JPH10201491A - タンパク質ホスファターゼ１結合タンパク質ｒ５ - Google Patents

タンパク質ホスファターゼ１結合タンパク質ｒ５

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JPH10201491A
JPH10201491A JP9367479A JP36747997A JPH10201491A JP H10201491 A JPH10201491 A JP H10201491A JP 9367479 A JP9367479 A JP 9367479A JP 36747997 A JP36747997 A JP 36747997A JP H10201491 A JPH10201491 A JP H10201491A
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ピーター・アール・ヤング
Patricia T W Cohen
パトリシア・ティ・ダブリュー・コーエン
Phillip Cohen
フィリップ・コーエン
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 真性糖尿病、肥満症、本態性高血圧、異脂血
症および早発性アテローム性動脈硬化症を含む、疾患を
診断または治療するために、種々のＰＰ１結合タンパク
質、そのアンタゴニストおよびアゴニスト、ならびにそ
れを用いる組成物および方法が望まれいる。 【解決手段】 本発明は、（ａ）配列番号２に示され
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）
配列番号２のアミノ酸からなるポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性
を有するポリヌクレオチド；（ｃ）遺伝暗号の重複性に
より、配列番号２と同じアミノ酸をコードするポリヌク
レオチド；等からなる群より選択されるメンバーからな
る単離ポリヌクレオチドを提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、新たに同
定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、そのポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導
体；かかるポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
プチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
使用、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの製造に関する。特に、本発明は、タンパク質ホス
ファターゼ１の肝臓および筋肉特異的グリコーゲン結合
サブユニットに関与する新規なヒトタンパク質に関連す
る新規なポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関す
る。この新規なタンパク質を、以下、タンパク質ホスフ
ァターゼ１結合タンパク質Ｒ５またはＰＰＰ１Ｒ５とい
う。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】タン
パク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）は、可逆的タンパク
質リン酸化により多種の細胞機能に関与しており、真核
細胞にてセリンおよびトレオニン残基を脱リン酸化する
主なタンパク質ホスファターゼの一つである。ＰＰ１の
種々の機能を調節する能力は、ＰＰ１を特異的な細胞下
位置に標的化する種々の調節サブユニットと相互反応
し、その基質特異性を調節し、その活性を細胞外シグナ
ルに応答するようにするＰＰ１の能力にある［Hubbard
およびCohen、Trends Biochem.Sci.、18：172-177（199
3）］。１２６ｋＤａのグリコーゲン結合サブユニット
（ＧMまたはＰＰＰ１Ｒ３）は、ＰＰ１をグリコーゲン
粒子に、および横紋筋の筋小胞体に標的化する［Tang
ら、J.Biol.Chem.、266：15782-15789（1991）；Chen
ら、Diabetes、43：1234-1241（1994）］。インスリン
およびアドレナリンホルモンは、ＧMサブユニットを介
してＰＰ１の活性に影響を及ぼすと考えられる。インス
リンに応答して、ヒトＧMのＳｅｒ−４６がリン酸化さ
れると、ＰＰ１が脱リン酸化し、グリコーゲンシンター
ゼを活性化する速度を速め、グリコーゲン合成の増加を
もたらす［P.Dentら、Nature、348：302-308（199
0）］。反対に、β―アドレナリン作動性アゴニストに
応答して、タンパク質キナーゼＡによりヒトＧMのＳｅ
ｒ−６５がリン酸化されると、ＰＰ１はＧMから解離す
るようになり、すなわちＰＰ１がグリコーゲンシンター
ゼおよびホスホリラーゼに作用することを阻害し、その
結果、グリコーゲン合成およびグリコーゲン分解の刺激
が減少することとなる［Nakielnyら、Eur.J.Biochem.、
199：713-722（1991）］。
【０００３】ＧMのＮ−末端部とわずか２３％同一であ
るにすぎない、別個の３３ｋＤａグリコーゲン結合サブ
ユニット（ＧLまたはＰＰＰ１Ｒ４）は、ＰＰ１を肝臓
にあるグリコーゲンに標的化させる［Moorheadら、FEBS
Lett.、362：101-105（1994）；Dohertyら、REBS Let
t.、375：284-289（1995）］。ＧLの結合は、ＰＰ１の
活性を調節し、ＰＰ１が脱リン酸化し、グリコーゲンシ
ンターゼを活性化する速度を速め、ホスホリラーゼを不
活性化する速度を抑制する。肝臓におけるＰＰ１の活性
のホルモン調節がＧLのリン酸化を介して起こることは
知られていない。代わりに、グルカゴンホルモン（サイ
クリックＡＭＰおよびタンパク質キナーゼＡを介して作
用）およびａ−アドレナリン作動性アゴニスト（Ｃａ+2
を介して作用）が、ＧLに結合し、ナノモルの濃度でＰ
Ｐ１を有意に阻害するホスホリラーゼａ型のレベルを増
加させる。ＰＰ１の基質としてのホスホリラーゼについ
てのＫｍがマイクロモルの範囲にあるため、この阻害は
アロステリックであると考えられる。インスリンは肝臓
におけるサイクリックＡＭＰのレベルを低下させ、それ
によりホスホリラーゼａ型のレベルを減少させ、ＰＰ１
−ＧL複合体の阻害を緩和することにより作用する。肝
臓におけるグリコーゲン合成もまた、ホスホリラーゼａ
型に結合するグルコースにより刺激され、脱リン酸化さ
れる速度を増大させる。
【０００４】ＰＰ１の他の標的化サブユニットがいくつ
か哺乳動物にて同定されている。そのサブユニットは、
ＰＰ１によるミオシン軽鎖の脱リン酸化を亢進し、平滑
筋の弛緩に関与している、平滑筋のミオシン結合標的化
複合体（Ｍ１１０とＭ２１のサブユニットからなる）を
包含す［D.Alessiら、Eur.J.Biochem.、210：1023-1035
（1992）；Y.H.Chenら、FEBS Lett.、365：51-55（199
4）］。別のＰＰ１のミオシン標的化サブユニットが横
紋筋に存在する［P.Dentら、Eur.J.Biochem.、210：103
7-1044（1992）］。ｐ５３結合タンパク質（５３ＢＰ
２）［Ｎ.Ｒ.Helpsら、FEBS Lett.、377：295-300（199
5）］、核タンパク質NIPP-1［A.Van Eyndeら、J.Biol.C
hem.、270：28068-28074（1995）］およびＲＮＡスプラ
イシング因子ＰＳＦ１［K.Hiranoら、FEBS Lett.、38
9：191-194（1996）］がＰＰ１に結合することがわかっ
ている。網膜芽腫遺伝子産物［Ｔ.Durpheeら、Genes De
v.、7：555-569（1993）］、リボソームタンパク質Ｌ５
［K.Hiranoら、J.Biol.Chem.、270：19786-19790（199
5）］およびＲＩＰＰ−１［Buellensら、Eur.J.Bioche
m.、239：183-189（1996）］および未だ同定されていな
い１１０ｋDa核タンパク質［I.Jagielloら、J.Biol.Che
m.、270：17257-17263（1995）］もまた、ＰＰ１と相互
反応すると報告されている。小さなサイトソルタンパク
質、阻害剤−１、阻害剤−２およびＤＡＲＰＰ−３２は
ＰＰ１を阻害する［Ｐ.Cohen，Annu.Rev.Biochem.、5
8：453-508（1989）］。阻害剤−２とＰＰ１の間の複合
体が単離されている。最近になって、阻害剤−２が分子
チャペロン（chaperon）のように作用し、ＰＰ１をその
元の構造に折りたたむことが明らかにされた［D.R.Ales
siら、Eur.J.Biochem.、213：1055-1066（1993）；C.Ma
cKintoshら、FEBS．Lett.、（1996）］。多数の異なる
ＰＰ１標的化サブユニットがまた酵母にて同定された
［M.J.R.Stark、Yeast （1996）］。
【０００５】ＰＰ１に結合するグリコーゲン上の部位お
よび筋原繊維標的化サブユニットが局在化され［Ｄ.Ｆ.
Johnsonら、Eur.J.Biochem.、239：317-325（199
6）］、多数のＰＰ１結合サブユニットに共通するRVXF
モチーフを有する１３残基ペプチドがＰＰ１との複合体
として結晶化された［Ｍ.Egloffら、EMBO J. （199
7）］。公知のＰＰ１サブユニットはグリコーゲン代謝
作用を制御するという役割を果たしており、かくして新
規なＰＰ１サブユニットタンパク質、そのアゴニストま
たはアンタゴニストは、グリコーゲン合成におけるイン
スリンの作用に対する耐性の関与する多くの疾患に効果
があると考えられる。かかる障害は、とりわけ、真性糖
尿病、肥満症、本態性高血圧、異脂血症（dyslipidaemi
a）および早発性アテローム性動脈硬化症を包含する。
したがって、当該分野にて、種々のＰＰ１結合タンパク
質、そのアンタゴニストおよびアゴニスト、ならびにそ
れを用いる組成物および方法に関する要求がある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】一の態様において、本発
明は、ポリペプチド、とりわけ、ヒト起源の新規なＰＰ
１結合サブユニットポリペプチドと同定されたポリペプ
チド、ならびにその生物学的に活性であり、診断学的ま
たは治療学的に有用なフラグメント、変種、アナログお
よび誘導体、該フラグメントの変種および誘導体、およ
び前記した物質のアナログを提供するものである。これ
らのポリペプチドは、例えば、図1および２に示される
アミノ酸配列とＧMおよびＧLなどの他のタンパク質の既
知アミノ酸配列（図５を参照のこと）の間の相同性によ
り、ＰＰ１結合サブユニットポリペプチドと同定され
た。一の具体例において、本発明は、ＰＰ１結合モチー
フを含有し、ＰＰ１の特異性を調節し、ＧLに関連つけ
られるが、非常に広い組織分布を有する、新規なヒトＰ
Ｐ１結合サブユニットを提供するものである。この結合
サブユニットは、ヒトゲノム学術名によれば、ＰＰＰ１
Ｒ５と称される［Ｐ.Ｔ.Ｗ.Cohen、Adv.Prot.Phosphata
ses、8：371-376（1996）］。
【０００７】本発明の別の態様において、発明のＰＰＰ
１Ｒ５の同類アミノ酸置換を有する、天然に存在しない
合成の単離および／または組換えＰＰＰ１Ｒ５ポリペプ
チド、フラグメント、コンセンサスフラグメントおよび
／または配列が提供される。これらのポリペプチドはＰ
Ｐ１に結合してもよく、あるいはまた、ＰＰＰ１Ｒ５リ
ガンド結合を定量的または定性的に調節することもでき
る。もう一つ別の態様において、本発明は、種々のＰＰ
Ｐ１Ｒ５タンパク質またはそのフラグメントを阻害また
は模倣するように設計されている合成、単離または組換
えポリペプチドを提供する。本発明の別の態様におい
て、ＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチド、特にヒトＰＰＰ１Ｒ５
をコードする単離核酸分子が提供される。かかる分子
は、ポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、
ゲノムＤＮＡおよびそのフラグメント、ならびにアナロ
グおよびその変種、アナログおよび誘導体のフラグメン
トを含め、生物学的に活性であり、診断学的または治療
学的に有用なその変種、アナログまたは誘導体を包含す
る。
【０００８】本発明のこの態様の特に好ましい具体例に
おいて、ポリヌクレオチドは、図1および２（配列番号
１および２）に示される配列のヒトＰＰＰ１Ｒ５をコー
ドする領域からなる。本発明のこの態様の特に好ましい
具体例には、ヒトＰＰＰ１Ｒ５の天然の対立遺伝子変種
がある。本発明の別の態様において、プラスミドｐＨＧ
ＢＤＸ２１に含まれるヒトｃＤＮＡより発現可能な成熟
ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供される。
さらに別の態様において、本発明は、本発明の核酸配
列、例えばヒトＰＰＰ１Ｒ５配列と特異的にハイブリッ
ド形成するのに十分な長さの核酸分子からなる核酸プロ
ーブを提供する。
【０００９】もう一つ別の態様において、本発明は、前
記したポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、変
種および誘導体、その変種および誘導体のフラグメン
ト、その前記した物のアナログの製法を提供する。好ま
しい具体例において、本発明は、本発明のポリペプチド
をコードする核酸配列を含有する（すなわち、その中に
発現できるように組み込まれている）組換え原核および
／または真核宿主細胞を、その宿主にてヒトＰＰＰ１Ｒ
５ポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養し、そ
の発現したポリペプチドを回収することからなる組換え
技法による、前記したＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドの製法
を提供する。さらに別の態様において、本発明は、前記
したポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、とりわ
け、研究、生物学的、臨床的および治療上の目的のため
に利用する生成物、組成物、プロセスおよび方法を提供
する。ＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチド、特にヒトＰＰＰ１Ｒ
５ポリペプチドは、限定するものではないが、グリコー
ゲン合成におけるインスリンの作用に対する耐性に関与
する多くの疾患の治療を含め、治療目的に利用すること
ができる。かかる障害は、限定するものではないが、と
りわけ、真性糖尿病、肥満症、本態性高血圧、異脂血症
および早発性アテローム性動脈硬化症を包含する。
【００１０】さらに、ＰＰ１、他のリガンドに結合する
ことおよび／またはリガンド結合を調節することでＰＰ
Ｐ１Ｒ５機能の潜在的調節剤として用いることができ、
その予想される生物学的特性により診断、治療および／
または研究用途に用いることができる、組成物および方
法が提供される。別の態様において、本発明は、これら
のポリペプチドおよびタンパク質を利用して、ＰＰＰ１
Ｒ５ポリペプチドとＰＰ１の相互反応を阻害または刺激
し、他のタンパク質とのその相互反応を阻害または刺激
し、これらペプチドの核への輸送を阻害または刺激し、
およびこれらのポリペプチドと核酸配列との相互反応を
阻害または刺激する、化合物または天然物質またはその
リガンドをスクリーニングする方法を提供する。
【００１１】本発明のこの態様の特定の好ましい具体例
によれば、とりわけ、ＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドまたは
ＰＰＰ１Ｒ５をコードするｍＲＮＡを測定することによ
り、細胞でのＰＰＰ１Ｒ５発現を評価し；細胞を本明細
書に開示のＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドに曝露することにより、インビトロ、エクスビボ
またはインビボで、限定するものではないが、前記した
疾患等を含め、機能障害または疾患を治療し；ＰＰＰ１
Ｒ５遺伝子における欠失などの遺伝的変異および異常を
分析し；および ＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドを生体に投
与し、ＰＰＰ１Ｒ５機能を改善し、あるいはＰＰＰ１Ｒ
５機能不全を治療する、生成物、組成物および方法が提
供される。本発明のさらにもう一つ別の具体例によれ
ば、かかる活性化化合物を用いて本発明のポリペプチド
を刺激し、ＰＰＰ１Ｒ５の発現不足に関連した症状を治
療する方法が提供される。本発明のもう一つ別の態様に
よれば、かかる阻害化合物を用いて、ＰＰＰ１Ｒ５の過
剰発現に関連した症状を治療する方法が提供される。
【００１２】本発明の別の態様において、ヒト化抗体、
抗−抗体、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を
含め、ＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドに対する抗体が提供さ
れる。この点で特定の特に好ましい具体例において、抗
体はヒトＰＰＰ１Ｒ５に対して高度に選択的である。さ
らなる態様において、本発明は本発明のポリペプチドに
対するアゴニストを提供する。本発明のポリペプチドに
対するアゴニストは、グリコーゲン合成におけるインス
リンの作用に対する耐性に関与する多くの疾患の治療に
て用いることができる。かかる障害は、限定するもので
はないが、とりわけ、真性糖尿病、肥満症、本態性高血
圧、異脂血症および早発性アテローム性動脈硬化症を包
含する。好ましいアゴニストには、ＰＰ１または他のＰ
ＰＰ１Ｒ５結合分子に結合し、ＰＰＰ１Ｒ５誘発応答を
惹起または増大させる、ＰＰＰ１Ｒ５を模倣する分子が
ある。また、好ましいアゴニストには、ＰＰＰ１Ｒ５ま
たはＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドと、あるいはＰＰＰ１Ｒ
５活性の他のモジュレーターと相互反応し、そのことに
よりＰＰＰ１Ｒ５の一つの効果またはＰＰＰ１Ｒ５の１
つよりも多い効果を亢進するか、または増大させる分子
もある。
【００１３】本発明のさらにもう一つ別の態様によれ
ば、ＰＰＰ１Ｒ５とＰＰ１との結合、輸送、他の下流タ
ンパク質の修飾およびシス要素との相互反応を拮抗する
ように標的化させることができる、ＰＰＰ１Ｒ５アンタ
ゴニストが提供される。ＰＰＰ１Ｒ５活性のアンタゴニ
ストは、前記した疾患の治療にて用いることができる。
好ましいアンタゴニストには、ＰＰＰ１Ｒ５を模倣して
ＰＰ１または他の結合分子に結合するが、ＰＰＰ１Ｒ５
誘発応答または1以上のＰＰＰ１Ｒ５誘発応答を惹起し
ない分子がある。また、好ましいアンタゴニストには、
ＰＰＰ１Ｒ５に結合するか、あるいはＰＰＰ１Ｒ５と相
互反応して、ＰＰＰ１Ｒ５の一つの効果またはＰＰＰ１
Ｒ５の一より多い効果を阻害する分子、あるいはＰＰＰ
１Ｒ５の発現を阻害する分子がある。本発明のさらなる
態様において、インビトロで細胞に、エクスビボで細胞
に、そしてインビボで細胞に、あるいは多細胞生物に投
与するための、ＰＰＰ１Ｒ５ポリヌクレオチドまたはＰ
ＰＰ１Ｒ５ポリペプチドからなる組成物が提供される。
本発明のこの態様の特定の特に好ましい具体例におい
て、該組成物は、疾患を治療するのに宿主生物中でＰＰ
Ｐ１Ｒ５ポリペプチドを発現させるためのＰＰＰ１Ｒ５
ポリヌクレオチドを含んでなる。この点において、ＰＰ
Ｐ１Ｒ５の異常内因性活性に付随する機能不全の治療に
関するヒト患者における発現が特に好ましい。
【００１４】さらに別の態様において、本発明は、本発
明のポリペプチドの過剰発現およびかかるポリペプチド
をコードする核酸配列における変異に関与する疾患を検
出するための診断アッセイを提供する。例えば、ＰＰＰ
１Ｒ５の配列を、前記した疾患を含め、種々の疾患の検
出に有用である、過剰発現を検出するための診断にて用
いることができる。本発明の別の態様は、とりわけ、前
記した疾患のインジケータとして、これらの配列を、こ
れらのＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドの変異の検出にて用い
る方法を提供する。本発明のさらなる態様は、科学的研
究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関与す
るインビトロの目的のために、かかるポリペプチドまた
該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用す
る方法を提供することである。
【００１５】本発明の他の目的、特徴、利点および態様
は、以下の説明から当業者に明らかとなるであろう。し
かしながら、以下の説明および特定の実施例は、本発明
の好ましい具体例を示すものであり、単なる説明にすぎ
ないことが理解されるであろう。開示された本発明の精
神および観点内での種々の変更および修飾は、以下の説
明を読むこと、本開示の他の部分を読むことにより、当
業者に容易に明らかとなるであろう。
【００１６】
【発明の実施の形態】
定義 以下に例示する説明は、本明細書、特に実施例において
頻繁に用いられるある単語の理解を容易にするために提
供されるものである。説明は簡便性のために提供される
のであって、本発明を限定するものではない。「遺伝
子」なる語は、ポリヌクレオチド鎖の形成に関与するＤ
ＮＡのセグメントを意味し；コーディング領域の前後の
領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコー
ディングセグメント（エキソン）の間の介在配列（イン
トロン）を包含する。ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのあ
る配列でのみ作用する制限酵素などの酵素を用いるＤＮ
Ａの触媒的分裂をいうが、これに限定されるものではな
い。本明細書にいう種々の制限酵素は市販されており、
その反応条件、補因子および使用についての他の要件は
知られており、当業者にとって慣用的である。
【００１７】解析を目的とする場合、典型的には、１μ
ｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０μ
ｌの反応緩衝液中、約２ユニットの酵素で消化する。プ
ラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離するこ
とを目的とする場合、典型的には５ないし５０μｇのＤ
ＮＡを、比例して大きくした容量中、２０ないし２５０
ユニットの酵素で消化する。個々の制限酵素についての
適当な緩衝液および基質の量は、以下に述べるような標
準的実験室マニュアルに記載されており、それらは供給
者によって詳説されている。３７℃で約１時間のインキ
ュベーション時間が通常使用されるが、条件は、標準的
方法、供給者の指示および反応の詳細な条件に従って変
えることができる。消化後、当業者に慣用的な周知方法
を用いて、反応物を解析し、フラグメントをアガロース
またはポリアクリルアミドゲルを介する電気泳動によっ
て精製し、所望のフラグメントを単離してもよい。
【００１８】「遺伝的因子」は、一般に、ポリペプチド
をコードする領域あるいは複製、転写もしくは翻訳また
は宿主細胞におけるポリペプチドの発現に重要な他のプ
ロセスを調節する領域を含んでなるポリヌクレオチド、
あるいはポリペプチドをコードする領域、およびそれに
作動可能に連結された、発現を調節する領域の両方を含
んでなるポリヌクレオチドを意味する。遺伝的因子は、
エピソーム因子として、即ち、宿主細胞ゲノムとは物理
的に独立した分子として複製されるベクター内に取り込
まれていてもよい。それらは、真核細胞において、メト
トレキセート選択によるトランスフェクトされたＤＮＡ
の増幅の間に生じるミニ染色体のようなものの中に取り
込まれていてもよい。遺伝的因子は、宿主細胞ゲノム内
に取り込まれていてもよいが、それは天然の状態ではな
く、むしろ、単離、クローニングおよび、とりわけ精製
ＤＮＡの形態の、またはベクターでの宿主細胞への導入
などの操作の後のものである。
【００１９】「単離」とは、「人工的」にその天然状態
から変えられること、すなわち、天然物の場合、その本
来的な環境から変化または除去されること、あるいはそ
の両方を意味する。例えば、その自然状態にある生存動
物に自然に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは「単離」されていないが、その天然状態で共
存物質から分離されている同じポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書で用いる用語としての「単
離」である。ポリヌクレオチドに関しては、「単離」と
いう語は、それが天然に存在している染色体および細胞
から分離されていることを意味する。単離の際に、ある
いは単離後に、かかるポリヌクレオチドを、例えば、突
然変異を誘発し、融合タンパク質を形成するために、お
よび宿主中での増殖または発現のために、ＤＮＡなどの
他のポリヌクレオチドに結合させることができる。単独
で、またはベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合
した単離ポリヌクレオチドを、培養中または完全生物に
おける宿主細胞に導入することができる。培養中または
完全生物における宿主細胞へ導入される場合、かかるＤ
ＮＡは単離されている。というのも、それらは天然の形
態でなく、あるいは自然環境にあるものではないからで
ある。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
は、培地などの組成物、処方、ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドの、（例えば細胞への）導入のための溶
液、例えば、天然に存在しない組成物であり、その中に
本明細書で用いる場合の用語としての意味としての単離
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを保持する、化学
反応または酵素反応のための組成物または溶液中に存在
してもよい。
【００２０】「ライゲーション」とは、ほとんどの場
合、２本鎖ＤＮＡである２個またはそれ以上のポリヌク
レオチドの間でホスホジエステル結合を形成するプロセ
スをいう。ライゲーションの方法は当該分野においてよ
く知られており、ライゲーションについてのプロトコル
は標準的実験室マニュアル、および例えば、Sambrook
ら、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL，第２
版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spri
ng Harbor，New York，(1989) （以下、Sambrookらとい
う）などの文献に記載されている。「オリゴヌクレオチ
ド」とは比較的短いポリヌクレオチドをいう。しばし
ば、その用語は１本鎖デオキシリボヌクレオチドをいう
が、同様に、とりわけ、１本鎖または２本鎖リボヌクレ
オチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび２本鎖ＤＮ
Ａをいうこともできる。１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌ
クレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、自動式オリゴ
ヌクレオチド合成機の使用のごとき、化学的方法により
合成されることがよくある。しかしながら、オリゴヌク
レオチドは、インビトロ組換えＤＮＡ媒介法、細胞およ
び生物におけるＤＮＡ発現による方法を含め、他の種々
の方法により製造することができる。
【００２１】最初、化学的に合成されたＤＮＡは、典型
的には、５’リン酸を欠く状態で得られる。かかるオリ
ゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ分子を形成
するために典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用す
るライゲーション反応によるホスホジエステル結合形成
の基質ではない。かかるオリゴヌクレオチドのライゲー
ションが望ましい場合、キナーゼおよびＡＴＰを用いる
ような標準的方法によりリン酸を付加することができ
る。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの３’末端
は、一般に、遊離のヒドロキシル基を有し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼなどのリガーゼの存在下、別のオリゴヌクレオ
チドなどの、別のポリヌクレオチドの５’リン酸とホス
ホジエステル結合を容易に形成するであろう。よく知ら
れているように、要すれば、ライゲーションの前に他の
ポリヌクレオチド（複数でも可）の５’リン酸を除去す
ることによって、この反応を選択的に阻害できる。
【００２２】「プラスミド」は、宿主細胞の染色体の一
部ではなく、安定して受け継がれる遺伝的因子である。
プラスミドはＤＮＡまたはＲＮＡからなり、直鎖または
環状であってもよい。プラスミドは細胞複製の間にその
複製および安定な遺伝性を確実にする分子をコードして
おり、医学的、農学的、および環境学的に非常に重要な
産物をコードするかもしれない。例えば、プラスミドは
病原菌の毒性を非常に増加させる毒素をコードする。プ
ラスミドはまた抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を
コードすることもできる。プラスミドは、組換え遺伝子
をクローン化および発現するために用いられるベクター
として分子生物学において広く使用されている。プラス
ミドは、一般に、当業者が使いなれた標準的な命名操作
に従い、本明細書では、小文字「ｐ」を前置し、および
／またはつづいて大文字および／または数字で表す。本
明細書に開示されている出発プラスミドは、市販され、
公的に入手可能であるか、または周知の公開された方法
を慣用的に適用することにより利用可能なプラスミドか
ら構築され得る。本発明に従い使用され得る多くのプラ
スミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは、
よく知られており、当業者に容易に利用され得る。さら
に、当業者であれば、本発明での使用に適したかなり多
数の他のプラスミドでも容易に構築し得る。本発明にお
ける、かかるプラスミドならびに他のベクターの特性、
構築および用途は、当業者であれば本明細書から容易に
理解できるはずである。
【００２３】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボ
ヌクレオチドを包含し、それらは非修飾ＲＮＡもしくは
ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。す
なわち、例えば、本明細書で使用されているポリヌクレ
オチドは、とりわけ、１本および２本鎖ＤＮＡ、１本お
よび２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本または２本
鎖ＲＮＡ、および１本および２本鎖領域の混合物である
ＲＮＡ、１本鎖またはより典型的には２本鎖、または１
本および２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲ
ＮＡを含むハイブリッド分子をいう。加えて、本明細書
で使用されているポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤ
ＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる３本鎖領
域をいう。かかる領域の鎖は同じ分子または異なる分子
に由来していてもよい。これらの領域は１個またはそれ
以上の分子の全てを含み得るが、より典型的には幾つか
の分子の一領域のみを含み得る。３重らせん領域の分子
の一つは、オリゴヌクレオチドであることがしばしばで
ある。
【００２４】本明細書で使用されている、「ポリヌクレ
オチド」の語は、１個またはそれ以上の修飾塩基を含有
する上記のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。すなわち、
バックボーンが安定性またはその他の理由で修飾された
ＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書で意図するところの
「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの
普通でない塩基、またはトリチル化塩基などの修飾塩基
を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、２例しか挙げていない
が、本明細書で使用するところのポリヌクレオチドであ
る。当業者に周知の多くの有用な目的に役立つ非常に多
様な修飾がＤＮＡまたはＲＮＡに対してなされているこ
とは明らかであろう。ここで使用されているポリヌクレ
オチドの語は、ポリヌクレオチドのそうした化学的、酵
素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルス
および特に単純型および複雑型細胞を含む細胞に特有の
ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００２５】本明細書で使用されている「ポリペプチ
ド」は、下記のポリペプチド全てを包含する。ポリペプ
チドの基本的構造はよく知られており、当該分野におけ
る多数のテキストブックおよび他の刊行物に既に記載さ
れている。この語は、本明細書中、ペプチド結合により
直鎖で互いに結合された２個またはそれ以上のアミノ酸
からなるペプチドまたはタンパク質をいうものとして使
用されている。本明細書で使用されている、この語はま
た、一般に当該分野で、例えばペプチド、オリゴペプチ
ドおよびオリゴマーと称されている短鎖、および一般に
当該分野でタンパク質と称され、その多くのタイプが存
在している長鎖の両方を包含する。ポリペプチドは、２
０天然アミノ酸として一般に称される２０アミノ酸以外
のアミノ酸を含むことが多く、末端アミノ酸を含む多く
のアミノ酸は、所定のポリペプチドにおいて、自然プロ
セス、例えばプロセッシングおよび他の翻訳後修飾、ま
たは当該分野で公知の化学的修飾技術により修飾されて
いてもよい。ポリペプチドにて自然に生じる非常に多く
の一般的修飾は基本テキストおよび詳細な研究論文なら
びに多量の研究文献に詳述されており、当業者にはよく
知られている。
【００２６】本発明のポリペプチドに存在し得る既知修
飾として、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リ
ボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の
共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共
有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジ
ルイノシトールの共有結合、交差結合、閉環、ジスルフ
ィド結合形成、脱メチル化、共有交差結合の形成、シス
チンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガ
ンマ−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形
成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイ
ル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸
化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ア
ルギニル化などの、転移ＲＮＡ媒介のタンパク質へのア
ミノ酸付加およびユビキチン化が挙げられるが、これに
限定されるものではない。
【００２７】かかる修飾は、当業者に周知であり、科学
文献に非常に詳細に記載されている。数種の特に一般的
な修飾、例えば、糖鎖形成、脂質結合、硫酸化、グルタ
ミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化
およびＡＤＰ−リボシル化が、PROTEINS-STRUCTURE AND
MOLECULAR PROPERTIES、第２版、Ｔ.Ｅ.Ｃreighton，
Ｗ.Ｈ.Ｆreeman and Ｃompany、ニューヨーク（１９９
３）などの最も基本的なテキストに記載されている。こ
の題目に関して、Ｗold,Ｆ.、POSTTRANSLATIONAL COVAL
ENT MODIFICATION OF PROTEINS、「翻訳後タンパク質修
飾：展望および予想」、１−１２頁、Ｂ.Ｃ.Ｊohnson
編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（１９８
３）；Ｓeifterら、Meth.Ｅnzymol. １８２：６２６−
６４６（１９９０）およびＲattanら、Ann.N.Y.Acad.Sc
i.，６６３：４８−６２（１９９２）により提供される
ような多くの詳細な報文が入手可能である。
【００２８】ポリペプチドが必ずしも完全に線状でない
ことは当該分野にて周知である。例えば、ポリペプチド
は、ユビキチン化の結果として分枝状であってもよく、
一般に、自然プロセッシング事象および自然には起こら
ない人的操作により得られる事象を含む、翻訳後事象の
結果として、分枝の有無にかかわらず、環状であっても
よい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、非翻
訳自然プロセスおよび、同様に完全な合成方法によって
も合成され得る。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖
およびアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプ
チドのあらゆる場所で起こり得る。事実、ポリペプチド
でのアミノまたはカルボキシル基、あるいはそれら両方
の共有結合の修飾による遮断は、天然および合成ポリペ
プチドに共通しており、かかる修飾が本発明のポリペプ
チドにあってもよい。例えば、プロセッシングの前に、
エシェリキア・コリ（Ｅ.coli）で生成されたポリペプ
チドのアミノ末端残基は、ほとんど例外なく、Ｎ−ホル
ミルメチオニンである。
【００２９】ポリペプチドに起こる修飾は、ポリペプチ
ドの形成の仕方と相関関係にあることがしばしばであ
る。例えば、宿主においてクローン化遺伝子を発現させ
ることにより生成されたポリペプチドの場合、修飾の性
質および程度の大部分は、宿主細胞翻訳後修飾能力およ
びポリペプチドアミノ酸配列に存在する修飾シグナルに
より決定される。例えば、よく知られているように、糖
鎖形成は、多くの場合、細菌宿主、例えばエシェリキア
・コリでは起こらない。従って、糖鎖形成が望ましい場
合、ポリペプチドを糖鎖形成性宿主、一般に真核細胞で
発現させるべきである。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動
物と同じ翻訳後糖鎖形成を行う。この理由のため、昆虫
細胞発現系が、とりわけ、元来の糖鎖形成のパターンを
有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現するために開
発された。同様の考え方が他の修飾にも適用される。
【００３０】同じタイプの修飾が、所定のポリペプチド
のいくつかの部位にて同じまたは様々な程度にて存在し
てもよいことが理解されよう。また、所定のポリペプチ
ドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。一般に、
本明細書にて用いるような、ポリペプチドなる語は、か
かる修飾のすべて、特に、宿主細胞にてポリヌクレオチ
ドを発現させることにより合成されるポリペプチドにて
存在する修飾を包含する。ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドの「変種（複数でも可）」を、本明細書にて用
いる場合、それは、各々、対照標準のポリヌクレオチド
またはポリペプチドとは異なる、ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドをいう。この意味における変種は、下記
およびこの開示のいずれかの部分においてより詳細に記
載されている。変種は、ヌクレオチド配列にて、別の対
照標準のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドを
包含する。一般に、相違は対照と変種のヌクレオチド配
列が全体的に極めて類似し、多くの領域において同一で
あるようなものに限られる。
【００３１】下記のごとく、変種のヌクレオチド配列の
変化はサイレントであってもよい。すなわち、その変化
は、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変
えなくてもよい。変化がこの型のサイレント変化に限定
される場合、変種は対照標準と同じアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするであろう。また、下記のご
とく、変種のヌクレオチド配列における変化が、対照標
準のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変化させてもよい。かかるヌクレオチ
ドの変化は、下記のごとく、対照標準の配列によりコー
ドされるポリペプチドにてアミノ酸置換、付加、欠失、
融合および切断をもたらすかもしれない。変種はアミノ
酸配列にて、別の対照標準のポリペプチドと異なるポリ
ペプチドを包含する。一般に、相違は、対照標準と変種
の配列が全体的に極めて類似し、多くの領域において同
一であるようなものに限られる。変種および対照標準の
ポリペプチドは、アミノ酸配列にて、１個またはそれ以
上の置換、付加、欠失、融合および切断により異なって
いてもよく、それらはいずれの組み合わせにて存在して
もよい。
【００３２】本明細書にて用いる場合、「融合タンパク
質」は、２種の、しばしば、無関係の融合遺伝子または
そのフラグメントでコードされるタンパク質である。Ｅ
Ｐ-Ａ-０４６４５３３（対応カナダ国特許２０４５８６
９）は、もう一つ別のヒトタンパク質またはそれの一部
と共に免疫グロブリン分子の不変領域の種々の部分を含
んでなる融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合
タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を用い
ることが、治療および診断における使用について有利で
あり、例えば、改良された薬物動態学的性質が得られる
（例えば、ＥＰ-Ａ ０２３２２６２を参照のこと）。あ
る用途には、融合タンパク質が発現され、検出され、次
いで精製された後、Ｆｃ部分を検出できることが望まし
い。したがって、融合タンパク質の二成分を、化学的ま
たは酵素的切断しうる結合領域で連結させることが望ま
しい。これは、Ｆｃ部分が治療および診断における用途
に対する妨害物であると判明した場合、例えば、融合タ
ンパク質を免疫化のための抗原として使用すべき場合で
ある。例えば、薬物の発見において、ｓｈＩＬ５などの
ヒトタンパク質を、ｈＩＬ-５のアンタゴニストを同定
するための高処理量のスクリーニングアッセイにて用い
るためにＦｃ部分と融合させる。D.Bennettら、J.Mol.R
ecog., 8：52−58（1995）およびK.Johansonら、J.Bio
l.Chem.，270（16）：9459−9471（1995）を参照のこ
と。
【００３３】かくして、本発明はまた、ＰＰＰ１Ｒ５、
またはその部分、および、種々のサブクラスの免疫グロ
ブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖また
は軽鎖の不変領域の種々の部分を含んでなる遺伝子操作
された可溶性融合タンパク質にも関する。免疫グロブリ
ンとして好ましいのは、融合がヒンジ領域で起こる場合
の、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の不変部分であ
る。個々の具体例において、血餅形成因子Ｘａで開裂で
きる開裂配列を組み込むことによってＦｃ部分は簡単に
除去されうる。さらに、本発明は遺伝子操作によるこれ
らの融合タンパク質の製造方法、ならびに診断および治
療におけるそれらの使用に関する。本発明のさらなる態
様は、かかる融合タンパク質をコードするポリヌクレオ
チドにも関する。
【００３４】膜結合レセプターは融合タンパク質の形成
において特に有用である。かかるレセプターは、一般
に、３つの異なる構造領域：細胞外領域、トランスメン
ブラン領域および細胞質領域を有することで特徴付けら
れる。本発明は融合タンパク質の成分として１またはそ
れ以上のこれら領域を用いるものである。このような融
合タンパク質技術の例は、国際特許出願ＷＯ９４／２９
４５８およびＷＯ９４／２２９１４に見ることができ
る。「結合分子」（別に、「相互反応分子」または「レ
セプター成分因子」とも称される）は、リガンドを含
め、本発明のポリペプチドに特異的に結合または相互反
応する分子をいう。例えば、ＰＰ１は公知結合分子であ
る。かかる結合分子は本発明の一部である。結合分子は
また、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体お
よび抗体誘導試薬などの非天然物であってもよい。
【００３５】当該分野に知られているごとく、２つのポ
リペプチドの間の「類似性」は、一のポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその保存アミノ酸置換基を、別のポリ
ペプチドの配列と比較することにより決定する。さら
に、かかる配列の２本の鎖の間の対合の同一性によって
決定されるごとき、２つのポリペプチドまたは２つのポ
リヌクレオチド配列の間の配列の関連性の度合いを意味
する「同一性」も当該分野において知られている。同一
性および類似性は共に容易に計算できる（COMPUTATIONA
L MOLECULAR BIOLOGY，Lesk,A.M.編, Oxford Universit
y Press，New York（1988）；BIOCOMPUTING：INFORMATI
CS AND GENOME PROJECTS, Smith,D.W.編,Academic Pres
s, New York（1993）；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE
DATA，PART I，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編，H
umana Press, New Jersey（1994）；SEQUENCE ANALYSIS
IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje, G.,Academic Pre
ss（1987）；およびSEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribsk
ov,M.およびDevereux,J.編, M Stockton Press，New Yo
rk（1991））。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド配列の間の同一性および類似性を測定するための多
くの方法が存在する。「同一性」および「類似性」なる
用語は当業者によく知られている（Carillo,H.およびLi
pton,D.、SIAM J.Applied Math. 48：1073（1988））。
２つの配列間の同一性または類似性を決定するために通
常用いられる方法は、これに限定されないが、GUIDE TO
HUGE COMPUTERS，Martin J.Bishop編，Academic Pres
s，SanDiego（1994）およびＨ.Carilloおよび Ｄ.Lipto
n、SIAM J.Applied Math. 48：1073（1988）に開示され
ている方法を包含する。同一性を測定するための好まし
い方法は、試験する２つの配列間に最大の対合を与える
ように設計される。同一性および類似性を測定する方法
はコンピュータープログラムに書き込まれている。２つ
の配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコン
ピュータープログラムの方法は、これに限定されない
が、ＧＣＧプログラム・パッケージ（Ｊ.Devereuxら、N
ucleic Acids Research 12（1）：387（1984）、BLAS
T、FASTA（Ｓ.Ｆ.Atschulら、J.Molec.Biol.，215：403
（1990））を包含する。
【００３６】発明の詳細な記載 本発明はヒトＰＰ１結合サブユニットＰＰＰ１Ｒ５ポリ
ペプチドと推定的に同定された新規ポリペプチド、およ
び該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関す
る。この同定はＰＰＰ１Ｒ５が他のＰＰ１結合タンパク
質とアミノ酸配列相同性を有する結果としてなされたも
のである。本明細書で同定したヒトタンパク質ＰＰＰ１
Ｒ５は、ＰＰ１のラット肝臓グリコーゲン結合サブユニ
ット（ＧＬ）と最も密接に、すなわち４２％のアミノ酸
同一性により関連付けられる。ＰＰＰ１Ｒ５はヒト骨格
筋由来のＰＰ１のグリコーゲン結合サブユニットＧＭの
Ｎ−末端と２８％の同一性を有する。本発明は、特に、
前記した相同性および後記する別の特徴に基づいて、Ｐ
Ｐ１結合タンパク質の推定コーディング領域を含む完全
長のクローンであるＰＰＰ１Ｒ５に関する。ＰＰＰ１Ｒ
５は図1および２に示されるヌクレオチドおよびアミノ
酸配列（配列番号1および２）を有する。実施例１も参
照のこと。
【００３７】ＰＰＰ１Ｒ５のＧＬとの配列同一性が明ら
かに低いことおよび組織分布がより広いこと（以下の実
施例を参照のこと）は、それがＧＬのヒト相同体であり
そうもないことを示す。ＰＰＰ１Ｒ５はまた、それがＰ
Ｐ１−ＧＬ複合体の活性を調節することが知られている
ホスホリラーゼａ型と結合しない点でＧＬと異なってい
る。共同沈殿実験よりＰＰＰ１Ｒ５がＰＰ１との複合体
を形成するであろうことが判明し、ＰＰＰ１Ｒ５の配列
を調査することで該配列が、ＧＭおよびＧＬのＰＰ１へ
の結合に関与し（Ｄ.Ｆ.Johnsonら、前掲（1996））、
多くのＰＰ１結合タンパク質に共通する、ＲＶＸＦモチ
ーフ（図3の二重下線部）を有することがわかった。し
たがって、ＰＰＰ１Ｒ５は新規なＰＰ１結合タンパク質
である。
【００３８】ＰＰＰ１Ｒ５およびＧＬはホスホリラーゼ
・ホスファターゼ活性の類似する阻害作用を示す。した
がって、ＰＰ１の他の調節剤サブユニットと同様、ＰＰ
Ｐ１Ｒ５は特定の基質に対するＰＰ１の特異性を調節し
うる。肝臓を含め、多数の種々の組織におけるＰＰＰ１
Ｒ５をコードするｃＤＮＡの同定は、肝特異的であるＧ
Ｌおよび筋肉（骨格筋、横隔筋および心筋）に見られる
ＧＭと異なり、ＰＰＰ１Ｒ５は多くの組織に共通する機
能を提供する。ＰＰＰ１Ｒ５およびＧＬの凝集特性によ
り、グリコーゲンの存在下および不在下で、遠心分離に
付すとＰＰＰ１Ｒ５はペレット状になる。しかし、ＰＰ
Ｐ１Ｒ５はＧＭにあると仮定されるグリコーゲン結合部
位に相同的な領域（配列番号２のアミノ酸１７０−１８
１）を有していない［HubbardおよびCohen、前掲（199
3）］。
【００３９】興味あることには、ＰＶＸＦ ＰＰ１を有
しないＰＰＰ１Ｒ５の拡張領域が、真菌類より分泌さ
れ、でんぷんを分解する酵素、Rhizopus oryzaeグルコ
アミラーゼにて保存されている（Y.Tanakaら、Agric.Bi
ol.Chem.、50：965-969（1986））。ＰＰＰ１Ｒ５（配
列番号２のアミノ酸１５７ないし２５６）と、ＧＬ（配
列番号３）、ＧＭ（配列番号４）、Ｓ.cerevisiae ＧＡ
Ｃ１（J.M.Francoisら、EMBO J.、11：87-96（1992）、
配列番号５）およびR.oryzae グルコアミラーゼ（配列
番号６のアミノ酸３３ないし１２９）の配列を図５に示
す。R.oryzae グルコアミラーゼのアミノ酸２６−１０
９（配列番号６）は未処理でんぷんに吸着し［Tanaka、
前掲］、ＧＬ、ＧＭおよびＧＡＣ１はすべてグリコーゲ
ンに結合することがわかっているため、図5に図示され
るすべての配列の一部は炭水化物結合領域であると思わ
れる。Ｓ.cerevisiae ＧＩＰ２、その機能が不明である
ＰＰ１結合タンパク質もまた、最近に成って、この領域
の一部に配列することが明らかにされた［Ｊ.Tuら、Mol
ecular and Cellular Biology、16（8）：4199-4206（1
996）］。ＰＰＰ１Ｒ５は、肝臓および筋肉の他に、広
範囲の組織におけるグリコーゲン代謝の調節に関与して
いると思われる。しかし、ＰＰＰ１Ｒ５のホルモン調節
はＧＭおよびＧＬとは異なるにちがいない。インスリン
およびアドレナリンに応答してＧＭにてリン酸化される
セリン残基だけでなく、ホルモンによるＧＬのアロステ
リックな調節に関与しているホスホリラーゼａ型結合部
位もＰＰＰ１Ｒ５に保存されていない。ＰＰ１の他の調
節性サブユニットのように、ＰＰＰ１Ｒ５はその活性を
調節することにより特定の基質に対するＰＰ１の特異性
を増加させる。
【００４０】ポリヌクレオチド 本発明は、図１および２（配列番号１および２）の推定
アミノ酸配列を有する成熟ＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドを
コードする単離核酸（ポリヌクレオチド）が提供され
る。図１および２（配列番号１）に示すポリヌクレオチ
ド配列などの本明細書に示す情報を用いて、ヒトＰＰＰ
１Ｒ５をコードする本発明のポリヌクレオチドを標準的
クローニングおよびスクリーニング法を用いて得ること
ができる。本発明の代表例である、図１および２（配列
番号１）に示すポリヌクレオチドが、発現配列タグ（Ｅ
ＳＴ）分析を用いて、ヒト胆嚢細胞から由来のｃＤＮＡ
ライブラリーにて見つけられた（Adams,M.D.ら、Scienc
e、252：1651-1656（1991）；Adams,M.D.ら、Nature、3
55：632-634（1992）；Adams,M.D.ら、Nature、377 Sup
p：3-174（1995））。
【００４１】本発明のヒトＰＰＰ１Ｒ５は、構造的に他
のＰＰ１結合タンパク質に関連付けられる。例えば、Ｐ
ＰＰ１Ｒ５のｃＤＮＡ配列（図1および２、配列番号
１）は、翻訳がコドン番号１から開始するとした場合
に、３１７個のアミノ酸のポリペプチドをコードする読
み枠を有する。別のタンパク質配列は、開始Ｍetに応じ
て、各々、長さが３１２、２９８および２９２のアミノ
酸を産生する、アミノ酸６−３１７、２０−３１７また
は２６−３１７に及ぶ。ヒトＰＰＰ１Ｒ５のアミノ酸配
列は、同類置換を考慮にいれるとすれば、ラット肝臓Ｇ
Ｌと４２％の同一性および５１％の類似性を示す（図
３）。ＰＰＰ１Ｒ５は、ＧＭに対する類似性はさらに小
さく、ウサギおよびヒトＧＭの最初の２８５個のアミノ
酸に対して、各々、わずか２７％および２８％の同一性
を示すにすぎない。この配列は約３６kDaないし約３８
ｋDaの推定分子量を有するタンパク質をコードする。図
３および５ならびに以下の実施例１を参照のこと。
【００４２】本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの
ごときＲＮＡの形態であってもよく、あるいは、例えば
クローニングにより得られるか、または化学合成法もし
くはその組み合わせにより産生されるｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡを含め、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮ
Ａは２本鎖または１本鎖であってもよい。１本鎖ＤＮＡ
はセンス鎖としても知られているコーディング鎖であっ
てもよく、または、アンチセンス鎖とも称される非コー
ディング鎖であってもよい。成熟ポリペプチドをコード
する配列は、図１および２（配列番号１）に示すポリヌ
クレオチドのコーディング配列と同じであってもよい。
そのコーディング配列はまた、遺伝暗号の重複性（縮重
性）の結果として、図１および２（配列番号２）の成熟
ポリペプチドをもコードする、別の配列を有するポリヌ
クレオチドであってもよい。
【００４３】図１および２のポリペプチドをコードする
本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチド用のコ
ーディング配列自体；成熟ポリペプチド用のコーディン
グ配列および付加的なコーディング配列、例えば、プレ
−、プロ−またはプレプロ−タンパク質配列などのリー
ダーまたは分泌配列をコードするもの；および前記した
付加的なコーディング配列を有するか、または有するこ
となく、付加的な非コーディング配列を有する、成熟ポ
リペプチドのコーディング配列を包含するが、これに限
定されるものではない。付加的な非コーディング配列と
して、例えば、転写およびスプライシングを含め、ｍＲ
ＮＡプロセッシングにて役割を果たす、転写され、かつ
非翻訳の配列および、例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結
合および安定性のためのポリアデニル化シグナルなどの
イントロンおよび非コーディング５’および３’配列を
包含するが、これに限定されない。付加的な官能性を付
与するコーディング配列をポリペプチドに組み入れても
よい。
【００４４】本発明はまた、成熟ポリペプチドについて
のコーディング配列が、宿主細胞由来のポリペプチドの
発現および分泌を助成するポリヌクレオチド配列、例え
ば細胞由来のポリペプチドの輸送を調節するための分泌
配列として機能するリーダー配列に同じ読み枠にて融合
していてもよい、ポリヌクレオチドを包含する。リーダ
ー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、
そのリーダー配列を宿主細胞で切断し、ポリペプチドの
成熟形態を形成することができる。ポリヌクレオチドは
また、成熟タンパク質＋付加５’アミノ酸残基であるプ
ロタンパク質をコードすることもできる。プロ配列を有
する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、不活性形
態のタンパク質である。プロタンパク質が切断される
と、活性な成熟タンパク質が残る。
【００４５】かくして、例えば、ポリペプチドを、融合
ポリペプチドの精製を容易にする、ペプチドなどのマー
カー配列に融合させてもよい。本発明のこの態様のある
好ましい具体例において、マーカー配列は、ｐＱＥ−９
ベクター（Qiagen,Inc.）で供給されるタグのようなヘ
キサヒスチジンペプチドであり、細菌性宿主の場合に、
マーカーに融合した成熟ポリペプチドを精製するために
用いられる。また、例えば、Gentzら、Proc.Natl.Acad.
Sci.,USA、86：821-824（1989）に記載されているよう
に、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質を精製するのに
都合がよい。別の具体例において、特に哺乳動物細胞、
例えば、ＣＯＳ−７が用いられる場合、マーカー配列は
ヘマグルチニン（ＨＡ）タグである。そのＨＡタグはイ
ンフルエンザ・赤血球凝集素タンパク質由来のエピトー
プに対応するものである［例えば、Wilsonら、Cell 3
7：767 (1984)］。他の多くのそのようなタグが市販さ
れている。
【００４６】前記によれば、本明細書にて用いられる
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語
は、遺伝暗号の重複性により、本発明のポリペプチド、
特に、図１および２（配列番号２）に示すアミノ酸配列
を有するヒトＰＰＰ１Ｒ５をコードするいずれの配列を
も含むポリヌクレオチドを包含する。該用語はポリペプ
チドについてのコーディング配列だけならびにコーディ
ングおよび／または非コーディング配列を有するポリヌ
クレオチドを包含する。該用語はまた、コーディングお
よび／または非コーディング配列を含んでいてもよい、
付加的な領域と共に、該ポリペプチドをコードする単一
の連続領域または不連続領域（例えば、イントロンによ
り分断されている）を含むポリヌクレオチドも包含す
る。さらに本発明は、図１および２（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント、
アナログおよび誘導体をコードする、本明細書にて前記
したポリヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオチ
ドの変種は、天然の対立遺伝子変種などの、配列番号１
および２の天然に存在する変種であってもよく、あるい
は、天然に存在することが知られていない変種であって
もよい。当該分野にて知られているように、対立遺伝子
の変種は、コードされるポリペプチドの機能を実質的に
変化させない、１またはそれ以上のヌクレオチドが置
換、欠失または付加されていてもよいポリヌクレオチド
配列の別の形態である。ポリヌクレオチドの天然に存在
しない変種は、ポリヌクレオチド、細胞または生物に用
いる方法を含め、突然変異誘発法により製造してもよ
い。
【００４７】この点で変種には、ヌクレオチド置換、欠
失または付加により前記したポリヌクレオチドと異なる
変種がある。置換、欠失または付加には１個またはそれ
以上のヌクレオチドが関与しているかもしれない。変種
は、コーディング配列または非コーディング配列あるい
はそれらの両方において変化していてもよい。コーディ
ング配列の変化により、同類または非同類アミノ酸置
換、欠失または付加が生じてもよい。この点で本発明の
特に好ましい具体例には、図１および２（配列番号２）
に示すＰＰＰ１Ｒ５のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド；その変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメント、ならびにその変種、ア
ナログおよび誘導体のフラグメントがある。
【００４８】さらに、この点において、図１および２の
ＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドのアミノ酸配列を有する、Ｐ
ＰＰ１Ｒ５変種、アナログ、誘導体およびフラグメン
ト、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよび
誘導体をコードするポリヌクレオチドが特に好ましい。
かかるポリペプチドは、数個、わずかな、５ないし１
０、１ないし５、１ないし３、２、１個または０個のア
ミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、欠失また
は付加されているものを包含する。これらのうち特に好
ましいのは、ＰＰＰ１Ｒ５の特性および活性を変化させ
ないサイレント置換、付加および欠失の変種である。ま
たこの点において、同類置換が特に好ましい。置換され
ていない、図１および２のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドが最も好ましい。
【００４９】本発明のさらに好ましい具体例は、図１お
よび２に示すアミノ酸配列を有するＰＰＰ１Ｒ５ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくと
も７０％の同一性を有するポリヌクレオチド、およびか
かるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであ
る。ＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドおよびそれに相補的なポリヌクレオチドに対して
少なくとも７５％同一である領域からなるポリヌクレオ
チドが非常に好ましい。この点において、その同じポリ
ペプチドに対して少なくとも９０％同一であるポリヌク
レオチドが特に好ましく、これらのうちでも特に好まし
いのは、少なくとも９５％同一のものである。さらに
は、少なくとも９７％同一のものが非常に好ましく、少
なくとも９８−９９％同一のものがさらに好ましく、少
なくとも９９％同一のものが最も好ましい。この点にお
いて、さらに特に好ましい具体例は、図１および２のｃ
ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に
同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチ
ドをコードしているポリヌクレオチドである。
【００５０】本発明はさらに本明細書にて前記した配列
とハイブリッド形成するポリヌクレオチド、特に前記し
た配列の間に少なくとも８０％の同一性を有するポリヌ
クレオチドに関する。この点において、本発明は、特
に、ストリンジェントな条件下、本明細書にて前記した
ポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオ
チドに関する。本明細書にて用いるような、「ストリン
ジェントな条件」なる語は、ハイブリッド形成が、配列
間で少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％同
一である場合にのみ生じることを意味する。本発明のポ
リヌクレオチドアッセイに関してさらに検討するよう
に、ＰＰＰ１Ｒ５フラグメントを含め、本発明のポリヌ
クレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリ
ダイゼーションプローブとして用いて、ＰＰＰ１Ｒ５を
コードする完全長のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単
離し、ヒトＰＰＰ１Ｒ５遺伝子に対して高度の配列類似
性および／または類似する生物学的活性を有する他の遺
伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離してもよ
い。かかるプローブは、一般に、少なくとも１５個のヌ
クレオチドを有してなる。好ましくは、かかるプローブ
は少なくとも３０個のヌクレオチドを有するであろう
し、少なくとも５０個のヌクレオチドを有していてもよ
い。特に好ましいプローブは３０と５０個の範囲にある
ヌクレオチドを有する。さらに、該プローブを用いて、
完全長の転写物に対応するｃＤＮＡクローンおよびゲノ
ムクローンまたは調節およびプロモーター領域、エキソ
ンおよびイントロンを含む完全なＰＰＰ１Ｒ５遺伝子を
含有するクローンを同定することができる。
【００５１】スクリーニングの一例は、公知ＤＮＡ配列
を用いてオリゴヌクレオチド・プローブを合成すること
で、遺伝子のコーディング領域を単離することからな
る。本発明の遺伝子の配列と配列相補性を有する標識し
たオリゴヌクレオチドを用いてヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニング
し、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリ
ダイズするか決定する。好ましい具体例において、前記
したポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌク
レオチドは、図１および２（配列番号１）のｃＤＮＡに
よりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物
学的機能または活性のいずれかを保持するポリペプチド
をコードする。
【００５２】例えば、かかるポリヌクレオチドは、配列
番号１のポリヌクレオチドの、例えば、そのポリヌクレ
オチドの回収のためのプローブとして、診断用プローブ
として、またはＰＣＲプライマーとして用いることがで
きる。例えば、ＰＰＰ１Ｒ５遺伝子のコーディング領域
は、公知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニングし、オリゴ
ヌクレオチド・プローブを合成することにより単離でき
る。ついで、本発明の遺伝子の配列と配列相補性を有す
る標識化オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトｃＤＮＡ、
ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリー
ニングし、そのプローブがハイブリッド形成するライブ
ラリーのメンバーを決定する。本発明のポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドは、本明細書においてポリヌクレ
オチド・アッセイに関してさらに説明するように、ヒト
疾患に対する治療および診断の発見のための研究試薬お
よび研究材料として用いることができる。
【００５３】該ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質
に、付加的なアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸が加
わるか、成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わった
（例えば、成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有す
る場合）ポリペプチドをコードすることができる。この
ような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態へのタン
パク質のプロセッシングにおいて役割を果たし、タンパ
ク質を運ぶことを容易にし、タンパク質の半減期を長く
したり、短くしたり、あるいはアッセイまたは生産のた
めのタンパク質の操作を容易にすることができる。イン
シテューで一般的なように、該付加アミノ酸は細胞酵素
により成熟タンパク質からプロセッシングにより除かれ
る。一またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチ
ドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は該ポリペプチ
ドの不活性形でもよい。プロ配列が除かれると、そのよ
うな不活性前駆体は一般に活性化される。プロ配列の幾
らかまたは全体を、活性化の前に除去できる。一般に、
そのような前駆体はプロタンパク質と称される。
【００５４】総じて、本発明のポリヌクレオチドは成熟
タンパク質、リーダー配列の加わった成熟タンパク質
（プレタンパク質とも称される）、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有す
る成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列と、一
般に、ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセ
ッシング工程の間に除去される１またはそれ以上のプロ
配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタ
ンパク質をコードする。
【００５５】ポリペプチド 本発明は、さらに図１および２（配列番号２）の推定ア
ミノ酸配列を有するヒトＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドに関
する。本発明はまた、これらのポリペプチドの変種、ア
ナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそのフラ
グメントの変種、アナログおよび誘導体に関する。「フ
ラグメント」、「誘導体」および「アナログ」なる語
は、図１および２のポリペプチドについて言う場合、か
かるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活
性を保持している、すなわち、ＰＰＰ１Ｒ５のごとく機
能するポリペプチド、またはＰＰ１または他の結合分子
に結合する能力を保持している、ポリペプチドを意味す
る。かくして、アナログは、プロタンパク質部分の開裂
により活性化され、活性成熟ポリペプチドを産生しうる
プロタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドは、
組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリ
ペプチドであってもよい。ある種の好ましい具体例にお
いて、本発明のポリペプチドは組換えポリペプチドであ
る。
【００５６】図１および２のポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体またはアナログ、あるいは寄託ｃＤＮＡによ
りコードされるものは、（ｉ）１個またはそれ以上のア
ミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましく
は、保存アミノ酸残基）で置換されており、かかる置換
アミノ酸残基は遺伝暗号によりコードされているもので
あっても、なくてもよいもの；（ｉｉ）１個またはそれ
以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの；（ｉｉｉ）成
熟ポリペプチドが別の化合物、例えば、ポリペプチドの
半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリ
コール）と融合しているもの；または（ｉｖ）付加的な
アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているもの、例え
ば、リーダーもしくは分泌配列または成熟ポリペプチド
の精製用に利用される配列またはプロタンパク質配列で
あってもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナ
ログは、本明細書の教示から当業者に自明であると考え
られる。本発明の特に好ましい具体例には、図１および
２(配列番号２)に示すＰＰＰ１Ｒ５のアミノ酸配列を有
するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体および
フラグメント、ならびに該フラグメントの変種、アナロ
グおよび誘導体である。さらに、この点において本発明
の特に好ましい具体例は、図１および２（配列番号２）
に示されるヒトＰＰＰ１Ｒ５のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグ
メント、ならびにこの酵素の活性／機能を保持している
フラグメントの変種、アナログおよび誘導体である。
【００５７】好ましい変種には、同類アミノ酸置換によ
って対照標準から変化している変種がある。かかる置換
は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特性の別
のアミノ酸で置換したものである。同類アミノ酸置換と
して認められる典型的なものは、脂肪族アミノ酸である
Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間での相互の置
換；ヒドロキシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの相互
置換、酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミ
ド残基であるＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残
基であるＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残
基であるＰｈｅおよびＴｙｒの間の置換である。さらに
この点において特に好ましいのは、数個、わずかな、５
ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１個または
０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、
欠失または付加されている、図１および２のＰＰＰ１Ｒ
５ポリペプチドのアミノ酸配列を有する変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラグメン
トの変種、アナログおよび誘導体である。これらのうち
特に好ましいのは、ＰＰＰ１Ｒ５の性質および活性を変
化させないサイレント置換、付加および欠失である。ま
たこの点において、同類置換が特に好ましい。最も好ま
しいのは、置換されていない図１および２（配列番号
２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００５８】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、単離形態にて提供され、好ましく
は、等質性になるまで精製される。本発明のポリペプチ
ドは、配列番号２のポリペプチド（詳細には成熟ポリペ
プチド）、ならびに配列番号２のポリペプチドに対して
少なくとも約７０％の同一性を有し、より好ましくは配
列番号２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の類
似性（より好ましくは少なくとも８０％の同一性）を有
し、さらにより好ましくは配列番号２のポリペプチドに
対して少なくとも９０％の類似性（さらにより好ましく
は少なくとも９０％の同一性）を有するポリペプチドを
包含する。また、一般に、少なくとも３０個のアミノ
酸、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含有する
ポリペプチドの部分を有するそのようなポリペプチドの
部分を有する。
【００５９】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分を、ペプチド合成により対応する完全長のポリペ
プチドの製造に使用してもよい；従って、フラグメント
を完全長のポリペプチドの製造のための中間体として使
用してもよい。本発明のポリヌクレオチドのフラグメン
トまたは部分を用いて本発明の完全長のポリヌクレオチ
ドを合成してもよい。フラグメントは、「自立してい
る」、すなわち、他のアミノ酸またはポリペプチドの一
部でなく、または、それらに融合しておらず、あるい
は、かかるフラグメントが大きなポリペプチド中に含ま
れていてその一部分または領域となっていてもよい。大
きなポリペプチド中に含まれている場合、現在議論中の
フラグメントは、最も好ましくは単一の連続した領域を
形成する。しかしながら、いくつかのフラグメントが、
単一のより大きなポリペプチド中に含まれていてもよ
い。例えば、特定の好ましい具体例は、宿主中での発現
のために設計された前駆体ポリペプチド中に含まれてい
て、ＰＰＰ１Ｒ５フラグメントのアミノ末端に融合した
異種プレおよびプロ−ポリペプチド領域、および、該フ
ラグメントのカルボキシル末端に融合した付加的な領域
を有している、本発明のＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドのフ
ラグメントに関する。従って、本明細書の意図する１つ
の態様において、フラグメントは、ＰＰＰ１Ｒ５から由
来の融合ポリペプチドまたは融合タンパク質の一部また
は部分をいう。
【００６０】本発明のポリペプチドフラグメントの典型
例として、長さが約５ないし１５個、１０ないし２０
個、１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし
７５個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０な
いし１００個、７５ないし１００個、９０ないし１１５
個、１００ないし１２５個、および１１０ないし１１３
個のアミノ酸のものを挙げることができる。この意味に
おいて、「約」とは、特に列挙した範囲、ならびに数
個、わずかな、５、４、３、２、１個のアミノ酸残基の
分だけ大きいまたは小さい範囲であって、上限または下
限、あるいはそれらの両方の範囲を包含する。例えば、
この意味においては、約４０ないし９０個のアミノ酸
は、４０プラスまたはマイナス数個、わずかな、５、
４、３、２、１個のアミノ酸残基から、９０プラスまた
はマイナス数個、わずかな、５、４、３、２、１個のア
ミノ酸残基までのポリペプチドフラグメントを意味し、
すなわち、最大４０マイナス数個のアミノ酸から９０プ
ラス数個のアミノ酸、最小４０プラス数個のアミノ酸か
ら９０マイナス数個のアミノ酸の範囲である。この点に
おいて好ましくは、上限または下限、あるいはそれらの
両方の範囲において、列挙した範囲プラスまたはマイナ
ス５個程度のアミノ酸である。上限または下限、あるい
はそれらの両方の範囲において、列挙した範囲プラスま
たはマイナス３個程度のアミノ酸が特に非常に好まし
い。上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲にお
いて、列挙した範囲プラスまたはマイナス１個程度のア
ミノ酸、または列挙した範囲に付加または欠失のないも
のが特に非常に好ましい。この点において、約５ないし
１５個、１０ないし２０個、１５ないし４０個、３０な
いし５５個、４１ないし７５個、４１ないし８０個、４
１ないし９０個、５０ないし１００個、７５ないし１０
０個、９０ないし１１５個、１００ないし１２５個、お
よび１１０ないし１１３個のアミノ酸の長さのフラグメ
ントが、すべてのうちで最も好ましい。
【００６１】本発明の特に好ましい具体例には、ＰＰＰ
１Ｒ５の平滑末端の変異体がある。平滑末端の変異体
は、アミノ末端を含む連続した一連の残基（すなわち、
連続領域、一部または部分）またはカルボキシル末端を
含む連続した一連の残基の欠失、あるいは両平滑末端の
変異体のような、２つの連続した一連の残基の欠失、す
なわち、アミノ末端における欠失およびカルボキシル末
端における欠失を除く、図１および２のアミノ酸配列を
有するＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチド、またはその変種また
は誘導体を包含する。前記した範囲にある大きさのフラ
グメントもまた、平滑末端フラグメントの好ましい具体
例であり、一般にフラグメントの中でも特に好ましい。
【００６２】本発明のこの態様において、ＰＰＰ１Ｒ５
の構造的または機能的属性によって特徴づけられるフラ
グメントが好ましい。この点において本発明の好ましい
具体例は、利用できるならば、ＰＰＰ１Ｒ５のアルファ
−ヘリックスおよびアルファ−ヘリックス形成領域
（「アルファ−領域」）、ベータ−シートおよびベータ
−シート形成領域（「ベータ−領域」）、ターンおよび
ターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイ
ル形成領域（「コイル−領域」）、親水領域、疎水領
域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可動
性領域、界面形成領域および高抗原性指数領域を含んで
なるフラグメントを包含する。この点において、非常に
好ましい具体例には、前記したいくつかの特徴のよう
な、構造的特徴を組み合わせたＰＰＰ１Ｒ５の領域から
なるフラグメントがある。かかる領域はより大きなポリ
ペプチド中に含まれていてもよく、あるいは前記のごと
くそれら自体本発明の好ましいフラグメントであっても
よい。このパラグラフにて用いる「約」なる語は、一般
に、フラグメントに関して前記した意味を有することが
理解されよう。
【００６３】さらに好ましい領域はＰＰＰ１Ｒ５の活性
を媒介する領域である。この点において、類似活性また
は改善された活性または望ましくない活性の減少したも
のを含め、ＰＰＰ１Ｒ５の化学的、生物学的活性または
他の活性を有するフラグメントが最も好ましい。この点
において、ヒトＧMまたはラットＧLポリペプチドのよう
に、関連するポリペプチドの活性領域に対して配列また
は位置、あるいは両方が相同的である領域を含むフラグ
メントが非常に好ましい。この点において、特に好まし
いフラグメントには、前記した平滑末端変異体、または
該ポリペプチドの種々の領域を有するフラグメントがあ
る。本発明はまた、とりわけ、前記したフラグメントを
コードするポリヌクレオチド、該フラグメントをコード
するポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌク
レオチド、特にストリンジェントな条件下でハイブリッ
ド形成するもの、および該フラグメントをコードするポ
リヌクレオチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなど
のポリヌクレオチドに関する。これらの点において、好
ましいポリヌクレオチドは、前記のような好ましいフラ
グメントに対応するポリヌクレオチドである。
【００６４】ベクター、宿主細胞、発現 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、
本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞お
よび組換え法による本発明のポリペプチドの製造にも関
する。宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチドを取
り込ませ、本発明のポリペプチドを発現させることがで
きる。例えば、感染、トランスダクション、トランスフ
ェクション、トランスベクションおよび形質転換といっ
たよく知られた方法を用いて、ポリヌクレオチドを宿主
細胞中に導入してもよい。特記しない限り、形質転換
は、Graham,F.およびVan der Bb，A.、Virology、52：4
56−457（1973）の方法に従って行った。
【００６５】ポリヌクレオチドを単独または他のポリヌ
クレオチドと一緒に導入してもよい。他のポリヌクレオ
チドを本発明のポリヌクレオチドと別個に導入するか、
同時に導入するか、あるいは結合させて導入してもよ
い。かくして、例えば、本発明のポリヌクレオチドを、
例えば、哺乳動物細胞において同時トランスフェクショ
ンおよび選択のための標準的方法を用いて、選択可能マ
ーカーをコードするもう１つ別のポリペプチドで宿主細
胞中にトランスフェクションしてもよい。この場合、一
般に、ポリヌクレオチドは宿主細胞ゲノム中に安定に取
り込まれるであろう。
【００６６】別法として、ポリヌクレオチドを、宿主に
おける増殖用の選択可能マーカーを有するベクターに結
合させてもよい。前記した方法により、ベクター構築物
を宿主細胞中に導入してもよい。一般に、プラスミドベ
クターは、リン酸カルシウム沈殿物のごとき沈殿物中、
あるいは荷電脂質との複合体中のＤＮＡとして導入され
る。さらに、エレクトロポレーションを用いてポリヌク
レオチドを宿主に導入してもよい。ベクターがウイルス
である場合、それをインビトロでパッケージし、または
パッケージ細胞中に導入し、そのパッケージウイルスを
細胞中に形質導入してもよい。本発明のこの態様によれ
ば、ポリヌクレオチドを製造し、ポリヌクレオチドを細
胞に導入するのに適当な多種の方法は当業者によく知ら
れた、慣用的なものである。かかる方法は、詳細に、Sa
mbrookらに詳細に記載されており、これらの方法を詳述
する多くの実験室マニュアルを説明している。
【００６７】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えばプラスミドベクター、１本鎖または２本鎖のファ
ージベクター、１本鎖または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮ
Ａウイルスベクターであってもよい。かかるベクター
は、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するためのよく知
られた方法によって、ポリヌクレオチド、好ましくはＤ
ＮＡとして細胞中に導入される。ファージおよびウイル
スベクターの場合、感染およびトランスダクションにつ
いての周知方法によって、ベクターはまた、パッケージ
または封入ウイルスとして細胞中に導入されていてもよ
く、好ましくは導入されている。ウイルスベクターは複
製可能であってもよく、複製欠損であってもよい。後者
の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補的宿主細胞にお
いてのみ起こるであろう。ベクターには、ある態様にお
いて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
発現用ベクターが好ましい。一般に、かかるベクター
は、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結
された宿主中での発現に効果的なシス−作用性制御領域
を含んでなる。適当なトランス−作用性因子は、宿主に
より供給されるか、相補的ベクターにより供給される
か、または宿主中に導入した後のベクター自身によって
供給されるかである。
【００６８】この点における好ましい具体例において、
ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は
誘導可能な発現であってもよく、またはある型の細胞に
おいてのみ起こる発現であってもよく、または誘導可能
および細胞特異的の両方であってもよい。誘導可能なベ
クターの中でも、温度および栄養添加物などの操作容易
な環境因子によって発現を誘導することのできるベクタ
ーが、特に好ましい。原核細胞および真核細胞宿主にお
いて使用される構成的および誘導可能な発現ベクターを
含め、本発明のこの態様に適する種々のベクターは当業
者によく知られており、慣用的に使用されている。遺伝
子操作された宿主細胞は通常の栄養培地で培養すること
ができ、そのような培地は、とりわけプロモーターの活
性化、形質転換体の選択、または遺伝子の増幅に関し
て、適宜修飾されていてもよい。温度、ｐＨなどの、発
現のために選択される宿主細胞で予め使用された培養条
件は、一般に、本発明のポリペプチドの発現に適してお
り、それは当業者に明らかであろう。
【００６９】多種の発現ベクターを用いて、本発明のポ
リペプチドを発現させることができる。かかるベクター
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵
母エピソーム、酵母染色体因子、バキュロウイルス、パ
ポーバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデ
ノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイ
ルス、アルファーウイルスおよびレトロウイルスから由
来のベクター、およびプラスミドおよびバクテリオファ
ージ遺伝的因子から由来のベクターなどのその組み合わ
せに由来のベクター、コスミドおよびファージミドを包
含する。この点における発現のために、一般に、宿主中
でポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチドを維
持、増殖または発現するのに適したベクターを用いるこ
とができる。
【００７０】種々のよく知られた慣用的方法のいずれに
よっても、適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入すること
ができる。一般に、発現させるＤＮＡ配列を、そのＤＮ
Ａ配列および発現ベクターを１種またはそれ以上の制限
エンドヌクレアーゼで開裂させ、ついで、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて制限フラグメントを一緒に結合させる
ことにより、発現ベクターに結合させる。この目的に用
いることのできる制限的開裂およびライゲーションの操
作は当業者によく知られており、慣用的なものである。
この点における、および別法を用いて発現ベクターを構
築するための適当な操作も当業者によく知られており、
慣用的なものであり、Sambrookらに詳細に記載されてい
る。
【００７１】発現ベクター中のＤＮＡ配列を、例えば、
ｍＲＮＡ転写を指令するプロモーターを含め、適当な発
現制御配列（複数でも可）に作動可能に連結する。かか
るプロモーターの代表例は、ファージ・ラムダＰＬプロ
モーター、エシェリキア・コリのｌａｃ、ｔｒｐおよび
ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモー
ターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターを包
含するが、それらは周知プロモーターのほんの例示に過
ぎない。本発明のこの態様にて有用な多数の他のプロモ
ーターはよく知られており、本明細書の記載および実施
例で説明されるようにして当業者であれば慣用的に使用
することができる。一般に、発現構築物は、転写開始部
位および停止部位、および、転写領域に翻訳のためのリ
ボソーム結合部位を有するであろう。構築物により発現
される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳されるべ
きポリペプチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧを、およ
び終わりの部分に適宜位置する終止コドンを含むであろ
う。
【００７２】加えて、構築物は、発現を調節ならびに発
生させる制御領域を含んでいてもよい。一般に、多くの
通常なされる操作に従って、かかる領域は、転写を調節
することにより作動するであろう。例えば、とりわけ、
レプレッサー結合部位およびエンハンサーが挙げられ
る。一般に、増殖および発現のためのベクターは選択可
能なマーカーを有する。選択可能なマーカー遺伝子は形
質転換された宿主細胞を選択するための表現型特徴を提
供する。好ましいマーカーは、真核細胞を培養するため
のジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性のも
の、およびエシェリキア・コリおよび他の細菌を培養す
るためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝
子を包含するが、これに限定されるものではない。かか
るマーカーはまた、増幅に適していてもよい。また、ベ
クターがこの目的のための別のマーカーを有していても
よい。
【００７３】所望のポリペプチドの宿主中での発現に適
した種々の周知方法を用いて、本明細書にて記載した適
当なＤＮＡ配列、ならびに適当なプロモーター、および
他の適当な制御配列を含むベクターを、適当な宿主中に
導入してもよい。適当な宿主の代表例は、エシェリキア
・コリ、ストレプトマイセス（Streptomyces）およびサ
ルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）
細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ドロソ
フィラ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ（Spodop
tera）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよ
びボウエス（Bowes）メラノーマ細胞などの動物細胞を
包含する。多種の発現構築物の宿主が周知であり、当業
者は本開示により本発明のこの態様に従ってポリペプチ
ドの発現のための宿主を容易に選択することができる。
より詳細には、本発明はまた、発現構築物などの組換え
構築物であって、１種またはそれ以上の前記した配列を
含んでなる組換え構築物を包含する。構築物は、本発明
のかかる配列がその中に挿入されたプラスミドまたはウ
イルスベクターなどのベクターからなる。配列は順方向
または逆方向に挿入することができる。この点におい
て、ある種の好ましい具体例において、構築物はさら
に、例えば、該配列に作動可能に連結されたプロモータ
ーを含め、調節配列を含んでなる。多数の適当なベクタ
ーおよびプロモーターが当業者に知られており、本発明
の使用に適した多数の市販のベクターがある。
【００７４】市販されている以下のベクターを例示とし
て提供する。細菌に使用するのに好ましいベクターに
は、Qiagenから市販されている、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９；Stratageneから市販されている、
ｐＢＳベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベ
クター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐ
ＮＨ４６Ａ；ならびに、Pharmaciaから市販されてい
る、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３
−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５がある。好ましい真核
細胞ベクターには、Stratageneから市販のｐＷＬＮＥ
Ｏ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳ
Ｇ；ならびに、Pharmaciaから市販のｐＳＶＫ３、ｐＢ
ＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。これらのベクタ
ーは、多くの市販されている、および、本発明のこの態
様により使用するために当業者によく知られたベクター
を例示するためにのみ列挙する。例えば、宿主中におけ
る本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導
入、維持、増殖または発現に適する他のプラスミドまた
はベクターを本発明のこの態様に使用してもよいことが
理解されよう。
【００７５】プロモーター領域は、制限部位、または、
候補プロモーターフラグメント；すなわち、プロモータ
ーを含んでいるかもしれないフラグメントを導入するた
めの部位の下流の、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットのごとき、
プロモーター領域を欠くレポーター転写ユニットを含む
ベクターを用いて、所望の遺伝子から選択することがで
きる。周知のように、プロモーター含有フラグメントを
ベクター中にＣＡＴ遺伝子の上流の制限部位で導入する
ことにより、ＣＡＴ活性を生じさせ、それを標準的ＣＡ
Ｔアッセイにより検出することができる。この目的に適
するベクターはよく知られており、容易に入手できる。
かかるベクターとして、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ
７の２種類が挙げられる。かくして、本発明のポリヌク
レオチドの発現用のプロモーターはよく知られていて容
易に入手できるプロモーターだけでなく、レポーター遺
伝子を用いて上記方法により容易に得ることのできるプ
ロモーターも包含する。
【００７６】本発明に係るポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現に適した既知細菌プロモーターには、エ
シェリキア・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモータ
ー、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモータ
ー、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモ
ーターがある。この点において適当な既知の真核細胞プ
ロモーターには、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、Ｒｏｕｓサルコーマウイルス（「ＲＳ
Ｖ」）のごときレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、
ならびにマウス・メタロチオネイン−Ｉプロモーターな
どのメタロチオネインプロモーターがある。宿主細胞中
での発現に適するベクターおよびプロモーターの選択は
周知操作であり、発現ベクターの構築、宿主中へのベク
ターの導入および宿主における発現のための必須方法
は、当業者にとって日常的なものである。
【００７７】本発明は、前記の構築物を含む宿主細胞に
も関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のごとき高等真核
細胞、酵母細胞のごとき下等真核細胞、または細菌細胞
のごとき原核細胞であってもよい。構築物の宿主細胞へ
の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、Ｄ
ＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェク
ション、陽イオン性脂質により媒介されるトランスフェ
クション、エレクトロポレーション、形質導入、感染ま
たは他の方法により、行うことができる。かかる方法
は、Davisら、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、
(1986)などの多くの標準的実験室マニュアルに記載され
ている。
【００７８】宿主中の構築物を常法で使用して、組換え
配列によりコードされた遺伝子産物を製造することがで
きる。別法として、慣用的ペプチド合成装置により本発
明ポリペプチドを合成的に製造することもできる。成熟
タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物
細胞、酵母、細菌または他の細胞中で発現させることが
できる。さらに、無細胞翻訳系を利用して、本発明のＤ
ＮＡ構築物から由来のＲＮＡを用いて、かかるタンパク
質を製造することもできる。原核宿主および真核宿主と
ともに使用に適するクローニングおよび発現ベクター
は、Sambrookらにより記載されている。一般に、組換え
発現ベクターは、複製開始点、下流の構造配列の転写を
指令する高発現遺伝子由来のプロモーター、およびベク
ターに曝露した後のベクター含有細胞の単離を可能にす
る選択可能マーカーを含む。適当なプロモーターには、
とりわけ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（「ＰＧ
Ｋ」）などの糖分解酵素、ａ−ファクター、酸ホスファ
ターゼ、および熱ショックタンパク質をコードする遺伝
子由来のプロモーターがある。選択可能マーカーは、エ
シェリキア・コリのアンピシリン耐性遺伝子およびエス
・セレビシエ（S.cerevisiae）のｔｒｐ１遺伝子を包含
する。
【００７９】高等真核生物により本発明のポリペプチド
をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベク
ター中に挿入することにより増大させることができる。
エンハンサーは、通常、約１０ないし３００ｂｐのＤＮ
Ａのシス−作用性エレメントであり、所定の宿主細胞型
中でのプロモーターの転写活性を増大させるように作用
する。エンハンサーの例は、複製開始点の後期側１００
ないし２７０ｂｐに位置するＳＶ４０エンハンサー、サ
イトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複
製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、なら
びにアデノウイルスエンハンサーを包含する。
【００８０】一般に、本発明のポリペプチドの異種構造
配列をコードする本発明のポリヌクレオチドを、発現用
プロモーターに作動可能に連結されるように標準的方法
を用いてベクター中に挿入する。転写開始部位がリボソ
ーム結合部位に対して５’付近に位置するようにポリヌ
クレオチドを配置する。リボソーム結合部位は、発現さ
れるポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５’
にある。一般に、通常、ＡＵＧである開始コドンから始
まり、リボソーム結合部位と開始コドンの間に位置する
他のオープン・リーディング・フレームはないであろ
う。また、一般に、ポリペプチド末端に翻訳終止コドン
が存在し、転写される領域の３’末端に適宜散在するポ
リアデニル化シグナルおよび転写終止シグナルが存在す
るであろう。適当な分泌シグナルを、小胞体ルーメン、
周辺腔または細胞外環境中への翻訳タンパク質の分泌の
ために、発現されるポリペプチド中に組み込ませてもよ
い。シグナルは、ポリペプチドに対して内在性のもので
あってもよく、あるいは異種的であってもよい。
【００８１】ポリペプチドは、融合タンパク質のごとき
修飾形態で発現させることができ、分泌シグナルのみな
らず付加的な異種機能領域を含んでいてもよい。かくし
て、例えば、付加的アミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸
の領域をポリペプチドのＮ−末端に付加して、宿主細胞
における精製またはその後の取り扱いおよび保存の間の
安定性および維持性を改善してもよい。また、一の領域
をポリペプチドに付加し、精製を容易にしてもよい。か
かる領域は、最終的なポリペプチドの調製の前に除去す
ることができる。ペプチド部分をポリペプチドに付加
し、とりわけ、分泌または外分泌を引き起こし、安定性
を改善し、精製を容易にすることは、当業者によく知ら
れている日常的方法である。本発明に係るポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの増殖、維持または発現に適し
た原核宿主は、エシェリキア・コリ（Escherichia col
i）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）および
サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimuriu
m）を包含する。シュードモナス（Pseudomonas）、スト
レプトマイセス（Streptomyces）およびスタフィロコッ
カス（Staphylococcus）の様々な種もまた、この点にお
いて適当な宿主である。さらに、この点において、当業
者に知られている他の多くの宿主も使用可能である。
【００８２】限定するものではないが、一の代表例とし
て、細菌についての有用な発現ベクターは、選択可能な
マーカーと、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２
（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的エレメントを有してな
る市販プラスミドから由来の細菌の複製開始点とからな
り得る。かかる市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３
−３（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,Sweden）お
よびＧＥＭ１（Promega Biotec, Madison,WI,USA）を包
含する。これらベクターにおいて、ｐＢＲ３２２「骨
格」部分を適当なプロモーターおよび発現すべき構造配
列と組み合わせる。適当な宿主株を形質転換した後、そ
の宿主株を適当な細胞密度まで増殖させる。選択したプ
ロモーターが誘導可能である場合には、適当な手段（例
えば、温度シフトまたは化学誘導剤に曝露）によりそれ
を誘導し、細胞をさらなる期間培養する。次いで、典型
的には、細胞を遠心分離により集め、物理的または化学
的手段により破壊し、得られた粗抽出物をさらに精製に
供する。
【００８３】凍結−融解のサイクリング、超音波処理、
機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、慣用的方
法により、タンパク質発現に使用する微生物細胞を破壊
することができる。かかる方法は当業者によく知られて
いる。同様に、種々の哺乳動物細胞培養系を発現に使用
することができる。哺乳動物発現系の例は、Ｃ１２７、
３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨ
Ｋ細胞系ならびにGluzmanら、Cell，23：175（1981）に
記載されたサル・腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７細胞系を
包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当
なプロモーターおよびエンハンサー、および必要なリボ
ソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナ
ーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および発現
に必要とされる５’隣接非転写配列からなるであろう。
好ましい具体例において、ＳＶ４０スプライス部位およ
びＳＶ４０ポリアデニル化部位から由来のＤＮＡ配列
が、必須の非転写遺伝的エレメントとして用いられる。
【００８４】ＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドは、硫酸アンモ
ニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは
陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースク
ロマトグラフィー、疎水相互反応クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパ
タイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラ
フィーを含むよく知られた方法により、組換え細胞培養
物から回収し、精製することができる。最も好ましく
は、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を
精製に用いる。単離または精製の間にポリペプチドが変
性する場合、タンパク質の再生するためのよく知られた
方法を用いて活性コンフォメーションを再生することが
できる。本発明のポリペプチドは、自然に精製されるポ
リペプチド、化学合成法による産生されるポリペプチ
ド、および例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および
哺乳動物細胞を含め、原核細胞または真核細胞宿主から
組換え技術により得られるポリペプチドを包含する。組
換え体産生法に用いる宿主によっては、本発明のポリペ
プチドは糖鎖形成されていても、糖鎖形成されていなく
てもよい。加えて、本発明のポリペプチドは、ある場合
には、宿主が介在する工程の結果として、最初の修飾さ
れたメチオニン残基を含みうる。ＰＰＰ１Ｒ５ポリヌク
レオチドおよびポリペプチドを、本発明に従って、種々
の用途、特にＰＰＰ１Ｒ５の化学的および生物学的特性
を用いる用途に使用することができる。さらなる用途
は、細胞、組織および器官の障害の診断および治療に関
する。本発明のこれらの態様を以下の議論によってさら
に説明する。
【００８５】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断試薬として用いるための相補
的ポリヌクレオチドの検出のためのＰＰＰ１Ｒ５ポリヌ
クレオチドの使用に関する。機能不全に伴う変異形のＰ
ＰＰ１Ｒ５をコードする遺伝子の検出は、ＰＰＰ１Ｒ５
の過小発現、過剰発現または発現の変化から生じる疾患
の診断、または疾患に対する感受性に付加および定義す
ることができる診断用装置を提供することである。かか
る疾患は、例えば、グリコーゲン合成におけるインスリ
ンの作用に対する耐性に関与する疾患を包含する。かか
る障害は、限定されるものではないが、とりわけ、真性
糖尿病、肥満症、本態性高血圧、異脂血症および早発性
アテローム性動脈硬化症を包含する。
【００８６】ヒトＰＰＰ１Ｒ５遺伝子に変異を有する個
体は、種々の方法により、ＤＮＡレベルで検出すること
ができる。診断のための核酸を、血液、尿、唾液、生検
および剖検材料などの患者の細胞から得てもよい。ゲノ
ムＤＮＡを検出用に直接使用してもよく、または分析前
にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより
酵素的に増幅してもよい（Saikiら、Nature，324：163
−166（1986））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同じように
使用してもよい。一例として、ＰＰＰ１Ｒ５をコードす
る核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ＰＰＰ１
Ｒ５の発現および変異を同定および分析することができ
る。例えば、正常な遺伝子型との比較にて増幅産物の大
きさが変化することにより、欠失および挿入を検出する
ことができる。増幅したＤＮＡを放射性標識したＰＰＰ
１Ｒ５ ＲＮＡまたは放射性標識したＰＰＰ１Ｒ５アン
チセンスＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションさせるこ
とにより、点突然変異を同定することができる。好まし
くは、ＲＮａｓｅ Ａ消化または融点温度の相違によ
り、対合した配列と誤対合の２本鎖を識別することがで
きる。
【００８７】直接的ＤＮＡ配列決定により、対照標準の
遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明ら
かとなりうる。加えて、クローン化されたＤＮＡセグメ
ントをプローブとして用い、特定のＤＮＡセグメントを
検出してもよい。ＰＣＲまたは他の増幅方法を適宜用い
ることにより、かかる方法の感度を非常に向上させるこ
とができる。例えば、配列決定用プライマーを、２本鎖
ＰＣＲ産物またはＰＣＲ変法により得られた１本鎖鋳型
分子とともに使用する。放射性標識されたヌクレオチド
を用いる慣用的操作により、または蛍光タグを用いる自
動式配列決定法により配列決定を行う。変性剤と共にま
たは無しで、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度
の変化を検出することにより、ＤＮＡ配列の相違に基づ
く遺伝的試験を行うことができる。高分解能ゲル電気泳
動により、小規模な配列の欠失および挿入を可視化する
ことができる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、そ
の特異的融点または部分的融解温度によって、異なるＤ
ＮＡフラグメントの移動がゲル中の異なる位置で遅延す
る、変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別することができ
る（例えば、Myersら、Science，230：1242（1985）を
参照のこと）。
【００８８】特定位置での配列の変化はまた、ＲＮase
およびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイまたは
化学的開裂法により明らかとなる（例えば、Cottonら、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：4397−4401（1985））。
かくして、ハイブリダイゼーション、ＲＮase保護、化
学的開裂、直接的ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用
（例えば、制限フラグメント長多型性（「ＲＦＬ
Ｐ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングな
どの方法により、特定のＤＮＡ配列の検出を行うことが
できる。本発明は、限定するものではないが、グリコー
ゲン合成におけるインスリンの作用に対する耐性に関与
する疾患を含め、ＰＰＰ１Ｒ５関連機能障害または疾患
の罹病性を診断または測定する方法を提供する。かかる
障害は、限定されるものではないが、とりわけ、真性糖
尿病、肥満症、本態性高血圧、異脂血症および早発性ア
テローム性動脈硬化症を包含する。ＰＰＰ１Ｒ５遺伝子
の変異はそのような機能障害または疾患に対する罹病性
を意味し、前記した核酸配列をかかる罹病性を確認する
ためのアッセイにて用いることができる。したがって、
例えば、該アッセイを用いて、前記したヒトＰＰＰ１Ｒ
５遺伝子の変異、例えば、置換、欠失、切断、挿入、フ
レームシフトなどを測定することができ、そのような変
異は前記した機能障害または疾患の罹病性を示すことと
なる。
【００８９】本発明は、前記したＰＰＰ１Ｒ５関連疾患
の診断法であって、患者から由来の試料より、図1およ
び２(配列番号１)の配列を有するポリヌクレオチドの異
常に減少または増加した発現レベルを測定することから
なる方法を提供するものである。ポリヌクレオチドの発
現の減少または増加は、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣ
Ｒ、ＲＮase保護、ノザンブロッティングおよび他のハ
イブリダイゼーション法などのポリヌクレオチド定量の
ための当該分野でよく知られた方法を用いて測定でき
る。より慣用的なゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定
法に加えて、突然変異をインシテュ分析により検出する
こともできる。
【００９０】染色体アッセイ 本発明の配列はまた、染色体同定についても価値があ
る。該配列を特異的に標的とし、個々のヒト染色体上の
特定の位置でハイブリダイゼーションさせることができ
る。さらには、染色体上の特定の部位を同定することに
対する要求がある。染色体位置をマーキングするため
の、実際の配列データ（反復多型性）に基づいた染色体
マーキング試薬は、現在ほとんど手に入らない。本発明
によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、その配列を疾
患に関係した遺伝子と相関付ける重要な第一工程であ
る。簡単には、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好まし
くは１５−３０ｂｐ）を調製することによって、配列を
染色体に対してマッピングできる。一つ以上のエクソン
に広がるプライマーは増幅工程を混乱させ得るため、
３’非翻訳領域のコンピューター解析を用いて、ゲノム
ＤＮＡ中に一つ以上のエクソンが広がっていないプライ
マーを迅速に選択する。ついで、これらのプライマーを
個々のヒト染色体を含有する体細胞雑種のＰＣＲスクリ
ーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子
を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを有するで
あろう。
【００９１】体細胞雑種のＰＣＲマッピングは、個々の
ＤＮＡを個々の染色体に帰属させるための迅速な方法で
ある。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーに用
いると、サブローカリゼーションは特定の染色体からの
フラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプ
ールで同様の方法にて達成することができる。同様に、
染色体への地図作成に用いることができる他のマッピン
グ法は、in situハイブリダイゼーション、標識された
フロー−ソーティド（flow-sorted）染色体でのプレス
クリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリ
ーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ
選択を包含する。ｃＤＮＡクローンを中期染色体スプレ
ッドに対して蛍光in situハイブリダイゼーション（Ｆ
ＩＳＨ）に付し、正確な染色体位置を１工程で知ること
ができる。この方法は、５０ないし６０塩基の短いｃＤ
ＮＡを用いることができる。この方法の報文として、Ve
rmaら、HUMAN CHROMOSOMES：A MANUAL OF BASIC TECHNI
QUES，Pergamon press，New York （1988）を参照のこ
と。
【００９２】この方法をいかにして行うのかという一例
として、ＰＰＰ１Ｒ５ ＤＮＡを消化し、QIAEX II ＤＮ
Ａ精製キット（Qiagen，Inc.，Chatsworth，ＣＡ）を用
いて精製し、Super Cos１ コスミドベクター（Stratage
ne，La Jolla，ＣＡ）に連結する。Qiagen Plasmid Pur
ification Kit（Qiagen，Inc，Chatsworth，ＣＡ）を用
いてＤＮＡを精製し、BioNick Labeling Kit（GibcoBR
L，Life Technologies Inc.，Gaithersburg，ＭＤ）を
用いてビオチン−ｄＡＴＰの存在下でニックトランスレ
ーションにより１ｍｇを標識する。GENE-TECT Detectio
n System（Clontech Laboratories，Inc. Palo Alto，
ＣＡ）を用いてビオチン化を検出する。ONCOR Light Hy
bridization Kit（Oncor，Gaithersburg，ＭＤ）を用い
てin situハイブリダイゼーションをスライド上で行っ
て、中期染色体上の単一コピー配列を検出する。２０％
ＦＣＳ、３％ ＰＨＡおよびペニシリン／ストレプトマ
イシンを補足したＲＰＭＩ １６４０中で正常ドナーの
末梢血を３日間培養し、１０- 7Ｍメトトレキセートで１
７時間同調させ、補足物不含ＲＰＭＩで２回洗浄する。
細胞を１０-3Ｍチミジンとともに７時間インキュベーシ
ョンする。コルセミド（０.５μｇ／ｍｌ）とともに２
０分のインキュベーション後、細胞を中期で捕捉し、つ
づいて７５ｍＭ ＫＣｌ中３７℃で１５分間、低張溶解
を行う。ついで、細胞ペレットを遠心分離し、Carnoy’
sの固定液（メタノール：酢酸（３：１））中で固定す
る。
【００９３】１滴の懸濁液をスライドに添加し、その懸
濁液を風乾することにより中期スプレッドを調製する。
ブロッキング・ヒト・胎盤ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）を含
む１０ｍｌのハイブリダイゼーション混合物（５０％ホ
ルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％デキストラン硫酸）に懸
濁させた１００ｎｇのプローブを添加することによりハ
イブリダイゼーションを行う。プローブ混合物を７０℃
の水浴で１０分間変性させ、３７℃で１時間インキュベ
ーションし、予備加温した（３７℃）スライド上に置
く。それは予め７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ中７０
℃で変性させ、エタノール種で脱水し、４℃に冷却して
おいたものである。スライドを加湿チャンバ中３７℃で
１６時間インキュベーションする。スライドを５０％ホ
ルムアミド／２ＸＳＳＣで１０分間４１℃で洗浄し、２
ＸＳＳＣで３７℃で７分間洗浄する。製造者のプロトコ
ルに従って、スライドをＦＩＴＣ−アビジン（Oncor，G
aithersburg，ＭＤ）とともにインキュベーションする
ことによりハイブリダイゼーションプローブを検出す
る。マウンティング培地に懸濁させたヨウ化プロプリデ
ィウムで染色体を対比染色する。スライドをLeitz ORTH
OPLAN ２−エピ蛍光顕微鏡を用いて可視化し、Imagenet
ics ComputerおよびMacIntoshプリンターを用いて５つ
のコンピューター映像を得る。
【００９４】配列が正確な染色体位置にマッピングされ
ると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデ
ータと相関させることができる。かかるデータは、例え
ば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（Joh
ns Hopkins University Welch Medical Libraryからオ
ンラインで利用可能）に見られる。ついで、同じ染色体
領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関連を連関分
析（物理的に近接した遺伝子の同時遺伝）を介して同定
する。感染した個体と感染していない個体間のｃＤＮＡ
またはゲノム配列の相違を決定することが必要である。
感染した個体の一部または全部において変異が観察され
るが、正常な個体においては変異が観察されない場合に
は、その変異がその疾患の病因である可能性がある。
【００９５】現在の物理的マッピングおよび遺伝学的マ
ッピング法の分解では、疾患に関連した染色体領域と正
確に位置決めされるｃＤＮＡは、１メガ塩基のマッピン
グ分解および２０ｋｂ当たり１遺伝子と仮定して５０な
いし５００個の潜在的病因遺伝子のうちの１つとするこ
とができる。実施例１に記載の、染色体を位置決定する
別法は、最新のｃＤＮＡをＥＳＴデータベースから由来
のｃＤＮＡのアセンブリーと重複させることからなる。
この方法により、完全なｃＤＮＡが公知ＰＣＲプライマ
ー対に対合することがわかる。３’配列で染色体１０ｑ
２３−２４に局在化されている部位配列をタグ化した２
つの配列（ＳＴＳアイデンティファイアー配列：ＷＩ−
１１１２９およびＴＩＧＲ−Ａ００４Ｓ４７）が重複し
た。
【００９６】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、細胞および組織中のＰＰＰ１Ｒ５タンパ
ク質レベルを検出するための診断アッセイに関する。か
かるアッセイは定量的または定性的であってもよい。か
くして、例えば、正常対照組織試料と比較してＰＰＰ１
Ｒ５タンパク質の過剰発現を検出するための本発明の診
断アッセイを用いて、前記したような疾患／障害の存在
を検出することができる。宿主由来の試料中の本発明の
ＰＰＰ１Ｒ５タンパク質のごときタンパク質のレベルを
決定するのに用いることのできるアッセイ法は当業者に
よく知られている。かかるアッセイ法は、ラジオイムノ
アッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析
およびＥＬＩＳＡを包含する。これらのうち、ＥＬＩＳ
Ａが好ましいことが多い。ＥＬＩＳＡアッセイは、最初
にＰＰＰ１Ｒ５に特異的な抗体、好ましくはモノクロー
ナル抗体を調製することからなる。加えて、一般に、モ
ノクローナル抗体に結合するレポーター抗体を調製す
る。レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光試薬または酵
素試薬のごとき検出可能試薬に結合する。本明細書の実
施例では、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ酵素
に結合している。
【００９７】ＥＬＩＳＡを行うために、試料を宿主から
取り出し、試料中のタンパク質に結合する固体支持体、
例えば、ポリスチレン皿上でインキュベーションする。
ついで、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質
とともにインキュベーションすることにより、皿上の遊
離タンパク質結合部位を被覆する。ついで、モノクロー
ナル抗体を皿中でインキュベーションし、その間にモノ
クローナル抗体は、ポリスチレン皿に結合しているＰＰ
Ｐ１Ｒ５タンパク質に結合する。未結合モノクローナル
抗体をバッファーで洗い流す。ホースラディッシュ・ペ
ルオキシダーゼに連結したレポーター抗体を皿中に入
れ、レポーター抗体とＰＰＰ１Ｒ５に結合しているモノ
クローナル抗体との結合を生じさせる。ついで、未結合
レポーター抗体を洗い流す。ついで、発色基質を含め、
ペルオキシダーゼ活性のための試薬を皿に添加する。１
次抗体および２次抗体を介してＰＰＰ１Ｒ５に結合し、
固定されているペルオキシダーゼは、着色反応生成物を
生成する。所定の時間に発色した量は試料中のＰＰＰ１
Ｒ５タンパク質量を示す。典型的には、標準曲線と比較
することにより定量的結果が得られる。
【００９８】競合アッセイはまた、固体支持体に結合す
るＰＰＰ１Ｒ５に特異的な抗体、標識したＰＰＰ１Ｒ５
および宿主由来の試料を、固体支持体上を通すことで用
いられる。固体支持体に結合した標識の検出量を試料中
のＰＰＰ１Ｒ５量と相関させることができる。種々の変
法を用いて酵素アッセイをフォーマットすることができ
る。かかるアッセイは、ＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドと、
またはＰＰ１と相互反応することでその反応系を阻害し
うる、不明な化合物をその系に挿入するものである。フ
ォーマットの選択はその罹病性およびアッセイの目的：
酵素レベルを定量するように、または速度研究における
阻害速度を測定するように設計するかに依存する。フォ
ーマットにかかわらず、かかる酵素アッセイは自動化お
よび高処理スクリーニングの点で有利である。
【００９９】抗体 ポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、ま
たはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞を、そ
れらに対する抗体を製造するための免疫原として使用す
ることができる。これらの抗体は、例えば、ポリクロー
ナルまたはモノクローナル抗体であってよい。本発明
は、キメラ、単鎖およびヒト化抗体ならびにＦａｂフラ
グメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの生成物も包
含する。当該分野で知られた種々の操作をかかる抗体お
よびフラグメントの製造に用いてもよい。本発明の配列
に対応するポリペプチドに拮抗して生成される抗体は、
ポリペプチドを動物に直接注射することにより、あるい
はポリペプチドを動物、好ましくはヒト以外の動物に投
与することにより得ることができる。そのようにして得
られた抗体はポリペプチド自体と結合する。このよう
に、ポリペプチドのフラグメントだけをコードする配列
であっても、完全に無傷のポリペプチドに結合する抗体
を得るのに用いることができる。ついで、かかる抗体を
用いて、ポリペプチドを発現する組織からそのポリペプ
チドを単離することができる。
【０１００】モノクローナル抗体を調製する場合、連続
細胞培養系により産生される抗体を提供するいずれの方
法も用いることができる。例えば、ハイブリドーマ法
（Kohler,G.およびMilstein,C.、Nature，256：495-497
（1975））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドー
マ法（Kozborら、Immunology Today，4：72（1983））
およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、MONOCLONAL
ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY，７７-９６頁、Alan
R.Liss,Inc,（1985））が挙げられる。さらに、単鎖抗
体の製造について記載されている方法（米国特許第４,
９４６,７７８号）を用いて、本発明の免疫原性ポリペ
プチド生成物に対する単鎖抗体を製造することができ
る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳
動物を含む他の生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペ
プチド産物に対するヒト化抗体を発現させてもよい。
【０１０１】アフィニティークロマトグラフィーにより
単離および／または精製する場合、前記した抗体を用い
て、ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定
してもよく、あるいは抗体を固体支持体に結合させるこ
とにより本発明のポリペプチドを精製してもよい。ま
た、ＰＰＰ１Ｒ５に対する抗体を用いて、前記した障害
などのグリコーゲン合成におけるインスリンの作用に対
する耐性に関与する機能障害または疾患を阻害すること
ができる。
【０１０２】ＰＰＰ１Ｒ５結合分子およびアッセイ ＰＰＰ１Ｒ５をこれに相互反応するタンパク質を単離す
るために使用することができる；この相互反応は阻害の
ための標的となり得る。ＰＰＰ１Ｒ５とＰＰ１または他
の因子の間のタンパク質−タンパク質相互反応の阻害剤
は、ＰＰＰ１Ｒ５活性の調節のための医薬品の開発に用
いることができる。かくして、本発明は、ＰＰ１に加え
て、ＰＰＰ１Ｒ５に結合する分子の同定方法も提供す
る。分子をＰＰＰ１Ｒ５に結合させるタンパク質をコー
ドする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例え
ば、リガンドパニング（panning）およびＦＡＣＳソー
ティングにより、同定することができる。かかる方法は
多くの実験室用マニュアル、例えば、Coliganら、CURRE
NT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY １，第５章（１９９１）
に記載されている。
【０１０３】例えば、酵母２ハイブリッドシステムが、
転写活性化因子の活性を復元するのに用いる、インビボ
での第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との
間の相互反応を検出するための方法を提供する。この方
法は、米国特許第５,２８３,１７３号に開示されてお
り；試薬はClontechおよびStratageneから市販されてい
る。簡単には、ＰＰＰ１Ｒ５ ｃＤＮＡをＧａｌ４転写
因子ＤＮＡ結合領域に融合させ、酵母細胞中で発現させ
る。問題の細胞から得られたｃＤＮＡライブラリーメン
バーをＧａｌ４のトランス活性化領域に融合させる。Ｐ
ＰＰ１Ｒ５と相互反応可能なタンパク質を発現するｃＤ
ＮＡクローンは、Ｇａｌ４活性の復元およびＧａｌ４−
ｌａｃＺなどのレポーター遺伝子の発現のトランス活性
化をもたらす。
【０１０４】別法は、組換えＰＰＰ１Ｒ５を用いてλgt
１１、λＺＡＰ（Stratagene）または同等のｃＤＮＡ発
現ライブラリーをスクリーニングすることからなる。組
換えＰＰＰ１Ｒ５タンパク質またはそのフラグメントを
ＦＬＡＧ、ＨＳＶまたはＧＳＴなどの小さなペプチドタ
グに融合させる。ペプチドタグは心筋クレアチンキナー
ゼなどのキナーゼについての都合のよいリン酸化部位を
有しており、あるいはそれらをビオチン化できる。組換
えＰＰＰ１Ｒ５を32［Ｐ］または標識されていないＰを
用いてリン酸化し、ストレプトアビジンまたはそのタグ
に対する抗体で検出することができる。λgt１１ｃＤＮ
Ａ発現ライブラリーを問題の細胞から作成し、組換えＰ
ＰＰ１Ｒ５とともにインキュベートし、洗浄し、次い
で、ＰＰＰ１Ｒ５と相互反応するｃＤＮＡクローンを単
離する。かかる方法は当業者に慣用的なものである。例
えば、Sambrookらを参照のこと。
【０１０５】もう一つの方法は、哺乳動物発現ライブラ
リーをスクリーニングすることである。この方法におい
ては、ｃＤＮＡを哺乳動物プロモーターとポリアデニル
化部位の間のベクターにクローンし、ＣＯＳまたは２９
３細胞にて一時的にトランスフェクションされる。４８
時間後、結合タンパク質を、固定かつ洗浄した細胞を標
識したＰＰＰ１Ｒ５と一緒にインキュベーションするこ
とで検出する。好ましい具体例においては、ＰＰＰ１Ｒ
５をヨウ素化し、結合ＰＰＰ１Ｒ５の検出をオートラジ
オグラフィーを介して検出する。Simsら、Science，24
1：585-589（1988）およびMcMahanら、EMBO J.，10：28
21-2832（1991）を参照のこと。このように、問題の結
合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むｃＤＮＡプー
ルを選択し、各プールをさらに分割し、つづいて一時的
なトランスフェクション、結合およびオートラジオグラ
フィーのサイクルにより問題のｃＤＮＡを単離すること
ができる。結合タンパク質が分泌される場合、結合また
は中和アッセイが一時的にトランスフェクションされた
細胞からの上清をアッセイするために確立されると、類
似するプール方法によりそのｃＤＮＡを得ることができ
る。上清をスクリーニングする一般的方法は、Wongら、
Science，228：810-815（1985）に開示されている。
【０１０６】もう一つの別法は、細胞からのＰＰＰ１Ｒ
５と直接相互反応するタンパク質を単離することであ
る。ＰＰＰ１Ｒ５のＧＳＴまたは小さいペプチドタグと
の融合タンパク質を製造し、ビーズ上に固定化する。問
題の細胞からの生合成的に標識された、または標識され
ていないタンパク質抽出物を調製し、ビーズとインキュ
ベートし、バッファーで洗浄する。ＰＰＰ１Ｒ５と相互
反応するタンパク質はビーズから特異的に溶出し、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによって解析する。結合相手の一次アミノ
酸配列データをマイクロシークエンシングによって得
る。所望により、細胞性タンパク質のチロシンリン酸化
などの機能的応答を誘発する物質で細胞を処理できる。
かかる物質の一例は、成長因子またはインターロイキン
−２などのサイトカインである。
【０１０７】もう一つの別の方法はイムノアフィニティ
ー精製法である。組換えＰＰＰ１Ｒ５を標識または標識
していない細胞抽出物とインキュベートし、抗ＰＰＰ１
Ｒ５抗体で免疫沈降させる。その免疫沈降物をプロテイ
ンＡ−セファロースで回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析
する。標識されていないタンパク質をビオチン化により
標識化し、ストレプトアビジンを含むＳＤＳゲル上で検
出する。結合相手のタンパク質をマイクロシークエンシ
ングにより解析する。さらに、当業者に知られている標
準的生化学的精製工程をマイクロシークエンシングの前
に使用してもよい。さらにもう一つの別法は、ペプチド
ライブラリーを結合相手についてスクリーニングするこ
とに関する。組換えタグ付きまたは標識されたＰＰＰ１
Ｒ５を用いて、ＰＰＰ１Ｒ５と相互反応するペプチドま
たはホスホペプチドライブラリーからペプチドを選択す
る。そのペプチドを配列決定し、相互反応するタンパク
質にて見いだされるコンセンサスペプチド配列を同定す
る。
【０１０８】アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明のＰＰＰ１Ｒ５は、本発明のＰＰＰ１Ｒ５ポリペ
プチドを亢進（アゴニスト）またはその活性化を阻害
（アンタゴニスト）する化合物をスクリーニングする方
法にて用いてもよい。アゴニストまたはアンタゴニスト
をスクリーニングする一の方法は、図４に記載されてい
るＧＳＴ−ＰＰＰ１Ｒ５などの、エピトープタグ化バー
ジョンのＰＰＰ１Ｒ５を、精製したＰＰ１と混合し、推
定アンタゴニストの有無の下、その相互の結合を測定す
ることからなる。この結合アッセイは、以下に示すＥＬ
ＩＳＡプレートアッセイの形態である。ＧＳＴ−ＰＰＰ
１Ｒ５を直接的にまたは抗−ＧＳＴ抗体を介してプレー
トに付着させ、つづいてウシ血清アルブミンなどの非特
異的タンパク質を用いて別の結合部位を遮断する。つい
で、そのウェルをアンタゴニストの有無の下でＰＰ１と
一緒にインキュベートする。洗浄工程に付した後、ホー
スラディッシュ・ペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホ
スファターゼなどの酵素に間接的または直接的に結合し
た特異的抗体を介してその結合ＰＰ１を検出することが
できる。アンタゴニストでは結合量が減少し、それに対
してアゴニストでは結合量が増加するであろう。そのよ
うなアゴニストおよびアンタゴニストの検出を容易にす
るためにタンパク質のレベルを操作することは当業者に
自明である。
【０１０９】該アッセイはまた、プレート上にＰＰ１を
置き、アンタゴニストまたはアゴニストの存在下でＧＳ
Ｔ−ＰＰＰ１Ｒ５またはＰＰＰ１Ｒ５を添加することも
できる。プレートに結合したＰＰＰ１Ｒ５またはＧＳＴ
−ＰＰＰ１Ｒ５の抗体検出に加えて、プレート上のＰＰ
１の活性を測定することもできる。というのも、その活
性はＰＰＰ１Ｒ５の結合により阻害されるからである。
共同沈殿（例えば、以下の実施例３）および界面プラス
モン共鳴を含め、当業者に公知の別の結合フォーマット
がある。同様のアッセイを用いて、ＰＰＰ１Ｒ５と他の
タンパク質、グリコーゲン、および非タンパク質全体
（前記した方法を用いて検出することのできる）の相互
反応を測定することもできる。
【０１１０】本発明のＰＰＰ１Ｒ５についてのアゴニス
トおよびアンタゴニストを検出する方法は、米国特許第
５４８２８３５号に記載の酵母に基づく技法である。潜
在的ＰＰＰ１Ｒ５アンタゴニストとして、例えば、抗
体、またはある場合には、応答を誘起しないが、ＰＰＰ
１Ｒ５に結合する、すなわち、ＰＰＰ１Ｒ５の活性を妨
げる、ペプチドが挙げられる。潜在的アンタゴニストは
また、ＰＰＰ１Ｒ５のリガンドに密接に関連付けられる
タンパク質、すなわち、タンパク質が生物学的機能を失
っており、ＰＰＰ１Ｒ５に結合した場合に、何の応答も
惹起しない、そのリガンドのフラグメントを包含する。
【０１１１】潜在的アンタゴニストはまた、アンチセン
ス法を用いて調製されたアンチセンス構築物も包含す
る。アンチセンス法を用いて、３重ヘリックス形成によ
り、またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ（いずれの
方法もポリペプチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合をベ
ースとしている）により遺伝子発現を制御することがで
きる。例えば、ポリヌクレオチド配列の５’コーディン
グ部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードしてお
り、約１０ないし４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドを設計するのに用いられる。ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、転写に関する遺伝子の領域に
相補的であるように設計され（３重ヘリックス）［ Lee
ら、Nucl.Acids Res.，6：3073（1979）；Cooneyら、Sc
ience，241：456（1988）；およびDervanら、Science，
251：1360（1991）を参照のこと］、それによりＰＰＰ
１Ｒ５の転写および製造を阻害する。アンチセンスＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、インビボにてｍＲＮＡとハイ
ブリッド形成し、ｍＲＮＡ分子のＰＰＰ１Ｒ５への翻訳
を遮断する（アンチセンス）［ Okano、J.Neurochem.，
56：560（1991）；Oligodeoxynucleotides as Antisens
e Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca R
aton，ＦＬ（1988）を参照のこと］。前記したオリゴヌ
クレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが
インビボにて発現されてＰＰＰ１Ｒ５の生成を阻害する
ように、細胞にデリバリーすることができる。
【０１１２】もう一つの潜在的アンタゴニストは、ＰＰ
１に近寄り難いようにし、正常な生物学的活性が妨げら
れる、ＰＰＰ１Ｒ５に結合する小さな分子である。小さ
な分子の例として、小さなペプチドまたはペプチド様分
子が挙げられるが、これに限定されるものではない。小
さな分子もまた、ＰＰ１またはＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチ
ドの別の相互反応タンパク質に結合し、その結合を妨げ
ることができる。小さな分子として、例えば、小さなペ
プチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これに限
定されるものではない。
【０１１３】潜在的アンタゴニストはまた、リガンドに
結合し、該リガンドが細胞質ＰＰＰ１Ｒ５と相互反応す
ることを妨げる、ＰＰＰ１Ｒ５のフラグメントを包含す
る。ＰＰＰ１Ｒ５タンパク質は哺乳動物宿主に偏在して
おり、多くの病状を含め、多くの生物学的機能を媒介す
る原因である。したがって、一方でタンパク質活性を刺
激し、他方でＰＰＰ１Ｒ５の機能を阻害しうる化合物お
よび薬剤を見出すことが望ましい。一般に、ＰＰＰ１Ｒ
５についてのアゴニストまたはアンタゴニストは、とり
わけ、前記した疾患または障害に対する種々の治療およ
び予防目的に用いられる。
【０１１４】加えて、本発明は、過剰なＰＰＰ１Ｒ５活
性に関係した異常な状態を治療する方法であって、前記
した阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容される
担体と共に、リガンドのＰＰＰ１Ｒ５への結合を阻害す
るか、または第２シグナルを阻害し、それにより異常な
状態を緩和するのに効果的な量にて対象に投与すること
からなる方法を提供する。本発明はまた、ＰＰＰ１Ｒ５
およびその活性の発現不足に関連する異常な病態を治療
する方法であって、前記した本発明のＰＰＰ１Ｒ５ポリ
ペプチドを活性化する化合物（アゴニスト）の治療上有
効量を対象に投与し、その異常な病態を緩和することか
らなる方法を提供する。、
【０１１５】組成物およびキット これらのＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチド、およびかかるＰＰ
Ｐ１Ｒ５を活性化または阻害する化合物を、適当な医薬
担体と組み合わせて用いることができる。かかる組成物
は、医薬上有効量のポリペプチドまたは化合物と、医薬
上許容される担体または賦形剤とからなる。かかる担体
は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセ
ロール、エタノールおよびその組み合わせを包含する
が、これに限定されるものではない。処方は投与方法に
適していなければならない。当業者であれば、投与方法
による適当な担体を慣用的に選択することができる。本
発明はさらに、１またはそれ以上の前記した本発明の組
成物を充填した１またはそれ以上の容器からなる医薬パ
ックおよびキットに関する。
【０１１６】投与 特定の疾患は、本発明のＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドの全
身性臨床投与によりいくらかまたは完全に治癒すること
ができる。この投与は遺伝子治療（後記参照のこと）の
形態にて、またはＰＰＰ１Ｒ５ ＤＮＡの組換え構築物
よりもしくはペプチド化学合成（Wooら、Protein Engin
eering、3：29−37（1989））より合成したＰＰＰ１Ｒ
５ペプチド・アゴニストまたはアンタゴニストの投与を
介する形態であってもよい。ＰＰＰ１Ｒ５を活性化また
は阻害する本発明のポリペプチドまたは他の化合物を単
独で、あるいは治療化合物などの他の化合物と組み合わ
せて用いてもよい。医薬組成物は、例えば、とりわけ、
局所的、経口的、経肛門的、経膣的、静脈内、腹腔内、
筋肉内、皮下、経鼻内または皮内経路による投与を含
め、効果的かつ都合のよい方法で投与してもよい。
【０１１７】医薬組成物は、一般に、特定の適応症（複
数でも可）の治療または予防に有効な量にて投与され
る。本発明のポリペプチドまたは化合物の使用量は投与
方法、他の活性化合物の使用などで変化するが、一般に
約１ｍｇないし１００ｍｇの範囲にある。使用する化合
物の量は、インビトロにおける細胞応答および本発明の
ポリペプチドまたは該ポリペプチドを含有する処方に対
する動物の試験的応答に基づいて、経験的に決定され
る。一般に、組成物を、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体
重の量で投与する。大抵の場合、一日に付き約８ｍｇ／
ｋｇ体重を越えない量で組成物が投与されるであろう。
好ましくは、大抵の場合、投与量は、一日当たり約１０
μｇ／ｋｇ体重ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重である。最適
用量は、症状、重篤度、投与経路、合併症などを考慮し
て、各治療様式についての標準的方法および症状により
決定されることが理解されよう。
【０１１８】遺伝子治療 ＰＰＰ１Ｒ５ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペ
プチドであるアゴニストおよびアンタゴニストを、しば
しば「遺伝子治療」と呼ばれる治療様式において、かか
るポリペプチドを発現させることにより、本発明にて使
用することができる。かくして、例えば、患者からの細
胞を、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドで操
作し、ポリペプチドをエクスビボでコードしてもよい。
次いで、その操作された細胞をそのポリペプチドで治療
すべき患者に与えてもよい。この具体例において、例え
ば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルスプラスミドベクターの使用により、細胞を
エクスビボで操作してもよい。かかる方法は当該分野に
おいてよく知られており、本発明におけるそれらの使用
は本明細書の教示から明らかである。
【０１１９】同様に、当該分野において知られた方法に
より、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞を
インビボで処理してもよい。例えば、本発明のポリヌク
レオチドを、上記のように、複製欠損レトロウイルスベ
クターまたはアデノウイルスベクターあるいは他のベク
ター（例えば、パーボウイルスベクター）中での発現の
ために操作してもよい。ついで、その発現構築物を単離
してもよい。パッケージ細胞を本発明のポリペプチドを
コードするＲＮＡを含有するプラスミドベクターで形質
導入し、そのパッケージング細胞が目的とする遺伝子を
含有する感染性ウイルス粒子を産生するようにしてもよ
い。これらの産生細胞を、インビボでの細胞の操作およ
びインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与
してもよい。本発明のポリペプチドを投与するためのこ
れらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者
に明らかである。
【０１２０】本明細書において前記したレトロウイルス
プラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モロ
ニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス
肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイ
ルス、ギボンサル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイル
ス、アデノウイルス、ミエロ増殖性肉腫ウイルス（Myel
oproliferative Sarcoma Virus）および哺乳動物腫瘍ウ
イルスを包含するが、これらに限定されない。好ましい
具体例において、レトロウイルスプラスミドベクターは
モロニーネズミ白血病ウイルス由来のものである。かか
るベクターは、ポリペプチド発現のための１個またはそ
れ以上のプロモーターを含む。用いることのできる適当
なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プ
ロモーター；およびMillerら、Biotechniques，7：980-
990（1989）に記載されたヒトサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーターを包含するが、これに限定され
ない。ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびβ−
アクチンプロモーターを包含するが、これに限定されな
い真核細胞プロモーターなどの細胞プロモーターもまた
用いることができる。使用できる付加的なウイルス性プ
ロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジン
キナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パーボウ
イルスプロモーターを包含するが、これらに限定されな
い。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる
教示から当業者に明らかであろう。
【０１２１】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろう。
使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス主要
後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモータ
ー；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーのごとき異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス
（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロ
チオネインプロモーターのごとき誘導可能プロモータ
ー；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのごと
きウイルス性チミジンキナーゼプロモーター；レトロウ
イルス性ＬＴＲ（本明細書で前記した修飾レトロウイル
スＬＴＲを包含する）；β−アクチンプロモーター；お
よびヒト成長ホルモンプロモーターを包含するが、これ
らに限定されない。プロモーターは、ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を制御する元来のプロモーターであって
もよい。
【０１２２】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
てパッケージング細胞系に形質導入し、産生細胞系を形
成する。トランスフェクションされてもよいパッケージ
ング細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ
−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７
−Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ
＋ｅｎｖＡｍ１２、およびMiller,A.、Human Gene Ther
apy，1：5-14（1990）に記載されたＤＡＮ細胞系を包含
するが、これらに限定されない。当該分野で知られてい
るいずれかの手段によりベクターをパッケージング細胞
中に形質導入してもよい。かかる手段は、エレクトロポ
レーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ4沈殿を包含
するが、これらに限定されない。別法において、レトロ
ウイルスプラスミドベクターをリポソーム中に封入し、
あるいは脂質と結合させ、ついで、宿主に投与してもよ
い。
【０１２３】産生細胞系は、ポリペプチドをコードする
核酸配列（複数でも可）を含む、感染性レトロウイルス
ベクター粒子を産生するであろう。かかるレトロウイル
スベクター粒子を用いて、インビトロまたはインビボの
いずれかにおいて真核細胞に形質導入してもよい。形質
導入された真核細胞はポリペプチドをコードする核酸配
列（複数でも可）を発現するであろう。形質導入されう
る真核細胞は、胚幹細胞、胚カルシノーマ細胞、ならび
に造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチ
ノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含する
が、これらに限定されない。
【０１２４】
【実施例】本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明す
る。実施例は、特定の具体例を参照することにより本発
明を説明するためにのみ提供される。これらの例示説明
は開示した発明の範囲を限定または制限するものではな
い。本明細書中の特定の用語は、上記の定義において説
明されている。すべての実施例は標準的方法を用いて行
われ、特記しないかぎり、それらの方法は当業者によく
知られており、通常的なものである。以下の実施例の通
常的方法は、例えばSambrookらの標準的な実験室マニュ
アルに記載されているようにして行うことができる。下
記の実施例に示すすべての部分または量は、特記しない
かぎり、重量である。
【０１２５】実施例１−ヒトプロテインホスファターゼ
１結合サブユニットR5をコードするcDNAの単離および配
列分析 500以上のヒトｃDNAライブラリー由来のヒトゲノム表現
配列（EST)データベース［M. Adamsら、Nature, 355:63
2-634(1992); M. Adamsら、Nature, 377:3-174(1995)］
を、TBLASTNアルゴリズム［S. F. Altschulら、J. Mol.
Biol., 215:403-410(1990)]を用いて、ラット肝グリコ
ーゲン結合サブユニット（GL)と関連する配列について
検索した。異なるライブラリーから単離された、部分的
に配列決定された4つのオーバーラップするｃDNA配列が
ラットGLとかなりの配列相同性を有するタンパクの部分
をコードしていた。PPP1R5をコードする、ヒト胆嚢ライ
ブラリー由来のこれらのｃDNAの一つ、ｐHGBDX21は、タ
ックダイターミネーターサイクル（Taq dye terminator
cycle)配列決定を用い、アップライド バイオシステ
ム ３７３A 自動DNAシークエンサーで、両方向から完
全に配列決定された。ｐHGBDX21cDNAによりコードされ
るオープンリーディングフレームの完全な配列は図１お
よび２（配列番号１）に示される。
【０１２６】図１および２の完全配列は、さらにのオー
バーラッピングアセンブリーに組織されている最近のＥ
ＳＴライブラリに対して検索され、完全なコード領域と
オリジナルｃＤＮＡに含まれない付加的な３’非翻訳領
域（ＵＴＲ）の３７９ヌクレオチド（または１．３ｋ
ｂ）をスパンするさらに５８のＥＳＴ類を同定した。そ
れゆえ、完全なｍＲＮＡは少なくとも２．５ｋｂであ
る。また、末端３’ＵＴＲ配列はPPP1R5の遺伝子が染色
体１０ｑ２３−２４に位置するために必要な２つのタッ
グドサイト配列（ＳＴＳidentifiers：WI-11129とTIGR-
A004S47)とオーバーラップしていた［Whitehead/MIT C
enter]。推定される図１および２のPPP1R5タンパク質
は、開始メチオニンがコドン６、２０、２６よりもコド
ン1にあるとすると、３１７アミノ酸からなる３６．４
ｋＤａである。フレーム中の終止コドンは、コドン1に
先行する。しかしながら、コドン６、２０、２６に先行
するヌクレオチド配列は、コドン１に先行するものより
も真核細胞翻訳開始コンセンサス配列と類似する。それ
ゆえ、翻訳は、配列番号２（図２）のコドン６から開始
され、３１２アミノ酸からなる３５．８ｋＤａのタンパ
ク質となるだろう。また、翻訳開始がアミノ酸２０で、
２９８のアミノ酸のタンパク質となること、アミノ酸２
６で、２９２のアミノ酸のタンパク質となることも可能
である。
【０１２７】ヒトPPP1R5のアミノ酸配列は、保存的置換
を考慮すると、ラット肝ＧLと４２％の同一性と５１％
の類似性を示す（図３）。PPP1R5は、ウサギとヒトＧM
の最初の２８５アミノ酸と、それぞれ２７％、２８％の
同一性のみを示し、ＧMとは類似性がより少ない。PPP1R
5のＧLとＧMとの類似性の度合いが少ないことは、PPP1R
5がラットＧLのヒト相同体ではないことを示す。ヒトと
ウサギ骨格筋からのグリコーゲン結合サブユニットは、
もっと高いレベルの同一性（７３％）を示す[Chenら、
(1994)、上記引用］。また、ヒトPPP1R5とラットＧLの
異なる組織への分布は、これらの2つのタンパク質が相
同種ではないことを示す。PPP1R5cDNAは、胆嚢、前立
腺、骨芽細胞、網膜、平滑筋、肝、腎、骨髄、線条およ
び老化繊維細胞を含むいくつかの成人組織および細胞、
脳、肺、肝、心臓、脾臓、胎盤を含むいくつかの胎児組
織、および、骨肉腫、肝細胞、卵巣、メラノサイト腫瘍
細胞のような腫瘍細胞由来のライブラリーから単離され
た。加えて、肝cDNAは、I.M.A.G.E国際資本連合の好意
により提供され、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓが、配列分析によっ
てPPP1R5の部分をコードすることを示された。対照的
に、ＧLは、そのｍＲＮＡが肝に存在し、肺、脳、心
臓、脾臓、骨格筋、腎臓および睾丸には検出できないこ
とから、肝特異的タンパク質であるらしいことが示され
た[Dohertyら、(1995)、上記引用］。それゆえ、ヒトタ
ンパクホスファターゼI結合サブユニットR5は、ラット
肝グリコーゲン結合サブユニットPP1と関連するが、相
同体ではない。
【０１２８】実施例２−イー．コリ(E.coli）中でのGST
-PPP1R5融合タンパク質の発現と抗体の作成 PPP1R5がPPP1に結合するのかどうかを決定するために、
R5がGST融合タンパクとして以下に示すようにイー．コ
リ中で発現された。PPP1R5のオープンリディングは、PC
Rにより、開始メチオニンコドンとしてNdeIサイト(アン
ダーラインで示される)を作るオリゴヌクレオチド
５’−ＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡ
ＡＴＧＡＴＣ−３’と、終始コドンの３’のＸｈｏＩサ
イト(アンダーラインで示される)を作るオリゴヌクレオ
チド５’−ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＣＧＡＴＡＡ
ＧＡＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣ−３’を用いて増幅した。PP
P1R5の完全なコーディング領域は、原核細胞遺伝子融合
発現ベクター、pGEX-CA［Guan and Dixon, Anal. Bioch
em., 192:262-267(1991); Dohertyら、(1995)、上記引
用］中にクローニングされた。最終構築物、pGEX-PPP1R
5は、PPP1R5の完全オープンリーディングフレームが続
く、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
をコードする。
【０１２９】pGEX-PPP1R5プラスミドを通常の手法でイ
ー．コリにトランスフェクトし、トランスフェクタント
を適切な培養条件で培養し、GST-PPP1R5（またはGST-R
5)融合タンパク質をイー．コリ内で発現させた。GST-PP
P1R5タンパク質は、上記に引用したDohertyら(1995)に
記載されるように、グルタチオン−アガロース(シグマ)
上のアフィニティクロマトグラフィにより培養物から精
製した。細菌培養物1リッターあたり、２５０ｍｇの可
溶性のGST-PPP1R5が単離された。GST-PPP1R5に対する抗
体が羊中で作られ、アフィニティを精製した。PPP1活性
におけるPPP1R5の効果を測定するために、５０ｍMTris-
HCl、ｐH7.5、0.03％Brij-35、0.1％２−メルカプトエ
タノール中のセファデックス２００を用いたクロマトグ
ラフィーによって、GST-PPP1R5調製物中に混ざっている
GSTを除いた。おそらく、GSTが二量体構造を有するため
に、GST-PPP1R5は、二量体として溶出した。加えて、GS
T-PPP1R5に対する、親和性の精製された抗体は、ラット
肝臓と骨格筋抽出物のイムノブロットにおいて３６ｋDa
タンパク質を認識したが、GL(３３ｋＤａ)は、肝臓にお
いてのみ検出された。
【０１３０】実施例３−ヒトPPP１R５のPP1との共同沈
降 グルタチオン−親和性沈降研究が以下のようになされ
た。精製されたGST-PPP1R5は、実施例２に述べたように
得られた。ヒトPP1g[Barkerら、Biochim. Biophys. Act
a, 1178:228-233(1993)]がイー．コリ中に発現され、上
記に引用したAlessiら、(1993)に記載されるように精製
された。異なった量のGST-PPP1R5と細菌に発現させたPP
P1を50または100ｍｌの150mMNaCl、0.1％(v/v)２−メル
カプトエタノール、0.02％(v/v)Brij３５および0.1mg/m
lの牛血清アルブミンを含む50mMTris-HCl、ｐH7.5中で
４℃で１時間インキュベートした。10mgのグルタチオン
−アガロースベッド(シグマ)を加え、インキュベーショ
ンを30分間4℃で、振りながら続けた。遠心した後、上
澄を除去し、ペレットを１ｍｌの緩衝液(アルブミンを
除く)で2回洗浄し、次いで、SDSゲルローディング緩衝
液中で、5分間95℃で加熱して変性し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で、解析した。ペレットのＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル解析から、PP1はGST-PPP1R5とGSH-
アガロースベッドの存在下で沈降し、PP1とGSHアガロー
スのみを有するコントロールのインキュベーション中で
は、沈降しないことが示された(データは示されていな
い)。
【０１３１】実施例４−ヒトPPP1R5はPP1の基質特異性
を調節する。 プロテインホスファターゼアッセイは、上記に引用した
Cohenら(1988)に記載されるように、2価のカチオンの非
存在下で行われた。上述の実施例2に記載された触媒サ
ブユニットPP1gをアッセイ緩衝液で1.5U/ml(1.4nM）に
希釈した。Choenら、Meth. Enzymol.,159:390-408(198
8)に記載されるように、ウサギ骨格筋グリコーゲンホス
ホリラーゼを1モルサブユニットあたり1モルホスフェー
トの化学量論となるように、ホスホリラーゼキナーゼに
より32Ｐ-標識し、アッセイ中１０ｍMとした。0.01mlに
分けたものを30℃で15分間、同じ緩衝液で希釈した精製
された細菌中に発現されたGST-R5、GST-GL、またはGST
の濃度（0.01、0.1、1、10、100、1000nM）の0.01mlと
ともにインキュベートした。アッセイは、0.01mlの32Ｐ
-標識ホスホリラーゼで開始した。活性の１ユニット
が、1分間に1mmolの[32Ｐ]ホスフェートの放出を触媒す
る酵素の量である。
【０１３２】図４に示されるように、親和性の精製され
たGST-PPP1R5は、以前にGST-GLについて示されていたよ
うに［Dohertyら、(1995)、上記引用］、PP1のホスホリ
ラーゼホスファターゼ活性を阻害した。GST-R5とGST-GL
の異なる調製物により、阻害の量が変化したが、おそら
く、両方のタンパクの重合によるためであろう。図４
は、新鮮に準備されたGST-R5とGST-ＧLの調製物で見ら
れる阻害は、IC50が約100nMで、類似することを示す。P
PP1R5調製物の主な不純物であるGSTの除去は、IC50に大
きく影響しない。
【０１３３】実施例５-ヒトPPP１R５は、ホスホリラー
ゼａと結合しない。 PP1とGLのコンプレックスのグリコーゲンシンターゼホ
スファターゼ活性は、ホスホリラーゼａにより阻害さ
れ、阻害は、ホスホリラーゼａのGLサブユニットへの結
合によってなされる「Dohertyら、(1995)、上記引用］。
それゆえ、PPP1R5のホスホリラーゼａへの結合活性を調
べた。ホスホリラーゼａのGST-GLとGST-R5への結合を比
較するために、イムノブロットを調製した。GST-GLとGS
T-R5を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニ
トロセルロース膜に移し、（Ａ）Dohertyら、(1995)、
上記に引用およびMoorheadら、(1995)、上記に引用、に
記載されるように32Ｐ標識されたホスホリラーゼ0.01ml
でプローブし、(B)クーマシーブルーで染色した。各条
件（A)および（B)について、スーパーデックス(superde
x)２００上でゲル濾過した後、一つのレーンにアフィニ
ティ−精製したGST-GLを流し；二つ目のレーンにアフィ
ニティ精製したGST-R5を流し；三つ目のレーンにGST-R5
を流した。分子量マーカーは、ホスホリラーゼβ(97kD
a)、牛血清アルブミン(66kDa)、オボアルブミン(43kD
a)、カルボニックアンハイドラーゼ(29kDa）である。
【０１３４】イムノブロットの結果(示されていない)
は、ホスホリラーゼはGST-GLに結合するを示す［すなわ
ち、レーン1（A）の４３と６６kDaのマーカーの間に大
きなブロットが見られる。］。しかしながら、ホスホリ
ラーゼは、GST-PPP1R5には結合しなかった［すなわち、
条件（A)のレーン2とレーン3にはブロットが見られな
い。］。条件（B)では、レーン1の４３と６６kDaのマー
カーの間に小さなブロットが見られ、レーン2には、中
程度の大きさのブロットが見られた［すなわち、４３と
６６kDaマーカーの間に2つのブロットが見られた；２０
と２９kDaマーカーの間には、一つのブロットが見られ
た。レーン3（B）では、４３と６６kDaマーカーの間に
一つのブロットが見られた。］。それゆえ、PPP1R5は、
この特性においてはGLと相違し、ホスホリラーゼａによ
って調節されていない。
【０１３５】実施例６−哺乳類細胞におけるPPP1R5の発
現 PPP1R5をコードするｃDNAを発現ベクターｐCDNにクロー
ニングすることによって発現ベクターを作成する［N. A
iyarら、Mol. Cell. Biochem., 131:75-86(1994),出典
明示により本発明に含める］。適当な制限酵素の選択、
クローニングの手法は、当業者によく知られている。
【０１３６】発現ベクターｐCDNは以下のものを含んで
いる： （１）ｃＤＮＡがＣＭＶプロモーターの発現コントロー
ル下におかれ、ポリリンカー中の制限サイトによって、
ＳＶ４０イントロンとポリアデニレーションシグナルに
リンクすることができるようにアレンジされた、ヒトサ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、牛生育ホ
ルモン３’フランキング配列、ポリリンカー、ＳＶ４０
イントロン、およびポリアデニレーションシグナル； （２）イー．コリおよび他の原核細胞中での増殖に効果
的な複製のイー．コリオリジン； （３）ゲネチシン（Ｇ４１８）選択のための細菌ネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）発現
カセット （４）メトトレキセート（ＭＴＸ）増幅のためのマウス
ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）； （５）プラスミド含有原核細胞の選択のためのアンピシ
リン抵抗遺伝子；および （６）真核細胞中での増殖のための複製のＳＶ４０オリ
ジン
【０１３７】完全PPP1R5をコードするDNA断片は、CMVプ
ロモーターにより、直接、組換えタンパク発現がなされ
るように、ベクターのポリリンカー領域にクローニング
された。プラスミド構築手法は以下に示される。プラス
ミドのPPP1R5ｃDNAは、特徴的な制限サイトを含むプラ
イマーを用いて増幅される。レセプター発現が最大にな
るように、５’および３’非翻訳領域（UTRs)がベクタ
ーｐCDNに挿入される前に、特徴的な制限酵素を用いて
レセプターｃDNAから除去される。PCRがｃDNAをトリム
するために用いられるので、DNA配列は発現に先立ち、
確認される。
【０１３８】適当なプライマーがこの実施例で用いられ
る。５’プライマーは、約３０ｂｐの長さで、特徴的な
制限サイトとAUG開始コドンを含む。３’プライマー
は、約３０ｂｐと適当なス終止コドンを含む。PCRで増
幅されたDNA断片とベクター、pCDNは、この配列に特徴
的な制限酵素で切断され、次いで、ライゲートされる。
ライゲーション混合物でイー．コリ株SURE（Stratagene
Cloning Systems, La Jolla, CA92037 から利用可
能）をトランスフォームし、トランスフォームされた培
養物をアンピシリン培地プレートにまいて、アンピシリ
ン抵抗コロニーが生育するように、培養する。プラスミ
ドDNAを抵抗コロニーから単離し、PPP１R５をコードす
る断片の存在を制限分析およびゲルサイズ決定により調
べる。
【０１３９】ヒト胚腎293(HEK293)細胞がHTABK54レセプ
ターを発現するように選択される。組換えHTABK54の発
現のために、2×10５のHEK細胞を培地プレートにまき、
５％の湿度のインキュベーター中で37℃で一晩培養す
る。翌日、上述したように２０ｍｇ／プレートの発現ベ
クターのＤＮＡを、製造者の指示に従って哺乳類トラン
スフェクションキットを用いて、または例えば、上記に
引用したSambrookらに示されるように、DEAE-DEXTRANを
用いて、カルシウムリン酸方法によって、細胞に導入す
る。
【０１４０】トランスフェクションに続き、細胞を２４
時間３７℃で３%CO２で培養し、温めたダルベッコリン
酸緩衝生理食塩水（DPBS)で洗浄し、新しい培地を与え
て、５％CO２、３７℃に保った。一晩培養した後、培地
を除き、発現ベクターで安定にトランスフォームされて
いる細胞を選択するために、400mg/mlのG418を含む新鮮
な選択培地に移す。選択培地は、独立した細胞コロニー
が皿上に現われるまで、２−４週間、週に2回置き換え
る。細胞コロニーをそれぞれとり、制限希釈によって精
製し、さらに解析するために広めた。クローンを、6穴
プレートで生育させ、ヒトPPP1R5を発現するクローンさ
れた細胞系を同定した。発現はノーザンブロット解析に
よって検出した。負のコントロール（ｐCDNベクター単
独でトランスフェクトされたHEK293細胞クローンが負の
コントロールとして用いられる。)では見られない、期
待される大きさの発現生成物が、細胞分解物中に見られ
る。
【０１４１】実施例７−リガンドまたはアンタゴニスト
の同定 上述の実施例１または６に記載される発現されたPPP1Rt
を以下に示すようにリガンドまたはアンタゴニストにつ
いてスクリーンした。 A. リガンド／組織バンク 化合物バンク、複合体生化学的流動体、複合的有機物お
よびペプチドライブラリをスクリーンするために、例え
ば、活性なリガンドまたはアンタゴニストを同定するた
めに、発現されたPPP1R5を用いる。例えば、発現された
PPP1R5は、（ａ）PPP1R5のアゴニストまたはアンタゴニ
ストであると推定される天然に存在する化合物；（ｂ）
サバジン(savagine)、ウロテンシンI(urotensin Ｉ）
のような、いまだ発見されていない哺乳類に対応する、
非哺乳類の、生化学的に活性なペプチド；（ｃ）自然に
は見出されないが、知られていない天然のリガンド（例
えば、デルタ９ＴＨＣ）とその他とともにＰＰ１結合サ
ブユニットを活性化する化合物；を含む、150以上の推
定されるリガンドのバンクをスクリーンするために適用
される。
【０１４２】同様に、PPP1R5は、ヒトの組織抽出物、お
よびブタの組織のような他の哺乳類の組織抽出物をスク
リーンするのに用いられる。特に、そのような組織抽出
物には、肺、肝、消化器官、心臓、腎臓、副腎、虚血
脳、血漿、尿、胎盤などが含まれる。最初の抽出手段
は、分離物を、知られた天然のPPP1R5のリガンドを高い
パーセンテージとなるように、ペプチドと小さな分子に
偏らせるために、酸またはエタノールの沈殿から大きな
タンパク質を除くことに焦点が置かれる。続けて、穏や
かな抽出手段がタンパク質を同定するために用いられ
る。これらの組織バンクの形成に用いられる抽出手段
は、技術分野において知られるものである。
【０１４３】B.ELISA プレートアッセイ GST-PPP1R5をELISAプレートに直接または抗-GST抗体を
介して固着し、次いで、非特異的タンパク、例えば、BS
Aで付加的な結合サイトをブロックする。ウェルはアン
タゴニストの存在下または非存在下でPP1とインキュベ
ートされる。洗浄工程の後、結合したPP1を、ホースラ
ディッシュぺルオキシダーゼまたはアルカラインホスフ
ァターゼのような酵素と非直接的にまたは直接的にリン
クした特異的抗体を介して検出する。アンタゴニストは
結合量を減少させ、アゴニストは増加させる。そのよう
なアゴニストおよびアンタゴニストの検出を強めるため
の各タンパク質のレベルの操作は、技術分野において知
られている。アッセイは、プレート上のPP1と、アンタ
ゴニストまたはアゴニストの存在下で加えられるGST-PP
P1R5またはPPP1R5とでなされる。プレートに結合するPP
P1R5またはGST-PPP1R5の抗体検出に加え、プレート上の
PP1の活性が、これが結合したPPP1R5によって阻害され
るために、測定される。
【０１４４】実施例８−遺伝子治療におけるヒトPPP1R5
の発現 皮膚生検によって、患者から繊維芽細胞を得る。得られ
た組織を組織−培養培地に置き、小さな断片に分ける。
組織の小さな塊を組織培養フラスコの湿った表面に置
く；約10個の断片を各々のフラスコに置く。フラスコを
ひっくり返して回し、しっかりと閉じて、一晩室温で置
いた。室温に24時間おいた後、フラスコを逆さまにす
る；組織の塊はフラスコの底に固着して残る；新鮮な培
地(例えば、１０％FBS、ペニシリン、ストレプトマイシ
ンを含むHam's F12 培地）を加える。組織を約1週間3
7℃で培養する。この時、新鮮な培地を加え、数日毎に
かえる。さらに2週間培養した後、繊維芽細胞の一層が
できる。一層は、トリプシン処理され、大きなフラスコ
ではかる。遺伝子治療のためのベクターは、発現される
断片のクローニングのために制限酵素で切断される。切
断されたベクターは、セルフライゲーションを防ぐため
に、子牛小腸ホスファターゼで処理される。デホスホリ
レートされた線上のベクターをアガロースゲルで分画
し、精製する。
【０１４５】活性なPPP1R5を発現できるPPP1R5cDNAが単
離される。所望に応じ、ベクター中にクローニングする
ために断片の末端を修飾する。例えば、５’の張り出し
た部分をDNAポリメラーゼ処理して、平滑末端を形成す
ることができる。３’の張り出した部分をS1ヌクレアー
ゼを用いて除去することができる。T４DNAリガーゼを用
いてリンカーを平滑末端にライゲートできる。同量のモ
ロニーマウス白血病ウイルスの線上バックボーンとPPP1
R5断片を一緒に混合し、T4DNAライゲースを用いて結合
する。ライゲーション混合物をイー．コリをトランスフ
ォームするために用い、次いで細菌をカナマイシン含有
寒天プレートにまく。カナマイシン表現型と制限解析に
よりベクターが遺伝子中に適切に挿入されていることを
確認する。パッケージング細胞を10％子牛血清（CS)、
ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたダルベッ
コの修飾イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagles M
edium, DMEM)中で密集状態になるまで生育させる。PPP1
R5遺伝子を含むベクターは、標準的な手法でパッケージ
ング細胞中に導入される。PPP1R5遺伝子を含む感染ウイ
ルス粒子をパッケージング細胞から集め、これをプロデ
ューサー細胞と呼ぶ。
【０１４６】プロデューサー細胞に新鮮な培地を加え、
適当な培養期間の後、密集状態のプロデューサー細胞の
プレートから培地を集める。分離したプロデューサー細
胞を除去するために、感染ウイルス粒子を含む培地をMI
LIPOREフィルター(Bedford,MA)を通して濾過する。濾過
した培地を繊維芽細胞を感染することに用いる。繊維芽
細胞の中程度な密集状態のプレートから培地を除去し、
すばやく濾過した培地で置き換える。POLYBRENE(Aldric
h Chemical Co., Milwaukee, WI)を形質導入を促進する
ために培地に含ませることができる。適当な培養の後、
培地を除去し、新鮮な培地に置き換える。ウイルスの力
価が高い場合には、ほとんどすべての繊維芽細胞が感染
するので、選択は必要ない。力価が低い場合には、拡張
のために形質導入された細胞を選択するために、ネオや
ヒスのような選択マーカーを有するレトロウイルスベク
ターの使用が必要である。作成された繊維芽細胞を単独
で、または、CYTODEX３ベッドのようなマイクロキャリ
アベット上で密集状態まで生育させた後に、ラットに注
入する。注入された繊維芽細胞はPPP1R5産物を生成し、
タンパク質の生化学的な作用が宿主に伝えられる。本発
明は特に上述した説明と実施例以外のものも意図するこ
とは明らかであろう。本発明の多数の修飾と変形は、上
述した技術を考慮すれば可能であり、それゆえ、クレー
ム中に包含される。
【０１４７】
【配列表】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人：コーエン，パトリシア・テイ・ダブリュ
ー コーエン，フィリップ ヤング，ピーター・アール （ｉｉ）発明の名称： タンパク質ホスファターゼ１結
合タンパク質Ｒ５ （ｉｉｉ）配列の数：６ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名： スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名： スウェードランド・ロード・７０９ （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６−２７９９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ
−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release＃１．０，Vers
ion ＃１．３０ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：シェレック、パトリシア・エイ （Ｂ）登録番号：３３,７７７ （Ｃ）代理人等における処理番号：ATG５００３３ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５０３１ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０
【０１４８】（２） 配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１５８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （A）名称／キー：ＣＤＳ （B）位置：９２．．．１０４２ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： CACGAGGCCG CGGGGGCAAG GCCTGGAGCT GTGGTTCGAA TTTGTGCAGG CAGCGGGTGC 60 TGGCTTTTAG GGTCCGCCGC CTCTCTGCCT A ATG AGC TGC ACC AGA ATG ATC 112 Met Ser Cys Thr Arg Met Ile 1 5 CAG GTT TTA GAT CCA CGT CCT TTG ACA AGT TCG GTC ATG CCC GTG GAT 160 Gln Val Leu Asp Pro Arg Pro Leu Thr Ser Ser Val Met Pro Val Asp 10 15 20 GTG GCC ATG AGG CTT TGC TTG GCA CAT TCA CCA CCT GTG AAG AGT TTC 208 Val Ala Met Arg Leu Cys Leu Ala His Ser Pro Pro Val Lys Ser Phe 25 30 35 CTG GGC CCG TAC GAT GAA TTT CAA CGA CGA CAT TTT GTG AAT AAA TTA 256 Leu Gly Pro Tyr Asp Glu Phe Gln Arg Arg His Phe Val Asn Lys Leu 40 45 50 55 AAG CCC CTG AAA TCA TGT CTC AAT ATA AAA CAC AAA GCC AAA TCA CAG 304 Lys Pro Leu Lys Ser Cys Leu Asn Ile Lys His Lys Ala Lys Ser Gln 60 65 70 AAT GAC TGG AAG TGC TCA CAC AAC CAA GCC AAG AAG CGC GTT GTG TTT 352 Asn Asp Trp Lys Cys Ser His Asn Gln Ala Lys Lys Arg Val Val Phe 75 80 85 GCT GAC TCC AAG GGC CTC TCT CTC ACT GCG ATC CAT GTC TTC TCC GAC 400 Ala Asp Ser Lys Gly Leu Ser Leu Thr Ala Ile His Val Phe Ser Asp 90 95 100 CTC CCA GAA GAA CCA GCG TGG GAT CTG CAG TTT GAT CTC TTG GAC CTT 448 Leu Pro Glu Glu Pro Ala Trp Asp Leu Gln Phe Asp Leu Leu Asp Leu 105 110 115 AAT GAT ATC TCC TCT GCC TTA AAA CAC CAC GAG GAG AAA AAC TTG ATT 496 Asn Asp Ile Ser Ser Ala Leu Lys His His Glu Glu Lys Asn Leu Ile 120 125 130 135 TTA GAT TTC CCT CAA CCT TCA ACC GAT TAC TTA AGT TTC CGG AGC CAC 544 Leu Asp Phe Pro Gln Pro Ser Thr Asp Tyr Leu Ser Phe Arg Ser His 140 145 150 TTT CAG AAG AAC TTT GTC TGT CTG GAG AAC TGC TCA TTG CAA GAG CGA 592 Phe Gln Lys Asn Phe Val Cys Leu Glu Asn Cys Ser Leu Gln Glu Arg 155 160 165 ACA GTG ACA GGG ACT GTT AAA GTC AAA AAT GTG AGT TTT GAG AAG AAA 640 Thr Val Thr Gly Thr Val Lys Val Lys Asn Val Ser Phe Glu Lys Lys 170 175 180 GTT CAG ATC CGT ATC ACT TTC GAT TCT TGG AAA AAC TAC ACT GAC GTA 688 Val Gln Ile Arg Ile Thr Phe Asp Ser Trp Lys Asn Tyr Thr Asp Val 185 190 195 GAC TGT GTC TAT ATG AAA AAT GTG TAT GGT GGC ACA GAT AGT GAT ACC 736 Asp Cys Val Tyr Met Lys Asn Val Tyr Gly Gly Thr Asp Ser Asp Thr 200 205 210 215 TTC TCA TTT GCC ATT GAC TTA CCC CCT GTC ATT CCA ACT GAG CAG AAA 784 Phe Ser Phe Ala Ile Asp Leu Pro Pro Val Ile Pro Thr Glu Gln Lys 220 225 230 ATT GAG TTC TGC ATT TCT TAC CAT GCT AAT GGG CAA GTC TTT TGG GAC 832 Ile Glu Phe Cys Ile Ser Tyr His Ala Asn Gly Gln Val Phe Trp Asp 235 240 245 AAC AAT GAT GGT CAG AAT TAT AGA ATT GTT CAT GTT CAA TGG AAG CCT 880 Asn Asn Asp Gly Gln Asn Tyr Arg Ile Val His Val Gln Trp Lys Pro 250 255 260 GAT GGG GTG CAG ACA CAG ATG GCA CCC CAG GAC TGT GCA TTC CAC CAG 928 Asp Gly Val Gln Thr Gln Met Ala Pro Gln Asp Cys Ala Phe His Gln 265 270 275 ACG TCT CCT AAG ACA GAG TTA GAG TCA ACA ATC TTT GGC AGT CCG AGG 976 Thr Ser Pro Lys Thr Glu Leu Glu Ser Thr Ile Phe Gly Ser Pro Arg 280 285 290 295 CTG GCT AGT GGG CTC TTC CCA GAG TGG CAG AGC TGG GGG AGA ATG GAG 1024 Leu Ala Ser Gly Leu Phe Pro Glu Trp Gln Ser Trp Gly Arg Met Glu 300 305 310 AAC TTG GCC TCT TAT CGA TGAATTAAGC AACAATGTAA CTGGTCTTGA 1072 Asn Leu Ala Ser Tyr Arg 315 CTTGTCATAT TCCCCCATGC AATCCTAGGT CTGTATTGCT CAATTTTAGG AAGCCTTTGC 1132 TACTCCATCA GTAGGTTTAG ATTTGA 1158
【０１４９】（２） 配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３１７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Ser Cys Thr Arg Met Ile Gln Val Leu Asp Pro Arg Pro Leu Thr 1 5 10 15 Ser Ser Val Met Pro Val Asp Val Ala Met Arg Leu Cys Leu Ala His 20 25 30 Ser Pro Pro Val Lys Ser Phe Leu Gly Pro Tyr Asp Glu Phe Gln Arg 35 40 45 Arg His Phe Val Asn Lys Leu Lys Pro Leu Lys Ser Cys Leu Asn Ile 50 55 60 Lys His Lys Ala Lys Ser Gln Asn Asp Trp Lys Cys Ser His Asn Gln 65 70 75 80 Ala Lys Lys Arg Val Val Phe Ala Asp Ser Lys Gly Leu Ser Leu Thr 85 90 95 Ala Ile His Val Phe Ser Asp Leu Pro Glu Glu Pro Ala Trp Asp Leu 100 105 110 Gln Phe Asp Leu Leu Asp Leu Asn Asp Ile Ser Ser Ala Leu Lys His 115 120 125 His Glu Glu Lys Asn Leu Ile Leu Asp Phe Pro Gln Pro Ser Thr Asp 130 135 140 Tyr Leu Ser Phe Arg Ser His Phe Gln Lys Asn Phe Val Cys Leu Glu 145 150 155 160 Asn Cys Ser Leu Gln Glu Arg Thr Val Thr Gly Thr Val Lys Val Lys 165 170 175 Asn Val Ser Phe Glu Lys Lys Val Gln Ile Arg Ile Thr Phe Asp Ser 180 185 190 Trp Lys Asn Tyr Thr Asp Val Asp Cys Val Tyr Met Lys Asn Val Tyr 195 200 205 Gly Gly Thr Asp Ser Asp Thr Phe Ser Phe Ala Ile Asp Leu Pro Pro 210 215 220 Val Ile Pro Thr Glu Gln Lys Ile Glu Phe Cys Ile Ser Tyr His Ala 225 230 235 240 Asn Gly Gln Val Phe Trp Asp Asn Asn Asp Gly Gln Asn Tyr Arg Ile 245 250 255 Val His Val Gln Trp Lys Pro Asp Gly Val Gln Thr Gln Met Ala Pro 260 265 270 Gln Asp Cys Ala Phe His Gln Thr Ser Pro Lys Thr Glu Leu Glu Ser 275 280 285 Thr Ile Phe Gly Ser Pro Arg Leu Ala Ser Gly Leu Phe Pro Glu Trp 290 295 300 Gln Ser Trp Gly Arg Met Glu Asn Leu Ala Ser Tyr Arg 305 310 315
【０１５０】（２） 配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２８４アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号３： Met Ala Val Asp Ile Glu Tyr Ser Tyr Ser Ser Met Ala Pro Ser Leu 1 5 10 15 Arg Arg Glu Arg Phe Thr Phe Lys Ile Ser Pro Lys Leu Asn Lys Pro 20 25 30 Leu Arg Pro Cys Ile Gln Leu Gly Ser Lys Asp Glu Ala Gly Arg Met 35 40 45 Val Ala Pro Thr Val Gln Glu Lys Lys Val Lys Lys Arg Val Ser Phe 50 55 60 Ala Asp Asn Gln Gly Leu Ala Leu Thr Met Val Lys Val Phe Ser Glu 65 70 75 80 Phe Asp Asp Pro Leu Asp Ile Pro Phe Asn Ile Thr Glu Leu Leu Asp 85 90 95 Asn Ile Val Ser Leu Thr Thr Ala Glu Ser Glu Ser Phe Val Leu Asp 100 105 110 Phe Pro Gln Pro Ser Ala Asp Tyr Leu Asp Phe Arg Asn Arg Leu Gln 115 120 125 Thr Asn His Val Cys Leu Glu Asn Cys Val Leu Lys Glu Lys Ala Ile 130 135 140 Ala Gly Thr Val Lys Val Gln Asn Leu Ala Phe Glu Lys Val Val Lys 145 150 155 160 Ile Arg Met Thr Phe Asp Thr Trp Lys Ser Phe Thr Asp Phe Pro Cys 165 170 175 Gln Tyr Val Lys Asp Thr Tyr Ala Gly Ser Asp Arg Asp Thr Phe Ser 180 185 190 Phe Asp Ile Ser Leu Pro Glu Lys Ile Gln Ser Tyr Glu Arg Met Glu 195 200 205 Phe Ala Val Cys Tyr Glu Cys Asn Gly Gln Ser Tyr Trp Asp Ser Asn 210 215 220 Lys Gly Lys Asn Tyr Arg Ile Thr Arg Ala Glu Leu Arg Ser Thr Gln 225 230 235 240 Gly Met Thr Glu Pro Tyr Asn Gly Pro Asp Phe Gly Ile Ser Phe Asp 245 250 255 Gln Phe Gly Ser Pro Arg Cys Ser Phe Gly Leu Phe Pro Glu Trp Pro 260 265 270 Ser Tyr Leu Gly Tyr Glu Lys Leu Gly Pro Tyr Tyr 275 280
【０１５１】（２） 配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０２アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号４： Ala Ile Leu Glu Ser Thr Glu Ser Leu Leu Gly Ser Thr Ser Ile Lys 1 5 10 15 Gly Ile Ile Arg Val Leu Asn Val Ser Phe Glu Lys Leu Val Tyr Val 20 25 30 Arg Met Ser Leu Asp Asp Trp Gln Thr His Tyr Asp Ile Leu Ala Glu 35 40 45 Tyr Val Pro Asn Ser Cys Asp Gly Glu Thr Asp Gln Phe Ser Phe Lys 50 55 60 Ile Val Leu Val Pro Pro Tyr Gln Lys Asp Gly Ser Lys Val Glu Phe 65 70 75 80 Cys Ile Arg Tyr Glu Thr Ser Val Gly Thr Phe Trp Ser Asn Asn Asn 85 90 95 Gly Thr Asn Tyr Thr Phe 100
【０１５２】（２） 配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号５： Val Lys Leu His Ser Leu Thr Gln Leu Gly Asp Asp Ser Ser Lys Ile 1 5 10 15 Thr Gly Leu Val Tyr Val Lys Asn Leu Ser Phe Glu Lys Tyr Leu Glu 20 25 30 Ile Lys Phe Thr Phe Asn Ser Trp Arg Asp Ile His Tyr Val Thr Ala 35 40 45 Asn Phe Asn Arg Thr Ile Asn Ser Asn Val Asp Glu Phe Lys Phe Thr 50 55 60 Ile Asp Leu Asn Ser Leu Lys Tyr Ile Leu Leu Ile Lys Arg Ile Ile 65 70 75 80 Thr Met Glu Lys Asn Thr Ser Ser Cys Pro Leu Asn Ile Glu Leu Cys 85 90 95 Cys Arg Tyr Asp Val Asn Asn Glu Thr Tyr Tyr Asp Asn Asn Asn Gly 100 105 110 Lys Asn Tyr His Leu 115
【０１５３】（２） 配列番号６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９６アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号６： Val Gln Leu Asp Ser Tyr Asn Tyr Asp Gly Ser Thr Phe Ser Gly Lys 1 5 10 15 Ile Tyr Val Lys Asn Ile Ala Tyr Ser Lys Lys Val Thr Val Ile Tyr 20 25 30 Ala Asp Gly Ser Asp Asn Trp Asn Asn Asn Gly Asn Thr Ile Ala Ala 35 40 45 Ser Tyr Ser Ala Pro Ile Ser Gly Ser Asn Tyr Glu Tyr Trp Thr Phe 50 55 60 Ser Ala Ser Ile Asn Gly Ile Lys Glu Phe Tyr Ile Lys Tyr Glu Val 65 70 75 80 Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Asp Asn Asn Asn Ser Ala Asn Tyr Gln Val 85 90 95
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトタンパク質ホスファターゼ１結合サブユ
ニットＲ５（ＰＰＰ１Ｒ５）の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
および推定タンパク質配列（配列番号１および２）を示
す。開始Ｍｅｔコドンがのその配列のアミノ酸１、６、
２０および２６である場合には、ＰＰＰ１Ｒ５について
の数種のタンパク質配列はその配列番号２より選択する
ことができる。
【図２】 ヒトタンパク質ホスファターゼ１結合サブユ
ニットＲ５（ＰＰＰ１Ｒ５）の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
および推定タンパク質配列（配列番号１および２）を示
す。開始Ｍｅｔコドンがのその配列のアミノ酸１、６、
２０および２６である場合には、ＰＰＰ１Ｒ５について
の数種のタンパク質配列はその配列番号２より選択する
ことができる。
【図３】 ＰＰＰ１Ｒ５のアミノ酸配列（配列番号２）
とラット肝臓のタンパク質ホスファターゼ１のグリコー
ゲン結合サブユニット（Ｇ Ｌ）（配列番号３）を比較し
たものである。アイデンティティを垂線で示す。同類ア
ミノ酸変化を次のグループ（Ｌ，Ｉ，Ｖ）；（Ａ，
Ｇ）；（Ｓ，Ｔ）；（Ｄ，Ｅ）；（Ｑ，Ｎ）；（Ｒ，
Ｋ）；（Ｆ，Ｙ）のコロンで示す。Ｒ５、ＧＬおよびヒ
トタンパク質ホスファターゼ１のグリコーゲン結合サブ
ユニット（Ｇ Ｍ）で同じである残基を下線で示す。最小
ＰＰ１結合モチーフを二重下線で示す。
【図４】 タンパク質ホスファターゼ１のホスホリラー
ゼ・ホスファターゼ活性についてのグルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｒ５融合タンパク質お
よびＧＳＴ−Ｇ Ｌ融合タンパク質の作用を比較した線図
である。ＧＳＴ−Ｒ５（白抜き四角）およびＧＳＴ−Ｇ
Ｌ（黒丸）およびＧＳＴ（白抜き三角）の存在下でのＰ
Ｐ１のホスホリラーゼ・ホスファターゼ活性を示す。活
性は最初のＰＰ１活性のパーセンテージとして表わす。
【図５】 ＰＰＰ１Ｒ５（配列番号２）、ラットＧＬ
（配列番号３）、ヒトＧＭ（配列番号４）、S.cerevisi
ae ＧＡＣ１（配列番号５）およびRhizopus oryzaeグル
コアミラーゼ（ＡＭＹＬ）（配列番号６）の配列を比較
するものである。５種のすべてのタンパク質で保存され
ているアミノ酸に下線を付し、同じであるものに二重線
下線を付す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＢＵ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 16/18 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｚ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＸ 5/10 ＡＣＮ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＰ Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 598008994 ユニバーシティ・オブ・ダンデイー Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｎｄｅ ｅ イギリス、スコットランド、ディディ１・ ４エイチエヌ、ダンディー (71)出願人 597166578 メディカル リサーチ カウンシル イギリス国 ダブリュ１エヌ ４エイエル ロンドン，パーク クレセント 20 (72)発明者 ピーター・アール・ヤング アメリカ合衆国08648ニュージャージー州 ローレンスビル、ヘンドリクソン・ロード 32番 (72)発明者 パトリシア・ティ・ダブリュー・コーエン イギリス、スコットランド、ダンディー、 インバーゴーウイ、インバーベイ・セカン ド (72)発明者 フィリップ・コーエン イギリス、スコットランド、ダンディー、 インバーゴーウィ、インバーベイ・セカン ド

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）配列番号２に示されるポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号２のアミノ酸からなるポリペプチドをコ
    ードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の
    同一性を有するポリヌクレオチド； （ｃ）遺伝暗号の重複性により、配列番号２と同じアミ
    ノ酸をコードするポリヌクレオチド； （ｄ）図１および２のアミノ酸１ないし３１７からなる
    ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｅ）図１および２のアミノ酸６ないし３１７からなる
    ポリペプチドをコードするポヌクレオチド； （ｆ）図１および２のアミノ酸２０ないし３１７からな
    るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｇ）図１および２のアミノ酸２６ないし３１７からな
    るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｈ）（ａ）ないし（ｇ）のポリヌクレオチドに対して
    相補性のポリヌクレオチド；および （ｉ）（ａ）ないし（ｈ）のポリヌクレオチドの少なく
    とも連続した１５塩基からなるポリヌクレオチド からなる群より選択されるメンバーからなる単離ポリヌ
    クレオチド。
  2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ
    である請求項１記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 配列番号１に示されるヌクレオチドから
    なる請求項２記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 配列番号１に示されるヌクレオチド１−
    １１５８からなる請求項２記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸からなるポリペプ
    チドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項２記載のＤＮＡからなるベクタ
    ー。
  7. 【請求項７】 請求項６記載のベクターからなる宿主細
    胞。
  8. 【請求項８】 請求項７記載の宿主細胞からそのＤＮＡ
    によってコードされるポリペプチドを発現させることを
    特徴とするポリペプチドの製造法。
  9. 【請求項９】 ポリペプチドを発現する細胞の製造法で
    あって、細胞が請求項６のベクター中に含まれるヒトｃ
    ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現するよう
    に、該細胞を該ベクターで形質転換またはトランスフェ
    クションすることからなる方法。
  10. 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸配列に対して少
    なくとも７０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペ
    プチド。
  11. 【請求項１１】 配列番号２に示されるアミノ酸配列か
    らなるポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 配列番号２のアミノ酸１−３１７、ア
    ミノ酸６−３１７、アミノ酸２０−３１７およびアミノ
    酸２６−３１７からなる群より選択される請求項１１記
    載のポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１０記載のポリペプチドの生物
    学的活性を阻害する化合物。
  14. 【請求項１４】 請求項１０記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
  15. 【請求項１５】 請求項１０記載のポリペプチドの生物
    学的活性を活性化する化合物。
  16. 【請求項１６】 ＰＰＰ１Ｒ５を必要する患者の治療方
    法であって、請求項１０記載のポリペプチドの治療上有
    効量を該患者に投与することからなる治療方法。
  17. 【請求項１７】 ポリペプチドをコードするＤＮＡを患
    者に付与し、該ポリペプチドをインビボにて発現させる
    ことにより、該ポリペプチドの治療上有効量を投与する
    ことからなる請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 ＰＰＰ１Ｒ５ポリペプチドの阻害を必
    要とする患者の治療方法であって、請求項１３記載の化
    合物の治療上有効量を該患者に投与することからなる方
    法。
  19. 【請求項１９】 請求項１０に記載のポリペプチドの発
    現に関与する疾患または該疾患に対する感受性の診断方
    法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列にお
    ける突然変異を測定することからなる方法。
  20. 【請求項２０】 宿主から由来のサンプル中の請求項１
    ０記載のポリペプチドの存在について分析することから
    なる診断方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１０記載のポリペプチドのリガ
    ンドに結合して、それを阻害または活性化する化合物を
    同定する方法であって、 細胞表面に該ポリペプチドについてのリガンド（該リガ
    ンドは、化合物の該リガンドへの結合に応じて検出可能
    なシグナルを提供することのできる第２成分と結合して
    いる）を発現する細胞を、リガンドとの結合を可能とす
    る条件下で、スクリーニングすべき化合物と接触させ；
    該化合物と該ポリペプチドとの相互反応から生じるシグ
    ナルの有無を検出して、該化合物がリガンドと結合し、
    それを活性化するか、阻害するかを測定することからな
    る方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１０記載のポリペプチドのアゴ
    ニストとして活性な化合物を同定する方法であって、Ｐ
    ＰＰ１Ｒ５リガンドを発現する細胞型を含有する反応混
    合物とスクリーニングすべき化合物を接触させ；化合物
    がＰＰＰ１Ｒ５由来のシグナルを発するかどうかを測定
    し、該化合物が効果的なアゴニストであるかどうかを同
    定することからなる方法。
  23. 【請求項２３】 他のタンパク質との相互反応を阻害
    し、ＰＰＰ１Ｒ５の核への輸送を阻害してＰＰＰ１Ｒ５
    の核酸配列との相互反応を阻害する、請求項１０記載の
    ポリペプチドの生物学的活性のアンタゴニストとして活
    性な化合物を同定する方法であって、 ＰＰＰ１Ｒ５リガンドを発現する細胞型を含有する反応
    混合物とスクリーニングすべき化合物を接触させ；該化
    合物の結合後に該リガンドから生じるシグナルが無いこ
    とを確認し、該化合物が効果的なアンタゴニストである
    かどうかを同定することからなる方法。
JP9367479A 1996-12-05 1997-12-05 タンパク質ホスファターゼ１結合タンパク質ｒ５ Withdrawn JPH10201491A (ja)

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