球の割合ならびにＢリンパ球およびＴリ
ンパ球に占める死細胞の割合を測定し、Ｂリンパ球およ
びＴリンパ球の生細胞数を算出した。細胞代謝活性は、
培養の終わる３時間前に臭化３−（４,５−ジメチル−
２−チアゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾ
リウムを５mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解
した液を１穴当たり１０マイクロリットル加え、培養終
了時に２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり
５０マイクロリットル加え、３７℃で１日放置後、マイ
クロプレートリーダーで培養液の吸光度５５０nmを測定
することにより細胞代謝活性を求めた。表１にその結果
を示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】表１に示すごとく、無刺激群においては、
酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン
熱処理品はいずれもＢリンパ球の生細胞数を軽度にしか
減少させず細胞代謝活性にはほとんど影響を及ぼさなか
ったが、Ｂリンパ球刺激群においては、酵素分解カード
ラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品はいず
れもＢリンパ球の生細胞数を大幅に減少させ細胞代謝活
性の上昇を完全に抑制した。Ｔリンパ球刺激群において
は、酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カード
ラン熱処理品はいずれも細胞代謝活性の上昇を強度に抑
制した。この様に、酵素分解カードラン熱処理品および
蟻酸分解カードラン熱処理品のいずれにも、リンパ球が
活性化されるときにより選択的に働き、強度な抑制作用
が認められた。
酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カードラン
熱処理品はいずれもＢリンパ球の生細胞数を軽度にしか
減少させず細胞代謝活性にはほとんど影響を及ぼさなか
ったが、Ｂリンパ球刺激群においては、酵素分解カード
ラン熱処理品および蟻酸分解カードラン熱処理品はいず
れもＢリンパ球の生細胞数を大幅に減少させ細胞代謝活
性の上昇を完全に抑制した。Ｔリンパ球刺激群において
は、酵素分解カードラン熱処理品および蟻酸分解カード
ラン熱処理品はいずれも細胞代謝活性の上昇を強度に抑
制した。この様に、酵素分解カードラン熱処理品および
蟻酸分解カードラン熱処理品のいずれにも、リンパ球が
活性化されるときにより選択的に働き、強度な抑制作用
が認められた。
【００１７】試験例２ ラミナリビオース、ラミナリトリオース、ラミナリテト
ラオース、ラミナリペンタオースおよびラミナリヘキサ
オース（焼津水産化学）の各試薬を用いて、マウス脾臓
リンパ球増殖反応に対する加熱処理ラミナリビオース、
加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラ
オース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミ
ナリヘキサオースの作用を調べることにより、加熱処理
ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱
処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオ
ース、加熱処理ラミナリヘキサオースのリンパ球代謝活
性上昇抑制効果を検証した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、
雌、１８週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１
６４０培地中で脾臓を押しつぶし、２００メッシュの篩
に通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数
を自動血球計測装置により測定した後、細胞数を５×１
０6／mlの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６
穴組織培養プレートに１穴あたり１００マイクロリット
ルを播種した。Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッ
カライドを２００マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ
１６４０培地に溶解した液、Ｔリンパ球増殖刺激物質の
コンカナバリンＡを８マイクログラム／mlの濃度でＲＰ
ＭＩ１６４０培地に溶解した液、あるいはＲＰＭＩ１６
４０培地を、それぞれ１穴当たり５０マイクロリットル
播種した脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｂリンパ球刺激群、
Ｔリンパ球刺激群、無刺激群とした。これらの３群にリ
ン酸緩衝生理食塩水を１２１℃、２０分間加熱して冷却
した液（対照）あるいはラミナリビオース、ラミナリト
リオース、ラミナリテトラオース、ラミナリペンタオー
ス、ラミナリヘキサオースを８mg／mlの濃度あるいは１
mg／mlの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し１２１
℃、２０分間加熱して冷却した液、をそれぞれ１穴当た
り５０マイクロリットル加え、３７℃の５％炭酸ガス培
養器内で１日間培養し、培養後の細胞代謝活性を調べ
た。
ラオース、ラミナリペンタオースおよびラミナリヘキサ
オース（焼津水産化学）の各試薬を用いて、マウス脾臓
リンパ球増殖反応に対する加熱処理ラミナリビオース、
加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテトラ
オース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理ラミ
ナリヘキサオースの作用を調べることにより、加熱処理
ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱
処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオ
ース、加熱処理ラミナリヘキサオースのリンパ球代謝活
性上昇抑制効果を検証した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、
雌、１８週齢）から無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１
６４０培地中で脾臓を押しつぶし、２００メッシュの篩
に通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数
を自動血球計測装置により測定した後、細胞数を５×１
０6／mlの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６
穴組織培養プレートに１穴あたり１００マイクロリット
ルを播種した。Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッ
カライドを２００マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ
１６４０培地に溶解した液、Ｔリンパ球増殖刺激物質の
コンカナバリンＡを８マイクログラム／mlの濃度でＲＰ
ＭＩ１６４０培地に溶解した液、あるいはＲＰＭＩ１６
４０培地を、それぞれ１穴当たり５０マイクロリットル
播種した脾臓細胞浮遊液に加えて、Ｂリンパ球刺激群、
Ｔリンパ球刺激群、無刺激群とした。これらの３群にリ
ン酸緩衝生理食塩水を１２１℃、２０分間加熱して冷却
した液（対照）あるいはラミナリビオース、ラミナリト
リオース、ラミナリテトラオース、ラミナリペンタオー
ス、ラミナリヘキサオースを８mg／mlの濃度あるいは１
mg／mlの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し１２１
℃、２０分間加熱して冷却した液、をそれぞれ１穴当た
り５０マイクロリットル加え、３７℃の５％炭酸ガス培
養器内で１日間培養し、培養後の細胞代謝活性を調べ
た。
【００１８】細胞代謝活性は、培養の終わる３時間前に
臭化３−（４,５−ジメチル−２−チアゾリル）−２,５
−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムを５mg／mlの濃度で
ＲＰＭ１１６４０培地に溶解した液を１穴当たり１０マ
イクロリットル加え、培養終了時に２０％ドデシル硫酸
ナトリウム溶液を１穴当たり５０マイクロリットル加
え、３７℃で２日放置後、マイクロプレートリーダーで
培養液の吸光度５５０nmを測定することにより細胞代謝
活性を求めた。表２にその結果を示す。
臭化３−（４,５−ジメチル−２−チアゾリル）−２,５
−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムを５mg／mlの濃度で
ＲＰＭ１１６４０培地に溶解した液を１穴当たり１０マ
イクロリットル加え、培養終了時に２０％ドデシル硫酸
ナトリウム溶液を１穴当たり５０マイクロリットル加
え、３７℃で２日放置後、マイクロプレートリーダーで
培養液の吸光度５５０nmを測定することにより細胞代謝
活性を求めた。表２にその結果を示す。
【００１９】
【表２】
【００２０】表２に示すごとく、無刺激群においては、
加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオー
ス、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリ
ペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースはいずれ
も細胞代謝活性にはほとんど影響を及ぼさなかったが、
Ｂリンパ球刺激群においては、加熱処理ラミナリビオー
ス、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテ
トラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理
ラミナリヘキサオースはいずれも２mg／mlおよび０．４
mg／mlの濃度において細胞代謝活性の上昇を完全に抑制
した。Ｔリンパ球刺激群においては、加熱処理ラミナリ
ビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミ
ナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加
熱処理ラミナリヘキサオースはいずれも２mg／mlの濃度
において細胞代謝活性の上昇を完全に抑制したが、０．
４mg／mlの濃度においては、加熱処理ラミナリビオー
ス、加熱処理ラミナリトリオースのみが細胞代謝活性の
上昇を部分抑制した。この様に、加熱処理ラミナリビオ
ース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリ
テトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処
理ラミナリヘキサオースはいずれも、リンパ球が活性化
されるときにより選択的に働き、強度な抑制作用を示
し、特に、Ｂリンパ球に対する作用が強く、また、リン
パ球抑制活性は加熱処理ラミナリビオースおよび加熱処
理ラミナリトリオースが強かった。
加熱処理ラミナリビオース、加熱処理ラミナリトリオー
ス、加熱処理ラミナリテトラオース、加熱処理ラミナリ
ペンタオース、加熱処理ラミナリヘキサオースはいずれ
も細胞代謝活性にはほとんど影響を及ぼさなかったが、
Ｂリンパ球刺激群においては、加熱処理ラミナリビオー
ス、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリテ
トラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処理
ラミナリヘキサオースはいずれも２mg／mlおよび０．４
mg／mlの濃度において細胞代謝活性の上昇を完全に抑制
した。Ｔリンパ球刺激群においては、加熱処理ラミナリ
ビオース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミ
ナリテトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加
熱処理ラミナリヘキサオースはいずれも２mg／mlの濃度
において細胞代謝活性の上昇を完全に抑制したが、０．
４mg／mlの濃度においては、加熱処理ラミナリビオー
ス、加熱処理ラミナリトリオースのみが細胞代謝活性の
上昇を部分抑制した。この様に、加熱処理ラミナリビオ
ース、加熱処理ラミナリトリオース、加熱処理ラミナリ
テトラオース、加熱処理ラミナリペンタオース、加熱処
理ラミナリヘキサオースはいずれも、リンパ球が活性化
されるときにより選択的に働き、強度な抑制作用を示
し、特に、Ｂリンパ球に対する作用が強く、また、リン
パ球抑制活性は加熱処理ラミナリビオースおよび加熱処
理ラミナリトリオースが強かった。
【００２１】
【発明の効果】本発明によれば、重篤な副作用のない、
優れた免疫抑制剤が提供される。
優れた免疫抑制剤が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 日下 博昭 兵庫県宝塚市安倉南３丁目３番１−202号
Claims (8)
- 【請求項１】 加熱処理されたβ−１,３−グルコシド
結合からなる直鎖の糖類を有効成分とする免疫抑制剤。 - 【請求項２】 β−１,３−グルコシド結合からなる直
鎖の糖類がカードラン加水分解物である請求項１記載の
免疫抑制剤。 - 【請求項３】 加水分解物が酸加水分解物である請求項
２記載の免疫抑制剤。 - 【請求項４】 酸加水分解に使用する酸が蟻酸である請
求項３記載の免疫抑制剤。 - 【請求項５】 加水分解物がβ−１,３−グルカナーゼ
による加水分解物である請求項２記載の免疫抑制剤。 - 【請求項６】 β−１,３−グルコシド結合からなる直
鎖の糖類の数平均分子量が３４０から４０００の範囲に
ある請求項１〜５いずれか１項記載の免疫抑制剤。 - 【請求項７】 加熱処理が水溶液中で８０℃以上の温度
である請求項１〜６いずれか１項記載の免疫抑制剤。 - 【請求項８】 免疫抑制作用がリンパ球抑制作用である
請求項１〜７いずれか１項記載の免疫抑制。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00652497A JP4091137B2 (ja) | 1997-01-17 | 1997-01-17 | 免疫抑制剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00652497A JP4091137B2 (ja) | 1997-01-17 | 1997-01-17 | 免疫抑制剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10194976A true JPH10194976A (ja) | 1998-07-28 |
| JP4091137B2 JP4091137B2 (ja) | 2008-05-28 |
Family
ID=11640767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00652497A Expired - Lifetime JP4091137B2 (ja) | 1997-01-17 | 1997-01-17 | 免疫抑制剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4091137B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002098433A1 (en) * | 2001-06-01 | 2002-12-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Drugs for intestinal diseases |
| JP2009148206A (ja) * | 2007-12-20 | 2009-07-09 | Kirin Food-Tech Co Ltd | 樹状細胞活性化用組成物 |
| WO2009068996A3 (en) * | 2007-11-26 | 2009-12-23 | Novartis Ag | Conjugated beta-1,3-linked glucans |
| JP2021028322A (ja) * | 2019-08-09 | 2021-02-25 | 国立大学法人東京農工大学 | 生活習慣病予防または改善用組成物 |
| JP2022537533A (ja) * | 2019-06-14 | 2022-08-26 | 正大制▲薬▼（青▲島▼）有限公司 | β－グルカン組成物およびその用途 |
-
1997
- 1997-01-17 JP JP00652497A patent/JP4091137B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002098433A1 (en) * | 2001-06-01 | 2002-12-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Drugs for intestinal diseases |
| WO2009068996A3 (en) * | 2007-11-26 | 2009-12-23 | Novartis Ag | Conjugated beta-1,3-linked glucans |
| US9439954B2 (en) | 2007-11-26 | 2016-09-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Conjugated beta-1,3-linked glucans |
| US9439955B2 (en) | 2007-11-26 | 2016-09-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Conjugated β-1,3-linked glucans |
| JP2009148206A (ja) * | 2007-12-20 | 2009-07-09 | Kirin Food-Tech Co Ltd | 樹状細胞活性化用組成物 |
| JP2022537533A (ja) * | 2019-06-14 | 2022-08-26 | 正大制▲薬▼（青▲島▼）有限公司 | β－グルカン組成物およびその用途 |
| US12533373B2 (en) | 2019-06-14 | 2026-01-27 | Qingdao Conson Pharmaceutical Co., Ltd. | β-glucan composition and use therefor |
| JP2021028322A (ja) * | 2019-08-09 | 2021-02-25 | 国立大学法人東京農工大学 | 生活習慣病予防または改善用組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4091137B2 (ja) | 2008-05-28 |
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