JPH10197481A

JPH10197481A - 蛍光検出等電点電気泳動用マーカー

Info

Publication number: JPH10197481A
Application number: JP9267974A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Matsumoto; 浩幸松本; Takako Tsukata; 貴子津賀田; Yasuhiro Mizusawa; 康弘水澤; Hisanobu Takamoto; 尚宜高本; Kiyohito Shimura; 清仁志村; Yuki O; 志王; Kenichi Kasai; 献一笠井
Original assignee: Bunshi Biophotonics Kenkyusho KK
Current assignee: Bunshi Biophotonics Kenkyusho KK
Priority date: 1996-11-14
Filing date: 1997-09-12
Publication date: 1998-07-31
Anticipated expiration: 2017-09-12
Also published as: JP3246888B2

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、蛍光検出等電点電気泳動法におい
て、試料物質の等電点を確認するため使用される蛍光検
出等電点電気泳動用マーカーを提供するものである。【解決手段】本発明により、オリゴペプチドのシステ
インのＳＨ基に発蛍光団色素を設けることにより、ｐＩ
の大きな蛍光物質標識オリゴペプチドが得られる。この
際、オリゴペプチドと発蛍光団は温和な条件下で結合さ
れ得るため、オリゴペプチドに結合させる蛍光物質の数
と位置が制御され、従って得られる蛍光検出等電点電気
泳動用マーカーは、単一の鋭いｐＩピークを示すもので
あり、さらに保存安定性が良く、蛍光キャピラリー等電
点電気泳動法にも使用可能なものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光検出等電点電
気泳動法において使用する蛍光検出等電点電気泳動用マ
ーカーおよびマーカーキットに関する。

【０００２】

【従来の技術】分子の表面に電荷を有する粒子を電解質
溶液に浮遊させて電流を通ずると、それぞれの荷電と反
対の方向に向かって粒子が移動する現象が、１８９２年
にＰｉｃｔｏｎ，Ｈ．とＬｉｎｄｅｒ，Ｓ．Ｅ．によっ
て観察されて以来、電気泳動の現象は物質の分離分析の
手段として用いられるようになり、１９３７年にＴｉｓ
ｅｌｉｕｓが装置を完成させてからは、今日まで急速に
その応用面が拡大されてきている。

【０００３】一般の電気泳動が、ある特定のｐＨにおけ
る荷電状態の差を利用しているのに対し、１９６６年に
Ｖｅｓｔｅｒｂｅｒｇ，Ｏ．とＳｖｅｎｓｓｏｎ，Ｈ．
が合成両性電解質であるアンフォラインを開発してから
は、それぞれの両性電解質がある値のｐＨにおいて、そ
の実効電荷がゼロとなり、泳動しなくなる現象を利用し
た等電点電気泳動法が確立された。

【０００４】ここで実効電荷がゼロとなるようなｐＨの
値をその物質の等電点という。等電点電気泳動法では、
試料は泳動用担体に形成されたｐＨ勾配において、その
等電点に等しい位置に濃縮されて静止する。

【０００５】このように、試料が焦点的に濃縮されて分
離されるので、非常に高い分離能を持つ電気泳動法とし
て、物質の分離・分析に利用されている。

【０００６】また、近年、電気泳動を内径５〜１００μ
ｍ、長さが３０〜１００ｃｍの溶融シリカでできた毛細
管（キャピラリー）の中で行なうキャピラリー電気泳動
法が考案され、微量な分析試料で高い分離能を有するこ
とから、タンパク質のみならず、無機イオンや低分子化
合物、核酸の分離・分析にも応用されてきた。

【０００７】また、キャピラリーの一端に検出器を装着
し、分離されてきた試料成分を検出することにより、濃
度を定量化する試みもなされている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】検出方法としては従来
は、主に紫外光あるいは可視光を照射することで、試料
成分にそれらの光が吸収されることによる光量の変化か
ら検出する方法（紫外可視検出法）が一般的である。

【０００９】さらに高感度な検出方法として、あらかじ
め分析試料を蛍光物質で標識し、分離されてきた試料成
分に光を照射し、発せられる蛍光を検出することにより
濃度を定量化する検出方法（蛍光検出法）が考えられ
る。

【００１０】このために分析試料を蛍光物質で標識する
にあたっては、分析試料がタンパク質の場合、タンパク
質のアミノ基と蛍光物質とを化学的に結合させる手法が
一般的であり、例えば、アミノ基に結合させる蛍光物質
として、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩ
ＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート
（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅｉｓｏ
ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＴＲＩＴＣ）等が知られて
いる（大野素徳、金岡祐一、崎山文夫、前田浩、蛋白質
の化学修飾（下）、学会出版センター、１９８１）。

【００１１】一方、上記のキャピラリー等電点電気泳動
法においてもこの蛍光検出法により分離された試料成分
を十分定量化可能となり、その高い分離能と検出感度に
より、タンパク質の超高感度分析技術としての可能性が
高い。

【００１２】しかしながら、等電点電気泳動において
は、分離された試料の泳動用担体中での静止位置から等
電点（ｐＩ）が推定されるものであるから、泳動用担体
に形成されたｐＨ勾配を明確にしておくことが必要であ
り、このための標準マーカーが必要となる。

【００１３】この目的のため、例えば従来からｐＩが明
らかとなっているタンパク質（例えば、トリプシノーゲ
ン（ｐＩ＝９．３０）、レンチルレクチン（ｐＩ＝７．
８０、８．００、８．２０）、ヒト・ヘモグロビンＣ
（ｐＩ＝７．５０）、ヒト・ヘモグロビンＡ（ｐＩ＝
７．１０）、ウマ・ミオグロビン（ｐＩ＝７．００）、
ヒト・カーボニックアンヒドラーゼ（ｐＩ＝６．５
０）、ウシ・カーボニックアンヒドラーゼ（ｐＩ＝６．
００）、β−ラクトグロブリンＢ（ｐＩ＝５．１０）、
フィコシアニン（ｐＩ＝４．６５）、アミログルコシダ
ーゼ（ｐＩ＝３．５０）等をそのまま上記マーカーとし
て用いることは、これらのタンパク質自身から発せられ
る蛍光が非常に微弱なため極めて困難である。

【００１４】そこで、ひとつの方法として、上記のｐＩ
が明らかになっているタンパク質を適当な蛍光物質で標
識する方法が必要と考えられる。

【００１５】しかしながら、タンパク質の中のＮー末端
のアミノ基及びリシン側鎖のアミノ基の数とその解離状
態は、タンパク質のｐＩを決める大きな要因となるので
（続生化学実験講座２、タンパク質の化学（上）、日本
生化学会、１９８７）、タンパク質のアミノ基を蛍光物
質で化学結合修飾する一般的な標識方法を用いると、タ
ンパク質自身の等電点は大きく変化する。

【００１６】さらに、タンパク質には蛍光標識物質と反
応可能なアミノ酸が多く存在するため、結合する蛍光標
識物質の数と位置が不特定となり、結果として、一つの
タンパク質であるが、複数のｐＩを示す混合物となって
しまうため（Ｆｌａｔｍａｒｋ，Ｔ．，Ｖｅｓｔｅ
ｒｂｅｒｇ，Ｏ．，ＡｃｔａＣｈｅｍ．Ｓｃａｎ
ｄ．，２０，１４９７−１５０３，１９６６）、
泳動用担体中に形成されたｐＨ勾配を正確に明らかにす
ることが困難となるという問題がある。

【００１７】さらに、蛍光物質標識によりタンパク質の
３次構造が変化し（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，
Ｋｒｅｔｈ，Ｈ．Ｗ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，２０９，２１１−２２４，１９７３）、タンパ
ク質自身の化学的安定性が悪くなる。このことは、マー
カーとしての保存安定性の点で問題となる。

【００１８】従って、蛍光検出等電点電気泳動におい
て、従来よりあるあらかじめｐＩが明らかなタンパク質
に蛍光物質で標識したものをマーカーとして用いること
はできない。

【００１９】本発明者等は、上記問題点を解決するため
鋭意研究し、発蛍光団色素を有したシステインを含むオ
リゴペプチドが、単一特有のｐＩを示し、しかも大きな
ｐＩ値（３＜ｐＩ＜１０）の範囲をカバーし、さらに保
存安定性にも優れていることを見いだし、本発明を完成
するにいたった。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明は、蛍光検出等電
点電気泳動において、泳動用担体中に形成されたｐＨ勾
配を正確に明らかにするため、適当なオリゴペプチドを
選択し、さらに適当な蛍光物質で標識することにより、
均一なｐＩを示し、しかも保存安定性が高いことを特徴
とする蛍光検出等電点電気泳動用マーカーに係るもので
ある。

【００２１】すなわち、本発明は、蛍光検出等電点電気
泳動法において用いる蛍光検出等電点電気泳動用マーカ
ーであって、発蛍光団色素を結合したシステインを含む
オリゴペプチドであることを特徴とする蛍光検出等電点
電気泳動用マーカーに係るものである。より詳しくは、
本発明は、蛍光検出等電点電気泳動法において用いる蛍
光検出等電点電気泳動用マーカーであって、ＳＨ基に発
蛍光団色素を結合したシステインを少なくとも１つ含む
オリゴペプチドであることを特徴とする蛍光検出等電点
電気泳動用マーカーを提供するものである。

【００２２】また、本発明は、前記結合が、少なくと
も、チオエステル、ジチオエステル、チオエーテル結合
からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする蛍
光検出等電点電気泳動用マーカーを提供するものであ
る。

【００２３】さらに、本発明は、前記オリゴペプチド
が、少なくとも、プロトンを放出して負電荷を持つ基を
有するアミノ酸であって、プロトンを放出して負電荷を
持つ基の酸解離定数をＫ_jとするｎ_j個のアミノ酸および
／または、プロトンを受け取って正電荷を持つ基を有す
るアミノ酸であって、プロトンを受け取って正電荷を持
つ基の酸解離定数をＫ_iとするｎ_i個のアミノ酸とを含
み、Ｚ＝Σ_i（ｎ_i／（１＋Ｋ_i／［Ｈ⁺］））−Σ_j（ｎ_j
／（１＋［Ｈ⁺］／Ｋ_j））とした際に、｜Ｚ｜＜０．０
１をみたす際の−ｌｏｇ（［Ｈ⁺］）をｐＩとした場
合、３＜ｐＩ＜１０であることを特徴とする蛍光検出等
電点電気泳動用マーカーを提供することである。

【００２４】また、本発明は、前記オリゴペプチドが、
Gly-Cys-Tyr-Lys-Arg、Gly-Cys-Tyr-Lys-Lys、Gly-Cys-
Tyr-Tyr-Lys-Lys、 Gly-Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys、Gly
-Cys-Tyr-Lys、 Gly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys、Gly-Cy
s-Glu-His-His-His-Arg、Gly-Cys-Glu-His-Arg、Gly-Cy
s-Glu-His-His、Gly-Cys-Glu-Arg、Gly-Cys-Glu-His、G
ly-Cys-Asp-Asp-His-His、Gly-Cys-Glu-Glu-His、 Gly-
Cys-Asp-Asp-Arg、Gly-Cys-Glu-Glu、Gly-Cys-Asp-Asp-
Aspのいずれか、またはいくつかの組合せであることを
特徴とする蛍光検出等電点電気泳動用マーカーを提供す
るものである。

【００２５】さらに、本発明は、前記発蛍光団色素が、
ローダミン、フルオレセイン、シアニン、インドシア
ニン、インドカルボシアニン、ピロニン、ルシファーイ
エロー、キナクリン、スクエア酸、クマリン、フルオロ
アンセニルマレイミド、アントラセンからなる群より選
ばれる発蛍光団色素であることを特徴とする蛍光検出等
電点電気泳動用マーカーを提供することである。

【００２６】また、本発明は、前記蛍光検出等電点電気
泳動法が、蛍光検出キャピラリー等電点電気泳動法であ
ることを特徴とする蛍光検出等電点電気泳動用マーカー
を提供するものである。

【００２７】さらに、本発明は、システインのＳＨ基に
発蛍光団色素を結合した、 Gly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-L
ys、 Gly-Cys-Glu-His-His-His-Arg、 Gly-Cys-Glu-His
-Arg、Gly-Cys-Glu-His-His、 Gly-Cys-Glu-Arg、 Gly-
Cys-Glu-His、 Gly-Cys-Asp-Asp-His-His、Gly-Cys-Glu
-Glu-His、Gly-Cys-Asp-Asp-Arg、 Gly-Cys-Glu-Gluか
らなる蛍光検出等電点電気泳動用マーカーキットを提供
するものである。

【００２８】また、本発明は、システインのＳＨ基に発
蛍光団色素を結合した、 Gly-Cys-Tyr-Lys-Arg、Gly-Cy
s-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys、Gly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Ly
s、Gly-Cys-Glu-His-His-His-Arg、Gly-Cys-Glu-His-Ar
g、Gly-Cys-Glu-His-His、Gly-Cys-Glu-Arg、Gly-Cys-G
lu-His、Gly-Cys-Asp-Asp-His-His、Gly-Cys-Glu-Glu-H
is、Gly-Cys-Asp-Asp-Arg、Gly-Cys-Glu-Glu からなる
蛍光検出等電点電気泳動用マーカーキットを提供するも
のである。

【００２９】以下、本発明を実施の形態に即して説明す
る。

【００３０】

【発明の実施の形態】

（オリゴペプチド）本発明においては、マーカーとして
使用可能な種々の両性物質から、特にオリゴペプチドを
使用する。等電点電気泳動法において、通常使用される
試料としては、タンパク質等が主成分のものが多く、従
って該試料のｐＩ値を確認するためには、同様な解離基
からなるオリゴペプチドを用いることが好ましいからで
ある。

【００３１】しかしながら、オリゴペプチドがあまり多
くのアミノ酸を含むものである場合においては、発蛍光
団を含む基を結合する際に、複数の反応点の存在や、反
応条件による副生成物の混在などを生じる可能性があ
り、この場合、得られるマーカーが単一の鋭いピークを
与えないこととなり好ましくない。

【００３２】従って、本発明においては、オリゴペプチ
ドを形成するアミノ酸の数には特に制限はなく、目的の
ｐＩを示すに十分なアミノ酸基を有するオリゴペプチド
であればよい。

【００３３】両性化合物としてのアミノ酸からなるオリ
ゴペプチドは、酸塩基解離基として種々の酸性基、およ
び塩基性基、そしてＮ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシ
ル基を有する。例えば酸性基を有するアミノ酸基として
は、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、チロ
シン等であり、また塩基性基を有するアミノ酸基として
はリシン、アルギニン、ヒスチジン等である。

【００３４】これらの酸塩基解離基によりオリゴペプチ
ドはあるｐＨにおいて特定の荷電数を示す。従って、こ
れらの酸塩基解離基の種類と数から、オリゴペプチド全
体としての荷電数が計算することが可能である。

【００３５】例えば、次の式によりオリゴペプチド全体
としての荷電数（Ｚ）を推定することが可能となる。

【００３６】ここで、プロトンを放出して負電荷を持つ
基を有するアミノ酸であって、プロトンを放出して負電
荷を持つ基の酸解離定数をＫ_jとするｎ_j個のアミノ酸
と、プロトンを受け取って正電荷を持つ基を有するアミ
ノ酸であって、プロトンを受け取って正電荷を持つ基の
酸解離定数をＫ_iとするｎ_i個のアミノ酸とを含むオリゴ
ペプチドの全荷電数（Ｚ）は、Ｚ＝Σ_i（ｎ_i／（１＋Ｋ
_i／［Ｈ⁺］））−Σ_j（ｎ_j／（１＋［Ｈ⁺］／Ｋ_j））で
与えられる（化学の領域、３６、４７０ー４８６、１９
８２）。

【００３７】さらに、この式において、Ｚ＝０における
−ｌｏｇ（［Ｈ⁺］）＝ｐＨがそのオリゴペプチドの等
電点ｐＩとなる。

【００３８】従って、この式を利用することにより、目
的となるｐＩを示すオリゴペプチドに必要なアミノ酸基
を選択することが可能となる。また、その等電点への収
束性に関しては、ペプチドの等電点におけるｐＨの変化
に対する電荷の変化量、ｄＺ／ｄｐＨが大きいことが必
要である（Shimura,K., and Kasai,K.,Electrophoresi
s,16,1479-1484,1995）。ｄＺ／ｄｐＨ値が大きくなる
ためには、そのペプチドの等電点の値に近いｐＫａ値を
持つ解離基が存在することが必要となる。

【００３９】この際、蛍光色素のハロアセチル誘導体又
はマレイミド誘導体と極めて選択的かつ高収率に反応
し、標識化合物を生成する。さらに発蛍光団を含む基を
結合する方法として、該オリゴペプチドのシステインの
ＳＨ基に結合する場合においては、Ｎ末端アミノ基によ
る塩基性解離も発揮され、Ｎ末端アミノ基のｐＫａであ
るｐＨ７．６前後にｐＩを有する収束性の良い標識ペプ
チドが得られることとなる。

【００４０】この推定を可能とし、必要なアミノ酸基を
選択するために、上記の酸塩基性の解離基の有するｐＫ
ａとして、例えば、α−カルボキシル（Ｃ末端）（３．
６）、β−カルボキシル（Ａｓｐ）（３．９５）、γ−
カルボキシル（Ｇｌｕ）（４．４５）、イミダゾール
（Ｈｉｓ）（６．４５）、αーアミノ（Ｎ末端）（７．
６）、チオール（Ｃｙｓ）（８．５）、フェノール性ヒ
ドロキシ（Ｔｙｒ）（９．８）、εーアミノ（Ｌｙｓ）
（１０．２）、グアニジウム基（Ａｒｇ）（１２．５）
等が使用可能である。

【００４１】例えば、ｐＩを小さくするためには、アス
パラギン酸、またはグルタミン酸を選択し、ｐＩを大き
くするには、アルギニン、またはリシンを選択する、さ
らに、α−アミノ基をフリーにすることも可能である。
同様に、ｐＩをそれらの間にするためには、チロシンや
ヒスチジンを選択すればよい。

【００４２】本発明においては、ｐＩの範囲として特に
３以上であって、１１以下のものが好ましい。さらに特
に、ｐＩの範囲として特に３以上であって、１０以下の
ものが好ましい。

【００４３】さらに、本発明においては、望ましく選択
されたアミノ酸を含むオリゴペプチドの合成方法につい
ては、特に制限されない。一般的な合成方法による合成
（液相法、固相法等、ペプチド合成の基礎と実験、泉谷
信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、丸善１９８５
年）、または自動合成方法による合成等が好ましく使用
可能である。

【００４４】また、本発明においては、天然物由来のシ
ステインを少なくとも１つ含むオリゴペプチドも、必要
なアミノ酸基が存在し、さらに反応活性点が制御可能な
ものであれば、その全部、または一部が好適に使用可能
である。具体的には、オキシトシン、バソプレシン、バ
ソトシン由来のオリゴペプチド、ソマトスタチン由来の
オリゴペプチドが挙げられる。

【００４５】さらに天然物由来のオリゴペプチドに必要
なアミノ酸基を化学合成により結合し、望ましいアミノ
酸基を有するオリゴペプチドを合成することも可能であ
る。この際、システイン数又はシステインの配列位置に
は特に制限はない。

【００４６】（発蛍光団）本発明において使用可能な発
蛍光団の種類については特に制限されず、一般に知られ
ている蛍光性色素を含むものであればよい。

【００４７】例えば、ローダミン、フルオレセイン、
シアニン、インドシアニン、インドカルボシアニン、ピ
ロニン、ルシファーイエロー、キナクリン、スクエア
酸、クマリン、フルオロアンセニルマレイミド等であれ
ばよい。本発明においては、特にローダミン、シアニン
色素等が好ましく使用可能である。

【００４８】本発明においては特に、ローダミン発蛍光
団（ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
ＰｒｏｂｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍ
ｉｃａｌｓ，５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲＰＲＯＢＥＳ，ＩＮＣ．，１９９２）を導入する
ことが好ましい。

【００４９】本ローダミン発蛍光団はメタノール中にお
いて、５５６ｎｍに極大吸収（モル吸光係数９３、００
０）を有し、また５７６ｎｍを極大とする蛍光を有す
る。

【００５０】さらに本発明において好適に使用可能な発
蛍光団としては、芳香族複素環式化合物または多環芳香
族炭化水素がある（例えば、蛍光リン光分析、西川泰
治、平木敬三著、共立出版、１９８９参照）。例えばア
ントラセン、ナフタレン、フェナントレン、キノリン、
ピレン、ペリレン等またはそれらの誘導体が特に好適に
使用可能である。これらの炭化水素発蛍光団には、適当
な結合基を設けることにより好適にオリゴペプチドと結
合可能となる。

【００５１】（結合基）本発明においては、発蛍光団基
とオリゴペプチドのシステインのＳＨ基とを結合する結
合基の種類においては特に制限はない。結合基を介する
ことなく、発蛍光団を含む基が前記ＳＨ基と結合しても
よいし、適当な結合基を介して結合してもよい。

【００５２】この場合、発蛍光団を含む基が前記ＳＨ基
と、例えば、チオエステル結合、ジチオエステル結合、
チオエーテル結合（スルフィド結合）等で結合すること
が好ましい。本発明においては特にチオエ−テル結合が
好ましい。

【００５３】（発蛍光団色素基）−（結合基）−Ｓ−シ
ステイン結合基の導入方法は特に制限はない。発蛍光団色素を含
む基が、ハロゲン化メチル基（例えばヨードメチル基、
−ＣＨ₂Ｉ）、活性エステル基、酸塩化物、酸無水物、
マレイミド基等を有する場合においては、これらの活性
基と反応可能であり、さらに、システインのＳＨ基と反
応可能な２官能性基が好ましい。

【００５４】例えば、ローダミン発蛍光団基が酸塩化物
基（例えば、色素−ＳＯ₂Ｃｌ）を有する場合に、まず
ジアミン（例えばエチレンジアミン）との反応によりチ
オアミド結合（色素−ＳＯ₂ＮＨ（ＣＨ₂）₂ＮＨ₂）を形
成し、さらにモノヨード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミド
エステルと反応させて、得られる色素−ＳＯ₂ＮＨ（Ｃ
Ｈ₂）₂ＮＨＣＯＣＨ₂Ｉは容易に選択的にオリゴペプチ
ドのシステインのＳＨ基と反応し、チオエ−テル結合を
形成する。

【００５５】色素−ＳＯ₂ＮＨ（ＣＨ₂）₂ＮＨＣＯＣＨ₂
−Ｓ−システイン本反応は温和な条件で行うことが可能であり、他のオリ
ゴペプチド部分および蛍光色素部に変化を与えない。

【００５６】さらに、オリゴペプチドに複数の反応活性
点がある場合には、前記ＳＨ基にのみ反応可能とするた
め、反応条件、反応試薬等の選択が可能である。この選
択を可能とするため、一般的な有機合成の手法が好適に
使用可能である。

【００５７】例えば、必要ならば、反応性の他の置換基
（例えばアミノ基、フェノール基等）をあらかじめ保護
しておくことは好ましい手法の１つである。

【００５８】本発明においては、得られた蛍光検出キャ
ピラリー等電点電気泳動用マーカーの純度、および、保
存安定性は、等電点電気泳動法により確認可能である。

【００５９】さらに必要ならば、高速液体クロマトグラ
フィーを用いて簡便に精製可能である。その際、逆相系
カラム、特にオクタデシル基を化学結合させた充填剤を
用いることで効率の良い分離精製が可能となる。検出に
は２８０ｎｍが好適に使用可能な波長である。

【００６０】（ｐＩ測定）本発明において、蛍光等電点
電気泳動用マーカーのｐＩは、等電点電気泳動を行い、
市販の等電点電気泳動用マーカーとの移動度を比較する
こと、あるいは標識ペプチドの泳動位置のｐＨを直接測
定することにより測定可能である。

【００６１】等電点電気泳動はポリアクリルアミドを支
持体とするスラブ（平面状）ゲル等電点電気泳動が好ま
しく使用可能である（Righetti,P.G.,Isoelectric Focu
sing:Theory, Methodology and Applications, Elsevie
r, Amsterdam, 1983参照）。

【００６２】染色方法による検出は一般の方法（例えば
クーマシーブリリアントブルー−Ｒ２５０染色）を好適
に使用可能である。

【００６３】さらに、蛍光分析法による検出は、一般の
方法例えばデンシトメータによる方法を好適に使用可能
である（例えば島津製作所製、島津二波長フライングス
ポットスキャニングデンシトメータＣＳ９３００Ｐ
Ｃ）。

【００６４】（キャピラリー等電点電気泳動）本発明に
かかる標識オリゴペプチドをマーカーとして用いること
のできるキャピラリー等電点電気泳動用装置に特に制限
はない。

【００６５】一般的に、蛍光物質を標識したペプチド
が、キャピラリー等電点電気泳動装置によって、それぞ
れのｐＩに応じて泳動用担体に形成されたｐＨの位置に
濃縮されて静止する。さらにこれらの位置は、励起光照
射により発生する蛍光を検出することにより確認され得
る。

【００６６】本発明においては、励起光源は特には制限
されないが、安定した光照射を可能とするレーザーの使
用が特に好ましい。

【００６７】例えば、本発明においては、発蛍光団であ
るローダミン色素に対する励起光としては、ヘリウムネ
オンレーザーが好適に使用可能である。

【００６８】キャピラリーの一端に設けられた蛍光検出
器により泳動用担体に形成されたｐＨのグラジエントを
確認することができる。

【００６９】上で説明したように、本発明の蛍光検出等
電点電気泳動用マーカーは、オリゴペプチドの、発蛍光
団を有する基を結合させることにより合成し、ｐＩが均
一でしかも高い安定性を有する。従って蛍光検出等電点
泳動において、泳動用担体に形成されたｐＨのグラジエ
ントに基づき、泳動された試料物質の等電点を確認する
際の高感度分析用のマーカーとなる。

【００７０】従って本発明の蛍光検出等電点電気泳動用
マーカーは、キャピラリー等電点泳動方法にも使用可能
となる。

【００７１】以下、実施例に基づき本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、以
下の実施例に限定されるものではない。

【００７２】（蛍光検出等電点電気泳動用マーカーキッ
ト）上記説明したように、本発明に係る蛍光等電点電気
泳動用マーカーに使用可能なオリゴペプチドは、適時選
択し、組合せて使用可能である。

【００７３】すなわち、本発明に係るマーカーは、ｐＩ
として３から１０の範囲にわたり計算値と実測値の良好
な一致を示すものであり（具体的には表１に挙げられて
いる）、かつ良好な焦点性を示すものである。さらに、
本発明に係るマーカーは、低分子量のオリゴペプチドで
あって、それらを複数組合せて種々の等電点電気泳動条
件下で使用してもそれぞれ独立にそれぞれのｐＩ値に焦
点化するものである。上記組合せとしては、具体的には
マーカーとして使用したい範囲内にある本発明に係るマ
ーカーを上記表１に基づき適当な数選択することが可能
となる。

【００７４】例えば、表１中に示される番号で、６，
７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５の１
０種類の組合せ（Gly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys、 Gly-
Cys-Glu-His-His-His-Arg、 Gly-Cys-Glu-His-Arg、Gly
-Cys-Glu-His-His、 Gly-Cys-Glu-Arg、 Gly-Cys-Glu-H
is、 Gly-Cys-Asp-Asp-His-His、Gly-Cys-Glu-Glu-Hi
s、Gly-Cys-Asp-Asp-Arg、 Gly-Cys-Glu-Glu）は好まし
いキットの１例である。これらは広い範囲のｐＩをカバ
ーし、かつそのｐＩも略等間隔となっているものであ
る。

【００７５】また、同様に、１，４，６，７，８，９，
１０，１１，１２，１３，１４，１５の１２種類の組合
せ（Gly-Cys-Tyr-Lys-Arg、Gly-Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-L
ys、Gly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys、Gly-Cys-Glu-His-H
is-His-Arg、Gly-Cys-Glu-His-Arg、Gly-Cys-Glu-His-H
is、Gly-Cys-Glu-Arg、Gly-Cys-Glu-His、Gly-Cys-Asp-
Asp-His-His、Gly-Cys-Glu-Glu-His、Gly-Cys-Asp-Asp-
Arg、Gly-Cys-Glu-Glu）も好ましいキットの１例であ
る。

【００７６】

【実施例】

（蛍光検出等電点電気泳動用マーカーの合成）（１）Gly-Cys-Tyr-Lys-Arg、Gly-Cys-Tyr-Lys-Lys、Gl
y-Cys-Tyr-Tyr-Lys-Lys、 Gly-Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Ly
s、Gly-Cys-Tyr-Lys、Gly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys、G
ly-Cys-Glu-His-His-His-Arg、Gly-Cys-Glu-His-Arg、G
ly-Cys-Glu-His-His、Gly-Cys-Glu-Arg、Gly-Cys-Glu-H
is、Gly-Cys-Asp-Asp-His-His、Gly-Cys-Glu-Glu-His、
Gly-Cys-Asp-Asp-Arg 、Gly-Cys-Glu-Glu、Gly-Cys-Asp
-Asp-Aspの調製。

【００７７】ペプチドは、Applied Biosystems社製ペプ
チド自動合成装置によりＢｏｃ法に基づいて合成し（例
えば、新生化学実験講座１、タンパク質ＶＩ、日本生化
学会編、１９９２年を参照）、得られたオリゴペプチド
は、高速液体クロマトグラフにより精製した。高速液体
クロマトグラフに用いた条件は、ワイエムシ−社製カラ
ムＳ−５、１２０ＡＯＤＳ（３０ｍｍ内径ｘ２５０ｍ
ｍ全長、）を用い、流速は２０ｍｌ／分、検出波長は２
２０ｎｍ、移動相はアセトニトリル勾配−０．１％トリ
フルオロ酢酸で以下のグラジエント／80分条件で用い
た。

【００７８】オリゴペプチドＨＰＬＣ移動相勾配条件 --------------------------------------------------------- Gly-Cys-Tyr-Lys-Arg 3％〜 23％ Gly-Cys-Tyr-Lys-Lys 4.5％〜24.5％ Gly-Cys-Tyr-Tyr-Lys-Lys 2.5％〜22.5％ Gly-Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys 1％〜 19％ Gly-Cys-Tyr-Lys 3.7％〜23.7％ Gly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys 2.3％〜22.3％ Gly-Cys-Glu-His-His-His-Arg 1％〜 18％ Gly-Cys-Glu-His-Arg 0％〜 5％ Gly-Cys-Glu-His-His 0.1％〜 10％ Gly-Cys-Glu-Arg 1％〜 10％ Gly-Cys-Glu-His 0％〜 5％ Gly-Cys-Asp-Asp-His-His 1％〜 15％ Gly-Cys-Glu-Glu-His 1％〜 13％ Gly-Cys-Asp-Asp-Arg 1％〜18.5％ Gly-Cys-Glu-Glu 1％〜 19％ Gly-Cys-Asp-Asp-Asp 0.5％〜 10％ --------------------------------------------------------。

【００７９】（２）リサミンローダミンＢ（ＬＲＢ）ヨ
ードアセタミドの調製（Alexander,H., Lewis,A.S., an
d Ram,R.C., J.Medicinal Chem.,1976,Vol19,1279-128
3）（ａ）ＬＲＢアミンの調製エチレンジアミン104mgとジメチルホルムアミド0.4mlの
混液に、0.3mlのジメチルホルムアミドに溶解した10mg
のリサミンローダミンＢ塩化スルホニル（米国、モレキ
ュラープローブス社製、以下に構造を示す）を滴下し、
暗所室温にて１時間反応させた。

【００８０】

【化１】

【００８１】反応液を減圧下にて蒸発乾固した後、20％
アセトニトリル−１％ギ酸溶液2mlに溶解し、20％アセ
トニトリル−１％ギ酸溶液で平衡化した１mlのDowex-1
（Ｈ１型）カラムに全量流して素通り画分を集め、減圧
下にて蒸発乾固し、ＬＲＢアミンの粗製品とした。これ
を、アセトニトリル0.4mlと0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液（pH7.5)1.6mlに溶解し、570nmにおけるモル吸光係数
を93,000として吸光度測定によってその濃度を決定し
た。ＬＲＢアミン粗製品150nmolを25％アセトニトリル
−0.1％トリフルオロ酢酸溶液で平衡化した逆相クロマ
トグラフカラム（東ソーODS-80Ts、直径4.6mm、長さ25c
m）にかけ、30分間にわたって25−55％のアセトニトリ
ルの濃度直線勾配をかけて溶出し、280nmの吸収をモニ
ターすることで検出を行った。最も大きなピークを分取
し（127nmol）、精製ＬＲＢアミンとして以下の操作に
用いた。

【００８２】（ｂ）ＬＲＢアミンのヨードアセチル化（ａ）で調製した画分を減圧下に乾固し、その後、アセ
トニトリルと0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)の1:4
混合液88μｌに溶解し、これに10mMモノヨード酢酸Ｎ−
オキシコハク酸イミドエステルのジメチルホルムアミド
溶液12μｌを添加し、室温にて１時間反応させた。反応
液の全量を（ａ）で説明した同じ条件にて逆相クロマト
グラフにかけ、溶出した主ピークをＬＲＢ−ヨードアセ
タミドとして分取し（70nmol)、ペプチドの標識に用い
た。以下にＬＲＢ−ヨードアセタミドの構造を示し
た。

【００８３】

【化２】

【００８４】（３）ペプチドの標識（２）で調製した精製色素（ＬＲＢ−ヨードアセタミ
ド）25nmolを含むカラム溶液を試験管中で乾固し、その
後、アセトニトリル20μｌに溶解した。これに、（１）
で調製したペプチド水溶液１０μｌ（濃度5mM、50nmo
l）と緩衝液（0.1M Na-Pi、5mM EDTA、pH7.5）を加え、
暗所にて一晩室温で反応させた。反応液を、25％アセト
ニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸溶液で平衡化した逆
相クロマトグラフカラム（東ソー ODS-80Ts、直径4.6m
m、長さ25cm）にかけ、1ml／分の流速にて、30分間にわ
たって25−55％のアセトニトリルの濃度直線勾配をかけ
て標識ペプチドを溶出した、分取した。検出は280nmの
吸収にて行った。標識ペプチドの収量は、80％であっ
た。標識ペプチドの濃度は、570nmにおけるモル吸光係
数を93,000として、吸光度測定によって決定した。以下
に標識されたオリゴペプチドGly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-
Lysの構造を示す。

【００８５】

【化３】

【００８６】（蛍光物質標識ペプチドのｐＩ）Gly-Cys-
Tyr-Lys、Gly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys、Gly-Cys-Glu-
His-His-His-Arg、Gly-Cys-Glu-His-Arg、Gly-Cys-Glu-
His-His、Gly-Cys-Glu-Arg、Gly-Cys-Glu-His、Gly-Cys
-Asp-Asp-His-His、Gly-Cys-Glu-Glu-His、Gly-Cys-Asp
-Asp-Arg 、Gly-Cys-Glu-Glu、Gly-Cys-Asp-Asp-Aspの
上記蛍光物質標識オリゴペプチドは、Ampholine PAG Pl
ate(pH3.5-9.5、ファルマシアバイオテク社製）（5％
Ｔ、3％Ｃ、24.5ｍｍ×110ｍｍ大きさ、1ｍｍ厚さ）を
用いて等電点電気泳動を行い、市販の等電点電気泳動用
マーカー（ｐＩカリブレーションキット３−１０、ファ
ルマシアバイオテク社製）との移動度を比較した。

【００８７】泳動条件は３００Ｖの電圧にて電気泳動を
開始した後、３０分後に１、５００Ｖへ電圧を増加し、
５０分間泳動を行った。

【００８８】泳動終了後、蛍光物質標識オリゴペプチド
については、オレンジ色のフィルターを通して紫外線を
照射することにより写真撮影を行い、泳動位置を確認し
た。

【００８９】その後、市販の等電点電気泳動用マーカー
の泳動位置を知るためにゲルを、ページブルー８３染色
液（ＣＢＢ−Ｒ２５０、第一化学薬品社製）にて染色を
行った。

【００９０】染色後、メタノールと酢酸の水溶液にてバ
ックグラウンドを除去することにより、泳動位置を確認
した。

【００９１】また、Gly-Cys-Tyr-Lys-Arg、Gly-Cys-Tyr
-Lys-Lys、Gly-Cys-Tyr-Tyr-Lys-Lys、 Gly-Cys-Tyr-Ty
r-Tyr-Lys-Lysの上記蛍光物質標識オリゴペプチドにつ
いては以下の方法でｐＩを測定し、実測知を決定した。

【００９２】すなわち、１x６５x１２５mmの合成シリカ
板上に、ｐＨ勾配形成のための両性担体としてファルマ
シアバイオテク社製のPharmalyte8-10.5を終濃度として
原液の１／１６希釈で含む１x５０x１１５mmのポリアク
リルアミドゲル（4.2%Ｔ、4.8%Ｃ）を作製した。ゲルの
乗ったシリカ板は恒温水を循環させた水平な冷却板上に
置き、空気中の炭酸ガスの影響を避けるため、窒素ガス
を満たしたグローブボックス中で電気泳動を行った。短
片に沿って電極を置き、試料としてそれぞれのペプチド
約0.5 nmolを陰極側および陽極側から１cmの位置のゲル
表面に添加し、最終的に添加した試料が１箇所に焦点化
するまで約１００V/cmの電圧で焦点化した（約２時
間）。焦点化が完了した後、電圧をかけたままの状態で
ゲルの温度が２５℃になるようにゲル冷却板に循環する
水の温度を調整し、ｐＨ勾配に沿って１cm間隔にゲル表
面のｐＨを測定した。ゲルの温度とｐＨの測定には東亜
電波工業株式会社製ＭＥＴＯＸＹｐＨ計（HM-17MX型）
を用いた。ゲルの位置に対してｐＨをプロットしてゲル
中のｐＨ勾配を求め、蛍光物質標識オリゴペプチドの焦
点化位置からそれぞれの蛍光標識オリゴペプチドの等電
点を決定した。

【００９３】得られた蛍光物質標識オリゴペプチドと市
販の等電点電気泳動用マーカーの泳動像を図１に示し
た。

【００９４】得られたそれぞれの発蛍光団標識オリゴペ
プチドのｐＩおよび式（１）に基づく計算値を比較した
ものを表１にまとめた。

【００９５】（表１）ｐＩ実測値および計算値＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝番号構造計算値実測値 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 1 Gly-Cys-Tyr-Lys-Arg 10.02 9.00 2 Gly-Cys-Tyr-Lys-Lys 9.76 8.98 3 Gly-Cys-Tyr-Tyr-Lys-Lys 9.52 8.91 4 Gly-Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys 9.36 8.85 5 Gly-Cys-Tyr-Lys 8.62 8.30 6 Gly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys 8.46 8.36 7 Gly-Cys-Glu-His-His-His-Arg 7.34 7.67 8 Gly-Cys-Glu-His-Arg 7.04 7.24 9 Gly-Cys-Glu-His-His 6.42 6.71 10 Gly-Cys-Glu-Arg 6.06 6.04 11 Gly-Cys-Glu-His 5.48 5.60 12 Gly-Cys-Asp-Asp-His-His 5.24 5.34 13 Gly-Cys-Glu-Glu-His 4.54 4.35 14 Gly-Cys-Asp-Asp-Arg 4.16 4.10 15 Gly-Cys-Glu-Glu 3.82 3.59 16 Gly-Cys-Asp-Asp-Asp 3.38 <3.50(*) ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ (*)蛍光標識オリゴペプチドの泳動位置が、用いた市販の等電点電気泳動用マーカーの移動度の範囲（ｐＩ9.30〜3.50）を越えていることから、実測値を得ることができなかった。

【００９６】（蛍光検出キャピラリー等電点電気泳動）
得られた蛍光物質標識オリゴペプチドを蛍光検出キャピ
ラリー等電点電気泳動によって分離・検出を行った（Ｈ
ｊｅｒｔｅｎ，Ｓ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３４７，１９１−１９
８，１９８５）。内面をポリアクリルアミドでコーテ
ィング処理を施した内径0.05ｍｍ、外径0.375ｍｍ、全
長22ｃｍの溶解シリカキャピラリー（ジーエルサイエン
ス社製）を、２５倍希釈Pharmalyte（pH3-10、ファルマ
シアバイオテク社製）で満たし、陽極から上記得られた
オリゴペプチド（Gly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys、1×10
^-8M）を含む２５倍希釈Pharmalyte（pH3-10）溶液を落
差5cmの静水圧で１分間流すことにより導入した。

【００９７】陽極液として20ｍＭリン酸、陰極液として
20ｍＭのNaOHを用い、両電極槽を同じ高さにして５分
間、５００Ｖ／ｃｍで焦点化した。焦点化したマーカー
は５００Ｖ／ｃｍの電場を加えつつ陽極槽を陰極槽に対
して５ｃｍ高くすることにより、陰極側へ移動させ、陰
極端から２ｃｍの位置でレーザー励起による蛍光検出を
行った。

【００９８】蛍光物質の励起はヘリウムネオンレーザー
（波長543.5nm、出力１ｍＷ、モデル；０５−ＬＧＲ−
１５１−Ｓ、メレスグリオ社製）を用いて行い、発生し
た蛍光を４０倍の対物レンズにて集光した後、バンドパ
スフィルター（５９０ｎｍ、３０ｎｍバンド幅、モデ
ル；ＤＩＦ−ＢＰ−３、日本真空光学社製）を通して光
電子増倍管（モデル；Ｒ１３８７、浜松ホトニクス社
製）にて測定し、測定結果はインテグレーター（モデ
ル；ＣＲ４Ａ、島津製作所社製）を用いて解析した。

【００９９】得られた結果を図２に示した。

【０１００】以上の結果によれば、本発明により、オリ
ゴペプチドに発蛍光団色素を含むことにより、蛍光物質
標識オリゴペプチドが得られる。この際、オリゴペプチ
ドと発蛍光団は温和な条件下で結合され得るため、オリ
ゴペプチドおよび蛍光物質に対して障害を与えることな
く、さらにオリゴペプチドに結合させる蛍光物質の数と
位置も特定でき、得られる発蛍光団色素を含むオリゴペ
プチドは、安定性の高い、均一な単一のｐＩを有するこ
ととなる。従って、本発明において得られる蛍光検出キ
ャピラリー等電点電気泳動用マーカーは、試料物質の等
電点を推定する際のマーカーとして使用可能となる。

【０１０１】

【発明の効果】本発明に係る、蛍光検出等電点電気泳動
法において用いる蛍光検出等電点電気泳動用マーカー
は、ＳＨ基に発蛍光団色素を結合したシステインを少な
くとも１つ含むオリゴペプチドであることを特徴とす
る。従って、得られた本発明に係るマーカーは通常の高
分子蛋白に基づくマーカーに比較してその化学的安定性
において優れたものとなる。さらにＳＨ基に発蛍光団色
素を結合したシステインを少なくとも１つ含むものであ
るため、高いｐＩを示すマーカーが得られる。上記結合
反応を選択的に行うことが可能であることから、得られ
るマーカーの示すｐＩが均一で鋭いピーク状となる。

【０１０２】従って蛍光検出等電点泳動において、泳動
用担体に形成されたｐＨのグラジエントに基づき、泳動
された試料物質の等電点を確認する際の高感度分析用の
マーカーとなり、キャピラリー等電点泳動方法にも使用
可能となる。

【０１０３】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：２配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：３配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：４配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：５配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Cys Tyr Lys 配列番号：６配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：７配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：８配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：９配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：１０配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Cys Glu Arg 配列番号：１１配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Cys Glu His 配列番号：１２配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：１３配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：１４配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：１５配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly-Cys-Glu-Glu 配列番号：１６配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る１６種類の蛍光物質標識ペプチド
と市販の等電点電気泳動用マーカーの電点電気泳動を行
った際の電気泳動像を示す電気泳動写真である。図中の
番号１〜１６は、表１中に番号１〜１６で示されるオリ
ゴペプチドに対応する。

【図２】本発明に係る蛍光物質標識ペプチドの、蛍光検
出キャピラリー等電点電気泳動を行った際の移動時間と
蛍光強度を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者高本尚宜静岡県浜北市平口5000番地株式会社分子バイオホトニクス研究所内 (72)発明者志村清仁神奈川県津久井郡津久井町又野297−６ (72)発明者王志神奈川県津久井郡相模湖町寸沢嵐655−11 藤寮２号室 (72)発明者笠井献一神奈川県津久井郡城山町若葉台１−３−12

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛍光検出等電点電気泳動法において用い
る蛍光検出等電点電気泳動用マーカーであって、ＳＨ基
に発蛍光団色素を結合したシステインを少なくとも１つ
含むオリゴペプチドであることを特徴とする蛍光検出等
電点電気泳動用マーカー。
【請求項２】前記結合が、少なくとも、チオエステ
ル、ジチオエステル、チオエーテル結合からなる群から
選ばれる１つであることを特徴とする請求項１に記載の
蛍光検出等電点電気泳動用マーカー。
【請求項３】前記オリゴペプチドが、少なくとも、プ
ロトンを放出して負電荷を持つ基を有するアミノ酸であ
って、プロトンを放出して負電荷を持つ基の酸解離定数
をＫ_jとするｎ_j個のアミノ酸および／または、プロトン
を受け取って正電荷を持つ基を有するアミノ酸であっ
て、プロトンを受け取って正電荷を持つ基の酸解離定数
をＫ_iとするｎ_i個のアミノ酸とを含み、Ｚ＝Σ_i（ｎ_i／
（１＋Ｋ_i／［Ｈ⁺］））−Σ_j（ｎ_j／（１＋［Ｈ⁺］／
Ｋ_j））とした際に、｜Ｚ｜＜０．０１をみたす際の−
ｌｏｇ（［Ｈ⁺］）をｐＩとした場合、３＜ｐＩ＜１０
であることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかの
請求項に記載の蛍光検出等電点電気泳動用マーカー。
【請求項４】前記オリゴペプチドが、Gly-Cys-Tyr-Ly
s-Arg、Gly-Cys-Tyr-Lys-Lys、Gly-Cys-Tyr-Tyr-Lys-Ly
s、Gly-Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys、Gly-Cys-Tyr-Lys、G
ly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys、Gly-Cys-Glu-His-His-Hi
s-Arg、Gly-Cys-Glu-His-Arg、Gly-Cys-Glu-His-His、G
ly-Cys-Glu-Arg、Gly-Cys-Glu-His、Gly-Cys-Asp-Asp-H
is-His、Gly-Cys-Glu-Glu-His、Gly-Cys-Asp-Asp-Arg
、Gly-Cys-Glu-Glu、Gly-Cys-Asp-Asp-Aspからなる群
から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請
求項１〜３のいずれかの請求項に記載の蛍光検出等電点
電気泳動用マーカー。
【請求項５】前記発蛍光団色素が、ローダミン、フル
オレセイン、シアニン、インドシアニン、インドカル
ボシアニン、ピロニン、ルシファーイエロー、キナクリ
ン、スクエア酸、クマリン、フルオロアンセニルマレイ
ミド、アントラセンからなる群より選ばれる発蛍光団色
素であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの請
求項に記載の蛍光検出等電点電気泳動用マーカー。
【請求項６】前記蛍光検出等電点電気泳動法が、蛍光
検出キャピラリー等電点電気泳動法であることを特徴と
する請求項１〜５のいずれかの請求項に記載の蛍光検出
等電点電気泳動用マーカー。
【請求項７】システインのＳＨ基に発蛍光団色素を結合
した、Gly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys、 Gly-Cys-Glu-Hi
s-His-His-Arg、 Gly-Cys-Glu-His-Arg、Gly-Cys-Glu-H
is-His、 Gly-Cys-Glu-Arg、 Gly-Cys-Glu-His、 Gly-C
ys-Asp-Asp-His-His、Gly-Cys-Glu-Glu-His、Gly-Cys-A
sp-Asp-Arg、 Gly-Cys-Glu-Glu からなる蛍光検出等電
点電気泳動用マーカーキット。
【請求項８】システインのＳＨ基に発蛍光団色素を結合
した、Gly-Cys-Tyr-Lys-Arg、Gly-Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Lys
-Lys、Gly-Cys-Glu-Tyr-Tyr-Lys-Lys、Gly-Cys-Glu-His
-His-His-Arg、Gly-Cys-Glu-His-Arg、Gly-Cys-Glu-His
-His、Gly-Cys-Glu-Arg、Gly-Cys-Glu-His、Gly-Cys-As
p-Asp-His-His、Gly-Cys-Glu-Glu-His、Gly-Cys-Asp-As
p-Arg、Gly-Cys-Glu-Glu からなる蛍光検出等電点電気
泳動用マーカーキット。