JPH10201493A

JPH10201493A - 不妊と避妊のための透明帯抗原と抗体の調製法及び使用

Info

Publication number: JPH10201493A
Application number: JP10006947A
Authority: JP
Inventors: Boniter Su Dumber; スーダンバー，ボニター
Original assignee: Zonagen Inc
Current assignee: Repros Therapeutics Inc
Priority date: 1998-01-16
Filing date: 1998-01-16
Publication date: 1998-08-04

Abstract

(57)【要約】【課題】個体内で、透明帯上のエピトープに結合する
抗体の生産を誘発するのに有用な抗原を調製する。【解決手段】透明帯抗原に対する抗体の生産を可能に
するために、個体に免疫性を与える免疫性組成物及び免
疫方法が開示されている。免疫避妊法又は不妊のために
組換え分子及びそれに対するモノクローナル抗体を用い
ることもまた開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、個体(individual
s)の避妊又は不妊のための透明帯(ＺＰ)抗原及びモノ
(単)クローン抗体についての製法及び使用に関する。本
発明は免疫学的避妊にも関する。より具体的には、本発
明は、組換えＤＮＡ技術によって作られた透明帯(zona
pellucida)抗原を用いて妊娠しないように個体に自働的
又は活性的(actively)免疫を与え、又は透明帯抗原に抗
する又は反する作用を行なうようにモノクローン抗体を
作り個体に受動的(passively)免疫を与える免疫学的避
妊に関する。更に、本発明はＺＰ抗原に擬態(mimic)す
る抗遺伝型又は反遺伝型(anti-idiotype)のモノクロー
ン抗体を用いて、妊娠しないように個体に自働免疫を与
える技術に関する。本発明は、更に又、透明帯抗体に反
する作用又は抗する作用をする、モノクローンの抗透明
帯抗体又は反透明帯抗体(anti-zona pellucida antibod
y)、かかる抗体をエクスプレス(express)する新規なハ
イブリドーマ細胞、並びにかかるハイブリッド細胞(交
雑細胞)及び反透明帯抗体(抗透明帯抗体)を作る方法に
関する。

【０００２】

【従来技術及び解決しようとする課題】透明帯は細胞外
の複合的な糖タンパク質基質であって、哺乳動物の卵母
細胞を取り囲んでいる。この基質は、卵母細胞の成長初
期段階、及び卵胞(濾胞)の細胞分化の初期段階で形成さ
れ、子宮壁に着床するまでの間、卵母細胞及び胎児を保
護する役割を果たす(Cambridge Univ. Press、ケンブリ
ッジ、英国(1982)、オースチン他、「哺乳類の生殖：生
殖細胞と受精」)。更に、受精は精子が最初に透明帯に
固着し透明帯に侵入するのであるから、透明帯は受精過
程で重要な役割を果たす。卵母細胞の透明帯に結合した
後、精子は透明帯に侵入しなければならない。精子が透
明帯へ侵入できるのは、おそらく、アクロシンのような
精子酵素によって、透明帯要素が限定された範囲で加水
分解されるためと考えられる(Ann.Rev. Biochem. 43: 7
77(1974)、マクローリー他；Biol. Reprod.32:619(198
5)、ダンバー他)；Gam. Res. 1:65, 1978、スタンバ
ウ)。透明帯は、受精した後、無傷状態が維持されるた
め、胎児がうまく成育し、卵管中で胎児の融合が防止さ
れる(Science 138:594, 1962、ミンツ)。最後に、透明
帯は多数の精子が受精するのを阻止する役割を果たす。
哺乳類の中には、受精すると、透明帯に結合する精子を
変質させ、タンパク質分解消化に抵抗するものもある
(J. Exp. Biol. 33:358, 1956、オースチン及びブレイ
ドン)。

【０００３】人間に近い霊長類及び人間を含むその他の
種(sepcies)と比べて、囓歯類の透明帯の場合、その特
性は、主として生物学的、形態学的、生理学的及び免疫
化学的に変わる。これについては、Academic Press, p
p.139 (1983) ニューヨーク,ダンバー「受精のメカニズ
ムとコントロール(J. Hartmann, ed.)」；Oxford Univ.
Press, pp.505 (1983)、ロンドン、ダンバー「生殖免
疫における国際会議(Wegmann and Gill III, ed
s.)」)；Modern Cell Biology 3 (Satir, ed.) Alan R.
Liss, pp.77(1984)、ニューヨーク、ダンバー他、等を参
照することができる。哺乳類の透明帯は、主要な糖タン
パク質が、限られた数から構成されるけれども(Dev. Bi
ol. 76:185 (1980)、ブレイル他；Biol. Reprod. 24:11
11 (1981), ダンバー他；Biol. Reprod. (1987)ティモ
ンス及びダンバー)、種が異なれば、透明帯の構造的及
び機能的な関係は変動する。

【０００４】精子による卵母細胞の受精を抑制したり、
受精卵の着床を防止したり、又は卵巣の発育を防止する
ワクチンを作り出すのに必要な抗原及び抗体を相当量作
るための材料(物質)が十分でないため、免疫避妊を有効
にしかも経済的に行なうことはできなかった。初期の免
疫避妊法は、ほとんどうまく行かなかった。この方法
は、絨毛性生殖腺刺激ホルモン(hCG)や濾胞成熟ホルモ
ンのように自然発生の循環ペプチドを使用していた(Ple
num Press(G.P. Talwan), 1986 ニューヨーク、グリフ
ィン「避妊の免疫考察及び受精率の促進」)。通常、免
疫避妊において「循環(circulating)」抗原に抵抗する
抗体を用いると、免疫複合体が組織を損傷するという好
ましくない問題が生じる。さらに、「循環」抗原を用い
て免疫を与えても、受精抑制効果があまりないこともわ
かった。

【０００５】免疫学をベースにした避妊方法は、一般的
に利用されている外科的不妊法又は受胎調節ピル(人間
及びペットの場合)よりも望ましい。ピルの場合、一定
間隔で購入し服用せねばならないため、薬代に絶えずコ
ストがかかり、また、その効果もほんの一時的なものに
すぎない。このため、安全で、信頼性が高く、しかも経
済的にも安価に提供され、一時的又は永久的に個体の避
妊を行なえる抗原が要請されている。

【０００６】

【課題を解決する手段】本発明者は、免疫学的に不妊又
は避妊させるために、清浄化又は純化(purified)された
透明帯抗原を用いることに着目した。透明帯抗原を用い
て免疫性を与えることは、他の免疫学的避妊法よりも明
らかに利点がある。透明帯抗原による免疫は、だ胎作用
によるのではなく、受精を抑制するのである。この免疫
避妊法は、人間にとって特に好ましい。さらに、この方
法は卵巣の濾胞の発育を抑えて、永久的に不妊とするよ
うにもできる。ペットやその他動物をこのように永久的
に不妊とする場合にも、非外科的で行なうことができる
ので、これまでのような外科手術による危険性を伴った
り、費用がかかることもない。

【０００７】透明帯のタンパク質免疫避妊におけるその
他の利点として、数リットルの透明帯で受精を阻止でき
ることが挙げられる。これは、免疫避妊抗体の作用がそ
の部位で局部的に特有の性質を発揮すること、及び受精
を阻止しようとする個体中での透明帯タンパク質の自然
発生量を限定することによるものである。帯層抗原の組
織特性に関するこれまでの研究は、卵巣についてのもの
であり、抗原は循環しない。これに対して、ホルモンタ
ンパク質は個体の中を循環して、はるかに高いレベルで
生じる。また、循環する抗原のレベルは個体の生理学的
な状態によってもおおいに変動する。

【０００８】さらに、精子抗原の免疫避妊を有効ならし
めるために必要な精子抗原のレベルは、腟管及び子宮腔
の精子量によって変化する。種々の動物のＺＰタンパク
質は、免疫学的に交叉反応性(crossreactive)であるた
め、避妊させたい動物の免疫抗原を発育させる必要性は
ない。

【０００９】本発明の１つの目的は、免疫学的な方法で
効果的に避妊させる方法を提供することにある。この方
法によれば、１回(又は最少)の投与を行なうだけですむ
から、医師(人間の場合)又は獣医(動物の場合)に絶えず
かかわる必要はなくなる。また、永久的に不妊又は去勢
(ペットの場合に望ましい)とすることもできるし、一時
的に不妊(人間や飼育ペットの場合に望ましい)とするこ
ともできる。

【００１０】また、免疫避妊に使用するための透明帯抗
原及び抗体の供給が限られていることが、従来法の不利
な点の１つであった。これに対し、本発明は、免疫避妊
を行なうための透明帯抗原及び抗体は、組換えＤＮＡ技
術によって作られた透明帯抗原、モノクローン透明帯抗
原及びＺＰ反遺伝型抗体のように、入手源がきわめて豊
富である。抗原及び抗体は、組換えＤＮＡ技術及びハイ
ブリドーマ技術を用いて多量に作ることができるため、
コストが安いという追加の利点がある。

【００１１】本発明は抗原の調製、及び透明帯抗原中に
見い出されるエピトープの決定因子と反応する抗体を誘
発(induce)させるために動物に免疫を与える方法に関す
る。本発明は、さらにまた、モノクローンの反透明帯抗
体、かかる抗体をエクスプレスする新規なハイブリドー
マ細胞、並びにかかるハイブリッド細胞及び反透明帯抗
体を作る方法に関する。さらに、本発明は反遺伝型透明
帯のモノクローン抗体、及び該抗体の使用による自働又
は活性免疫避妊に関するものである。

【００１２】個体の抗原(例えば、糖タンパク質(glycop
rotein))は、多くの抗原決定因子、即ち「エピトープ」
を有していてもよく、この因子は抗体によって認識(rec
ognize)される。エピトープには、アミノ酸配列、炭水
化物残分、配座(conformational)又は「形状(shape)」
の決定要素、或は２つの異なる分子又はペプチドが相互
作用する部位が含まれる。透明帯構造の糖タンパク質に
は、これら種類の決定要素がすべて含まれる(Bio. Repr
o. 30:445 (1984), ドレルとダンバー：Biol. Repro. 3
6:1275 (1987), ティモス)。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明の第１の実施例では、組換
えＤＮＡ技術を用いることにより、透明帯タンパク質抗
原のポリペプチド部を含む抗原を作るものである。本発
明のタンパク質の実施例では、透明帯タンパク質のポリ
ペプチド決定因子部を含む抗原を、組換えＤＮＡ技術を
用いて作るものである。なお、これらの組換えポリペプ
チド、及びその同族体(analogs)は、ここではこれらを
総合的に、組換え透明帯タンパク質と称するものとす
る。

【００１４】「透明帯(zona pellucida)タンパク質」の
用語には、天然的に自然発生する透明帯タンパク質、組
換えによる透明帯タンパク質及びその同族体と、同じア
ミノ酸配列をもったポリペプチドを含むものとする。
「同族体」という用語には、ポリペプチドが透明帯タン
パク質の抗原的及び生物学的活性が実質的に同じなら
ば、１種又は２種以上のアミノ酸の添加、削除又は置換
による透明帯タンパク質とは異なるタンパク質又はポリ
ペプチドを含むものとする。これらの同族体は、透明帯
タンパク質の選択された決定因子の部位を含んでいる。
これらの抗原剤を用いて、動物を免疫し、抗体を作るこ
とができる。本発明にあっては、本発明の抗原剤(抗原
調製物)及び免疫反応高揚要素を有する薬組成物も又、
薬学的に適当なキャリヤと共に、本発明に包含されるも
のである。このように、一実施例において、本発明は、
透明帯タンパク質又はそのパーツのアミノ酸配列を含む
ほぼ純化されたポリペプチド、透明帯タンパク質の暗号
をもったＤＮＡ配列を含むエクスプレッション運搬体(e
xpression vehicles)、かかるエクスプレッション運搬
体で改質した宿主、宿主中に透明帯タンパク質を作る方
法、及び透明帯の組換えタンパク質を有する薬組成物で
動物に免疫性を与えることにより動物の体内に透明帯抗
原に対する抗体の生成を誘発する方法を包含するもので
ある。

【００１５】他の実施例において、本発明はモノクロー
ンの反透明帯抗体、かかる抗体をエクスプレスする新規
なハイブリドーマ細胞、及びかかるモノクローン抗体を
用いて免疫学的に避妊する方法を含むものである。

【００１６】免疫性がもたらされたドナー(donors)から
の骨髄腫細胞と脾臓細胞を融合することにより、均質な
(homogeneous)抗体を得ることに成功した。このように
して、遺伝学的に安定なハイブリドーマ細胞であって、
悪性腫瘍及び特異性ビールス及びそれらの抗原決定因子
に抗するモノクローン抗体を大量に作ることができるハ
イブリドーマ細胞の連続的な細胞系統(cell lines)を開
発した。

【００１７】コプロウスキー及びその他の物に付与され
た米国特許第４１７２１２４号には、悪性腫瘍に特異性
(specificity)を示す抗体は、体細胞ハイブリッドによ
って、ヒポキサンチン燐リボスチルトランスフェラーゼ
が欠乏する悪性腫瘍と、先に腫瘍細胞が注入された動物
から得た脾臓又はリンパ細胞との間に作られることが記
載されている。さらにまた、コプロウスキー及びその他
の物に付与された米国特許第４１９６２６５号には、遺
伝学的に安定な融合細胞ハイブリッドであって、特定の
ビールス及びそれらの抗原決定因子に抗するモノクロー
ン抗体を大量に作ることができるハイブリッドの連続的
な細胞系統を作ることができることが記載されている。

【００１８】このような細胞融合技術を用いることによ
り、反透明帯抗体、例えば免疫避妊抗体を、安定して供
給することができ、信頼性も高い。個体の免疫は活性的
(自働的)又は受動的に行なうことができる。「活性(自
働)免疫」という用語は、抗原又は免疫原(immunogen)が
個体に投与され、個体の免疫系統が抗原に抗する個体を
作ることを意味する。免疫抗原は、個体が抗体を作るこ
とのできるものであればどんな物質を用いることもでき
る。本発明にあっては、個体を避妊又は不妊とするため
に、個体を自働免疫するために有効な抗原には、グリコ
シル化(glycosylated)しているか否かに拘らず、組換え
によって作られたＺＰ抗原(ｒＺＰ)と、反遺伝型ＺＰ抗
体が含まれる。「受動免疫」という用語は、個体の外部
のインビトロで作られた抗体が、免疫避妊のために個体
に投与されることを意味する。本発明のＺＰモノクロー
ン抗体は、個体に投与されると、このような受動免疫を
作り出す。

【００１９】モノクローン抗体でＺＰ抗原に受動免疫す
ることにより、一時的(望ましくは数か月間)に不妊状態
となる。反ＺＰモノクローン抗体は、透明帯に結合又は
侵入する精子に干渉することにより、受精を抑制するも
ので、このとき卵巣機能に悪影響を及ぼすことはない。
このように、本発明の免疫避妊方法は、透明帯抗原に反
作用するモノクローン抗体を投与することにより受動的
に行なうことができるし、或は組換えＤＮＡ技術により
作られた透明帯抗原又は反遺伝型モノクローン抗体を投
与することにより自働的に行なうこともできる。均質な
抗体(例えば、モノクローンの抗体)を抗原として用いる
とき、分子の部分は、免疫をもった宿主が応答し、抗原
決定因子として認識される。抗原性決定因子を認識する
均質抗体の特有の組合せ部位は「遺伝型」と称される。
このため、抗体のこれらの部位に抗して作られた抗体
は、「抗遺伝型又は反遺伝型」と称される。これらの抗
体は「内部像(internal images)」を有してもよく、も
とのインミュノジェンに擬態する活性を有することもで
きる(Proc. Soc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75:2443 (19
78),セージ，ケイとピーターソンP.A.: Proc. Soc. Nat
l. Acad. Sci. (USA) 77: 7385 (1980), シュライバー
他)。

【００２０】モノクローン抗体(ＰＳＩ)は、図８に示す
ように、精子が透明帯の表面に結合するのを抑制するＺ
Ｐの炭水化物成分を認識する。ＰＳＩのモノクローン抗
体は、反遺伝型抗体を作るための免疫原として用いるこ
とができる。抗体は免疫学的に不妊又は避妊とするため
に用いることができる。モノクローンの反透明帯抗体に
結合する決定因子は、クローン化し、組換えＤＮＡ技術
を用いて改質(modify)することにより、ＺＰ抗原性決定
因子に抗する「単一鎖抗体」を作ることができる(Proc.
Acad. Sci. USA 81:3273 (1984), キャビリー他；Nucl
eic Acids Research 12:3791 (1984), ボス他)。

【００２１】その最も基本的なレベルにおいて、発明
は、透明帯抗原を遺伝学的に設計調製することを明らか
にすると共に、受精、着床(implantation)、卵胞の発育
及びそれに引き続く卵巣のホルモン形成機能を防止する
ことを目的として、動物の免疫系統を刺激し、透明帯抗
原に対する抗体の形成を誘発させるために前記の抗原を
利用する方法を明らかにするものである。

【００２２】発明者は、組換えＤＮＡ技術を用いて、透
明帯抗原をコード化したｃＤＮＡを作る方法を考案し
た。ＺＰｃＤＮＡは、エクスプレッションベクターλ
ｇｔ11の中に挿入される。このエクスプレッションベク
ターを用いて大腸菌(E.coli.)を形質変換(transform)さ
せる。クローンをエクスプレスするＺＰタンパク質又は
その決定因子は、ＺＰ抗体結合によって識別される。一
本鎖ファージから分離したＤＮＡを、ＺＰ抗原をエクス
プレスするために、ＤＮＡのコピー(転写物)及びｃＤＮ
Ａを作り出すための鋳型(template)として用いる。ＺＰ
ＤＮＡ配列をコード化したλｇｔ11 ファージＤＮＡ
を、ｐＥＸベクターの中に挿入する。ｐＥＸを用いて、
ＤＮＡがエクスプレスされる細菌宿主に形質転換させ、
免疫避妊に使用できるＺＰ抗原を大量に作るものであ
る。

【００２３】親和純化した(affinity purified)ＺＰ抗
体でλｇｔ11圧出ライブラリをスクリーニングすること
によって選択された３つの９ｃＤＮＡエクスプレッシ
ョンクローンの部分的ＤＮＡ配列を求めるのに、Ｍ13ク
ローン化法(Proc. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977),サ
ンガー他)が用いられていた。すなわち、クローン法は
ジデオキシ連鎖停止反応法であって、透明帯ＤＮＡは糸
状(filamentous)のバクテリオファージＭ13の中にクロ
ーンが形成される。

【００２４】透明帯の遺伝子が、原子核をもつ宿主大腸
菌の中でエクスプレスされると、作り出されるポリペプ
チドはグリコシド化(glycosylated)していない。このた
め、主なブタのＺＰポリペプチドの分子重量は、約35、
55及び80Kdである。また、主なラビットのＺＰポリペプ
チドの分子重量は、50、75、85Kd(表１)であり、グリコ
シル化した分子(表１)に対して観察される値よりも低
い。例えば、原核生物の中で、透明帯ポリペプチドの暗
号をもつ透明帯ＤＮＡから生産された透明帯タンパク質
は、「ｒＺＰ」又は「組換え透明帯タンパク質」として
称される。更に、透明帯タンパク質の暗号をもつ遺伝子
が真核生物の中で作られると、タンパク質はグリコスチ
ル化され、このグリコスチル化したタンパク質は「ｒｇ
ＺＰ」と称される。「免疫学的に関連ある抗原」とは、
透明帯タンパク質に対して、重要なゲノム相同関係を有
する抗原を意味しており、これらのＤＮＡによってエク
スプレスされた生産物は、免疫学的に交叉反応性をもち
意義のあるレベルを示す。このような免疫学的に関連あ
る抗原の例として、自然発生するＺＰ抗原よりも多少の
アミノ酸を含むポリペプチドが挙げられる。これは、透
明帯ポリペプチドと免疫学的又は生物学的に重要な性質
である交叉反応性を有している。

【００２５】本発明の中で使用される「宿主」には、原
核生物だけではなく、植物細胞及び動物細胞と同じよう
に、酵母(イースト)及び糸状の菌類をも含むものとす
る。「原核生物」には、透明帯をエクスプレスするため
のＤＮＡ又はｒＺＰタンパク質で形質転換され得る細菌
をすべて含むものとする。「真核生物」には、透明帯を
エクスプレスするためのＤＮＡ又はｒＺＰタンパク質で
形質転換され得る酵母、菌類、動物細胞及び植物細胞の
すべてを含むものとする。

【００２６】透明帯タンパク質のＤＮＡは、どんな哺乳
類からでも得ることができる。糖タンパク質の遺伝子配
列が原核有機体又は真核有機体の中でエクスプレスされ
ることが必要とされるすべてである。透明帯ＤＮＡの配
列が、哺乳動物類(例えば、ブタ、ラビット、イヌ、ネ
コ又は人間等)の間で免疫学的に交叉反応性を有するこ
とが特に望ましい。

【００２７】いわゆる当業者であれば周知のどんな技術
を用いて宿主を変化する場合にも、透明帯タンパク質の
暗号をもつ組換えＤＮＡ分子を使用することができる。
なお、原核生物の変換のためには、透明帯の暗号をもっ
た配列を含むベクターを使用することが特に望ましい。

【００２８】本発明の透明帯組換えタンパク質(ｒＺＰ)
は、自然発生、すなわち天然の透明帯タンパク質のアミ
ノ酸配列と比較して、その端部側面(flanking ends)に
おいて多少のアミノ酸を有することができる。

【００２９】「実質的にピュア(substantially pure)」
という用語を、本発明の透明帯タンパク質に適用する場
合、ポリペプチドは、その天然の状態で透明帯タンパク
質と正常な関連性を有したり、定常的に増殖可能な電気
泳動又はクロマトグラフ応答、溶離プロフィール(eluti
on profiles)、及び抗原活性を呈する、といったその他
の卵巣タンパク質を含まないことを意味する。「実質的
にピュア」という用語は、透明帯タンパク質とその他化
合物との人工又は合成混合物を排除するものではない。

【００３０】融合によって、リンク作用する遺伝子を作
り、これら遺伝子を細菌の中にエクスプレスする方法は
知られており、例えば米国特許第４３６６２４６号に開
示されている。ここに記載した遺伝子の製造及び方法
は、原核生物又は真核生物宿主中の透明帯タンパク質の
エクスプレスを行なうために利用することができる。

【００３１】原核生物の宿主は、グラム陰性細菌又はグ
ラム陽性細菌でもよく、例えば、大腸菌、S. Tymphimur
ium、セラチア属マルセッセン、枯草菌が挙げられる。
真核生物の宿主は、ピチアパストリス(Pichia pastori
s)又は哺乳類の細胞のような酵母でもよい。

【００３２】一般的には、エクスプレッションベクター
は、挿入されたＤＮＡ断片の転写を効率良く行なわせる
ためのプロモータ配列を含んでおり、そのベクターが宿
主と共に使用される。エクスプレッションベクターは、
通常、複製(replication)の原体(origin)、プロモー
タ、ターミネータを含み、さらに、トランスフォームす
なわち形質転換された細胞の中で表現選択を行なう能力
のある特異遺伝子を含んでいる。トランスフォームされ
た宿主は、当該分野で知られた手段により、発酵及び培
養させることにより、最適な細胞に成長させることがで
きる。

【００３３】本発明で使用することができるプロモータ
の例として、rec A、trp、lac、tac、及びバクテリオフ
ァージラムダｐＲ又はｐＬが挙げられるが、これらに限
定されるものではない。本発明で使用することができる
プラスミド又はバクテリオファージの例として、モニア
ティス他による「Molecular Cloning」(コールドスプ
リングハーバーラボラトリーズ，1982年)の中に掲げ
られたものが挙げられるが、いわゆる当業者であればこ
れ以外にも適当なものを用いることができる。

【００３４】本発明は、前述した方法によって変質させ
た(modified)どんな宿主に対しても、また当業者であれ
は一般的に知っている方法によって変質させたどんな宿
主に対しても適用することができ、透明帯タンパク質の
遺伝子をエクスプレスする原核生物又は真核生物を産生
できる。なお、当業者が知っている方法として、例え
ば、溶原性ファージを用いて遺伝性物質をトランスファ
ーする方法が挙げられる。

【００３５】遺伝子は、その鋳型または伝令ＲＮＡを通
じて、特異ペプチドに対して特徴的なアミノ酸配列を暗
号化したＤＮＡ配列である。ｃＤＮＡという用語には、
介在配列が除去された遺伝子を含むものとする。ｒＤＮ
Ａという用語は、ｃＤＮＡ又はゲノムのＤＮＡ配列を試
験官内(インビトロ)でスプライシングして組み換えられ
た分子を意味する。

【００３６】クローンを作る運搬体、すなわちクローニ
ング運搬体は、プラスミド又はファージＤＮＡ又は、宿
主細胞内で複製することができるその他のＤＮＡであ
り、１つ又は少数のエンドヌクレアーゼ認識部位によっ
て特徴づけられる。その部位にて、かかるＤＮＡ配列等
は、ＤＮＡの本質的生物学的機能を損なうことなく、決
定因子が備わるように切り取ることができる。また、運
搬体には、形質変換された細胞の識別に使用される適当
なマーカーを含んでいる。マーカーは、例えばテトラサ
イクリン抵抗体又はアンピリシン抵抗体が挙げられる。
「ベクター」の用語は、クローニング運搬体として使用
することもある。エクスプレッション運搬体は、クロー
ニング運搬体と同様な運搬体であるが、通常の場合、制
御配列のコントロールを受けながら、宿主の中で構造遺
伝子をエクスプレスする能力を有する。

【００３７】透明帯タンパク質を透明帯ゲノムで形質変
換した宿主は、透明帯ポリペプチド及びタンパク質の製
造に特に有用であり、動物の免疫に使用することができ
る。既に説明したように、透明帯タンパク質のゲノムが
バクテリア内でエクスプレスされると、グリコシレーシ
ョンは起こらない。このため、全長組換え透明帯タンパ
ク質の分子重量は、天然又は自生の分子よりも小さい
(表１参照)。組換え透明帯タンパク質は、透明帯タン
パク質のアミノ酸配列全体でもよいし、特異な決定因子
だけでもよい。透明帯組換えタンパク質で免疫を与えら
れた動物は抗体を作り、この抗体が組換えポリペプチド
又は天然ポリペプチドに存在するエピトープに結合す
る。このように、透明帯を含有する組換えタンパク質を
商業的規模で作ることができる。

【００３８】本発明で使用される「免疫学的な有効量」
とは、動物の中で透明帯エピトープに結合する抗体を作
るのに必要な透明帯抗原の量を表わすものとする。「個
体」という用語は、一切の動物を含むが、望ましくは哺
乳動物、最も望ましくは、ネコ、イヌ、ウシ又は人間を
含むものとする。

【００３９】本発明の透明帯組換えタンパク質は、動物
の免疫系統を感作(sensitize)するのに特に有効であ
る。このため、その１つの結果として、透明帯に存在す
るエピトープと反応する抗体が作られる。

【００４０】個体の免疫は自働的又は受動的に行なうこ
とができる。「自働(活性)免疫」という用語は、抗原又
は免疫原が個体に投与され、個体の免疫系統が抗原に抗
する個体を作ることを意味する。免疫抗原は、個体が抗
体を作ることのできるものであればどんな物質を用いる
こともできる。本発明にあっては、個体を避妊又は不妊
とするために、個体を自働免疫するために有効な抗原に
は、グリコシド結合しているか否かに拘らず、組換えに
よって作られたＺＰ抗原(ｒＺＰ)と、反遺伝型ＺＰ抗体
が含まれる。「受動免疫」という用語は、個体の外部の
インビトロで作られた抗体が、免疫避妊のために個体に
投与されることを意味する。本発明のＺＰモノクローン
抗体は、個体に投与されると、このような受動免疫が作
られる。

【００４１】個体が卵巣の熟成前にＺＰ抗原又は反遺伝
型抗体で免疫が与えられると、卵巣の発育は著しく阻止
され、取戻し不可能な永久不妊にすることができる。こ
の方法によって、免疫を与えて動物を避妊させることが
でき、特にネコやイヌのような生殖させたくないペット
などの動物に適用することが望ましい。このようなＺＰ
免疫避妊法の場合、コストが高くて潜在的な危険を伴う
外科的処置は不要となる。免疫避妊には、他の種に対し
ても免疫学的に交叉反応する透明帯ペプチドが望まし
い。ブタ又はラビットの卵巣から得た透明帯を暗号化し
たＤＮＡが望ましい。

【００４２】他の実施例において、本発明は透明帯のモ
ノクローン抗体をエクスプレスする新規な連続ハイブリ
ドーマ細胞系統を明らかにし、さらに抗体の製造にかか
る細胞系統の使用、及びかかる細胞系統の製造を明らか
にする。本発明は、さらに受動避妊に使用される反透明
帯抗体を大量に獲得する方法を明らかにする。

【００４３】本発明によれば、反透明帯抗体をエクスプ
レスする新規な連続ハイブリドーマ細胞系を得るには、
透明帯タンパク質、望ましくは透明帯の組換えタンパク
質、最も望ましくは天然の透明帯抗原で動物に免疫を与
え、抗体生産細胞の間に、融合したハイブリッド細胞を
免疫が与えられた動物及び骨髄腫細胞から形成し、ハイ
ブリッドのクローンを作り、反透明帯抗体をエクスプレ
スするクローンを選択することにより行なわれる。より
具体的には、マウスその他の動物に、精製した透明帯抗
原が注入され、動物の脾の抗体生産細胞は、癌型のマウ
ス細胞又は骨髄腫の細胞と融合される。そのような抗体
を生産する細胞のクローンは、連続細胞系統として選択
され、成長する。これから、大量の反透明帯抗体を得る
ことができる。

【００４４】或は又、クローンのハイブリッド細胞を、
組織適合性(histocompatable)のある動物の中に注入し
て増殖させ、高レベルの反透明帯抗体を作ることができ
る。細胞は、動物の腹水症流動体(ascites fluid)から
再生(recover)できる。このように、本発明は、免疫避
妊に使用される反透明帯抗体を、かなり大きな規模で、
高い信頼性をもってしかも安定して供給することを可能
ならしめるものである。「免疫避妊」という用語は、免
疫学的介在法によってもたらされるものであって、後で
受精可能な一時的避妊、再び受精ができない永久避妊、
又は不妊を含むものである。

【００４５】本発明は、一時的な不妊症をもたらすため
に行なう受動免疫のためのモノクローンＺＰ抗体の使
用、又は作働免疫のための天然抗原(Immunological Re
v. 94:25, 1986, アーランジャー他)の構造に擬態する
反遺伝型抗体の使用を含むものである。

【００４６】透明帯組換えタンパク質とモノクローン抗
体への投与は、注入、長いインプラントを用いる方法(l
ong release implants)、迅速注入(rapid infusion)、
静脈又は鼻腔からの吸収(absorption)、皮膚吸収等の非
経口的投与、及び経口投与により行なうことができる。
非経口投与の調製物として、無菌又は水性又は非水性溶
液、懸濁液及びエマルジョンが挙げられる。非水性溶剤
の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、オリーブ油の如き野菜油、オレイン酸エチルの
如き注入可能な有機エステル等が挙げられる。閉鎖包帯
(occlusive dressings)用キャリヤを用いて、皮膚の浸
透性を高め、抗原の吸収を高めることができる。経口投
与するときの液体の形態は、一般的には、液体の投与形
態を含んだリポソーム溶液である。液体投与の適当な形
態として、エマルジョン、懸濁液、溶液、シロップ、及
びエリキシル等を挙げることができる。なお、これらに
は、例えば清浄水のように、当該分野で一般的に知られ
ている不活性の希釈剤が含まれる。不活性の希釈剤の他
に、補助薬すなわちアジュバント(adjuvants)、湿潤
剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味剤及び香料等も更に
含めることができる。

【００４７】本発明にかかる透明帯の組換えタンパク質
を含有する抗原性調製物の場合も、アジュバントを含め
ることができる。アジュバントは、特異な免疫応答を非
特異的に促進するために使用される物質である。通常の
場合、アジュバントと抗原は、免疫系統に与えられる前
に混合されるか、又は別個に与えられる。但し、免疫を
もたせるべき動物の同じ部位に与えられる。アジュバン
トは、それらの組成に応じて、幾つかのグループにばら
ばらに(loosely)分割される。これらのグループには、
油アジュバント(フロイントの完全アジュバント及び不
完全アジュバント)、鉱物塩(例えば、AlK(SO₄)₂、AlNa
(SO₄)₂、AlNH₄(SO₄)、シリカ、アラム、Al(OH)₃、Ca₃(P
O₄)₂、カオリン及びカーボン)、ポリヌクレオチド(例え
ば、ポリIC酸及びポリAU酸)、及び天然物質(例えば、結
核菌からのワックスＤの他、コリネバクテリウムパルブ
ム(Corynebacterium parvum)の中に見い出される物質、
百日咳菌及びブルセラ属の一部)が含まれる。

【００４８】本発明にかかる透明帯抗原の調製物を動物
の体内で使用することにより、透明帯のエピトープ決定
因子に結合する抗体を作ることができる。透明帯に対す
る抗体の生産を向上させる上で特に有用な方法は、先ず
動物に、本発明にかかる透明帯の抗原性調製物で第１の
免疫を与え、その後、第２の免疫を与える方法である。

【００４９】最初の免疫は、動物の年齢が重要なものと
なる。永久的に免疫避妊又は不妊とするには、動物の青
春期が始まる２〜３か月前の年齢の時に免疫を与えるの
が最も望ましい。この時が、卵巣の成熟に最も著しく干
渉するからである。受精を回復ならしめるように避妊す
るには、卵巣の濾胞が発達した後でエクスプレスしたＺ
Ｐ抗原を用いればよい。

【００５０】動物に免疫が与えられたか否かは、透明帯
抗原に対する動物の免疫状態を判断することによって知
る方法がある。この評価は、本発明にかかる透明帯の組
換えタンパク質を免疫検定(immunoassay)を用いて、透
明帯に対する抗体を検出することができる。免疫検定と
して、例えばELISA検定(Biol. Reprod.30:445, 1984、
ドレルとダンバー)が知られている。その場合におい
て、透明帯に対する個体抗体のタイター(titer)が十分
に高い時、すなわち、確実に免疫がもたらせれて妊娠を
予防できる時を判断することが可能である。

【００５１】多くの免疫養生法(immunization regimen)
が利用されるとき、免疫法のタイミングによって異なる
多くの技術がある。本発明にかかる抗原性調製物を２回
以上用いることが可能であり、これによって、免疫が与
えられた動物によってエクスプレスされた免疫グロブリ
ンのレパートリーのエクスプレッションのレベルを高
め、多様性(diversity)を増すことができる。複数免疫
法による場合、一般的には、１〜６か月間の間隔があけ
られる。

【００５２】動物に投与された透明帯の組換えタンパク
質の適量は、年齢、状態によっても異なる。また、免疫
の目的が避妊するためか、または卵巣を去勢するためか
によっても異なるし、それ以外のその他の要因によって
も異なる。しかし、当該分野の専門家であれば、投与す
べき量は容易に確認できるし、調節することもできる。

【００５３】本発明にかかる抗原性調製物の投与は、１
回でもよいし、複数回でもよい。透明帯抗原の投与量
は、１回につき、0.01〜5g/mlの範囲で変えることがで
きる。なお、より望ましくは、0.05〜1.0g/mlであり、
最も望ましくは0.1〜0.5g/mlである。

【００５４】本発明の概要を説明したが、以下の具体的
の実施例を参照することにより、本発明をより完全に理
解することができる。なお、これらの実施例は、例示的
なものであって、特に指定しない限り、本発明を限定す
るものと解すべきではない。

【００５５】

【実施例】実施例１ＺＰタンパク質の分離と多クローン性抗体の調製Ａ．透明帯(ＺＰ)の分離(isolation) 透明帯(ＺＰ)を、Biol. Repr.25(2):439(1981)に記載さ
れたウッド他による方法に基づいて分離した。２つのホ
ィール(直径10cm)を備え、50列にそろえたカミソリ刃の
間をステンレス鋼のワッシャー(２mm)で夫々仕切った装
置を用いた。２つのホィールのうち一方は固定し、他方
のホィールはチェーンを介して回転ハンドルに取り付け
た。樹脂ガラス製タンク内に浸漬したカミソリ刃のホィ
ール間に、卵巣を落とした。なお、タンク内には、pH7.
2の0.01Ｍリン酸塩緩衝液(ＰＢＳ)を６リットル、クエ
ン酸ナトリウム２mＭ、及びＥＧＴＡ２mＭが入れられて
いる。約300個の卵巣をカミソリ刃のホィールを通過さ
せた後、破裂した卵巣を樹脂ガラスのタンクの底部の10
00μmメッシュの着脱式ナイロンスクリーン上に沈積さ
せた。スクリーンを取り外して卵巣を緩衝剤(buffer)か
ら分離し、十分に洗浄を行なって卵巣に付着した卵母細
胞を取り除いた。卵母細胞と透明帯は、次に種々サイズ
のナイロンメッシュスクリーンを通し、ふるい分けして
分離した。卵母細胞は、均質化され、50ミクロンメッシ
ュのナイロンスクリーンを通して洗浄し、帯層を保持し
た。この方法を用いたとき、８時間で約100,000〜300,0
00のＺＰを分離することができた。

【００５６】Ｂ．ＺＰタンパク質の清浄化(purificatio
n) 分解力(resolution)の大きい二次元のポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法(ＰＡＧＥ)を用いて、ＺＰタンパク質
を清浄化(ピュア化)した。ＰＡＧＥは、前述したよう
に、Biol. Repr. 24:1111(1981)の中にダンバー他が記
載している。この方法は、第１の次元では等電集束法に
よってタンパク質を分離し、第２の次元ではポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法(ＰＡＧＥ)を用いて、硫酸ドデ
シルナトリウム(ＳＤＳ)を分離する。

【００５７】約30,000の帯層のペレットを、300μlの可
溶化緩衝剤、２％のＳＤＳ、２％のβ−メルカプトエタ
ノール、及び１％のシクロヘキシルアミノスルホン酸
(ＣＨＥＳ)を含み、pH9.5〜9.6の水中にて再び懸濁させ
た。４％ＰＡＧＥ(1.8％のビスアクリルアミド交差結合
剤(cross-linker)を含む)ゲル毎に40マイクロリットル
加えた。pH範囲が3.5〜10と広いアムフォライン(amphol
ines)(ＬＫＢ)をＰＡＧＥゲルに添加した。ゲルは、200
Ｖで２時間予備集束した後、25℃、400Ｖにて16時間集
束させた。

【００５８】第２の次元のＳＤＳＰＡＧＥに対して
は、スラブゲル(slab gel)(10−20％勾配のポリアクリ
ルアミド及び0.8％ビスアクリルアミド交差結合剤)を用
いた。ゲルは、室温にて染料(dye)の先端がゲルの底部
に達するめで、約３アンペアで電気泳動を行なった。タ
ンパク質は、染色法により、クマシーブルー又はシルバ
ーの何れかにより識別することができる。ＺＰ抗原は、
グリコシレーションの進行によって、電荷及び分子重量
の両方において異質を呈する独特のタンパク質プロフィ
ールを有している。ＺＰ抗原は、以下に記載するよう
に、電気泳動によってニトロセルロースにトランスファ
ーした後、図１に示すように、免疫ブロット(immunoblo
t)により識別した。ＺＰタンパク質は、電気泳動により
ゲルから溶離した。ＺＰタンパク質のＮターミナル配列
は、Meth.Enzymol. 91:227 (1983)にハンクピラー他が
開示した方法により求めた。

【００５９】主なブタのＺＰポリペプチドの分子重量
は、約35、55及び80Kdである。また、主なラビットのＺ
Ｐポリペプチドの分子重量は、50、75、85Kd(表１)であ
り、グリコシル化した分子(表１)に対して観察される値
よりも低い。

【００６０】

【表１】

【００６１】実施例２多クローン性ＺＰ抗体の調製多クローン性抗体を雌ラビット又は去勢した雄ヒツジ
に、すべて熱で可溶化した300〜500μgの透明帯(ＨＳＺ
Ｐ)(0.01Ｍの炭酸ナトリウムの緩衝剤中60〜65℃、pH9.
5で１〜２時間)にて、免疫を与えることによって調製し
た。或はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥゲルで分離した精製ＺＰ
タンパク質約50〜200μgを用いて免疫化した。タンパク
質のすべての試料を１mlの水中で懸濁し、注入前にフロ
イントの完全アジュバントを用いて乳化した。動物の皮
層内の肩甲骨の下の多くの部位に注入し、４週間後、初
期免疫の使用量の半分のＺＰタンパク質を用い、フロイ
ントの不完全アジュバントの中でブーストした。幾つか
のものについては、フロイントの完全アジュバントを用
いて毎月、追加のブーストを行ない、より高い抗体のタ
イターを得ることができた。

【００６２】抗体は、酵素結合免疫検定(ＥＬＩＳＡ)法
又は免疫ブロット法を用いて、分析し特徴づけた。ＥＬ
ＩＳＡ検定では、ベクターラボラトリーから入手したベ
クタ染料キット(Vecta Stain Kits)を用いて、ラビッ
ト、ヒツジ又はマウスの免疫グロブリンを検出した。こ
の検定のために、0.1ＭのNaCO₃、pH9.0のＨＳＺＰタン
パク質50−100μgを96のくぼみ付滴定トレイのくぼみ内
に添加した。次に公知の方法により、キットの指示に基
づいて検定を行なった。免疫ブロット法では、前述した
Biol. Repr. 36:1275にティモンズ他が開示した方法を
用いて、特異なＺＰ糖タンパク質とペプチドの識別をし
た。未染色、未固定の２Ｄ−ＰＡＧＥゲルをニトロセル
ロース紙(Bio-Rad)のカソード側に載せ、Ｅ−Ｃ電気ブ
ロットトランスファーユニットを用いて、1.3Ａにて2.5
時間トランスファーを行なった。ニトロセルロース紙は
次に10mMのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(ト
リス)−塩水(saline)、pH7.2の中で、３重量％ウシ血清
アルブミン(ＢＳＡ)と0.01％のアジ化ナトリウムを用い
て、１晩中閉塞(block)した。その後、トリス−塩水−
アジド(ＢＳＡなし)を２回交換して洗浄した。多クロー
ン性血清(１−５ml)又はモノクローン抗体の上澄(100μ
g/mlの免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)を、50mlのトリス−塩
水−アジド(ＢＳＡ)の中で希釈し、25℃にて１晩中揺す
りながら、ニトロセルローストランスファーで培養し
た。その後、トリス−塩水−アジド(ＢＳＡなし)を２回
交換して洗浄した。

【００６３】次に、ニトロセルローストランスファー
を、多クローン性血清用¹²⁵Ｉ−タンパク質Ａ又はモノ
クローンの上澄用¹²⁵Ｉ−ヤギ、アンチマウスＩｇＧで
培養した。50mlのトリス−塩水−アジド中の合計10⁶cpm
を各トランスファーに添加し、揺すりながら１晩中培養
した。空気乾燥前に、トリス−塩水−アジド(ＢＳＡ)の
中で十分洗浄し、コダックXAR-5のエックス線フィルム
に露出して放射能写真を撮影した。

【００６４】抗体は、ＺＰタンパク質に接合したＣＮＢ
ｒ活性化セファローズ(Sepharose)を用いて親和清浄化
を行なった。ＣＮＢｒ活性化セファローズ４Ｂ樹脂(Pha
rmacia)を用いて親和カラムを調製した。樹脂は熱可溶
化ＨＳＰＺ又はＨＳＲＺ(ラビットの熱可溶化透明帯タ
ンパク質)のどちらか一方に結合した。約１mg/mlのＺＰ
調製物を、前述したように、pH9.6の可溶化緩衝剤の中
で作った。ＺＰは、結合緩衝剤(0.1Ｍ NaHCO₃; 0.5M Na
Cl, pH 8.3)の中で懸濁させた。樹脂を洗浄し、１mＭ H
Clの中で膨張させ、ＺＰを結合緩衝剤の中に入れる前
に、結合緩衝剤で速やかに洗い落とした。緩衝剤には、
0.5 NaClが含まれており、タンパク質同士の相互反応を
最少にすることができる。混合物は室温で、約２時間ゆ
っくりと回転した。結合緩衝剤は未反応のＺＰ溶液と共
に取り除き、樹脂は１Ｍのエタノールアミンの中で、ゆ
っくりと回転しながら４℃にて１晩中培養し、残留する
活性グループを閉塞させた。次に樹脂は、１mＭ NaHCO₃
(pH 8.3, 0.5M NaCl)で３回洗浄し、その後0.1Ｍのアセ
テート緩衝剤(pH 4, 0.5M NaCl)で洗浄した。

【００６５】抗血清は、４℃にて１晩中ゆっくりと回転
しながら、結合された樹脂で培養した。溶離を行なう前
に、樹脂を室温まで暖め、硼酸塩/塩水緩衝剤(100mM硼
酸、75mM硼酸ナトリウム、75mMNaCl、pH8.4)で十分に洗
浄し、未結合のタンパク質を完全に取り除いた。結合し
たＩｇＢの溶離は200mＭのグリシン(pH 2.7, 0.8％ NaC
l)を用いて行なった。酸のフラクションは、0.2Ｍのト
リズマ塩基(Trizma base)の中に直接集められ、最終溶
液のトリズマ：グリシンは１：２であり、pH7.5であっ
た。この中和作用によって、溶離して清浄度の高い抗体
への損傷を最小にすることができる。抗体を含有したフ
ラクションの部分標本を作り(aliquoted)、分析を行な
うために冷凍した。免疫親和性抗体の清浄化は一次元の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により明らかにされた。

【００６６】実施例３ｃＤＮＡクローンをエクスプレスするＺＰタンパク質の
分離いわゆる当業者であれば、Biochem. 18:5294 (1979)に
チルグウィン他が開示した方法を用いて、６週のラビッ
ト、12週のラビット、及び６か月以上のラビットの卵巣
からＲＮＡを調製できることは認識できるであろう。卵
巣は多量の結合組織を含んでいるため、均質化(homogen
ization)する前に、液体窒素の中で冷凍した後、微細な
粉末に砕くのが望ましい。４〜８の卵巣を、メルカプト
エタノールの存在下にて、４Ｍのチオシアン酸グアニジ
ニウム(0.025Ｍのクエン酸ナトリウム、0.5重量％のナ
トリウムラウリルサルコシン、pH 7.0)の中で均質化し
た。均質物(homogenate)は、ＪＡ-20のロータの中で、1
0,000rpmにて、10℃で10分間、遠心力作用を受けた。す
べてのＲＮＡは、塩化セシウムを通して、エタノール析
出又は沈降により、タンパク質から分離した。上澄み層
は、3.8g/100 mlsのＥＤＴＡを(二ナトリウム塩)を含有
する5.7ＭのCsClであり、ＳＷ−40のロータの中で、32,
000rpmにて、20℃で20時間遠心作用を与えた。ペレット
は、塩酸グアニジンの中で再び懸濁させた。ＲＮＡは、
３Ｍの酢酸ナトリウム(pH 5.2)0.3mlと95％エタノール
2.2容積で、沈降(precipitate)させる。−20℃にて１晩
中、培養した後、ＲＮＡは、11500rpm、−５℃、10分間
の遠心力作用により回収(recover)する。ＲＮＡは、95
％エタノールで２回の洗浄を行ない、水中に溶解した。
ＲＮＡのリカバリーは、260/280の吸光度比率を測定す
ることによりモニターされる。ポリアデニル化(polyade
nylated)ＲＮＡは、オリゴ(dT)セルロースクロマトグラ
フィーを用いて分離した。このクロマトグラフィーは、
Cold Spring Harbor Laboratory (1982)、p.197のマニ
アティス他による「分子クローニング」に記載されてい
る。クロマトグラフィーのカラムのフラクションは、Ｉ
ＳＣＯ分光光度計を用いてＡ₂₆₀でモニターした。

【００６７】細胞型の特異ｃＤＮＡプローブは、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81:2194(1984)にデービス他、及
びProc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1194 (1983)にヤン
グ他が記載している。エクスプレッションライブラリー
の調製に用いたグラムｇｔ11ベクターを図３に示してい
る。ｃＤＮＡのライブラリーを作るため、卵巣組織から
分離したポリＡ−ｍＲＮＡを２マイクログラム用いて、
各ｃＤＮＡを合成した。最初の鎖のｃＤＮＡは、オリゴ
ｄＴのプライミング及び逆転写酵素(reverse transcrip
tase)の添加によって合成した。逆転写酵素の添加し、4
3℃にて60分間、培養した後、ＥＤＴＡの添加によって
反応を終了させる。試料は、フェノール：クロロフォル
ム：イソアミルアルコール(25:24:1)を用いて抽出す
る。水性相(aqueous phase)を取り除き、有機相を１mＭ
のＥＤＴＡ(pH 8.0)を含有する10mＭのトリス−HClを含
む0.1Ｍ NaClで再び抽出した。水性相をプールした後、
ＤＮＡを２Ｍの酢酸アンモニウムで沈降させた後、95％
エタノールを添加した。冷凍・解凍後、溶液に遠心作用
を与え、25μlの10mＭトリス−HCl、１mＭＥＤＴＡ(Ｔ
Ｅ)の中で再び溶解させた。7.5Ｍの酢酸アンモニウムを
10マイクログラム、95％のエタノールを50μl、添加す
る。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは大腸菌ＲＮＡase Ｈ
により切り開かれた(nicked)。第２の鎖(second stran
d)ｃＤＮＡの合成は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼにより
行なった。二重鎖(double strand)ｃＤＮＡは、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより、ブラント終端させた(blunt-e
nded)。ｃＤＮＡは、EcoRＩリンカー(linkers)に結紮す
る前に、EcoRＩ部位でメチル化した。リンクしたｃＤＮ
Ａは、次にEcoRＩ酵素で処理し、BioGel P50(BioRad)の
クロマトグラフィーで清浄化し、ここに記載した方法に
基づいて、ストラテジェン(Strategen)から得たλｇｔ1
1の腕(arms)に結紮した。この方法によれば、６週のラ
ビット及び８か月ラビットのライブラリに対しては約５
ｘ10個の斑が得られ、12週ラビットのライブラリに対し
ては１ｘ10⁷個の斑が得られた。

【００６８】ライブラリをスクリーニングした場合、10
0mmのプレートにつき５ｘ10³個の斑が得られた。次に、
斑はＩＰＴＧを含浸させたニトロセルロース紙にトラン
スファーされ、プローブは、実施例２で記載の容量にて
調製した抗血清を用いた。タンパク質配列は多くの種の
中で類似しているため、ｃＤＮＡをエクスプレスするタ
ンパク質配列を分離する必要がある。このため、ウサギ
のＺＰタンパク質に抗する多クローン性抗体が、ブタの
ＺＰカラム(実施例２の如く、臭化シアン活性化セファ
ローズに結合したＺＰタンパク質)上で親和清浄され
た。0.1Ｍグリシン(pH 2)で溶離した抗体は、ラビット
とブタのＺＰタンパク質に関連する抗原を認識できるも
のである。

【００６９】ＺＰ抗原をエクスプレスしたλｇｔ11−Ｓ
1、λｇｔ11−Ｐ1、λｇｔ11−Ｐ2及びλｇｔ11−Ｐ3の
クローンは、サブクローンが作られた。これらのサブク
ローンは、サンガーのジデオキシヌクレオチド鎖ター
ミネーション法を用いて、Ｍ13ファージの中でクローン
を作り、ｃＤＮＡの配列を形成する(Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74:5463, 1977, サンガー他)。ＺＰ抗原をエ
クスプレスする３つのｃＤＮＡクローンに対して、この
方法を用いて得られた配列を図４に示す。

【００７０】ノーザンブロット(Northern blot)分析を
用いて、２つのｃＤＮＡクローン(Ｐ2及びＰ3)により認
識されたＺＰタンパク質のＲＮＡは、卵巣に存在する
が、他の組織には存在しないことが実証された。図５は
これらの分析の一つを示しており、分析は、「ノーザン
ブロット」及び「ドットブロット」を用いてラベル付プ
ローブをＲＮＡ試料に交雑させて行なったものである。
すなわち、ノーザンブロット分析の場合、すべてのＲＮ
Ａ卵巣から分離するとともに、同じように、肝臓、腎
臓、脳及び筋肉を含む他の組織とも分離した。ＲＮＡ
は、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で変性し、電気
泳動させた。次に、アガロースゲルからビオジン膜(bio
dyne membrane)の固形支持体にトランスファーした。膜
はトランスファーするために２つの紙フィルターの間に
置き、空気乾燥させ80℃にて２時間ベイキングした。λ
ｇｔ11の中に挿入された特異なＺＰｃＤＮＡは、EcoRＩ
によって消化(digest)された。次に、挿入物は、１％の
低融点アガロースの電気泳動により、クローニングベク
ターから分解(resolve)した。ＵＶ光の下で、挿入ＤＮ
Ａ分子は、臭化エチジウムで識別し、放射性ラベリング
のためにゲルから削り取った。Anal. Biochem. 132:6
(1983)の中にファインバーグ及びフォーゲルスタインが
記載したランダムオリゴ−プライミング方法によっ
て、ｃＤＮＡにラベリングを行なった。ラベリング反応
は、変性したｃＤＮＡを試剤(reagents)に添加すること
により行なった。なお、試剤には、³²Ｐ−ｄＣＴＰ、ク
レノー(krenow)断片、ＢＳＡ、混合プライマー、及びオ
リゴラベリング緩衝剤が含まれている。ラベリングされ
たＤＮＡは、クロマトグラフィーによりセファデックス
Ｇ-50のカラム上にて、ｄＣＴＰから分離した。ＤＮＡ
−ＲＮＡの交雑は、ＲＮＡがトランスファーされたビオ
ジン膜を熱シール可能なポリエチレン袋の中に別々に入
れた。予備交雑(prehybridization)溶液を袋内に加え、
袋は42℃の水槽の中に１晩中浸漬した。予備交雑溶液を
取り除き、³²ＰをラベリングしたＤＮＡプローブを含有
する交雑溶液と交換し、42℃の水槽の中に１晩中浸漬し
た。最終的に、膜は数回洗浄し、暗幕を施してＸ線フィ
ルムに光を当てた。フィルムは現像する前に、70℃にて
48時間、光を当てた。

【００７１】実施例４組換えＤＮＡによるＺＰタンパク質のエクスプレッショ
ン組換えＺＰタンパク質(ｒＺＰ)は、原核エクスプレッシ
ョン系統又は真核エクスプレッション系統の中でエクス
プレスされる。実施例３にて調製した、組換えλｇｔ11
ファージ、λｇｔ11−Ｓ1、λｇｔ11−Ｐ1、λｇｔ11−
Ｐ2及びλｇｔ11−Ｐ3は、10mＭのMgCl₂を含有するルリ
アブロース(Luria Broth)(ＬＢ)媒体内にて、32℃にて
20分間、大腸菌Ｙ1089とともに培養することにより、大
腸菌Ｙ1089を感染させた。集団(colonies)は32℃にて発
育させた。なお、温度敏感性を調べるために１つの集団
だけは42℃にて発育を行なった。32℃では発育するが、
42℃では発育しない集団は、溶解性(lysogenic)である
と考えられ、集団全体の約10〜70％を占める。組換えレ
ゾゲンの１個の集団を分離し、これを用いてＬＢ媒体を
接種し、32℃にて発育させた。O.D.600が約0.5のとき、
培養温度を42℃に変更し、さらに20分間培養した。クロ
ーンが作られた遺伝子の転写は、イソプロピルβ−Ｄチ
オガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)の添加によって刺激
し、最終濃度を10mＭとし、37℃にて60分間培養した。
形質転換した大腸菌は、遠心作用により得ることがで
き、50mＭトリス(Ph 7.5)の中で再び懸濁させ、冷凍し
た。細胞の解凍によって、細胞溶解作用が起こり、融合
ＺＰタンパク質を解放する。

【００７２】ＺＰＤＮＡで設計されたλｇｔ11−Ｐ1及
びλｇｔ11−Ｐ3を含有するバクテリオファージは、198
7年10月８日付にて、アメリカ合衆国メリーランド、ロ
ックビルにあるアメリカンタイプカルチャーコレク
ション(ＡＴＣＣ)に寄託した。寄託番号は、40377及び4
0378である。寄託したバクテリオファージは、米国特許
法及び規則に基づき、入手できる。また、対応出願の申
請がされた米国以外の国の国民も同様に入手できる。な
お、寄託したバクテリオファージを入手できるからとい
って、本出願及びこれに基づく分割出願等に対して付与
される特許の実施権まで与えるものでない。

【００７３】他の実施例において、EMBO 3(6):1429 (19
84)にてスタンレーとルジオが開示したｐＥＸプラスミ
ドを用いて、大腸菌Ｙ1090を形質転換させることができ
る。ｐＥＸベクターは不溶解のハイブリッドタンパク質
をエクスプレスする。バクテリオファージλ ＤＮＡの
分離は、Cold Spring Harbor Laboratory (1982)、p.19
7のマニアティス他による「分子クローニング」に記載
された方法に従って、組換えλｇｔ11ファージの上で実
行できる。10mＭ MgCl₂、0.2％マルトース及び50μg/ml
のアンピシリン(Ampicillian)で補足した(supplemente
d)ＬＢ媒体の中で発育させた大腸菌Ｙ1090は、組換えλ
ｇｔ11ファージで感染させ、37℃にて20分間培養した。
感染した大腸菌は、0.7％アガロース、MgCl₂及びアンピ
シリンとともに、ＬＢ媒体内のＬＢプレート上に載せ、
43℃にて一晩中、培養した。ファージはＳＭ媒体(0.02M
トリス−HCl、pH 7.5; 0.01M NaCl; 0.001M MgSO₄・7H₂
O)(pH 7.5)及び１リットル水の0.01％ゼラチン)の中に
集められ、細菌は、8,000ｘｇにて、４℃で10分間遠心
力作用を与えることにより除去される。ＲＮaseＡとＤ
ＮaseＩは、最終濃度が１μg/mlのファージを含有する
上澄みに添加し、37℃にて30分間培養した。20％ポリエ
チレングリコール及び２Ｍ NaClを含有するＳＭの等量
を添加し、０℃にて１時間懸濁液を培養し、10,000ｘｇ
にて、４℃で20分間遠心作用を与える。上澄みを除去
し、ファージを含むペレットは、0.5mlＭ媒体の中で再
び懸濁させた。残留物を除去するため、溶液は、8,000
ｘｇにて、４℃で２分間遠心作用を受け、５μlの10％
ＳＤＳと0.5ＭＥＤＴＡ(pH 8)を上澄みに加え、68℃に
て15分間、培養した。その結果、フェノール、フェノー
ル：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1)、
及びクロロホルム：イソアミルアルコール(24:1)が抽出
され、各段階で水性相を得ることができた。等量のイソ
プロパノールを水性相に添加し、溶液は−70℃にて20分
間、貯蔵した。４℃で10分間遠心力作用与えた後、ペレ
ットは70％EtOHで洗浄し、乾燥し、50μlのＴＥの中で
再び懸濁させた。EcoRＩの制限酵素の消化をおこなった
後、標準の方法により分離ＤＮＡの部分標本を作った。
消化完了後、トリス硼化物(Tris boronate)ＥＤＴＡロ
ーディング緩衝剤(ＴＢＥ)90mＭトリス硼酸塩、90mＭ硼
酸、２mＭＥＤＴＡを１：１の比率で添加し、1.4％アガ
ロースゲルに負荷した。ゲルは、キシレンシアノールの
前部(front)がゲルの中程になるまで、100Ｖでラン(ru
n)する。ＤＮＡのバンドは紫外線により視覚的に認識さ
れ、予想サイズのバンドが除去される。ＴＢＥのエルト
ラップ(Elutrap)装置の中で、電気的溶離(electroeluti
on)を行なう。分離したＤＮＡフラグメントは、次に、
ｐＥＸプラスミドの中に挿入される。

【００７４】プラスミドの調製は、マニティアス(1982)
の方法に基づいて実行できる。細菌クローンを一晩中か
けて発育させた後、1.5mlの培養をエッペンドルフ管(Ep
pendorf tube)の中にいれ、上澄みを吸引に取り除い
た。ペレットは、100μlの氷冷溶液の中で再び懸濁させ
た。溶液には50mＭグルコース、10mＭＥＤＴＡ、25mＭ
トリス(pH 8.0)、及び4mg/mlのリゾチーム(lysozyme)が
含まれる。懸濁後、22℃にて20分間培養し、氷冷した0.
2Ｍ NaCl及び１％ＳＤＳを200μl、さらに追加した。５
分間、氷の上で培養後、150μlの３Ｍ酢酸カリウム(pH
4.8)を添加した。溶液は氷の上で５分間培養し、その
後、遠心力作用を与え、上澄みを別の新しい間に移し
た。600μlのフェノール：クロロホルム：イソアミルア
ルコール(25:24:1)を加え、溶液を混合し、遠心作用を
与えて上澄みを節約する。次に、２容量(two volumes)
の冷たいエタノールを上澄みに添加し、上澄みを混合
し、22℃にて２分間培養する。上澄みを取り除き、ペレ
ットは、管を反転させて乾燥させる。ペレットは70％Et
OHで洗浄し、遠心作用を受け、再び排出する。20μg/ml
のＤＮase-freeの膵臓ＲＮaseを含有する50μlのＴＥ(p
H 8.0)を添加し、軽く混合し、EcoRＩによる消化のため
の部分標本を取り除いた。消化の分析は、アガロースゲ
ルの電気泳動により行なわれる。

【００７５】プラスミドは、製造者が指定する条件の下
に、EcoRＩ(ProMega BioTech)で線状化(linearize)され
る。200ngの線状化したプラスミドＤＮＡを、３倍(3-fo
ld)のモル過剰の分離ｃＤＮＡに添加する。ＤＮＡはEtO
Hで沈降させられ、８μlのＴＥ(pH 8.0)の中で再び懸濁
させる。１μlの10ｘ結紮 66mＭトリス−Cl(pH 7.6)、
6.6mＭ MgCl2、10mＭジチオテイトル、66mＭＡＴＰの
緩衝剤を添加し、その後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(ligas
e)を10ユニット添加した。混合物は、12℃にて、８時間
培養する。１μlの部分標本を、アガロースゲルにより
分析し、結紮する。2.4μlを用いて、CaCl₂技術によ
り、細菌の形質変換を行なう。

【００７６】組換えプラスミドを運ぶ集団は、多クロー
ン性抗血清で細菌をスクリーニングすることにより識別
できる。形質変換された細胞は、30℃にて20時間発育さ
せる。ニトロセルロースがその上に形成され、フィルタ
ーを取り除き、100μg Amp/mlを含有するＬＢメディア
の中に予め浸された３MMの紙フィルターの２層の下に集
団を並べて載せる。42℃にて２時間、培養することによ
り、交雑タンパク質の転写が開始する。フィルターはＴ
ＢＳの中で30分毎に３回洗浄し、２％の乾燥ミルクで補
足したＴＢＳの中で一晩中閉塞する。フィルターは、次
に親和清浄された抗体でプローブされる。陽性集団(pos
itive colonies)を32℃にて培養する。ＺＰタンパク質
のエクスプレッションは、温度を42℃に変え、２時間培
養することによってもたらされる。この時、組換えＺＰ
タンパク質は、すべてのＳＤＳが抽出されたタンパク質
の約25％でである。エクスプレスされた交雑ＺＰタンパ
ク質は不溶解性であり、従来のクロマトグラフィー法に
より容易に清浄化することができる。

【００７７】或は又、組換えＺＰＤＮＡを酵母の中に
挿入することができる。ピチアパストリスの如きメチル
萎縮性の酵母を用いることにより、遺伝学的に設計した
タンパク質を効率良くしかも大規模にエクスプレスする
ことができる(Chemical Week,マクグロウヒル社、(198
6) エム.ブルーストーンとピー.サベージ)。これらの酵
母は、醸造(brew)ベースとして、メタノールを用いるも
ので、酵母は、アルコール酸化酵素の助けを受けてホル
ムアルデヒドの中に新陳代謝する。第２の酵素は、次
に、ホルムアルデヒドをジヒドロキシアセテートに変換
し、次の段階の酵母細胞の合成を行なう。ｃＤＮＡは、
アルコールを酸化させる遺伝子の位置に挿入される。Ｚ
Ｐタンパク質からの組換えＤＮＡは、アルコール酸化酵
素遺伝子が通常存在する部位で置換される。この部位は
酵母内で変更されるため、メタノールに応答する。従っ
て、エタノール又は炭水化物への切換えを行なうだけ
で、挿入された遺伝子がエクスプレスしたり、エクスプ
レスしないようにすることができる。２つのメタノール
−調節されたラックＺ(lacZ)遺伝子は、ピチアパストリ
スの中でエクスプレスすることができる(Nucleic Acids
Research 15(9): 3859(1987), チョップ他)。

【００７８】実施例５組換え透明帯タンパク質の清浄化ＺＰタンパク質の組換えは実施例４に記載のようにして
エクスプレスされる。λｇｔ11組換えリゾゲンを用いて
大腸菌Ｙ1089を感染させた。大腸菌は、0.2％マルトー
スを32℃にて補足して最適密度(600nm)の0.5としたＬＢ
媒体の中で発育させた。次に培養温度を42℃に変え、そ
の温度で20分間さらに培養した。この培養の終りに、Ｉ
ＰＴＧを添加してラックリプレッサーを低下させた。こ
の結果、組換えたものを含むラックＺ方向の遺伝子がエ
クスプレスされる。細胞は37〜38℃で60分間培養され、
液体窒素の中で冷凍し、解凍して細胞を溶解させる。溶
解質(lysate)は、0.1Ｍトリス緩衝剤(pH 7.5)の中に集
められ、セファセル(Sephacel)カラムを通過させた。分
子重量が100Kdよりも大きいタンパク質を含む空隙(voi
d)の容積をもつものが集められた。エクスプレスされた
タンパク質は、この場合、β−ガラクトシダーゼタンパ
ク質に融合されるため、このタンパク質を部分的に清浄
化する迅速な方法であるといえる。このタンパク質フラ
クションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、免疫
ブロット法によりエクスプレスされた抗原を検出する。
図６はＰ1クローンによってエクスプレスされたＺＰ抗
原融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥで免疫ブロットし
たものを示している。ニトロセルロースのトランスファ
ーはラビットの抗ＨＳＰＺでプローブした。低分子重量
の細菌タンパク質はたくさんのものが、あらゆる細菌の
中で認識されるが、Ｐ1挿入の場合、２つのレーンがＺ
Ｐに特異な融合タンパク質のエクスプレッションを示
す。

【００７９】タンパク質は、タンパク質を細菌から抽出
することにより、ｐＥＸプラスミドから分離する。組み
換えたクロ−β−ガラクトシダーゼの交雑タンパク質
は、硫酸ドデシルナトリウムで抽出したタンパク質の約
25％であるため、セファセルとイオン交換カラムによ
り、または電気泳動により、沈積させることができる。
このため、動物の免疫に必要な清浄度が十分に得られる
ようにタンパク質を清浄にすることができる。酵母培養
媒体から分離した組換えタンパク質も、これらの方法に
よって清浄にすることができる。

【００８０】実施例６透明帯の免疫透明帯タンパク質の活性免疫又は自働免疫が、動物の受
精を抑制する上で効果のあることが見いだした。ラビッ
トに活性免疫を与えることにより、卵巣の卵胞における
受精機能を損なわせ、ステロイドホルモンの生産を停止
させることができる(図７参照)。

【００８１】ＺＰタンパク質(300μg/0.5ml; 0.1ＭＰ
ＢＳ)を、0.5mlのフロイントの完全アジュバント(ＣＦ
Ａ)の中で乳化させる。投与量の半分を皮内の多くの部
位に投与し、残りの半分は0.5mlＰＢＳで乳化した0.5ml
ＣＦＡのエマルジョンで注入した。この注入により、動
物は４週間後に免疫高揚作用を受ける。この免疫作用
は、最初のものと比較した場合、最初のものがフロイン
トの不完全アジュバントを用いている点を除くとその他
は全く同一である。卵巣の機能を評価できるようにする
ため、動物はｈＣＧ処理を行ない、血清プロゲステロン
のレベルを判断した。各グループの中で何匹かの動物
を、ｈＣＧの投与後少なくとも12時間で殺し、卵巣の重
量を測定し、排卵部位を調べた。また一方では、ｈＣＧ
の前に、動物にブタのＦＳＨ(Reheis Chemical Co., ア
リゾナ州フェニックス；0.5mg/１匹、毎日２回、３日
間)を与え、排卵過度にした。これらの研究結果によ
り、卵巣機能の変化原因は、卵胞細胞の分化の欠乏及び
ステロイド生産の欠乏であることが明らかになった(図
７参照)。ブタのＺＰで免疫をもたせたラビットの血清
プロゲステロンのレベルを求めた。50ＩＵｈＣＧが与
えられた動物の応答は、プロゲステロンレベルのＲＩＡ
により求めた。テストした血清試料は、21日間定期的に
採取した。このｈＣＧ処理の後に通常の場合、偽妊娠が
生じる。各ヒストグラムは血清プロゲステロン濃度(血
清１mlにつきナノグラムのプロゲステロン)の平均±S.
D.を表わす。

【００８２】パネルＡ及びＤは、前者が対照(control)
動物(アジュバントだけ)、後者が実験(experimented)動
物(ＺＰで免疫)の、夫々免疫前におけるプロゲステロン
のプロフィールを示している。Ｂ及びＥは、第１の免疫
処理後、20週間経過後の状態を示している。Ｃ及びＦ
は、増強していない動物のプロゲステロンのプロフィー
ルを示しており、これは、第１の免疫後、28週後にＦＳ
Ｈ/ｈＣＧ処理した後のものである。モノクローン抗体
Ｒ5とＲ7を受動免疫のために用いることにより、ラビッ
トの受精率は低下した。ＰＳＩで指定されるモノクロー
ン抗体は、シルバー染色されたブタのＺＰタンパク質に
抗して作られる。なお、タンパク質は２Ｄ−ＰＡＧＥに
より清浄化されている。このモノクローン抗体は、ブタ
血清がインビトロのぶたＺＰに固定されるのが抑制され
る(図８参照)。

【００８３】実施例７反透明帯モノクローン抗体の調製反透明帯モノクローン抗体を生産するハイブリッド細胞
系統を調製するもので、ＢＡＬＢ/ｃマウス骨髄腫細胞
を、透明帯タンパク質でプライムしたＢＡＬＢ/ｃマイ
スの脾臓細胞に融合するものである。この方法では、骨
髄腫細胞及び反透明帯抗体生産細胞は、人間、イヌ、又
はネコのような他の供給源を利用することができる。

【００８４】Ａ．融合のための脾臓細胞の調製透明帯タンパク質は、卵巣又は分解度の高い２Ｄ−ＰＡ
ＧＥによる分離したものを、熱可溶化したすべてのマト
リックスとして清浄にするものである。透明帯抗原は、
２Ｄ−ＰＡＧＥ分析では、約95％ピュア(熱可溶化した
ＺＰ)であり、シルバー染色分析では100％ピュアであっ
た。透明帯抗原は、フロイントの完全アジュバント約30
μgの中で乳化させたものを、大人のＢＡＬＢ/ｃ又はＣ
57Ｂ46の雄マイスに皮下投与して免疫を与えるために使
用される。マウスは２週間後、さらに不完全アジュバン
トのタンパク質30μgで、再び免疫を付与したさらに６
週間経過後、20〜40μgのタンパク質を静脈内に投与し
た。２〜４日後、マイスは死亡し、脾臓細胞の懸濁物
を、Somatic Cell Genetics 3:231, 1977にゲフター他
が開示した方法に基づいて作った。赤血球を溶解し、NH
₄Cl(0.83％)の中で、40℃で15分間培養した。得られた
懸濁物は、遠心力作用(800xg)によって熱不活性の子牛
血清を通して洗浄し、その後、タンパク質なしの媒体(R
RMI 1640、7.5nM HEPESで緩衝、pH 7.2)の中で遠心力を
作用させた。

【００８５】Ｂ．融合するための脾臓の調製脾臓細胞は、Ｐ３Ｕ１系統から得たが、Curr. Top. Mic
robiol. Immunal. 81:1-7 (1978)にイエルトン他が記載
しているようにＨＰＲＴ(E.C.2.4.2.8)が不足してい
る。この細胞をイーグルの最小必須媒体(minimum essen
tial medium, MEM)の中に維持した。この媒体は子牛血
清10％とウマ血清15％を含んでいる。骨髄腫細胞の成長
は、ヒポキサンチン−アミノペテリン−チミジン(ＨＡ
Ｔ)媒体の選択により抑制される。

【００８６】Ｃ．ハイブリッドの生産ハイブリッドの生産は、107ＢＡＬＢ/ｃ骨髄腫細胞と、
透明帯の免疫が与えられたＢＡＬＢ/ｃ又はＣ57Ｂ1/6マ
イスから得られた10⁸脾臓細胞を混合することにより行
なわれた。細胞の混合物は800xgの遠心力作用を受け、
細胞は、ゲフター他(1977)の方法に基づき、血清を含ま
ない最小必須媒体(ＭＥＭ)の中に希釈したポリエチレン
グリコール(PEG 1000)の50％溶液の中で再び懸濁させ
た。得られたハイブリドーマ細胞は、ガルフレとミルス
タインがMeth. Enzymol. 73:3, 1975に記載しているよ
うに、希釈剤を制限することにより、ヒポキサンチン−
アミノペテリン−チミジン(ＨＡＴ)媒体の中にクローン
を形成した。２つのハイブリドーマ細胞系統Ｒ５とＰＳ
Ｉを選択した。その理由は、細胞系統Ｒ５は、多くの動
物のＺＰ抗原のタンパク質部分を認識する抗体を作るた
めである。また、ＰＳＩは、ＺＰの多くの種の炭水化物
決定因子を認識し、この抗体は精子がＺＰの表面に結合
するのを抑制するためである（図８参照)。

【００８７】Ｒ５及びＰＳＩで指定されるハイブリドー
マ細胞系統は、1987年10月８日付にて、アメリカ合衆国
メリーランド、ロックビルにあるアメリカンタイプカ
ルチャーコレクション(ＡＴＣＣ)に寄託した。寄託番
号は、40377及び40378である。寄託したバクテリオファ
ージは、米国特許法及び規則に基づき、入手できる。ま
た、対応出願の申請がされた米国以外の国の国民も同様
に入手できる。なお、寄託したバクテリオファージを入
手できるからといって、本出願及びこれに基づく分割出
願等に対して付与される特許の実施権まで与えるもので
ない。

【００８８】Ｄ．反透明帯抗体を生産するクローンのテ
ストリンブロ(Linbro, Flow Lab)のマイクロタイター用の96
個のくぼみ付プレートを、ラビット又はブタのＺＰタン
パク質の50〜100μgで蔽い(coated)、20℃にて一晩培養
した。くぼみは、５％カーネーションインスタントミ
ルク(CarnationInstant Milk)及び0.085％アジ化ナトリ
ウムを含有する0.1Ｍトリス(pH 7.5)−1％ノンイデット
(nonidet)Ｐ-40で洗浄した後、0.05mlの培養上澄みを添
加し、40℃にて培養した。上澄みはＲＩＡ緩衝剤で３回
洗浄した後に除去し、ハイブリドーマスクリーニング
キット(Bethesda Research Labs)を用いて抗体を検出し
た。非特異的結合の対照は、第２の抗体又は培養上澄み
のどちらか一方が含まれていない。

【００８９】Ｒ２、Ｒ５、Ｒ７及びＰＳＩとよばれるハ
イブリドーマ細胞は、プリスタン処理した(pristane-tr
eated)マイスの中に腹腔内注射をすることにより、腹水
症の形態として発育させた(Meth.Enzymol. 73 (パート
Ｂ)１(1981)、ガルフレとミルスタイン)。腹水症の体液
を採り、これを免疫ブロット及び生物検定のためのモノ
クローン抗体源として用いた。

【００９０】本発明を詳細に説明した。当該分野の専門
家であれば、添付した請求の範囲における発明の精神又
は発明の範囲から逸脱することなく変形をなすことがで
きることは明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】２Ｄ−ＰＡＧＥゲル免疫ブロット法により、ラ
イブラリのスクリーニングを行なうために用いられた抗
体認識ＺＰ抗原を表わす図である。

【図２】ブタＺＰタンパク質とラビットＺＰタンパク質
のＮ−ターミナルアミノ酸配列を示す図である。

【図３】λｇｔ11ベクターであって、ＺＰのｃＤＮＡを
クローン化することを目的としてエクスプレッションラ
イブラリを発展させるために用いられるベクターの制限
エンドヌクレアーゼの分割マップ(cleavage map)を示す
図である。

【図４】ＺＰ抗原をエクスプレスする３つのクローンの
ＤＮＡ配列を示す図である。

【図５】卵巣にＺＰＲＮＡは存在するが、その他の組
織には存在しないことを表わしたノーザンブロット分析
を示す図である。

【図６】クローンＰ１からのλｇｔ11ＤＮＡのＳＤＳ−
ＰＡＧＥ免疫ブロットを示す図である。

【図７】ラビットの卵巣機能に対する活性免疫の結果を
示す図である。

【図８】精子がＺＰに血清結合するのを、モノクローン
抗体が抑制することを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 15/02 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ０７Ｋ 16/18 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 15/00 ＣＣ０７Ｋ 16/18 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】１又はそれ以上のアミノ酸の追加、削除
又は置換による、図４に示される、Ｐ２シーケンス、Ｐ
３２７２塩基シーケンス又はＰ３４８４塩基シーケン
スによりコードされた、アミノ酸シーケンスとは異なる
アミノ酸シーケンスを含む透明帯ポリペプチドをコード
する実質的に純粋なＤＮＡシーケンスであって、コード
されたポリペプチドは、Ｐ２シーケンス、Ｐ３２７２
塩基シーケンス又はＰ３４８４塩基シーケンスにより
コードされたアミノ酸シーケンスに特異的な抗原決定基
を含んでいる。
【請求項２】コードされたポリペプチドの発現のため
のシーケンスの管理下で、請求項１のＤＮＡを含むエク
スプレッション運搬体からなるＤＮＡ。
【請求項３】請求項１又は２の何れかのＤＮＡで形質
転換された宿主細胞。
【請求項４】宿主細胞は原核生物である請求項３の宿
主細胞。
【請求項５】宿主細胞は大腸菌（E. coli.）である請
求項４の宿主細胞。
【請求項６】宿主細胞はイーストである請求項３の宿
主細胞。
【請求項７】宿主細胞は哺乳類の細胞である請求項３
の宿主細胞。
【請求項８】宿主細胞を形質転換させるための請求項
１又は４のＤＮＡの使用。
【請求項９】コードされたポリペプチドの生産のため
の請求項３乃至７の何れかの宿主細胞の使用。
【請求項１０】ポリペプチドを生産する方法であっ
て、ａ）請求項１又は２のＤＮＡで宿主細胞を形質転換さ
せ、ｂ）コードされたポリペプチドを生産するためにＤＮＡ
を発現し、ｃ）発現されたポリペプチドを宿主細胞から回収する、
ことを含むポリペプチドを生産する方法。
【請求項１１】宿主細胞は原核生物である請求項10の
宿主細胞。
【請求項１２】宿主細胞は大腸菌（E. coli.）である
請求項11の宿主細胞。
【請求項１３】宿主細胞はイーストである請求項10の
宿主細胞。
【請求項１４】宿主細胞は哺乳類の細胞である請求項
10の宿主細胞。
【請求項１５】ポリペプチド及び薬学的に適当なキャ
リアーを含む組成物を生産することからなる、請求項10
乃至14の何れかの方法。
【請求項１６】組成物はアジュバントを含んでいる請
求項15の方法。
【請求項１７】更に、組成物をヒト以外の哺乳類に投
与して、避妊を起こさせることからなる、請求項15又は
16の方法。
【請求項１８】投与は注入により行われる請求項17の
方法。
【請求項１９】ヒト以外の哺乳類は、ウシ、ブタ、ネ
コ、イヌ又はウサギである請求項17又は18の方法。
【請求項２０】薬学的組成物であって、ａ）薬学的に適当なキャリアー、ｂ）形質転換された原核生物又は真核生物の宿主細胞内
でＤＮＡをコードすることからなる組換え発現により生
産される、免疫を生じるのに効果的な量の実質的に純粋
な自然発生的でないポリペプチドであって、該ポリペプ
チドは、天然由来の糖鎖を有さず、該ポリペプチドは、
１又はそれ以上のアミノ酸の追加、削除又は置換によ
る、図４に示される、Ｐ２シーケンス、Ｐ３２７２塩
基シーケンス又はＰ３４８４塩基シーケンスによりコ
ードされたアミノ酸シーケンスとは異なるアミノ酸シー
ケンスを含み、該ポリペプチドは、Ｐ２シーケンス、Ｐ
３２７２塩基シーケンス又はＰ３４８４塩基シーケン
スによりコードされたアミノ酸シーケンスに特異的な抗
原決定基を含んでいる、薬学的組成物。
【請求項２１】キャリアーはアジュバントを含んでい
る請求項20の薬学的組成物。
【請求項２２】請求項20又は21の組成物をヒト以外の
哺乳類に投与して、避妊を起こさせることからなる、哺
乳類内の避妊を含む方法。
【請求項２３】投与は注入により行われる請求項22の
方法。
【請求項２４】哺乳類は、ウシ、ブタ、ネコ、イヌ又
はウサギである請求項22又は23の方法。
【請求項２５】哺乳類はヒトである請求項22又は23の
方法。
【請求項２６】免疫を生じるのに効果的な量の請求項
20又は21の薬学的組成物を哺乳類に投与することによ
り、図４に示すＰ２又はＰ３として示されるＤＮＡによ
りコードされた透明帯抗原に向けられる抗体を哺乳類内
で生産する方法。
【請求項２７】投与は注入により行われる請求項26の
方法。
【請求項２８】哺乳類は、ウシ、ブタ、ネコ、イヌ又
はウサギである請求項26又は27の方法。
【請求項２９】哺乳類はヒトである請求項26又は27の
方法。