JPH10210982A - 新規なタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の診
断治療に関わる研究に有用な診断手段として、あるいは
その他の医学的生理学的用途に有用な、新規なタンパク
質、特には潜在型ゼラチナーゼ Aの活性化能を有するMM
P の一種であるマウスMT1-MMP 以外の潜在型ゼラチナー
ゼ A活性化因子であるマウス由来の膜結合型タンパク質
およびそれをコードする遺伝子を提供する。 【解決手段】 マウス肺cDNAライブラリーよりクローニ
ングされた新規の膜結合型マトリクスメタロプロテアー
ゼ［特にはマウスMT2-MMP （Membrane-type 2 matrix m
etalloproteinase）］、それをコードする塩基配列を含
有するDNA 、該DNA で形質転換せしめた宿主細胞、該宿
主紬胞を用いる該膜結合型マトリクスメタロプロテアー
ゼの製造方法、該マトリクスメタロプロテアーゼタンパ
ク質に結合するモノクローナル抗体、さらにはそれらタ
ンパク質および抗体および核酸オリゴマーの用途。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は癌細胞の有無、癌の
悪性度の診断等の癌の診断治療に関わる研究に有用な診
断手段として、あるいはアルツハイマー病その他の医学
的生理学的用途に有用な、新規なタンパク質及びそれを
コードする遺伝子に関するものである。特に本発明は、
潜在型ゼラチナーゼ Aの活性化能を有するマトリクスメ
タロプロテアーゼ（Matrix metalloproteinase, MMP ）
の一種であるマウスMT1-MMP 以外の潜在型ゼラチナーゼ
A活性化因子であるマウス由来の新規な膜結合型タンパ
ク質およびそれをコードする遺伝子に関する。さらに詳
しくは、本発明はマウス肺cDNAライブラリーよりクロー
ニングされた新規の膜結合型マトリクスメタロプロテア
ーゼ［本発明で明らかにされた新規の膜結合型マトリク
スメタロプロテアーゼをマウスMT2-MMP （Membrane-Typ
e 2 Matrix metalloproteinase）と命名する］、それを
コードする塩基配列を含有するDNA 、該DNA で形質転換
せしめた宿主細胞、該宿主紬胞を用いる該膜結合型マト
リクスメタロプロテアーゼの製造方法、該マトリクスメ
タロプロテアーゼタンパク質に結合するモノクローナル
抗体さらにはそれらタンパク質および抗体および核酸オ
リゴマーの用途に関するものである。

【０００２】

【従来技術】原発巣組織内に存在する癌細胞が浸潤、転
移するためには、その周囲に存在する細胞外マトリクス
が、癌細胞の移動の障害になる。したがって、癌細胞が
組織を浸潤し転移するには、原発巣からの遊離、周辺の
細胞外マトリクスの破壊が必要となる。癌細胞の転移
は、その後基底膜の破壊、血管への侵入、侵出、二次臓
器への生着、増殖等の段階を経て成立する。癌細胞の転
移の障壁となっている細胞外マトリクスは、IV型コラー
ゲン、プロテオグリカン、エラスチン、フィブロネクチ
ン、ラミニン、へパラン硫酸等の復雑な成分から構成さ
れているが、この細胞外マトリクスの分解には、基質特
異性を異にするマトリクスメタロプロテアーゼ（以下MM
P と略記する）と総称される一群の酵素が関与してい
る。

【０００３】これまでにMMP として間質コラゲナーゼ
（MMP-1 ）、ゼラチナーゼ A（MMP-2）、ゼラチナーゼ
B（MMP-9 ）、ストロムライシン 1（MMP-3 ）、マトリ
ライシン（MMP-7 ）、好中球コラゲナーゼ（MMP-8 ）、
ストロムライシン 2（MMP-10）、ストロムライシン 3
（MMP-11）、メタロエラスターゼ（MMP-12）、コラゲナ
ーゼ 3（MMP-13）等が報告されている。これらのMMP の
cDNA配列から推定されるアミノ酸配列には相同性が認め
られており、MMP ファミリーを形成していることが知ら
れている。これらMMP は、基本的に分泌産生時に除かれ
るN-末端のシグナルペプチドに続き、プロペプチドドメ
イン、Zn- 結合触媒ドメイン、5 〜50アミノ酸よりなる
プロリンに富んだヒンジドメイン、C-末端のへモペキシ
ン凝血酵素様ドメインから構成されている。MMP-7 にお
いてはへモペキシン凝血酵素様ドメインはない。ゼラチ
ナーゼ Aとゼラチナーゼ Bでは、この他にゼラチン結合
ドメインを含んでいる。

【０００４】これらのMMP のうち、基底膜の主要構造体
であるIV型コラーゲンを主たる基質とするゼラチナーゼ
Aとゼラチナーゼ Bは、高転移性の癌細胞における高い
発現が数多く報告され、癌細胞の基底膜浸潤への関与が
提唱されてきた（Cell, 64:327 〜336, 1991 ）。MMP
の活性発現調節は、少なくとも転写レベル、酵素活性を
示さない潜在型酵素から活性型酵素への活性化の段階、
MMP の特異的阻害剤であるティッシュインヒビターオブ
メタロプロテアーゼ類（TIMPs ）による活性調節などと
いった段階で行われていると考えられている（Trends G
enet., 6: 121〜125, 1990 ）。全てのMMP は不活性な
潜在型として分泌されるが、in vitroの実験では、MMP-
1 、ゼラチナーゼ Bの活性化は、プラスミン、トリプシ
ン、カテプシンG 等のセリンプロテアーゼによって生じ
ることが示されており、さらに、ゼラチナーゼ Bの活性
化が活性型MMP-3 の作用によっても引き起こされること
が報告されている（J. Biol. Chem., 267: 3581 〜358
4, 1992）。

【０００５】しかしながら、ゼラチナーゼ Aが上述のプ
ロテアーゼの切断部位を持たないため、ゼラチナーゼ A
の活性化は、これらによっては起こらないと考えられて
いる（Curr. Opin. Cell Biol., 5: 891〜897, 1993
）。このゼラチナーゼ Aは、組織構築の改変を伴うよ
うな様々な部位の線維芽細胞で発現しているが、正常組
織と癌組織のゼラチナーゼ Aを比較するとその活性化が
癌組織で特異的に生じていることが肺癌の例等で報告さ
れている（Clin. Exp-Metastasis, 11: 183 〜189,1993
）。また、癌細胞の浸潤の先端（invadopodia ）で活
性型ゼラチナーゼ Aが局在することがin vitroの実験系
で示され、ゼラチナーゼ Aの癌細胞浸潤における重要性
が示唆されている（Cancer Res., 53: 3159 〜3164, 19
93. Breast Cancer Res. Treat. 31: 217 〜226, 1994
）。この様な背景から、癌の浸潤・転移に深く関与す
るゼラチナーゼ Aの活性化機構が注目されてきたが、前
述の様に、ゼラチナーゼ Aの活性化機構は不明であり、
特に活性化因子は同定されていなかった。

【０００６】最近になって、遺伝子工学的手法により新
規なMMP 遺伝子のクローニングが行われ、C 末端に典型
的なトランスメンブレン・ドメインを持ち、潜在型ゼラ
チナーゼ Aを活性化する新しいMMP をコードするヒト遺
伝子がクローニングされた（Nature, 370: 61 〜65, 19
94）。この遺伝子を培養細胞で発現させると、遺伝子産
物は分泌されることなく細胞膜上に局在したことから、
このMMP はMT1-MMP (Membrane-Type 1 MMP ) と命名さ
れた。さらに、現在までにMT1-MMP と同様に、C 末端に
典型的なトランスメンブレンドメインを持つMMP として
MT2-MMP （Eur.J. Biochem., 231: 602〜608, 1995
）、MT3-MMP （J. Biol. Chem., 270: 23013〜23020,
1995 ）およびMT4-MMP （Cancer Res., 56: 944〜949,
1996 ）のヒト遺伝子がクローニングされている。これ
らのMT-MMPは互いに高い相同性を示し、前述のMMP ファ
ミリーに特徴的なドメイン構造とMMP ファミリーで非常
に高度に保存されているプロ体と活性型の切断部位近傍
の配列PRCGVPD を持つ（MT4-MMP の相同部位は、配列PR
CSLPD である）。さらに、これらのMT-MMPにはトランス
メンブレンドメインに加えて他のMMP ファミリーと比較
して特徴的な挿入配列が存在した。

【０００７】すなわち、プロペプチドドメインと触媒ド
メインの間に存在するR-X-R/K-R （X は任意のアミノ酸
残基）の配列を含む9 〜13アミノ酸残基の挿入配列、触
媒ドメイン中の8 アミノ酸残基の挿入（MT4-MMP には存
在しない）が共通して見られ、これらのMT-MMPは、MMP
ファミリーのサブファミリーを形成していると考えられ
る。MT-MMPファミリーによる潜在型ゼラチナーゼ Aの活
性化は、ヒトMT1-MMPあるいはMT3-MMP と潜在型ゼラチ
ナーゼ A遺伝子をコトランスフェクトしたCOS-1 細胞の
培養上清で確認され（J. Biol. Chem., 270: 23013〜23
020, 1995 ）、MT-MMPファミリーの内少なくともヒトMT
1-MMP およびMT3-MMP が、潜在型ゼラチナーゼ Aの活性
化因子であることが示された。ヒトMT2-MMP およびMT4-
MMP の機能に関する報告は現在のところない。これまで
述べてきたようにゼラチナーゼ Aは、癌の浸潤転移の過
程に重要な役割を担っていることに加え、ゼラチナーゼ
Aにアルツハイマー病の発症に関与するβアミロイドタ
ンパク質の分解活性が見出された（Nature, 362: 839〜
841, 1993 ）ことから、ゼラチナーゼ Aの活性化機構の
解明に大きな期待が寄せられている。潜在型ゼラチナー
ゼ Aの活性化因子と同定されたMT-MMPファミリーのヒト
MT1-MMP およびMT3-MMP の解析や新規のゼラチナーゼ A
活性化因子の探索・同定は、これらの疾患の診断や医薬
品等の開発に極めて重要であるといえる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】今日、医学、薬学を含
む生化学の分野において、実験動物は、様々な生理活性
を持つタンパク質の単離・精製の実験材料として提供さ
れたり、それらの生物学的機能の解析、様々な疾患や疾
患の治療、薬理・薬効に関する基礎および応用研究など
に広く用いられている。ヒトを使った実験的研究はあり
得ず、実験動物を用いた研究成果がヒトに外挿され、ヒ
トの疾患治療、医薬品開発に応用されている。このよう
な目的で使用される実験動物として線虫やショウジョウ
バエなどの非哺乳動物、ニワトリ、ウズラなどの鳥類、
マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなど
小型のげっ歯類、さらにネコ、イヌ、ブタ、ウシ、サル
など大型の哺乳動物があげられ、実験研究の目的に応じ
て選択し使用されている。なかでも、マウスは、実験動
物として永く飼育されており遺伝学的研究の蓄積が豊富
なこと、大きさ、飼育の容易さなどもあり最も広く利用
されている動物種である。

【０００９】近年、遺伝子の分子レベルにおける研究が
著しく発展しヒトとヒト以外の哺乳動物、特にマウスの
遺伝子を比較し、その遺伝的背景に相同性が確認される
ようになってきた。これによって、ヒトとマウスの両方
に相同性の高いタンパク質が存在し、共通した構造や機
能を持つことが認識されてきた。この遺伝的相同性は、
マウスにおける生物機能モデルや疾患モデルから得られ
た知見をヒトに外挿可能である根拠のひとつと言える。
さらに、遺伝子操作および胚操作の技術的進歩により、
任意の遺伝子を導入し発生・成長の過程で発現するトラ
ンスジェニックマウスが開発された。また、特定の遺伝
子のみを欠失させたり（ノックアウトマウス）別の遺伝
子と置換することで従来、存在し得なかった変異マウス
を作製できるようになった。これらの技術により様々な
疾患モデルマウスが入手可能となり、より複雑な生物学
的機能解析が可能になりつつある。このように実験動物
としてのマウスの重要性はさらに高まりつつある。

【００１０】以上の様な背景において、ヒト以外の動物
種、特にマウスの遺伝子検索は、ヒトの疾患モデルマウ
スの樹立やヒトおよびマウスのタンパク質の機能解析に
重要である。前述の様にヒトとマウスの遺伝子およびタ
ンパク質には相同性があり、様々な解析に汎用される抗
体や核酸プローブのなかには、動物種を越えて使用でき
るものもある。しかしながら、厳密にはタンパク質およ
び遺伝子は、それぞれの動物種に固有のものであり、そ
れぞれの動物種にあわせた抗体や核酸プローブを用いる
ことが実験上望ましく、マウス由来のタンパク質に反応
する抗体やマウス由来の遺伝子にハイブリダイズする核
酸プローブの作製の意義は大きい。この様にして得られ
る抗体や核酸オリゴマーには、マウス由来の様々なタン
パク質や遺伝子の検出あるいは定量を目的とした実験医
学上重要な試薬としての用途がある。さらにこれらの核
酸オリゴマーや抗体のうち、アンチセンスオリゴマーや
中和抗体には治療用薬剤としての用途もあり、マウスに
おける実験医学だけでなく医薬品の研究開発の有効な手
掛かりを与える。

【００１１】ところで、ヒトにおける潜在型ゼラチナー
ゼ Aの活性化能を有する因子として細胞膜上に局在する
MMP の一種であるヒトMT1-MMP が発見されたのに続い
て、このヒトMT1-MMP に類似したドメイン構造を持つヒ
トMT2-MMP 、ヒトMT3-MMP およびヒトMT4-MMP が見出さ
れ、これらのMT-MMPs がMMP ファミリーの中でサブファ
ミリーを形成していることが知られるようになった。現
在まで、ヒト以外の動物種において潜在型ゼラチナーゼ
Aの活性化能を有するMT-MMPとしてラットMT1-MMP およ
びマウスMT1-MMP （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:
2730〜2734, 1995）の報告があるのみで、それ以外の潜
在型ゼラチナーゼ A活性化因子については同定されてい
なかった。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記に鑑み、本発明者等
はマウスにおいてもヒトと同様に複数のゼラチナーゼA
の活性化因子として作用するMT-MMPが存在し、ファミリ
ーを形成するのではないかと考え、遺伝子工学的手法を
用い種々研究した結果、マウスMT1-MMP 以外の新たな潜
在型ゼラチナーゼ A活性化能を有するMT-MMPをコードす
るマウス遺伝子を単離することに成功、遺伝子塩基配列
およびアミノ酸配列の全てを明らかにし、本発明を完成
させるに至った。したがって、本発明は、潜在型ゼラチ
ナーゼ Aの活性化能を有するMMP の一種であり且つマウ
スMT1-MMP 以外の潜在型ゼラチナーゼ A活性化因子であ
る新規なマウス由来のタンパク質、その製造方法および
その用途、該タンパク質をコードする遺伝子およびその
用途、該タンパク質に対する抗体および該抗体の製造法
および該抗体の用途等を提供することを目的とする。本
発明によりクローニングされた新規な潜在型ゼラチナー
ゼ A活性化因子たるマウスMMP 遺伝子をマウスMT2-MMP
遺伝子およびマウスMT2-MMP 遺伝子がコードするマウス
由来タンパク質をマウスMT2-MMP と命名した。

【００１３】すなわち、本発明は新規なマウスMT2-MMP
遺伝子およびマウス由来のタンパク質マウスMT2-MMP お
よびその類縁体に関わるものである。さらに本発明は新
規なマウスMT2-MMP の全体または一部をコードするDNA
配列、このようなDNA 配列を有するベクターおよびこの
ようなベクターで形質転換またはトランスフェクション
された宿主細胞にも関する。さらに組換えマウスMT2-MM
P の製造法およびその用途も包含している。またマウス
MT2-MMP に結合する抗体、特にはモノクローナル抗体お
よびその抗体を産生するハイブリドーマ細胞にも関す
る。またマウスMT2-MMP 遺伝子にハイブリダイズする核
酸オリゴマー、たとえばDNA 、RNA プローブに関する。
さらに上記の産物を用いたマウスMT2-MMP の検出・測定
試薬、その試薬を用いた検出・測定方法を提供する。

【００１４】さらに、マウスMT2-MMP の有する潜在型MM
P-2 活性化能を阻害する物質および細胞外マトリクス分
解活性を阻害する物質の検出する手法を提供し、その物
質あるいは誘導体を有効成分とする抗癌剤、癌転移抑制
剤、たとえば潜在型ゼラチナーゼ A活性化能あるいは細
胞外マトリクス分解活性を阻害する中和抗体、特には、
マウスMT2-MMP に結合するモノクローナル抗体および潜
在型ゼラチナーゼ Aに結合し且つ潜在型MMP-2 活性化能
を有しないマウスMT2-MMP の部分ペプチドおよびその誘
導体またはそれらの塩にも関する。また、マウスMT2-MM
P の転写あるいは翻訳を阻止するアンチセンスオリゴマ
ーおよびその誘導体、それを有効成分とする抗癌剤およ
び癌転移抑制剤に関するものである。

【００１５】すなわち、本発明は、 〔１〕 潜在型ゼラチナーゼ Aの活性化能を有するMMP
の一種であり且つマウスMT1-MMP 以外の潜在型ゼラチナ
ーゼ A活性化因子である天然のマウスMT-MMP活性を有す
るかあるいはそれと実質的に同等な活性を有することを
特徴とするマウス由来のタンパク質またはその塩； 〔２〕 該タンパク質がマウスMT2-MMP またはその塩
と、実質的に同等な活性を有するか、あるいは実質的に
同等の一次構造コンフォメーションを持つものであるこ
とを特徴とする上記〔１〕記載のタンパク質； 〔３〕 C 末端領域に、配列表の配列番号：2 のVal⁶¹⁴
〜Val⁶³⁵で表されるアミノ酸配列またはそれと実質的に
同等のアミノ酸配列を有することを特徴とする上記
〔１〕または〔２〕記載のタンパク質； 〔４〕 配列表の配列番号：2 で表されるアミノ酸配列
またはそれと実質的に同等のアミノ酸配列を有するマウ
スMT2-MMP またはその塩であることを特徴とする上記
〔１〕〜〔３〕のいずれか一記載のタンパク質； 〔５〕 外因性DNA 配列を原核生物において発現して得
たものであるか、あるいは真核生物で発現させて得たも
のであることを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕のいずれ
か一記載のタンパク質；

【００１６】〔６〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一
記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩； 〔７〕 上記〔１〕〜〔６〕のいずれか一記載のタンパ
ク質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を有
することを特徴とする核酸； 〔８〕 上記〔２〕〜〔４〕のいずれか一記載のマウス
MT2-MMP をコードする塩基配列を有するDNA 遺伝子であ
ることを特徴とする上記〔７〕記載の核酸；

〔９〕 配列表の配列番号：１で表される塩基配列のう
ちオープンリーディングフレーム部分またはそれと実質
的に同等な活性を有する塩基配列を有することを特徴と
する上記〔７〕または〔８〕記載の核酸； 〔１０〕 上記〔７〕〜

〔９〕のいずれか一記載の核酸
を含有することを特徴とするベクター； 〔１１〕 上記〔７〕〜

〔９〕のいずれか一記載の核酸
または上記〔10〕記載のベクターを保有することを特徴
とする形質転換体；及び 〔１２〕 上記〔11〕記載の形質転換体を増殖可能な栄
養培地中で培養し、組換えタンパク質としてマウスMT2-
MMP またはその塩を包含する上記〔１〕〜〔６〕のいず
れか一記載のタンパク質またはその部分ペプチドを生成
せしめることを特徴とするマウスMT2-MMP またはその塩
を包含する上記〔１〕〜〔６〕のいずれか一記載のタン
パク質またはその部分ペプチドの製造方法を提供する。

【００１７】また別の態様では、本発明は 〔１３〕 上記〔１〕のタンパク質またはその塩あるい
はその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体； 〔１４〕 マウスMT2-MMP またはその塩と、実質的に同
等な活性を有するか、あるいは実質的に同等の一次構造
コンフォメーションを持つものであるタンパク質に対す
る抗体であることを特徴とする上記〔13〕記載の抗体； 〔１５〕 配列表の配列番号：2 で表されるアミノ酸配
列またはそれと実質的に同等のアミノ酸配列を有するマ
ウスMT2-MMP またはその塩であるタンパク質に対する抗
体であることを特徴とする上記〔13〕または〔14〕記載
の抗体； 〔１６〕 外因性DNA 配列を原核生物において発現して
得たものであるかあるいは真核生物で発現させて得たも
のであるタンパク質に対する抗体であることを特徴とす
る上記〔13〕〜〔15〕のいずれか一記載の抗体； 〔１７〕 タンパク質の部分ペプチドまたはその塩に対
する抗体であることを特徴とする上記〔13〕〜〔16〕の
いずれか一記載の抗体； 〔１８〕 上記〔17〕記載のタンパク質の部分ペプチド
またはその塩が配列表の配列番号：２のAsp²⁸¹〜Gly²⁹⁴
で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする上記
〔17〕記載の抗体；

【００１８】〔１９〕 抗血清であることを特徴とする
上記〔13〕〜〔18〕のいずれか一記載の抗体； 〔２０〕 モノクローナル抗体であることを特徴とする
上記〔13〕〜〔18〕のいずれか一記載の抗体； 〔２１〕 マウスMT2-MMP またはその塩に対するモノク
ローナル抗体であることを特徴とする上記〔13〕〜〔1
8〕および〔20〕のいずれか一記載の抗体； 〔２２〕 上記〔13〕の抗体を得ることを特徴とする上
記〔１〕のタンパク質またはその塩あるいはその部分ペ
プチドまたはその塩に対する抗体の製造方法； 〔２３〕 上記〔１〕のタンパク質またはその塩あるい
はその部分ペプチドまたはその塩で免疫した動物から得
られた、上記〔１〕のタンパク質またはその塩あるいは
その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を産生する
細胞を、継代培養可能な細胞と融合せしめ、継代培養可
能でかつマウスMT2-MMP を包含するタンパク質に対する
抗体を産生するハイブリッド細胞を選別することを特徴
とする上記〔20〕または〔21〕記載の抗体の産生方法；

【００１９】〔２４〕 上記〔１〕のタンパク質または
その塩あるいはその部分ペプチドまたはその塩を試薬と
して用いるか、あるいは上記〔13〕〜〔21〕のいずれか
一記載の抗体を試薬として用いることを特徴とするMT2-
MMP の検出・測定方法； 〔２５〕 上記〔24〕のMT2-MMP の検出・測定方法に用
いる標識化されたMT2-MMP に対する抗体； 〔２６〕 上記〔24〕のMT2-MMP の検出・測定方法に用
いる上記〔１〕のタンパク質またはその塩あるいはその
部分ペプチドまたはその塩であることを特徴とする標識
化されたタンパク質またはその塩あるいは部分ペプチド
またはその塩； 〔２７〕 標識化された上記〔７〕の核酸；及び 〔２８〕 ハイブリダイゼーション・プローブであるこ
とを特徴とする上記〔27〕記載の核酸を提供する。

【００２０】さらに別の態様では、本発明は 〔２９〕 上記〔１〕のタンパク質またはその塩の有す
る潜在型ゼラチナーゼ A活性化能を阻害する化合物およ
びタンパク質またはその塩を検出する方法； 〔３０〕 上記〔１〕のタンパク質またはその塩の有す
る潜在型ゼラチナーゼ A活性化能を阻害する化合物およ
びタンパク質またはその塩； 〔３１〕 有効成分として上記〔30〕記載の化合物およ
びタンパク質またはその塩を含有することを特徴とする
抗癌剤および癌転移抑制剤； 〔３２〕 有効成分として上記〔31〕のタンパク質また
はその塩が上記〔13〕〜〔18〕記載の抗体から選択され
るマウスMT2-MMP の中和抗体を含有することを特徴とす
る抗癌剤および癌転移抑制剤； 〔３３〕 有効成分として上記〔32〕の中和抗体が上記
〔20〕記載の抗体から選択されるモノクローナル抗体あ
るいはその誘導体を含有することを特徴とする抗癌剤お
よび癌転移抑制剤； 〔３４〕 有効成分として上記〔31〕のタンパク質また
はその塩が潜在型ゼラチナーゼ A活性化能を有さない上
記〔１〕のタンパク質の部分ペプチドおよび誘導体ある
いはそれらの塩を含有することを特徴とする抗癌剤およ
び癌転移抑制剤；

【００２１】〔３５〕 上記〔１〕のタンパク質または
その塩の有する細胞外マトリクス分解活性を阻害する化
合物およびタンパク質またはその塩を検出する方法； 〔３６〕 上記〔１〕のタンパク質またはその塩の有す
る細胞外マトリクス分解活性を阻害する化合物およびタ
ンパク質またはその塩； 〔３７〕 有効成分として上記〔36〕記載の化合物およ
びタンパク質およびその誘導体あるいはそれらの塩を含
有することを特徴とする抗癌剤および癌転移抑制剤； 〔３８〕 有効成分として上記〔37〕のタンパク質また
はその塩が上記〔13〕〜〔18〕記載の抗体から選択され
るマウスMT2-MMP の中和抗体を含有することを特徴とす
る抗癌剤および癌転移抑制剤； 〔３９〕 有効成分として上記〔38〕の中和抗体が上記
〔20〕記載の抗体から選択されるモノクローナル抗体あ
るいはその誘導体を含有することを特徴とする抗癌剤お
よび癌転移抑制剤； 〔４０〕 有効成分として上記〔37〕のタンパク質また
はその塩が細胞外マトリクス分解活性を有さない上記
〔１〕のタンパク質の部分ペプチドおよび誘導体あるい
はそれらの塩を含有することを特徴とする抗癌剤および
癌転移抑制剤； 〔４１〕 配列表の配列番号：１で表される塩基配列を
含むDNA およびRNA配列にハイブリダイズするアンチセ
ンスオリゴマーおよびその誘導体； 〔４２〕 上記〔41〕のアンチセンスオリゴマーおよび
その誘導体でマウスMT2-MMP 遺伝子の転写あるいは翻訳
を阻害し、マウスMT2-MMP の発現を阻止するアンチセン
スオリゴマーおよびその誘導体；及び 〔４３〕 有効成分として上記〔41〕のアンチセンスオ
リゴマーおよびその誘導体を含有することを特徴とする
抗癌剤および癌転移抑制剤を提供する。

【００２２】

【発明の実施の形態】潜在型ゼラチナーゼ Aの活性化能
を有するMMP の一種であるが、MT1-MMP 以外の潜在型ゼ
ラチナーゼ A活性化因子である天然のMT-MMP（例えば、
マウスMT2-MMP ）と実質的に同等な活性を有するタンパ
ク質またはその塩、そのタンパク質の特徴的な部分ペプ
チドまたはその塩、それらをコードする遺伝子、例えば
DNA 、RNA など、その遺伝子を遺伝子組換え技術で操作
することが可能なように含有しているベクターあるいは
プラスミド、こうしたベクターなどで形質転換された宿
主細胞、さらにはその遺伝子を含有するトランスジェニ
ックマウス等のトランスジェニック動物、その遺伝子を
特異的に欠失（欠損) するノックアウトマウス等のノッ
クアウト動物、その宿主細胞を、培養して該タンパク質
またはその塩を製造する方法、こうして得られた該タン
パク質またはその塩やそのタンパク質の特徴的な部分ペ
プチドまたはその塩を用いて得られた抗体、特にはモノ
クローナル抗体、その抗体を産生するハイブリドーマ細
胞、該単離された遺伝子、例えばDNA 、RNA などをプロ
ーブとして用いたり、あるいは該抗体を用いた測定診断
手段が提供される。

【００２３】より具体的には、本発明は配列表の配列番
号：２で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とす
るマウスMT2-MMP またはその塩を提供する。本発明のマ
ウスMT2-MMP としては、潜在型ゼラチナーゼ Aの活性化
能を有するMMP の一種であり且つマウスMT1-MMP 以外で
あって潜在型ゼラチナーゼ A活性化能を有することを特
徴とし潜在型ゼラチナーゼ A活性化因子でかつ新規なア
ミノ酸配列を有するものであればよい。より好ましくは
本発明のマウスMT2-MMP としては、配列表の配列番号：
２で表されるアミノ酸配列あるいはそれと実質的に同等
のアミノ酸配列を有するものがすべて挙げられる。さら
に本発明のマウスMT2-MMP としては、プレプロ部分とし
て配列中のアミノ酸番号１位のＭｅｔから１２８位のＴ
ｙｒまでのアミノ酸配列の一部または全部を有していて
もよい。こうした配列を有するものはすべて包含されて
よい。本発明のマウスMT2-MMP は、配列表の配列番号：
１で表される塩基配列の２９から３１位のＡＴＧから２
０００から２００２位のＴＧＡより構成される塩基配列
にコードされるもの（２０００から２００２位の終止コ
ドンＴＧＡは、ＴＡＡまたはＴＡＧでも有りうる）であ
ることができるし、また、該塩基配列と相同性を有する
が、マウスMT1-MMP 以外の配列を持ち且つ潜在型ゼラチ
ナーゼ Aの活性化能を有するといったそれと同効の塩基
配列を含有するDNA 配列でコードされるものであること
ができる。該マウスMT2-MMP の塩基配列は、修飾（例え
ば、付加、除去、置換など）されることもでき、そうし
た修飾されたものも包含されてよい。

【００２４】配列表の配列番号：１で表される塩基配列
またはそれと同効の塩基配列を含有する本発明のDNA
は、例えば以下に示す方法によって取得できる。なお、
遺伝子組換え技術は、例えばT. Maniatis et al.,"Mole
cular Cloning", 2nd ed., Cold Spring Harbor Labora
tory, Cold Spring Harbor, N. T. (1989)；日本生化学
会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東
京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学
実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えDNA 技術）」、東京化
学同人（１９９２）；R. Wu ed., "Methods in Enzymol
ogy", Vol. 68, Academic Press, New York (1980)；R.
Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100
& 101, Academic Press, New York (1983)；R. Wu et a
l. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153, 154 & 1
55, Academic Press, New York (1987) などに記載の方
法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそ
れらと実質的に同様な方法や改変法により行うことがで
きる。

【００２５】先ず、その全配列あるいは部分配列がクロ
ーニングされている既知のMMP ファミリー（特には、MM
P ファミリーのうちのサブファミリーであるMT-MMP、よ
り好ましくはヒトMT1-MMP ）より得られたDNA 断片をプ
ローブに種々のマウス組織（肺、肝臓、脳、腎臓、腸、
胃、子宮、卵巣、膵臓、胎盤、口腔癌、肺癌等）あるい
は培養細胞（マウス線維肉腫細胞、マウス単球性白血病
細胞等）から構築されたcDNAライブラリーをスクリーニ
ングし、プローブにハイブリダイズするクローンを選択
し、該クローン中のcDNAの挿入配列の塩基配列を決定
し、新規なＭＭＰ遺伝子配列を有するDNA 断片を取得す
る。必要に応じて該クローン中のcDNAの挿入配列はサブ
クローニングすることができる。塩基配列の決定は、ダ
イデオキシ法、例えばＭ１３ダイデオキシ法など、Maxa
m-Gilbert 法などを用いて行うことができるが、市販の
シークエンシングキット、例えば Taqダイプライマーサ
イクルシークエンシングキットなどを用いたり、自動塩
基配列決定装置、例えば蛍光DNA シーケンサー装置など
を用いて行うことが出来る。

【００２６】こうして新規なＭＭＰ遺伝子配列を有する
DNA 断片を取得することができるが、完全なオープン・
リーディング・フレームを含むDNA 断片を取得するため
など、必要に応じて、こうして得られた新規なＭＭＰ遺
伝子配列を有するDNA 断片をプローブに用いて、上記し
たような種々のマウス組織あるいは培養細胞から構築さ
れたcDNAライブラリーをスクリーニングし、プローブに
ハイブリダイズするクローンを選択し、該クローン中の
cDNAの挿入配列の塩基配列を決定し、新規なＭＭＰ遺伝
子配列を有するDNA 断片を取得する。もちろん、必要に
応じて該クローン中のcDNAの挿入配列はサブクローニン
グすることができる。決定された塩基配列を基にして、
目的とするDNA を単離することができる。好ましくはマ
ウス肺cDNAライブラリーをスクリーニングし、塩基配列
の決定をして目的とするDNA を単離する。なお、プロー
ブなどを放射性同位体などによって標識するには、市販
の標識キット、例えばランダムプライムドDNA ラベリン
グキット (Boehringer Mannhaim)などを使用して行うこ
とが出来る。

【００２７】cDNAライブラリーを構築するためには、cD
NAを入手する必要があるが、これは、例えば次のように
して得られる。先ず上記したような種々のマウス組織あ
るいは培養細胞からmRNAを単離する。特に好適にはマウ
ス肺細胞よりmRNAを単離できる。mRNAの単離は、当該分
野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改
変法により行うことができるが、T. Maniatis et al.,
"Molecular Cloning",2nd ed., Chapter 7, Cold Sprin
g Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. T. (19
89); L. Grossman et al. ed., "Methods in Enzymolog
y", Vol. 12, Part A & B, Academic Press, New York
(1968); S. L. Berger et al. ed., "Methods in Enzym
ology", Vol. 152, p.33 & p.215, Academic Press, Ne
w York (1987);Biochemistry, 18: 5294-5299, 1979 な
どに記載の方法、例えばグアニジン−塩化セシウム法、
チオシアン酸グアニジン法、フェノール法などの方法で
行うことが出来る。必要に応じ、得られた全RNA はオリ
ゴ（ｄＴ）−セルロースカラムなどを使用して精製して
ポリ（Ａ）⁺ mRNAを得ることが出来る。このmRNA及び逆
転写酵素を用いてcDNAを作製する。mRNA及び逆転写酵素
を用いてのcDNA合成は当該分野で公知の方法あるいはそ
れと実質的に同様な方法や改変法により行うことができ
るが、H. Land et al., Nucleic Acids Res., 9: 2251,
1981; U. Gubler et al., Gene, 25: 263-269, 1983;
S. L. Berger et al. ed., "Methodsin Enzymology",
Vol. 152, p.307, Academic Press, New York (1987)
などに記載の方法が挙げられる。

【００２８】こうして作製されたcDNAを基に、ファージ
ベクターを使用するなどしてcDNAライブラリーを構築で
きる。またファージベクターを使用する以外で、大腸菌
などの宿主細胞の形質転換をするには、例えばカルシウ
ム法、ルビジウム／カルシウム法など当該分野で知られ
た方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことが
できる（D. Hanahan, J. Mol. Biol., 166: 557, 1983
など）。さらに市販の種々の組織由来cDNAライブラリー
を直接使用することもでき、例えばClontech,USA など
から市販されたcDNAライブラリーを用いることができ
る。また別の方法としては、こうして作製されたcDNAを
鋳型にＰＣＲ増幅反応を行うことによっても可能であ
る。典型的な場合、その全配列あるいは部分配列がクロ
ーニングされている既知のMMP ファミリー（特には、MM
P ファミリーのうちのサブファミリーであるMT-MMP、よ
り好ましくはヒトMT1-MMP ）より得られたアミノ酸配列
から選択した、高度に保存されているアミノ酸配列（例
えば、プロ体と活性型の切断部位近傍の配列など）やMT
-MMPに特異的に存在する領域のアミノ酸配列（例えば、
Ｃ末端側のトランスメンブレン・ドメイン領域のうちの
アミノ酸配列、プロペプチド・ドメインと触媒ドメイン
の間に存在する領域のうちのアミノ酸配列など）を基
に、デジェネレイテッド・プライマーを作製する。プラ
イマーの作製は、当該分野で知られた方法で行うことが
でき、例えばDNA 自動合成装置を用い、フォスフォジエ
ステル法、フォスフォトリエステル法、フォスフォアミ
ダイト法などにより合成できる。このプライマーと上記
作製したcDNAとを用い、ＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応は、
当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方
法や改変法により行うことができるが、例えば R. Saik
i, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et
al., Science, 239: 487, 1985；ＰＣＲテクノロジー
(PCR Technology)，ストックトンプレス (Stockton Pre
ss) などに記載された方法に従って行うことができる。
得られたＰＣＲ産物をクローニングし、得られたＰＣＲ
産物の塩基配列を決定し、新規なＭＭＰ遺伝子配列を有
するDNA 断片を取得することもできる。また、このDNA
断片をプローブに同様にして種々のcDNAライブラリーを
スクリーニングし、目的とするDNA を単離することもで
きる。

【００２９】以下にさらに詳細に記述する。プローブDN
A を使用して、cDNAライブラリーから新規MT2-MMP 遺伝
子をスクリーニングし、得られた新規MT2-MMP 遺伝子を
コードするDNA 断片の塩基配列を決定する。プローブDN
A としては、例えば、ヒトMT1-MMPcDNA 断片（Gene, 15
5: 293〜298, 1995 ）を用い、それを標識してプローブ
として用いることができる。標識には、DNA ラベリング
キットを用いることができ、例えば、ランダムプライム
ドDNA ラベリングキット（Boehringer Mannhaim ）など
を使用してプローブ用DNA を [α-³²P]dCTP （Amersha
m）などを用いて標識し、放射活性を持つプローブを得
ることができる。該標識cDNA断片とマウス組織細胞から
調製したcDNAライブラリー、例えばマウス肺cDNAライブ
ラリー（Clontechから入手可能）などを用い、プラーク
ハイブリダイゼーションを行う。マウス肺cDNAライブラ
リーは、例えば、λgt10などのファージ中に構築するこ
とができ、それを大腸菌C600hfl 株などの宿主大腸菌に
感染させ、プラークを形成させて得ることができる。ハ
イブリダイゼーションは、上記のように形成されたプラ
ークをナイロンフィルターなどの膜に転写せしめ、必要
に応じ変成処理、固定化処理、洗浄処理などを施した
後、その膜に転写せしめられたものを、必要に応じ変成
させた標識プローブcDNA断片と、ハイブリダイゼーショ
ン用バッファ中で反応させて行われる。

【００３０】ハイブリダイゼーション処理は、普通約40
℃〜約80℃、より好適には約55℃〜約65℃で、約15分〜
約24時間、より好適には約1 時間〜約4 時間行われる
が、適宜最適な条件を選択して行うことができる。例え
ば、ハイブリダイゼーション処理は、約60℃で約2 時間
行われる。ハイブリダイゼーション用バッファとして
は、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用
いることができ、例えば、Rapid hybridization buffer
（Amersham）などを用いることができる。転写した膜の
変成処理としては、アルカリ変性液を使用する方法が挙
げられ、その処理後中和液や緩衝液で処理するのが好ま
しい。また膜の固定化処理としては、普通約40℃〜約 1
00℃、より好適には約70℃〜約90℃で、約15分〜約24時
間、より好適には約1 時間〜約4 時間ベーキングするこ
とにより行われるが、適宜好ましい条件を選択して行う
ことができる。例えば、フィルターを約80℃で約2 時間
ベーキングすることにより固定化が行われる。転写した
膜の洗浄処理としては、当該分野で普通に使用される洗
浄液、例えば1M NaCl 、1mM EDTAおよび 0.1％ SodiumD
odecyl sulfate (SDS) 含有 50mM Tris-HC1緩衝液，pH
8.0 などで洗うことにより行うことができる。ナイロン
フィルターなどの膜としては、当該分野で普通に使用さ
れるものの中から選んで用いることができ、例えば、ナ
イロンフィルター［ハイボンド（Hybond）-N、Amsham］
などを挙げることができる。

【００３１】上記アルカリ変性液、中和液、緩衝液とし
ては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで
用いることができ、アルカリ変性液としては、例えば、
0.5MNaOH および1.5M NaCl を含有する液などを挙げる
ことができ、中和液としては、例えば、1.5M NaCl 含有
0.5M Tris−HCl 緩衝液，pH8.0 などを挙げることがで
き、緩衝液としては、例えば、 2×SSPE（0.36M NaCl、
20mM NaH₂PO₄および2mM EDTA）などを挙げることができ
る。またハイブリダイゼーション処理に先立ち、非特異
的なハイブリダイゼーション反応を防ぐために、必要に
応じて転写した膜はプレハイブリダイゼーション処理す
ることが好ましい。このプレハイブリダイゼーション処
理は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液［50％
formamide、 5×Denhardt's溶液（0.2 ％ウシ血清アル
ブミン、0.2 ％ polyvinylpyroldone ）、 5×SSPE、0.
1 ％ SDS、100 μg/ml 熱変性サケ精子DNA ］などに浸
し、約35℃〜50℃、好ましくは約42℃で、約 4〜24時
間、好ましくは約 6〜8 時間反応させることにより行う
ことができるが、こうした条件は当業者であれば適宜実
験を繰り返し、より好ましい条件を決めることができ
る。ハイブリダイゼーションに用いる標識プローブcDNA
断片の変成は、例えば、約70℃〜100 ℃、好ましくは約
100 ℃で、約1 分間〜約60分間、好ましくは約 5分間加
熱するなどして行うことができる。

【００３２】ハイブリダイゼーション完了後、フィルタ
ーを十分に洗浄処理し、特異的なハイブリダイゼーショ
ン反応をした標識プローブcDNA断片以外の標識プローブ
を取り除く。フィルターの洗浄処理は、当該分野で普通
に使用されるものの中から選んで用いて行うことがで
き、例えば、0.1 ％ SDS含有 0.5×SSC ( O.15M NaCl、
15mM クエン酸）溶液などで洗うことにより実施でき
る。ハイブリダイズしたプラークは、代表的にはオート
ラジオグラフィーにより検出することができるが、当該
分野で用いられる方法の中から適宜選択してプラーク検
出に用いることもできる。検出したシグナルに相当する
プラークを、適切な緩衝液、例えば、SM溶液（ 100mM N
aCl および10mM MgSO₄含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.
5 ）などに懸濁し、ついでこのファージ懸濁液を適度に
希釈して、大腸菌に感染させ、得られた大腸菌を培養し
て、その培養された大腸菌から目的組換え体ファージを
得る。なお、必要に応じて上記プローブDNA を使用し
て、ハイブリダイゼーション処理によりcDNAライブラリ
ーから目的組換え体ファージをスクリーニングする処理
は、繰り返して行うことができる。また目的組換え体フ
ァージは、培養された大腸菌から抽出処理、遠心分離処
理などを施して得ることができる。

【００３３】得られたファージ粒子は、当該分野で普通
に使用される方法で精製分離することができ、例えば、
グリセロールグラジエント超遠心分離法（Molecular cl
oning, a laboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold
Spring Harbor Laboratory,2nd ed. 78, 1989）などに
より精製することができる。ファージ粒子からは、当該
分野で普通に使用される方法でDNA を精製分離すること
ができ、例えば、得られたファージをTM溶液（10mM MgS
O₄含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.8 ）などに懸濁し、
DNase I およびRNase A などで処理後、20mM EDTA 、50
μg/ml Proteinase K 及び0.5 ％SDS 混合液などを加
え、約65℃、約1 時間保温した後、これをフェノール抽
出ジエチルエーテル抽出後、エタノール沈殿によりDNA
を沈殿させ、次に得られたDNA を70％エタノールで洗浄
後乾燥し、TE溶液（10mM EDTA 含有10mM Tris-HC1 緩衝
液、pH8.0 ）に溶解するなどして得られる。また、目的
としているDNA は、サブクローニングなどにより大量に
得ることも可能であり、例えばサブクローニングは、宿
主として大腸菌を用いプラスミドベクターなどを用いて
行うことができる。こうしたサブクローニングにより得
られたDNA も、上記と同様にして遠心分離、フェノール
抽出、エタノール沈殿などの方法により精製分離でき
る。

【００３４】こうして得られたDNA の塩基配列、例えば
１本鎖DNA の塩基配列は、蛍光DNAシーケンサModel 373
A（Applied Biosystems）、Taq ダイプライマーサイク
ルシークエンシングキット（Applied Biosystems）など
を使用しその配列を決定することができる。そのDNA の
決定された塩基配列に関し、例えば、こうして得られた
目的とするDNA を含有する 8クローンの内、 6クローン
はProc. Natl. Acad.Sci. USA., 92: 2730 〜2734, 199
5に記載されているマウスMT1-MMP 遺伝子の一部と一致
した。このクローンのDNA 挿入断片をプローブに用い、
再度、上記と同様にしてマウス肺cDNAライブラリーなど
のスクリーニングを行うことにより、完全なオープンリ
ーディングフレームを含んでいるクローン、欠けた遺伝
子部分を含んでいるクローン、完全なオープンリーディ
ングフレームとするに欠かせない部分を含むクローンな
どを得ることができる。こうした再cDNAライブラリーの
スクリーニングの場合、より特異性の高いハイブリダイ
ゼーションの条件を選んで用いることが好ましい。また
決定されたDNA の塩基配列を基にプライマーをデザイン
し、これらプライマーと各種の動物細胞由来のcDNAライ
ブラリー（例えば、各種のマウス細胞由来のcDNAライブ
ラリー）を用いて、スクリーニングを行うことにより、
同様に目的とするクローンを得ることができる。またこ
れらプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、目的とする
遺伝子や、新規な遺伝子、それらの断片などを得ること
ができる。こうしてマウスMT2-MMP と相同性を有する
が、配列が新規なＰＣＲ産物を検索することもできる。

【００３５】こうして本発明に従って、上記で得られた
目的とするDNA を含有するクローンのDNA 挿入断片をプ
ローブに用いスクリーニングを行うことにより、陽性ク
ローンを検索して得ることができる。例えば、１クロー
ンの組換え体ファージを目的とするDNA を含有するクロ
ーンとして分離できる。このクローン化した組換え体フ
ァージより単離された遺伝子のDNA の塩基配列の決定を
行うと、その決定した塩基配列の全長は3339bpであり、
その配列は配列表の配列番号：1 で示されたものが得ら
れていることが認められる。GENBANK/EMBL DNA Data Ba
seを使用し、配列表の配列番号：1 に記載した塩基配列
を検索したところ、同一の配列は存在しなかった。この
単離され同定された約3.3kb のDNA 配列中には、推定65
7 アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム
の存在が認められ、その推定されるアミノ酸配列は、配
列表の配列番号：2 で示されるようなものと認められ
る。この推定されるタンパク質を「マウスMT2-MMP 」と
名付けた。そして、マウスMT2-MMP 遺伝子は、新規なＭ
ＭＰタンパク質をコードしていることは明白であり、マ
ウスMT2-MMP 遺伝子を用いて作製した組換え体プラスミ
ドは全て新規な組換え体であり、そのプラスミドで形質
転換あるいはトランスフェクトされ得られた形質転換体
あるいはトランスフェクタントも新規なものである。得
られたDNA 断片を、下記で詳しく説明するような適当な
ベクター、例えば、プラスミドpEX 、pMAMneo 、pKG5な
どのベクターに組込み、下記で詳しく説明するような適
当な宿主細胞、例えば、大腸菌、CHO 細胞などで発現さ
せることができる。また、該DNA 断片は、そのままある
いは適当な制御配列を付加したDNA 断片として、または
適当なベクターに組込み、そして動物に導入して、MT2-
MMP 遺伝子、例えば、マウスMT2-MMP を発現するトラン
スジェニック動物を作成することができる。動物として
は、温血動物が挙げられ、例えば、マウス、ラット、ウ
サギ、、モルモット、ブタなどが挙げられる。好ましく
は、マウスなどの動物の受精卵に該DNA 断片を導入し
て、トランスジェニック動物を作成することができる。

【００３６】本発明で得られた配列表の配列番号：１に
記載のマウスMT2-MMP の塩基配列から推定される配列表
配列番号：２に記載したアミノ酸配列を既知のヒトMT-M
MPsのアミノ酸配列と比較したすると、配列表配列番
号：２に示したアミノ酸配列は、ヒトMT-MMPs と高い相
同性を示し、ヒトMT-MMPs に特徴的なドメイン構造、す
なわち、分泌産生時に除去されるシグナルペプチド、プ
ロペプチドドメイン、触媒ドメイン、ヒンジドメイン、
ヘモペキシン凝血酵素様ドメインが良好に保存されてい
る。したがって、こうした特徴を持つものは、本発明の
マウス由来のタンパク質に含まれてよい。特に、ヒトMT
-MMPs を含むMMP ファミリーで非常に高度に保存されて
いるプロ体と活性型の切断部位近傍の配列PRCGVPD は、
マウスMT2-MMP でも完全に保存されている（配列表の配
列番号：２のPro¹⁰⁵〜Asp¹¹¹）。さらにマウスMT2-MMP
には、ヒトMT-MMPs のアミノ酸配列上で他のMMP ファミ
リーと比較して特徴的な点である3 ケ所の挿入配列が存
在する。すなわち、プロペプチドドメインと触媒ドメイ
ンの間に存在するRRKRの配列を含む13個のアミノ酸残基
の挿入配列-1（IS-1；配列表の配列番号：2 のVal¹¹⁵〜
Arg¹²⁷）、触媒ドメイン中のSYDDIRLRの配列からなる８
個のアミノ酸残基の挿入配列-2（IS-2；配列表の配列番
号：2 のSer¹⁷⁹〜Arg¹⁸⁶）およびトランスメンブレンド
メイン様の22個の疎水性アミノ酸の連続配列VVMVLVPLLL
LLCILGLAFALVを含む 102個のアミノ酸残基の挿入配列-3
（IS-3；配列表の配列番号：2 のGln⁵⁵⁶〜Val⁶⁵⁷）が存
在する。

【００３７】最初の挿入配列IS-1は、ヒトMMP ファミリ
ーにおいて例外的にMMP-11にも存在しているが、IS-1中
で保存されている配列RXKR(Xは任意のアミノ酸残基を示
す)は、ズブチリシン様プロテアーゼの切断部位の配列
であり、アミノ酸配列RXKRはズブチリシン様プロテアー
ゼによる多くの真核生物分泌タンパク質の切断部位であ
ることが知られている（J. Biol.Chem., 266: 12127 〜
12130, 1991 ）。IS-3中の疎水性アミノ酸の連続配列は
トランスメンブレンドメインと考えられ、ヒトMT-MMPs
の際立った特徴的な点であり（Cancer Res., 56: 944〜
949, 1996 ）、マウスMT2-MMP のIS-3中に存在する疎水
性アミノ酸の連続配列もトランスメンブレンドメインと
考えられる。したがって、こうした特徴のすべてあるい
はいずれか、または任意の組み合わせを持つものは、本
発明のマウス由来のタンパク質に含まれてよい。マウス
MT2-MMP のアミノ酸配列を他の既知のヒトMT-MMPs と比
較したところ、ヒトMT2-MMP に対する相同性が87％と最
も高く、また他のMT-MMPs に対する相同性もヒトMT1-MM
P に対して52％、ヒトMT3-MMP に対して50％、ヒトMT4-
MMP に対して29％の相同性を示すことから、本発明のマ
ウス由来のタンパク質としては、配列表の配列番号：２
に対して87％を越えるものはそのうちに含まれる。

【００３８】マウスMT2-MMP 遺伝子産物の確認を、マウ
スMT2-MMP 遺伝子をトランスフェクションしたＣＯＳ−
１細胞などのそれに適した動物細胞などを用いて行うこ
とができる。この外来遺伝子を哺乳動物などの動物細胞
に導入する方法としては当該分野で知られた方法あるい
はそれと実質的に同様な方法で行うことができ、例えば
リン酸カルシウム法（例えば、F. L. Graham et al., V
irology, 52: 456, 1973など）、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン法（例えば、D. Warden et al., J. Gen. Virol., 3:
371, 1968など）、エレクトロポレーション法（例え
ば、E. Neumann et al., EMBO J, 1: 841, 1982 な
ど）、マイクロインジェクション法、リボソーム法、ウ
イルス感染法、ファージ粒子法などが挙げられる。こう
してマウスMT2-MMP 遺伝子をトランスフェクションされ
た動物細胞の産生する遺伝子産物は、抗マウスMT2-MMP
モノクローナル抗体を用いた免疫沈降実験で解析するこ
ともできる。こうした解析では、例えば、トランスフェ
クションされた動物細胞溶解物から特定のトランスフェ
クションされた遺伝子産物であるタンパク質が免疫沈降
されるのに対し、培養上清からは相当するタンパク質は
検出されないというものであることもできる。すなわ
ち、マウスMT2-MMP 遺伝子産物は分泌されることなく、
細胞表層上で発現していることを示すことによりなされ
るものであることができる。

【００３９】マウスMT2-MMP 遺伝子を組込むプラスミド
としては遺伝子工学的に常用される宿主細胞（例えば、
大腸菌、枯草菌等の原核細胞宿主、酵母、ＣＨＯ細胞等
の真核細胞宿主、Ｓｆ２１等の昆虫細胞宿主）中で該DN
A が発現できるプラスミドであればどのようなプラスミ
ドでもよい。こうした配列内には、例えば選択した宿主
細胞で発現するのに好適なコドンが導入されていること
ができるし、制限酵素部位が設けられていることもでき
るし、目的とする遺伝子の発現を容易にするための制御
配列、促進配列など、目的とする遺伝子を結合するのに
役立つリンカー、アダプターなど、さらには抗生物質耐
性などを制御したり、代謝を制御したりし、選別などに
有用な配列等を含んでいることができる。好ましくは、
適当なプロモーター、例えば大腸菌を宿主とするプラス
ミドでは、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラ
クトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラ
クトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌ
ｐｐ）プロモーター、λファージＰＬプロモーター等
を、動物細胞を宿主とするプラスミドでは、ＳＶ４０レ
ートプロモーター、ＭＭＴＶ ＬＴＲプロモーター、Ｒ
ＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲ
αプロモーター等を、酵母を宿主とするプラスミドで
は、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０プロモーター等を使用し得
る。

【００４０】大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、
例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ
１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＴ
Ｚ−１８Ｒ／−１８Ｕ、ｐＴＺ−１９Ｒ／−１９Ｕ、ｐ
ＧＥＭ−３、ｐＧＥＭ−４、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ
−４Ｚ、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＫＳ^TM (Stratagene) などが挙げられる。大腸菌
での発現に適したプラスミドベクターとしては、ｐＡ
Ｓ、ｐＫＫ２２３ (Pharmacia)、ｐＭＣ１４０３、ｐＭ
Ｃ９３１、ｐＫＣ３０なども挙げられる。動物細胞を宿
主とするプラスミドとしては、ＳＶ４０ベクター、ポリ
オーマ・ウイルスベクター、ワクシニア・ウイルスベク
ター、レトロウイルスベクターなどが挙げられ、例えば
ｐｃＤ、ｐｃＤ−ＳＲα、ＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭ
Ｅ１８Ｓ、ｐＢＣ１２ＢＩ、ｐＳＧ５ (Stratagene) な
どが挙げられる。酵母を宿主とするプラスミドとして
は、ＹＩｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型ベ
クター、ＹＣｐ型ベクターなどが挙げられ、例えばｐＧ
ＰＤ−２などが挙げられる。宿主細胞としては、宿主細
胞が大腸菌の場合、例えば大腸菌Ｋ１２株に由来するも
のが挙げられ、例えばＮＭ５３３ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、
Ｃ６００、ＤＨ１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９などが挙げ
られる。宿主細胞が動物細胞の場合、例えばアフリカミ
ドリザル線維芽細胞由来のＣＯＳ７細胞、ＣＯＳ−１細
胞、ＣＶ−１細胞、マウス線維芽細胞由来のＣＯＰ細
胞、ＭＯＰ細胞、ＷＯＰ細胞、チャイニーズ・ハムスタ
ー細胞由来のＣＨＯ細胞、ＣＨＯ ＤＨＦＲ^- 細胞、ヒ
トＨｅＬａ細胞、マウス細胞由来Ｃ１２７細胞、マウス
細胞由来ＮＩＨ ３Ｔ３細胞などが挙げられる。昆虫細
胞としては、カイコ核多角体病ウイルス (Bombyx mori
nuclear polyhedrosis virus)をベクターとし、カイコ
幼虫あるいはカイコ培養細胞、例えばＢＭ−Ｎ細胞など
を用いることが挙げられる。

【００４１】本発明の遺伝子工学的手法においては、当
該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆
転写酵素、DNA 断片をクローン化するのに適した構造に
修飾したりあるいは変換するための酵素であるDNA 修飾
・分解酵素、DNA ポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ、DNA リガーゼなどを用いることが出
来る。制限酵素としては、例えば、R. J. Roberts, Nuc
leic Acids Res., 13:r165, 1985; S. Linn et al. ed.
Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab., Cold
Spring Harbor, New York, 1982; R. J. Roberts, D. M
acelis, Nucleic Acids Res., 19: Suppl. 2077, 1991
などに記載のものが挙げられる。逆転写酵素としては、
例えばマウスモロネイ白血病ウイルス (mouse Moloney
leukemiavirus; MMLV) 由来の逆転写酵素 (reverse tra
nscriptase)、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス (avian mye
loblastosis virus; AMV)由来の逆転写酵素などが挙げ
られ、特にはRNase H 欠損体などは好ましく用いること
が出来る。DNA ポリメラーゼとしては、例えば大腸菌DN
A ポリメラーゼ、その誘導体であるクレノウ・フラグメ
ント、大腸菌ファージＴ４ DNA ポリメラーゼ、大腸菌
ファージＴ７ DNAポリメラーゼ、耐熱菌DNA ポリメラ
ーゼなどが挙げられる。末端ヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼとしては、例えばR. Wu et al. ed., "Methods
in Enzymology", Vol. 100, p. 96, Academic Press,
New York (1983) に記載の３’−ＯＨ末端にデオキシヌ
クレオチド（ｄＮＭＰ）を付加するＴｄＴａｓｅなどが
挙げられる。DNA 修飾・分解酵素としては、エキソヌク
レアーゼ、エンドヌクレアーゼなどが挙げられ、例えば
ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステラー
ゼ、大腸菌DNA エキソヌクレアーゼ I、大腸菌DNA エキ
ソヌクレアーゼIII 、大腸菌DNA エキソヌクレアーゼ V
II、λエキソヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ I、ヌクレアー
ゼＳ１、ミクロコッカス (Micrococcus) ヌクレアーゼ
などが挙げられる。DNA リガーゼとしては、例えば大腸
菌DNA リガーゼ、Ｔ４ DNA リガーゼなどが挙げられ
る。DNA 遺伝子をクローニングしてDNA ライブラリーを
構築するのに適したベクターとしては、プラスミド、λ
ファージ、コスミド、Ｐ１ファージ、Ｆ因子、ＹＡＣな
どが挙げられ、好ましくはλファージ由来のベクターが
挙げられ、例えばＣｈａｒｏｎ ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ
２１Ａ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＤＡＳＨＩＩ、λ
ＦＩＸＩＩ、λＥＭＢＬ３、λＺＡＰＩＩ^TM (Stratage
ne) などが挙げられる。

【００４２】さらに、本発明に係わるマウスMT2-MMP の
遺伝子塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法を
用いることにより、マウスMT2-MMP のアミノ酸配列中に
適宜、１個ないし複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、
挿入、転移あるいは付加したごとき変異を導入した相当
するタンパク質を製造することができる。こうした変異
・変換・修飾法としては、日本生化学会編、「続生化学
実験講座１、遺伝子研究法 II 」、ｐ１０５（広瀬
進）、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、
「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技
術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９
２）；R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymol
ogy", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, N
ew York (1987)；R. Wu,L. Grossman, ed., "Methods i
n Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468, Academic
Press, New York (1983)；J. A. Wells et al., Gen
e, 34: 315, 1985；T. Grundstroem et al., Nucleic A
cids Res., 13: 3305, 1985 ；J. Tayloret al., Nucle
ic Acids Res., 13: 8765, 1985；R. Wu ed., "Methods
in Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Press,
New York（1987) ；A. R. Oliphant et al., Gene, 4
4: 177, 1986などに記載の方法が挙げられる。例えば合
成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入
法（部位特異的変異導入法）、 Kunkel 法、 dNTP[αS]
法（Eckstein) 、亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定
変異導入法等の方法が挙げられる。さらに得られた本発
明のタンパク質は、化学的な手法でその含有されるアミ
ノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例
えばペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライ
ン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなどの酵
素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体
などにすることができる。また遺伝子組換え法で製造す
る時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるいは
生体外で天然のマウスMT2-MMP と実質的に同等の生物学
的活性を有しているものに変換・加工してもよい。遺伝
子工学的に常用される融合産生法を用いることができる
が、こうした融合タンパク質はその融合部を利用してア
フィニティクロマトグラフィーなどで精製することも可
能である。タンパク質の構造の修飾・改変などは、例え
ば日本生化学会編、「新生化学実験講座１、タンパク質
VII、タンパク質工学」、東京化学同人（１９９３）を
参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用された
文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法
で行うことができる。また下記するようにその生物学的
活性のうちには、免疫的に活性、例えば抗原性を有する
ということも含まれてよい。

【００４３】かくして本発明は、１個以上のアミノ酸残
基が同一性の点で天然のものと異なるもの、１個以上の
アミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであって
もよい。本発明は、マウスMT2-MMP に特有なアミノ酸残
基が１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６
０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは
１〜２０個、特には１〜１０個など）欠けている欠失類
縁体、特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜８
０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４
０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個
など）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以
上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さら
に好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０
個、特には１〜１０個など）のアミノ酸残基が付加され
ている付加類縁体も包含する。ＭＭＰの共通の特徴であ
るドメイン構造やＣ末端のトランスメンブレンドメイン
構造が維持されていれば、上記のごとき変異体は、全て
本発明に包含される。また本発明のマウスMT2-MMP は天
然のマウスMT2-MMP と実質的に同等の一次構造コンフォ
メーションあるいはその一部を有しているものも含まれ
てよいと考えられ、さらに天然のマウスMT2-MMP と実質
的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよ
いと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであ
ることもできる。こうした本発明のマウスMT2-MMP は、
下記で説明するように分離・精製処理されることができ
る。こうして得られた本発明の潜在型ゼラチナーゼ Aの
活性化能を有するＭＭＰの一種であり且つMT1-MMP 以外
の潜在型ゼラチナーゼ A活性化因子である天然のMT-MMP
（特には、マウスMT2-MMP ）と実質的に同等な活性を有
することを特徴とするタンパク質またはその塩、あるい
はその部分ペプチドは、それを用いて酵素阻害剤の開発
や探索などの研究、医薬品の開発研究、マウスMT2-MMP
が関与すると考えられる生物的な現象や反応の研究を行
うことができるし、さらにはそれに対する抗体を作成す
るのに用いることができるし、特定の分析あるいは測定
対象物を調査研究するのに使用することもできる。一方
では、こうして本発明は上記したポリペプチドをコード
するDNA 配列、そして天然の特性の全部あるいは一部を
有するマウスMT2-MMP のポリペプチド、さらにその類縁
体あるいは誘導体をコードするDNA 配列も包含する。

【００４４】本発明のDNA 配列は、これまで知られてい
なかった哺乳動物のタンパク質のアミノ酸配列に関する
情報を提供しているから、こうした情報を利用すること
も本発明に包含される。こうした利用としては、例えば
マウスMT2-MMP 及び関連タンパク質をコードする哺乳動
物、特に好ましくはヒトの、ゲノムDNA 及びcDNAの単離
及び検知のためのプローブの設計などが挙げられる。本
発明のDNA 配列は、例えばマウスMT2-MMP 及び関連タン
パク質をコードする哺乳動物、特に好ましくはマウスや
ヒトの、ゲノムDNA 及びcDNAの単離及び検知のためのプ
ローブとして有用である。遺伝子の単離にあたっては、
ＰＣＲ法、さらには逆転写酵素（ＲＴ）を用いたＰＣＲ
法（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用することが出来る。マウスMT
2-MMP cDNA及びその関連DNA は、クローニングされ、配
列決定されたマウスMT2-MMP cDNA配列から推定されるア
ミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、DNA プラ
イマーをデザインして化学合成し、得られたDNA プライ
マーを用いて、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ、その他の方法
を用いてマウスMT2-MMP関連遺伝子の単離、検出などに
利用することが出来る。例えば、マウスMT2-MMPmRNAの
マウス組織中での発現を各種の組織由来poly (A)⁺ RNA
に対するノーザンブロット分析により検討することがで
きる。本発明のcDNAをプローブとして用いれば、例えば
ノーザン・ブロティング、サザン・ブロティング、in s
itu ハイブリダイゼーションなどによりマウス組織中で
のマウスMT2-MMP mRNAの発現やマウスMT2-MMP 遺伝子自
体などを検出・測定でき、ひいてはマウスを用いての研
究を基礎にヒト組織における癌細胞の有無、癌の悪性度
の診断等の癌の診断治療、またアルツハイマー病の診断
等の研究の発展に貢献できる。

【００４５】本発明で得られたDNA （例えば、マウスMT
2-MMP をコードするDNA ）を対象動物に転移させるにあ
たっては、それをDNA 断片としてあるいは該DNA を動物
細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合して用い
るのが一般に有利である。たとえば、マウスにマウスMT
2-MMP DNA を導入する場合、これと相同性が高い動物由
来のマウスMT2-MMP DNA を動物細胞で発現させうる各種
プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクト
を、対象動物の受精卵、たとえばマウス受精卵へマイク
ロインジェクションすることによってマウスMT2-MMP を
高産生する遺伝子導入（トランスジェニック）マウスを
作出できる。マウスとしては、特に純系のマウスに限定
されないが、例えば、C57BL/6 、Balb/C、C3H 、(C57BL
/6×DBA/2)F₁(BDF₁)などが挙げられる。このプロモータ
ーとしては、例えばウイルス由来プロモーター、メタロ
チオネイン等のユビキタスな発現プロモーターなどが好
ましく使用しうる。また該マウスMT2-MMP DNA を導入す
る場合、組換えレトロウイルスに組み換えて、それを用
いて行うこともできる。好適には対象DNA を導入された
マウス受精卵は、例えば、ICR のような仮親のマウスを
使用して生育せしめることができる。受精卵細胞段階に
おける本発明で得られたDNA （例えば、マウスMT2-MMP
をコードするDNA ）の転移は、対象動物の胚芽細胞およ
び体細胞の全てに存在するように確保される。DNA 転移
後の作出動物の胚芽細胞においてMT2-MMP をコードする
DNA が存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽
細胞および体細胞の全てに該MT2-MMP をコードするDNA
を有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の
動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てにおい
て、該MT2-MMP を発現できる可能性を有している。

【００４６】該MT2-MMP DNA 導入動物は、交配により遺
伝子を安定に保持することを確認して、該DNA 保有動物
として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。
さらに、目的DNA を保有する雌雄の動物を交配すること
により、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイ
ゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することに
よりすべての子孫が該DNA を有するように繁殖継代する
ことができる。該MT2-MMP DNA が導入された動物は、該
MT2-MMP タンパク質が高発現させられているので、該MT
2-MMP タンパク質に対する阻害剤（インヒビター）のス
クリーニング用の動物などとして有用である。またMT2-
MMP 遺伝子の複製を阻害することのできるアンチセンス
オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスDNA など
のスクリーニング用の動物などとして有用である。この
遺伝子導入動物を、組織培養のための細胞源として使用
することもできる。例えば、遺伝子導入マウスの組織中
のDNA もしくはRNA を直接分析するかあるいは遺伝子に
より発現されたタンパク質組織を分析することにより、
MMPs関連のタンパク質について分析することができる。
該MT2-MMP を有する組織の細胞を標準組織培養技術によ
り培養し、これらを使用して、たとえば肺やその他の組
織由来の一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究
することができる。また、その細胞を用いることによ
り、たとえば各種組織の機能を高めるような医薬開発に
資することも可能である。また、高発現細胞株があれ
ば、そこから、MT2-MMP を単離精製することも可能であ
る。トランスジェニック マウスなどに関連した技術
は、例えば、Brinster, R. L., et al.,; Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82:4438, 1985; Costantini, F. & Ja
enisch, R. (eds): Genetic manipulation ofthe early
mammalian embryo, Cold Spring Habor Laboratory, 1
985 などの文献に記載の方法あるいはそこに引用された
文献に記載の方法、さらにはそれらの改変法により行う
ことができる。

【００４７】本発明で得られた遺伝子（例えば、マウス
MT2-MMP をコードするDNA ）に変異をもち、マウスMT2-
MMP を全く発現しない変異マウス（ノックアウトマウ
ス）を作出することができる。たとえば、該遺伝子の翻
訳開始コドンの前後4kb を含むおよそ8kb のゲノムDNA
の中央近傍に位置し翻訳開始コドンに近いエクソンにne
o 耐性遺伝子-polyA付加シグナルからなる遺伝子カセッ
トを挿入した変異遺伝子を持つターゲティングベクター
を構築することができる。挿入する遺伝子カセットはne
o 耐性遺伝子カセット以外にDT-Aカセット、tkカセッ
ト、lacZカセットなどが挙げられる。ターゲティングベ
クターを直鎖状に開き、樹立したマウス胚性幹細胞（em
bryonic stem cells: ES細胞）にエレクトロポレーショ
ンで導入、さらに培養してneo 耐性を獲得したES細胞を
選別する。ES細胞は129 、C57BL/6 、F1(C57BL/6×CBA)
マウスなどのマウス系統から選択して調製することがで
きる。neo 耐性を獲得したES細胞は、MT2-MMP 遺伝子領
域において遺伝子カセットを挿入したターゲティングベ
クターと相同組換えを起こしていると想定され、少なく
ともMT2-MMP 遺伝子アリルのうち一つは破壊しMT2-MMP
を正常に発現できなくなる。選別には挿入した遺伝子カ
セットによりそれぞれ適当な方法が選択され、また、変
異の導入はPCR 、サザンハイブリダイゼーションあるい
はノーザンハイブリダイゼーションなどの方法を用いて
確認することができる。

【００４８】変異を導入したES細胞は、C57BL/6 、BALB
/c、ICR マウスなどから取り出した８細胞期胚に注入、
１日培養し胚盤胞に発生したものをICR のような仮親に
移植することで個体まで生育させることができる。生ま
れる子マウスは変異をもつES細胞と正常な宿主胚に由来
するキメラマウスで、ES細胞に由来する細胞がどの程度
含まれるかは個体の毛色で判断する。従って、ES細胞と
宿主胚は毛色の異なった系統の組合わせが望ましい。得
られたキメラマウスの変異はヘテロであり、これらを適
宜交配することでホモ変異マウスを得ることができる。
このようにして得られたホモ変異マウスは生殖細胞およ
び体細胞の全てにおいて、MT2-MMP 遺伝子のみが破壊さ
れMT2-MMP を全く発現せず、繁殖継代される子孫もまた
同様の表現系をもつ。このノックアウトマウスは正常マ
ウスとの比較において、発生、成長、生殖、老化および
死など個体のライフサイクルにおけるMT2-MMP の役割や
各臓器、組織におけるMT2-MMP の機能を解析するのに有
用である。また、発癌性物質、原発性癌および移植癌に
対する感受性を分析することでMT2-MMP の癌の浸潤、転
移への関与の解析に有用であり、抗癌剤および癌転移抑
制剤などの医薬品開発にも応用できる。ノックアウトマ
ウスはこれらモデル動物としてだけではなく、組織培養
のための細胞源として使用することもでき、細胞レベル
でのマウスMT2-MMP の機能解析などに供することができ
る。ノックアウトマウス等に関連した技術は、例えば、
Mansour, S. L., et al.,; Nature, 336: 348-352, 198
8; Joyner, A. L., ed.; Gene targeting, IRL Press,
1993; 相沢慎一, ジーンターゲティングES細胞を用いた
変異マウスの作成，羊土社，1995などの文献に記載の方
法あるいはそこに引用された文献に記載の方法、さらに
はそれらの改変法により行うことができる。

【００４９】本発明に従えば、MT2-MMP 遺伝子の複製又
は発現を阻害することのできるアンチセンス・オリゴヌ
クレオチド（核酸）を、クローン化したあるいは決定さ
れたMT2-MMP をコードするDNA の塩基配列情報に基づき
設計し、合成しうる。そうしたオリゴヌクレオチド（核
酸）は、MT2-MMP 遺伝子のRNA （あるいはDNA ）とハイ
ブリダイズすることができ、該RNA の合成又は機能を阻
害することができるか、あるいはMT2-MMP 関連RNA との
相互作用などを介してMT2-MMP 遺伝子の発現を調節・制
御することができる。MT2-MMP 関連遺伝子の選択された
配列に相補的なオリゴヌクレオチド、及びMT2-MMP 関連
遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるオリ
ゴヌクレオチドは、生体内及び生体外でMT2-MMP 遺伝子
の発現を調節・制御するのに有用であり、またそれに関
連した病気などの治療又は診断に有用である。用語「対
応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列
又は核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的
であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列又は核
酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」と
は、ヌクレオチド（核酸）の配列又はその相補体から誘
導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸
を通常指している。当該遺伝子の５’端ヘアピンルー
プ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領
域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領
域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端
パリンドローム領域、及び３’端ヘアピンループは、好
ましい対象領域として選択しうるが、当該遺伝子内の如
何なる領域も対象として選択しうる。

【００５０】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に
相補的なオリゴヌクレオチドとの関係は、対象物とハイ
ブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドとの関
係を意味し、それは、「アンチセンス」であるというこ
とができる。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、２
−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシ
ヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリデオキ
シヌクレオチド、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリ
コシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、ある
いは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例
えば、市販のタンパク質核酸及び合成配列特異的な核酸
ポリマー）又は特殊な結合を含有するその他のポリマー
（但し、該ポリマーはDNA やRNA 中に見出されるような
塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌ
クレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、
２本鎖DNA 、１本鎖DNA 、２本鎖RNA 、１本鎖RNA 、さ
らにDNA ：RNA ハイブリッドであることができ、さらに
非修飾ポリヌクレオチド又は非修飾オリゴヌクレオチ
ド、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該
分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたも
の、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチ
ドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾の
されたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホ
ネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カ
ルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合又は硫
黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジ
チオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌク
レアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗
体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖
（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有し
ているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリ
ジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物
（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性
の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有する
もの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー
型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシ
ド」、「ヌクレオチド」及び「核酸」とは、公知のプリ
ン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾され
たその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて
良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリン及びピ
リミジン、アシル化されたプリン及びピリミジン、ある
いはその他の複素環を含むものであってよい。修飾され
たヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部
分が修飾されていてよく、例えば１個以上の水酸基がハ
ロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるい
はエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよ
い。

【００５１】本発明のアンチセンス核酸は、RNA 、DNA
、あるいは修飾された核酸である。修飾された核酸の
具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘
導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオ
シドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それ
に限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸
は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、
細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、
アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とす
るセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そ
してもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより
小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知
られており、例えばJ. Kawakami et al.,Pharm Tech Ja
pan, 8: 247, 1992; 8: 395, 1992; S. T. Crooke et a
l. ed.,Antisense Research and Applications, CRC Pr
ess, 1993などに開示がある。本発明のアンチセンス核
酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合
を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのよ
うな特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用
されたり、付加された形態で与えられることができう
る。こうした付加形態で用いられるものとしては、リン
酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのよう
なポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核
酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホ
リピッド、コレステロールなど）といった粗水性のもの
が挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレ
ステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロ
ホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたも
のは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることが
でき、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着
させることができうる。その他の基としては、核酸の
３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用
の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレ
アーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。
こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコ
ール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをは
じめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げら
れるが、それに限定されるものではない。

【００５２】アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の
形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、
あるいはMT2-MMP の生体内や生体外の翻訳系を用いて調
べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で
細胞に適用できる。以上述べた、本発明者らの研究成果
によりマウスMT2-MMP の遺伝子及び組換えDNA 分子を宿
主に移入し、マウスMT2-MMP を発現させ、目的とするMT
-MMPを得る方法が提供される。こうして本発明によれ
ば、マウスMT2-MMP の遺伝子を実質的に発現する組換え
体あるいはトランスフェクタント及びその製造法、さら
にはその用途も提供される。別の面では、本発明は潜在
型ゼラチナーゼ Aの活性化能を有するMMP の一種であり
且つMT1-MMP 以外の潜在型ゼラチナーゼ A活性化因子で
ある天然のMT-MMPと実質的に同等な活性を有することを
特徴とするタンパク質またはその塩、より好ましくはマ
ウスMT2-MMP またはその塩と、実質的に同等な活性を有
するか、あるいは実質的に同等の一次構造コンフォメー
ションを持つ該タンパク質の少なくとも一部あるいは全
部を有するポリペプチドを、大腸菌などの原核生物ある
いは哺乳動物細胞などの真核生物で発現させることを可
能にするDNA やRNA などの核酸に関するとすることがで
きる。またこうした核酸、特にはDNA は、（ａ）配列表
の配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードできる
配列あるいはそれと相補的な配列、（ｂ）該（ａ）のDN
A 配列またはその断片とハイブリダイズすることのでき
る配列、及び（ｃ）該（ａ）又は（ｂ）の配列にハイブ
リダイズすることのできる縮重コードを持った配列であ
ることができる。こうした核酸で形質転換され、本発明
の該ポリペプチドを発現できる大腸菌などの原核生物あ
るいは哺乳動物細胞などの真核生物も本発明の特徴をな
す。

【００５３】さらに、本発明では、本発明に係わるマウ
スMT2-MMP と特異的に反応するモノクローナル抗体など
の抗体が提供される。本発明に係わるモノクローナル抗
体などの抗体により、癌の診断はもとより癌の浸潤、転
移に係わる研究に有用な研究手段、さらにはアルツハイ
マー病の発症機作や診断方法に係わる研究に有用な研究
手段が提供される。本発明に係わるモノクローナル抗体
などの抗体は、本発明により得られるマウスMT2-MMP あ
るいはその断片を免疫原として公知の方法で動物を免疫
したり、当該分野で知られたあるいは汎用されている方
法、例えばミルシュタインらの方法(Nature, 256: 495-
97, 1975)により製造することができる。この方法にお
いて、免疫原としては、天然型マウスMT2-MMP 、リコン
ビナント マウスMT2-MMP 及びマウスMT2-MMP の中の他
のMT-MMPファミリーとの相同性の低い領域から選択され
たアミノ酸配列を有する合成ペプチドあるいはタンパク
質から得られた断片、例えば連続した少なくとも８個の
アミノ酸からなるマウスMT2-MMP の一部のアミノ酸配列
を有する合成ペプチド、例えば１４個のアミノ酸残基を
有するアミノ酸配列を有する合成ペプチド、好ましくは
マウスMT2-MMP において特徴的な配列部分を有するペプ
チド等の何れでも使用することができる。

【００５４】マウスMT2-MMP としては、生体内外の産生
細胞、例えば、培養細胞、摘出組織、培養組織などから
得ることができ、例えば、肺細胞、癌細胞などの細胞な
どから得ることができる。さらに、マウスMT2-MMP は、
リコンビナントマウスMT2-MMP として得ることができ、
例えば、肺細胞などのマウスMT2-MMP 産生細胞から遺伝
子組換えの技術を利用して得ることができる。本発明で
調製したマウスMT2-MMP あるいはそれから誘導されたも
のが免疫抗原として好適に使用できる。これらマウスMT
2-MMP は、各種原料、例えば培養細胞、培養組織など、
形質転換体細胞などの抗原産生材料から従来公知の方
法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファ
デックスなどによるゲルろ過法、例えばジエチルアミノ
エチル基あるいはカルボキシメチル基などを持つ担体な
どを用いたイオン交換クロマトグラフィー法、例えばブ
チル基、オクチル基、フェニル基など疎水性基を持つ担
体などを用いた疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲル
クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過
法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体ク
ロマトグラフィー法などにより精製して得ることができ
る。好ましくは、ポリアクリルアミド電気泳動、モノク
ローナル抗体などの抗原と特異的に反応する抗体などを
固定化したアフィニティー・クロマトグラフィーなどで
処理し精製分離処理できる。精製されたリコンビナント
マウスMT2-MMP は、モノクローナル抗体作製のための免
疫抗原として好適に使用できる。

【００５５】例えば、ゼラチン−アガロース・アフィニ
ティー・クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・
クロマトグラフィーなどが挙げられる。また本発明で得
られたマウスMT2-MMP 遺伝子の情報を基にペプチドを合
成して、その合成ペプチドをモノクローナル抗体作製の
ための免疫抗原として好適に使用できる。さらに該モノ
クローナル抗体は、常用される方法によって適宜標識す
ることができる。標識としては、酵素、放射性同位体
（放射性物質）、化学ルミネッセンス化合物などの発光
性物質、螢光性物質、金属コロイド、補欠分子類、色素
物質及びビオチン等を使用することができる。以下抗体
の作製につき詳しく説明する。

【００５６】本発明のモノクローナル抗体は、ミエロー
マ細胞を用いての細胞融合技術を利用して得られたモノ
クローナル抗体であってよいことはいうまでもない。本
発明のモノクローナル抗体は、例えば次のような工程で
作製できる。 １．免疫原性抗原の調製 ２．免疫原性抗原による動物の免疫 ３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 ４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 ５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクロー
ン化 ６．モノクローナル抗体の製造

【００５７】１．免疫原性抗原の調製 抗原としては、上記記載の方法に従い調製したリコンビ
ナントマウスプロMT2-MMP を用いることもできるが、決
定されたMT2-MMP の情報を基に、適当なオリゴペプチド
を化学合成しそれを抗原として利用することができる。
またマウスMT2-MMP は、潜在型マウスMT2-MMP や活性型
マウスMT2-MMP を用いることができる。さらに免疫原性
コンジュゲートなどにしてもよいが、そのまま適当なア
ジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できる。
例えば、マウスMT2-MMP は、それを断片化したもの、あ
るいはクローニングされ、配列決定されたcDNA配列から
推定されるアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選
び、ポリペプチドをデザインして化学合成し、得られた
合成ポリペプチド断片であってもよく、その断片を適当
な縮合剤を介して種々の担体タンパク質類と結合させて
ハプテン−タンパク質の如き免疫原性コンジュゲートと
し、これを用いて特定の配列のみと反応できる（あるい
は特定の配列のみを認識できる）モノクローナル抗体を
デザインするのに用いることもできる。デザインされる
ポリペプチドには予めシステイン残基などを付加し、免
疫原性コンジュゲートの調製を容易にできるようにして
おくことができる。担体タンパク質類と結合させるにあ
たっては、担体タンパク質類はまず活性化されることが
できる。こうした活性化にあたり活性化結合基を導入す
ることが挙げられる。活性化結合基としては、（１）活
性化エステルあるいは活性化カルボキシル基、例えばニ
トロフェニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエス
テル基、１−ベンゾトリアゾールエステル基、Ｎ−スク
シンイミドエステル基など、（２）活性化ジチオ基、例
えば２−ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タン
パク質類としては、キーホール・リンペット・ヘモシア
ニン（ＫＬＨ），牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白ア
ルブミン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイ
ド、細菌菌体成分、例えばＢＣＧなどが挙げられる。

【００５８】２．免疫原性抗原による動物の免疫 動物を免疫するには、例えば村松繁、他編、実験生物学
講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日
本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究
法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生
化学実験講座１２、分子免疫学 III、抗原・抗体・補
体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じ
て行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバン
トとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ
（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、
リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ
などが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどの
マウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の
投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動
物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後
１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔
内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０
回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ
／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウス
とのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応
じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫
の程度を確認できる。

【００５９】３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）と
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−
１，Eur. J. Immunol., 6: 511〜519, 1976)、ＳＰ２／
０−Ａｇ１４（ＳＰ２，Nature, 276: 269〜270, 1978
) 、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来
のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Curr. topi
cs Microbiol. Immunol., 81: 1 〜7, 1978 ）、Ｐ３−
Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３，Nature, 256: 495〜497, 197
5 ) 、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３ (６５３，J. Imm
unol.,123: 1548〜1550, 1979) などを用いることがで
きる。８−アザグアニン耐性のマウスミエローマ細胞株
はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地）、ＲＰＭＩ−
１６４０培地などの細胞培地に、例えばペニシリン、ア
ミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清（ＦＣＳ）などを
加え、さらに８−アザグアニン（例えば５〜４５μｇ／
ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、細胞融合の２〜５
日前に正常培地で継代して所要数の細胞株を用意するこ
とができる。また使用細胞株は、凍結保存株を約３７℃
で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６４０培地などの正
常培地で３回以上洗浄後、正常培地で培養して所要数の
細胞株を用意したものであってもよい。

【００６０】４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細
胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、それか
ら脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ
節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもでき
る。こうして得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に
従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地
（ＭＥＭ培地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培
地などの細胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエ
チレングリコールを添加する。細胞融合剤としては、こ
の他各種当該分野で知られたものを用いることができ、
この様なものとしては不活性化したセンダイウイルス
（ＨＶＪ：Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ Ｖｉｒ
ｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ）なども挙げられる。好ましく
は、例えば３０〜６０％のポリエチレングリコールを
０．５〜２ｍｌ加えることができ、分子量が１，０００
〜８，０００のポリエチレングリコールを用いることが
でき、さらに分子量が１，０００〜４，０００のポリエ
チレングリコールがより好ましく使用できる。融合培地
中でのポリエチレングリコールの濃度は、例えば３０〜
６０％となるようにすることが好ましい。必要に応じ、
例えばジメチルスルホキシドなどを少量加え、融合を促
進することもできる。融合に使用する脾細胞（リンパ
球）：ミエローマ細胞株の割合は、例えば１：１〜２
０：１とすることが挙げられるが、より好ましくは４：
１〜７：１とすることができる。融合反応を１〜１０分
間行い、次にＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地を
加える。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合
反応処理後、遠心などにより細胞を分離した後選択用培
地に移す。

【００６１】５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及
びモノクローン化 選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙
げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレ
ートに分注した容量と等容量を翌日加え、その後１〜３
日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというように処
理することができるが、適宜これに変更を加えて行うこ
ともできる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテ
リンを除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換
をすることができる。フィーダーとして、例えばマウス
胸腺細胞を使用することもでき、それが好ましい場合が
ある。ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培
養上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分
析（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）などの測定
系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）など
で、マウスMT2-MMP あるいはその断片ペプチドを抗原と
して用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的
抗体を測定するなどして、スクリーニングしたりする。
目的抗体を産生しているハイブリドーマをクローニング
する。クローニングは、寒天培地中でコロニーをピック
・アップするか、あるいは限界希釈法によりなされう
る。限界希釈法でより好ましく行うことができる。クロ
ーニングは複数回行うことが好ましい。

【００６２】６．モノクローナル抗体の製造 得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培
養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得
ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリ
ドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエロ
ーマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に
各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、あるいは例
えばヌード・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、
増殖させ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル
抗体を回収して得ることが出来る。動物はハイブリドー
マの移植に先立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−
テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与
しておくことができ、その処理後、ハイブリドーマを増
殖させ、腹水を採取することもできる。腹水液はそのま
ま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム
沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過
法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透
析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー
法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製して
モノクローナル抗体として用いることができる。好まし
くは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫安分画
した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオン交換
ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ・カラ
ムなどで処理し精製分離処理できる。特に好ましくは抗
原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原タン
パク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位
など）を固定化したアフィニティ・クロマトグラフィ
ー、プロテインＡを固定化したアフィニティ・クロマト
グラフィーなどが挙げられる。

【００６３】またこうして大量に得られた抗体の配列を
決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコー
ドする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗
体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をト
リプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理し
て、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）₂ といった抗体フラグメントにして使用して
もよい。標識物を付与する抗体としては、IgG 画分、更
にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Ｆａ
ｂ’を用いることができる。これらの場合の標識物の例
としては、下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼなど）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素
などがある。本発明での検知・測定は、イムノ染色、例
えば組織あるいは細胞染色、イムノアッセイ、例えば競
合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行
うことができ、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡなど
を用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行ってもよいし、あ
るいは行わないでその測定を行うことができる。好まし
くは放射免疫測定法や酵素免疫測定法であり、さらにサ
ンドイッチ型アッセイが挙げられる。例えばサンドイッ
チ型アッセイでは、マウスMT2-MMP に対する抗体の一方
を検出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗
体を固相に固定化する。

【００６４】検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に
応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、こ
こで非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定され
た標識の量は抗原、すなわちマウスMT2-MMP の量と比例
する。このアッセイでは、不溶化抗体や、標識化抗体の
添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォ
ワード（forward)サンドイッチ型アッセイあるいは逆サ
ンドイッチ型アッセイなどと呼ばれる。例えば洗浄、撹
拌、震盪、ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、特定の状
況のもとでそれら測定工程の中で適宜採用される。特定
の試薬、緩衝液等の濃度、温度あるいはインキュベーシ
ョン処理時間などのその他の測定条件は、検体中の抗原
の濃度、検体試料の性質等の要素に従い変えることがで
きる。当業者は通常の実験法を用いながら各測定に対し
て有効な最適の条件を適宜選定して測定を行うことが出
来る。

【００６５】抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担
体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用
いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに
使用されるものが種々知られており、本発明においても
勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特
に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例え
ば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−
アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材
料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリ
レート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合
体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ス
チレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタ
クリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタ
クリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲ
ン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロ
ース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチ
ルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または
変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポ
リアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機
高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたも
の、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリ
ング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられ
る。さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試
験管、タイタープレート、タイターウェル、ガラスセ
ル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラ
ス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは
細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは
偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質
（物体）の表面などが挙げられる。

【００６６】これら担体へは、抗体を結合させることが
でき、好ましくは本発明で得られるマウスMT2-MMP に対
し特異的に反応するモノクローナル抗体を結合させるこ
とができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するもの
との結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤
などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする
化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用
した手法などにより行うことが出来る。標識としては、
酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵
素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学
ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物
質、金属粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質など
を挙げることができる。酵素としては、脱水素酵素、還
元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ
基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基な
どを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結
合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合など
を加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラー
ゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の
酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例
えば酵素的サイクリングを利用することもできる。

【００６７】代表的な放射性物質の標識用同位体元素と
しては、〔³²Ｐ〕、〔¹²⁵ Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔
³Ｈ〕、〔 ¹⁴ Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などが挙げられる。代表
的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼな
どのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼなどのガラクトシダーゼ、マレエート・デヒドロゲナ
ーゼ、グルコース−６−フォスフェート・デヒドロゲナ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、ア
セチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ウシ小腸アル
カリホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファターゼな
どのアルカリフォスファターゼなどが挙げられる。アル
カリホスファターゼを用いた場合、４−メチルウンベリ
フェリルフォスフェートなどのウンベリフェロン誘導
体、ニトロフェニルホスフェートなどのリン酸化フェノ
ール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素的サイクリング
系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体などの基
質を使用したりして、生ずる蛍光、発光などにより測定
できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ系を利用したり
することもできる。カタラーゼを用いた場合、過酸化水
素と反応して酸素を生成するので、その酸素を電極など
で検知することもできる。電極としてはガラス電極、難
溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電極、高分子膜電
極などであることもできる。酵素標識は、ビオチン標識
体と酵素標識アビジン（ストレプトアビジン）に置き換
えることも可能である。標識は、複数の異なった種類の
標識を使用することもできる。こうした場合、複数の測
定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にある
いは別々に行うことを可能にすることもできる。

【００６８】本発明においては、信号の形成に４−ヒド
ロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テ
トラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダ
ーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニル
ガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の
組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾ
キノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合
物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェ
ノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働き
で形成しうるものが使用できる。蛍光物質あるいは化学
ルミネッセンス化合物としては、フルオレセインイソチ
オシアネート、例えばローダミンＢイソチオシアネー
ト、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどの
ローダミン誘導体、ダンシルクロリド、ダンシルフルオ
リド、フルオレスカミン、フィコビリプロテイン、アク
リジニウム塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォ
リンなどのルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステ
ル、希土類キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げ
られる。標識するには、チオール基とマレイミド基の反
応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミ
ノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことがで
き、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になし
うる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜
選択して適用できる。また上記免疫原性複合体作製に使
用されることのできる縮合剤、担体との結合に使用され
ることのできる縮合剤などを用いることができる。

【００６９】縮合剤としては、例えばグルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレン
ジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨ
ードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミ
ド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネー
ト、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミ
ジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓ
ＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト、Ｎ−スクシンイミジル （４−ヨードアセチル）ア
ミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（１−
マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミ
ドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ），イ
ミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水
物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオン
イミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデー
ト、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ
−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテー
トなどが挙げられる。

【００７０】本発明の測定法によれば、測定すべき物質
を酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗
体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させるこ
とができるし、同時に反応させることもできる。試薬を
加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作さ
れたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、酵素
などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬
を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験
管中に一緒に入れ、その後該感作されたプラスチックな
どのビーズを加えることにより測定を行うことができ
る。本発明の定量法においては、免疫学的測定法が用い
られるが、その際の固相担体としては、抗体などタンパ
ク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト
製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボール、
マイクロプレート、スティック、微粒子あるいは試験管
などの種々の材料および形態を任意に選択し、使用する
ことができる。測定にあたっては至適ｐＨ、例えばｐＨ
約４〜９に保つように適当な緩衝液系中で行うことがで
きる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩
衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリ
ス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝
剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝
剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合
して用いることができる。抗体抗原反応は約０℃〜６０
℃の間の温度で行うことが好ましい。

【００７１】酵素などで標識されたモノクローナル抗体
などの抗体試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、
さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、
平衡に達するまで行うことができるが、抗体抗原反応の
平衡が達成されるよりもずっと早い時点で固相と液相と
を分離して限定されたインキュベーション処理の後に反
応を止めることができ、液相又は固相のいずれかにおけ
る酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。測
定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可
能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテ
クターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生
ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗
体抗原反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定
すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、
抗体抗原反応自体を安定化するように適切な手段を講ず
ることができる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻
害的に働く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性
化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性化
剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加
えることもできる。キレート化剤としては、エチレンジ
アミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）がより好ましい。当該分野
で普通に採用されていたりあるいは当業者に知られた非
特異的結合反応を防ぐためのブロッキング処理を施して
もよく、例えば、哺乳動物などの正常血清タンパク質、
アルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、
ゼラチンなどで処理することができる。非特異的結合反
応を防ぐ目的である限り、それらの方法は特に限定され
ず用いることが出来る。

【００７２】本発明の測定方法で測定される試料として
は、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非流体試料な
どが使用しうるが、好ましくは生物由来の試料、例えば
血液、血清、血漿、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、
尿、その他の体液、細胞培養液、組織培養液、組織ホモ
ジュネート、生検試料、組織、細胞などが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用
するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要と
されない。それぞれの方法における通常の条件、操作法
に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明の潜在型
ゼラチナーゼ A活性化因子である天然のマウスMT-MMP活
性を有するかあるいはそれと実質的に同等な活性を有す
るマウス由来のタンパク質に関連した測定系を構築すれ
ばよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、
総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江
寛編，「ラジオイムノアッセイ」，講談社，昭和４９
年発行；入江 寛編，「続ラジオイムノアッセイ」，講
談社，昭和５４年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定
法」，医学書院，昭和５３年発行；石川栄治ら編，「酵
素免疫測定法」（第２版），医学書院，昭和５７年発
行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第３版），医
学書院，昭和６２年発行；「Methods in Enzymology 」
Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))；同書
Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)) ；同
書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)) ；
同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: S
electedImmunoassays))；同書 Vol. 92 (Immunochemica
l Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and Ge
neral Immunoassay Methods))；同書 Vol. 121 (Immuno
chemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology
and Monoclonal Antibodies))( 以上、Academic Press
社 (USA)発行) など参照〕。

【００７３】こうして典型的には本発明の目的は、マウ
スMT2-MMP に対するモノクローナル抗体及び固相担体用
としてマウスMT2-MMP に対するモノクローナル抗体ある
いはTIMPs を用い、被検試料中の遊離の活性型マウスMT
2-MMP を分別定量する優れた方法及びその為の試薬キッ
トを提供することにある。本発明はこうした遊離の活性
型マウスMT2-MMP を分別定量することのできる試薬キッ
トのうちの各試薬をすべてその実施態様のうちに含むと
理解される。さらに本発明の目的は、上記定量法を用い
て遊離の活性型マウスMT2-MMP を分別定量することによ
り、組織破壊や癌転移などの病態をモニターし得る方法
並びに試薬あるいは診断剤を提供することにある。した
がって、医学的・生理学的分野における上記試薬の各種
利用、組織破壊や癌転移、組織の修復の程度の判断、あ
るいは細胞増殖促進などの生理的作用の指標として上記
試薬を使用することはすべて本発明のその実施態様のう
ちに含まれると理解される。

【００７４】本発明の前述した種々の態様を利用するこ
とにより、癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の診
断治療に関わる研究に有用な診断手段として、あるいは
その他の医学的生理学的用途に適用される種々の技術手
段を提供することができる。以下に実施例を掲げ、本発
明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定
されず、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能
であることは理解されるべきである。なお、明細書及び
図面において、用語は、IUPAC-IUB Commissionon Bioch
emical Nomenclature によるか、あるいは当該分野に
おいて慣用的に使用される用語の意味に基づくものであ
る。後述の実施例２ｆ）に記載のマウス由来単クローン
性抗マウスMT2-MMP 抗体産生ハイブリドーマ 162-4E3
は、平成８年１２月１３日から茨城県つくば市東１丁目
１番３号（郵便番号３０５）の通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に受託番号 FERM P-
16003 として寄託されている。同様に実施例１に記載の
マウスMT2-MMP をコードする塩基配列を挿入したベクタ
ー (pSG5^TM (Stratagene））を保有する大腸菌JM109
(pSGMMT2/JM109 ）は、ＮＩＢＨに受託番号 FERM P-160
10 として寄託保存されている（平成８年１２月１８日)
。

【００７５】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明
するが、本発明は実施例に限定されること無く様々な態
様が含まれることは理解されるべきである。 実施例１ cDNAライブラリーからの新規MT2-MMP 遺伝子のスクリー
ニングと塩基配列の決定 (a）cDNAライブラリーのスクリーニング ヒトMT1-MMPcDNA 断片 (Gene, 155: 293〜298, 1995) 2
5ng をランダムプライムドDNA ラベリングキット (Boeh
ringer Mannhaim)を使用して[ α-³²P]dCTP (Amersha
m) を用いて標識し、2 〜5.0 CPM/μg の比活性を持つ
プローブを得た。これをマウス肺cDNAライブラリーをス
クリーニングするためのプローブとして用いた。λgt10
中に構築したマウス肺cDNAライブラリー (Clontech) を
宿主大腸菌C600hfl 株に4 ×10⁴ プラーク形成単位/ 直
径15cmプレートの濃度で感染させプラークを形成させ
た。まず、大腸菌C600hfl 株を0.02％マルトースを含む
L 培地で1晩培養後、集菌し、10mM MgSO₄に懸濁した。
この細胞懸濁液とファージ液を混合し37℃、15分間保温
し、ファージを宿主菌に吸着させた。これに軟寒天を加
え、予め作製しておいた直径15cmのL プレート上に広げ
た。プレートを42℃で1 晩保温し、プラークを形成させ
た。

【００７６】ナイロンフィルター［ハイボンド (Hybon
d)-N 、Amsham］をプラークを形成させたプレート上に
置き、約30秒間放置した。膜を穏やかに剥しアルカリ変
性液 (0.5M NaOH および1.5M NaCl ) に1 分間浸した
後、中和液 (1.5M NaCl 含有 0.5M Tris−HCl 緩衝液、
pH8.0 ) に15分間浸した。このフィルターを 2×SSPE
(0.36M NaCl、20mM NaH₂PO₄および2mM EDTA) で洗浄し
た後、風乾した。上述のプラークのフィルターへの転写
を繰り返し、少なくとも2 枚のフィルターを調製する。
但し、2 枚目以降のフィルターとプレートの接触時間は
2 分間程度に延長した。このフィルターを80℃で2 時間
べーキングし、DNA を固定した。1つのプレートから調
製した少なくとも2 枚のフィルターをそれぞれ42℃、1
時間洗浄液 (1M NaCl 、1mM EDTAおよび 0.1％ Sodium
Dodecyl sulfate (SDS) 含有 50mM Tris-HC1緩衝液、pH
8.0)で洗浄後、ハイブリダイゼーションバッグ中にフィ
ルターを入れ、プレハイブリダイゼーション溶液［50％
formamide、 5×Denhardt's溶液 (0.2 ％ウシ血清アル
ブミン(BSA) 、0.2 ％ polyvinylpyroldone)、 5×SSP
E、0.1 ％ SDS、100 μg/ml 熱変性サケ精子DNA ］に
浸し、42℃で6〜8 時間プレハイブリダイゼーションを
行った。

【００７７】フィルターを新しいハイブリダイゼーショ
ンバッグ中に移し、100 ℃、5 分間加熱変性させた前述
の ³²P標識プローブをRapid hybridization buffer (Am
ersham) に添加し、60℃で2 時間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。ハイブリダイゼーション完了後、フィルタ
ーを50℃で多量の 0.1％ SDS含有 0.5×SSC ( O.15MNaC
l、15mM クエン酸) 溶液で洗浄した。この操作を2 回
繰り返したこのフィルターを風乾した後、X 線フィルム
(Kodak XR) と重ね−80℃で12時間オートラジオグラフ
ィーを行った。X 線フィルムを現像し、1 枚のプレート
からできた2 枚のフィルムを重ね、重なるシグナルをマ
ークした。マークしたシグナルに相当するプラークを S
M 溶液 ( 100mM NaCl および10mMMgSO₄含有50mM Tris-H
Cl 緩衝液、pH7.5 ) に懸濁した。このファージ懸濁液
を適度に希釈して、好ましくは 10 〜100 プラーク形成
単位/ 直径９cmプレートの濃度に希釈して大腸菌を培養
してある直径９cmプレートにプレーティングし、上記と
同様のスクリーニングを行い組換え体ファージを 8クロ
ーン得た。

【００７８】(b) 組換え体ファージ挿入DNA の調製 前 (a)項でクローン化した組換え体ファージ 8クローン
をそれぞれ前 (a)項の記載と同様にプレーティングし、
42℃で3 時間保温し、続いて37℃、1 晩保温した後、SM
溶液に数滴のクロロホルムを加え室温で30分間放置し
た。SM溶液と共に上層の軟寒天を掻き取り、遠心分離し
た。遠心後の上清に終濃度10％になるようにポリエチレ
ングリコール−6000 (PEG-6000) を加え撹拌した後、4
℃で1 時間放置した。これを遠心分離し上清を捨て、フ
ァージ粒子を回収した。このファージ粒子をSM溶液に懸
濁し、グリセロールグラジエント超遠心分離法(Molecul
ar cloning, a laboratory manual, ed. T. Maniatis,
Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989)
により精製した。得られたファージをTM溶液 (10mM MgS
O₄含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.8)に懸濁し、DNase
I およびRNase A で処理後、20mM EDTA 、50μg/ml Pro
teinase K 及び0.5 ％SDS 混合液を加え65℃、1 時間保
温した。これをフェノール抽出ジエチルエーテル抽出
後、エタノール沈殿によりDNA を沈殿させた。得られた
DNA を70％エタノールで洗浄後乾燥し、TE溶液 (10mM E
DTA 含有10mM Tris-HC1 緩衝液、pH8.0)に溶解した。

【００７９】(c)挿入断片の塩基配列決定 前項 (b)で調製したλgt10 DNAをEcoRI (宝酒造) で分
解し、挿入断片を分離精製後、ベクター pBluescript^TM
(Stratagene) のEcoRI 部位にサブクローニングした。
この組換え体pBluescript で大腸菌NM533 XL1-Blueを形
質転換した。形質転換細胞をF'選択後、ヘルパーファー
ジVCSM13 (Stratagene) を感染させ終夜培養した。培養
液を遠心分離し、菌体を除き、これにPEG/NaClを加えフ
ァージを沈殿させた。沈殿をTE溶液に懸濁後、1 本鎖DN
A をフェノール抽出、エタノール沈殿により回収した。
この1 本鎖DNA の塩基配列を蛍光DNA シーケンサModel
373A (Applied Biosystems) 、Taq ダイプライマーサイ
クルシークエンシングキット (Applied Biosystems) を
使用しその配列を決定した。塩基配列を決定した8 クロ
ーンの内、6 クローンはProc. Natl. Acad. Sci. USA.,
92: 2730 〜2734, 1995に記載されているマウスMT1-MM
P 遺伝子の全長あるいは一部と一致した。これら以外の
2 クローンは、前述マウスMT1-MMP 遺伝子と異なる同一
の挿入断片を有しており、その断片は、プローブに用い
たヒトMT1-MMP 遺伝子に対し62%の、マウスMT1-MMP 遺
伝子に対し88% の相同性を示した。しかしながら、この
クローンは、完全なオープンリーディングフレームを含
んでいなかったため、この挿入断片をプローブに用い、
再度、マウス肺cDNAライブラリーのスクリーニングを行
った。

【００８０】(d)マウス肺cDNAライブラリーの再スクリ
ーニング 前 (c)項で得た挿入断片を精製、 (a)項記載の方法と同
様にして³²P 標識プローブを調製し、 (a)項記載の方法
に従って調製したフィルターのハイブリダイゼーション
プローブとして添加した。ハイブリダイゼーションはよ
り特異性の高い条件を選択し、ハイブリダイゼーション
は65℃で2 時間、洗浄は65℃の0.1% SDS含有 0.1×SSC
で行った。洗浄完了後、 (a)記載の方法に従って、陽性
クローンを検索した結果、1 クローンの組換え体ファー
ジを分離した。

【００８１】(e)マウスMT2-MMP 遺伝子の解析 前項 (d)でクローン化した組換え体ファージより (b)項
および (c)項記載の方法に従ってサブクローニング、挿
入断片の調製および塩基配列の決定を行った。決定した
塩基配列の全長は3339bpであり、その配列は配列表の配
列番号：1 に記載した。GENBANK/EMBL DNA Data Baseを
使用し、配列表の配列番号：1 に記載した塩基配列を検
索したが、同一の配列は存在しなかった。この約3.3kb
のDNA配列中には、推定657 アミノ酸をコードするオー
プンリーディングフレームの存在が認められ、その推定
されるアミノ酸配列を配列表の配列番号：2 に記載し
た。この推定されるタンパク質を「マウスMT2-MMP 」と
名付けた。得られたDNA 断片をプラスミドpEX 、pMAMne
o 、pKG5などのベクターに組込み、大腸菌、CHO 細胞な
どで発現させることができる。上記マウスMT2-MMP をコ
ードする塩基配列を挿入したベクター (pSG5^TM (Strata
gene))を保有する大腸菌JM109 (pSGMMT2/JM109) は、工
業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-160
10として寄託保存されている (平成８年１２月１８日)
。

【００８２】(f)マウスMT2-MMP のアミノ酸配列解析 配列表の配列番号：１に記載のマウスMT2-MMP の塩基配
列から推定される配列表配列番号：２に記載したアミノ
酸配列を既知のヒトMT-MMPs のアミノ酸配列と比較した
アライメントを図１〜２に示した。すなわち、図１〜２
では本発明のマウスMT2-MMP (mMT2-MMP)のアミノ酸配列
と既知のヒトMT-MMPファミリー (hMT1-MMP、hMT2-MMP、
hMT3-MMPおよびhMT4-MMP) のアミノ酸配列との相同性を
比較してある。そこではアミノ酸の表記は一般的な一文
字表記に従い、N 末端のアミノ酸を１位として番号を付
してある。配列表の配列番号：２に示したアミノ酸配列
は、ヒトMT-MMPs と高い相同性を示し、ヒトMT-MMPs に
特徴的なドメイン構造、すなわち、分泌産生時に除去さ
れるシグナルペプチド、プロペプチドドメイン、触媒ド
メイン、ヒンジドメイン、ヘモペキシン凝血酵素様ドメ
インが良好に保存されていた。特に、ヒトMT-MMPs を含
むMMP ファミリーで非常に高度に保存されているプロ体
と活性型の切断部位近傍の配列PRCGVPD はマウスMT2-MM
P でも完全に保存されていた (配列表の配列番号：２の
Pro¹⁰⁵〜Asp¹¹¹) 。さらにマウスMT2-MMP には、ヒトMT
-MMPs のアミノ酸配列上で他のMMP ファミリーと比較し
て特徴的な点である3 ケ所の挿入配列が存在した。すな
わち、プロペプチドドメインと触媒ドメインの間に存在
するRRKRの配列を含む13個のアミノ酸残基の挿入配列-1
(IS-1；配列表の配列番号：2 のVal¹¹⁵〜Arg¹²⁷) 、触
媒ドメイン中のSYDDIRLRの配列からなる８個のアミノ酸
残基の挿入配列-2 (IS-2；配列表の配列番号：2 のSer
¹⁷⁹〜Arg¹⁸⁶) およびトランスメンブレンドメイン様の2
2個の疎水性アミノ酸の連続配列VVMVLVPLLLLLCILGLAFAL
Vを含む 102個のアミノ酸残基の挿入配列-3 (IS-3；配
列表の配列番号：2 のGln⁵⁵⁶〜Val⁶⁵⁷) が存在した。

【００８３】最初の挿入配列IS-1は、ヒトMMP ファミリ
ーにおいて例外的にMMP-11にも存在しているが、IS-1中
で保存されている配列RXKR (X は任意のアミノ酸残基を
示す) は、ズブチリシン様プロテアーゼの切断部位の配
列であり、アミノ酸配列RXKRはズブチリシン様プロテア
ーゼによる多くの真核生物分泌タンパク質の切断部位で
あることが知られている (J. Biol.Chem., 266: 12127
〜12130, 1991)。IS-3中の疎水性アミノ酸の連続配列は
トランスメンブレンドメインと考えられ、ヒトMT-MMPs
の際立った特徴的な点であり (Cancer Res., 56: 944〜
949, 1996)、マウスMT2-MMP のIS-3中に存在する疎水性
アミノ酸の連続配列もトランスメンブレンドメインと考
えられた。マウスMT2-MMP のアミノ酸配列を他の既知の
ヒトMT-MMPs と比較したところ、ヒトMT2-MMP に対する
相同性が87％と最も高く、また他のMT-MMPs に対する相
同性もヒトMT1-MMP に対して52％、ヒトMT3-MMP に対し
て50％、ヒトMT4-MMP に対して29％の相同性を示した。
本発明により単離されたマウスMT2-MMP cDNAによってコ
ードされるタンパク質のアミノ酸配列は、他のヒトMT-M
MPと相同性が高く、マウスMT1-MMP とも類似している
が、詳細な点では明らかに異なっていた。これらの配列
上の特徴は、マウスMT2-MMP がマウスMT1-MMP ととも
に、ヒトMT-MMPsと同様にファミリーを構成しているこ
とを示唆している。

【００８４】実施例２ モノクローナル抗体の調製 (a)抗原ポリペプチドの調製 配列表の配列番号：2 に記載したマウスMT2-MMP のアミ
ノ酸配列中より他のMT-MMPファミリーとの相同性が低い
マウスMT2-MMP に特徴的な配列として次の配列を選択
し、合成した。

【００８５】 ［配列番号：3 ］ Asp Thr Asp Asn Phe Gln Leu Pro Glu Asp Asp Leu Arg Gly (配列表の配列番号：２のAsp²⁸¹〜Gly²⁹⁴の配列；「ポ
リペプチド A」と略記する)

【００８６】このポリペプチド Aをペプチド合成機 (ペ
プチドシンセサイザー9600、MilliGen/Biosearch) を使
用して、Fmoc-bop法で合成した。ポリペプチドのN 末端
にはシステインを導入した。合成したペプチドはμBond
asphere, C18カラム (Waters) を用いた高速液体クロマ
トグラフィーにより精製した。

【００８７】(b)ポリペプチドとBSA の複合体の調製 システイン残基を介して BSAと結合させ抗原コンジュゲ
ートとした。18.2mg BSAを2ml の0.1M リン酸緩衝液，
pH7.5 に溶解したものと21.1mg N-(6-maleimidcaproylo
xy)succinimideを200 μl のジメチルホルムアミドに溶
解したものと混合し、30℃、30分間反応させた。つい
で、上記の混合液を0.1M リン酸緩衝液，pH7.0 で平衡
化したPD-10 (Pharmacia)でゲルろ過した。マレイミド
が結合したBSA を分取し、1.5ml 以下に濃縮した。マレ
イミドが結合したBSA に対し50倍モル量の前記 (a)で合
成したポリペプチドを1ml の0.1Mリン酸緩衝液，pH7.0
に溶解したものとそれぞれ混合し、4 ℃、20時間インキ
ュベートし、BSA-ポリペプチド複合体を調製した。

【００８８】(c)抗体産生細胞の調製 前記 (b)で調製したポリペプチド AとBSA との複合体、
200 μg を完全フロインドアジュバントと共に8 週令Ba
lb/c雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫した。19日目と
34日目に0.1M リン酸緩衝液，pH7.5 に溶解した複合体
200 μg を初回免疫したマウスに腹腔内投与し、追加免
疫した。さらに69日目に複合体200 μgを静脈内投与
し、最終免疫とした。その3 日後に脾臓を摘出し、脾細
胞懸濁液を調製した。

【００８９】(d)細胞融合 (1)以下の材料および方法を用いた。 RPMI-1640 培地：RPMI-1640 (Flow Lab.)に重炭酸ナト
リウム (24mM) 、ピルビン酸ナトリウム (1mM)、ペニシ
リンG カリウム (50U/ml) 、硫酸アミカシン (100 μg/
ml) を加え、ドライアイスでpHを7.2 にし、0.2 μm 東
洋メンブレンフィルターで除菌ろ過した。 NS-1培地：上記RPMI-1640 培地に除菌ろ過したウシ胎児
血清 (FCS, M.A. Bioproducts)を15％ (v/v)の濃度にな
るように加えた。 PEG-4000溶液：RPMI-1640 培地にポリエチレングリコー
ル-4000 (PEG-4000, Merk＆Co.)を50％ (w/w)になるよ
うに加えた無血清培地を調製した。8-アザグアニン耐性
ミエローマ細胞SP2 (SP2/0-Ag14) との融合は、Select
edMethod in culture immunology p. 351〜372 (ed. B.
B. Mishell and S. N. Shiigi), W. H. Freeman and C
ompany (1980)に記載の Oi らの方法を若干改変して行
った。

【００９０】(2)前記 (c)で調製した有核脾細胞 (生細
胞率100 ％) とミエローマ細胞 (生細胞率100 ％) とを
5：1 の比率で以下の手順で融合した。ポリペプチド A
免疫脾細胞懸濁液とミエローマ細胞をそれぞれRPMI1640
培地で洗浄した。次に同じ培地に懸濁し、融合させるた
めに有核脾細胞4.8 ×10⁸ 個とミエローマ細胞9.6 ×10
⁷ 個を混合した。次に遠心分離により細胞を沈殿させ、
上清を完全に吸引除去した。沈殿した細胞に37℃に加温
したPEG-4000溶液 3.2mlを1 分間で滴下し、1 分間撹拌
し、細胞を再懸濁、分散させた。次に37℃に加温したRP
MI1640培地 6.4mlを2 分間で滴下した後、同培地22.4ml
を2 〜3 分間で常に撹拌しながら滴下し、細胞を分散さ
せた。これを遠心分離し、上清を完全に吸引除去した。
次にこの沈殿した細胞に37℃に加温したNS-1培地 31ml
を速やかに加え、大きい細胞塊を注意深くピペッティン
グで分散した。さらに同培地64mlを加えて希釈し、ポリ
スチレン製96穴マイクロウェルにウェル当り 6.0×10⁵
個/0.1mlの細胞を加えた。細胞を加えた上記マイクロウ
ェルを7 ％炭酸ガス/93 ％空気中で温度37℃、湿度100
％で培養した。

【００９１】(e)選択培地によるハイブリドーマの選択
的増殖 (1)使用する培地は以下の通りである。 HAT 培地：前記 (d)項 (1)で述べたNS-1培地に更にヒポ
キサンチン (100 μM)、アミノプテリン (0.4 μM)およ
びチミジン (16μM)を加えた。 HT培地：アミノプテリンを除去した以外は上記HAT 培地
と同一組成のものである。

【００９２】(2)前記 (d)項の培養開始後翌日 (1 日目)
、細胞にパスツールピペットでHAT培地2 滴 (約0.1ml)
を加えた。2 、3 、5 、8 日目に培地の半分 (約0.1ml)
を新しいHAT 培地で置き換え、11日目に培地の半分を新
しいHT培地で置き換えた。14日目にハイブリドーマの生
育が肉眼にて認められた全ウエルについて固相- 抗体結
合テスト法 (ELISA)により陽性ウエルを調べた。すなわ
ち、ポリスチレン製96穴プレートを抗原としたポリペプ
チド Aでコートし、次に洗浄用PBS (0.05％ Tween20含
有) を用いて洗浄して未吸着のペプチドを除いた。さら
に各ウエルの未コート部分を1 ％ BSAでブロックした。
この各ウエルにハイブリドーマの生育が確認されたウエ
ルの上清0.1ml を添加し、室温で約1 時間静置した。 2
次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP)標識ヤ
ギ抗マウス免疫グロブリン (Cappele Lab.) を加え、さ
らに室温で約1 時間静置した。次に基質である過酸化水
素とo ‐フェニレンジアミンを加え、発色の程度をマイ
クロプレート用吸光度測定機 (MRP-A4、東ソー) を用い
て492nm の吸光度で測定した。

【００９３】(f)ハイブリドーマのクローニング 上記 (e)項で得られた抗原ペプチドに対する陽性ウエル
中のハイブリドーマを、限界希釈法を用いてモノクロー
ン化した。すなわち、NS-1培地1ml 当りフィーダーとし
て10⁷ 個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調
製し、96穴マイクロウエルにハイブリドーマをウエル当
り5 個、1 個、0.5 個になるように希釈し、それぞれ36
穴、36穴、24穴に加えた。5 日目、12日目に全ウエルに
約0.1mlのNS-1培地を追加した。クローニング開始後約2
週間で、肉眼的に十分なハイブリドーマの生育を認
め、コロニー形成陰性ウエルか50％以上である群につい
て (e)項に記載したELISA を行った。調べた全ウエルが
陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数が1 個
のウエルを4 〜6 個選択し、再クローニングを行った。
最終的に表1 に示したようにポリペプチド Aに対するモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが16個得ら
れた。

【００９４】

【表１】

【００９５】(g)ハイブリドーマの培養とモノクローナ
ル抗体の精製 得られたハイブリドーマ細胞をNS-1培地で培養し、その
上清から濃度10〜100μg/mlのモノクローナル抗体を得
ることができた。また、得られたハイブリドーマ 10⁷個
を予め1 週間前にプリスタンを腹腔内投与したマウス
(Balb/c系、雌、6 週齢) に同じく腹腔内投与し、1 〜2
週間後、腹水中からも4 〜7mg/mlのモノクローナル抗
体を含む腹水を得ることができた。得られた腹水を40％
飽和硫酸アンモニウムで塩析後、IgG クラスの抗体をプ
ロテインA アフィゲル (Bio-Rad)に吸着させ、0.1Mクエ
ン酸緩衝液，pH5.0 で溶出することにより精製した。

【００９６】(h)モノクローナル抗体のクラス、サブク
ラスの決定 前述したELISA に従い、ポリペプチド Aをコートしたポ
リスチレン製96穴プレートに、 (f)項で得られたハイブ
リドーマの上清を加えた。次にPBS で洗浄後、アイソタ
イプ特異的ウサギ抗マウスIgG 抗体 (Zymed Lab.) を加
えた。PBS により洗浄後、HRP 標識ヤギ抗ウサギIgG (
H ＋ L )を加え、基質として過酸化水素および 2,2'-ア
ジノ−ジ (3-エチルベンゾチアゾリン酸) を用いてクラ
ス、サブクラスを決定した。最終的に表１に示したよう
にマウスMT2-MMP に対するモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマのクラス、サブクラスを決定した。なお、ク
ローン番号162-4E3 のハイブリドーマは、工業技術院生
命工学工業技術研究所に受託番号 FERM P-16003 として
寄託保存されている (平成８年１２月１３日) 。

【００９７】実施例３ 遺伝子産物の発現と同定 動物細胞を宿主としてマウスMT2-MMP を発現させるた
め、cDNAを発現べクターと連結した。本実施例では、発
現用ベクターにはSV40のプロモーター、エンハンサー、
ポリA シグナル、small T antigen 遣伝子の介在配列を
含むpSG5^TM (Stratgene)を用いた。実施例1 (e)で構築
したマウスMT2-MMP 遺伝子をクローン化した組換えpBlu
escript ^TM (Stratagene) からEcoRI 切断により3339b
の挿入断片を切り出し、真核細胞用発現ベクターpSG5の
EcoRI サイトにクローニングし、発現用プラスミドpSGM
MT2 を作製した。ライゲーション反応は、ライゲーショ
ンキットに添付のプロトコールに従って行った。5 ％ F
CSおよび2mM glutamine を含むダルベッコ改変イーグル
培地 (Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM) 中
で培養したアフリカミドリザル腎由来細胞COS-1 にpSGM
MT2 、pSGHMT1 (ヒトMT1-MMP cDNAをpSG5にクローン化
したもの) 、pSGHMT2 (ヒトMT2-MMP cDNAをpSG5にクロ
ーン化したもの) およびpSGHMT3 (ヒトMT3-MMP cDNAを
pSG5にクローン化したもの) をリン酸カルシウム法によ
りそれぞれトランスフェクションした (F. L. Graham e
t al., Virology, 52: 456, 1973) 。対照として、pSG5
単独でCOS-1 をトランスフェクションした。

【００９８】すなわち、蒸留水に2 μg の組換えpSG5あ
るいはpSG5単独に60μl の0.25M CaCl₂ を加え、次に2
×BBS 溶液 (2.8mM Na₂HPO₄ 及び280mM NaCl含有50mM B
ES緩衝液、pH7.9) 62.5 μl をチューブの底に加えた。
これを混合後、室温で30分程度放置し、沈殿形成を十分
行った。沈殿をピペッティングにより分散し、COS-1細
胞に滴下した後、CO₂ インキュベーター中で約24時間イ
ンキュベートした。次に培地を除き、細胞をPBS で洗浄
後、新鮮な牛胎児血清不含のDMEMを加えた。培養を24時
間継続し、導入した遺伝子の発現を行った。遠心分離に
より細胞とコンディション培地を分離し、細胞を溶解緩
衝液［0.15M NaC1、0.1 ％ sodium deoxycholate、0.1
％ SDS、1mM Triton X-100、1 ％ NP-40、1mM EDTA、1m
M phenylmetanesulfonyl fluoride (PMSF) 含有10mM T
ris-HCl 緩衝液、pH7.5 ］中で4 ℃、1 時間インキュベ
ートした。細胞溶解液を遠心分離し、上清を回収した。
この細胞溶解液にSDS ポリアクリルアミド電気泳動用サ
ンプル緩衝液 (10％ glycerol 、2 ％ SDS、2 ％ β-m
ercaptoethanol、0.1％ bromophenol blue 含有50mM Tr
is-HCl 緩衝液，pH6.5)を加え、100 ℃で3 分間加熱し
た後、12％ SDSポリアクリルアミド電気泳動を行った。
泳動終了後、ウエスタン ブロッティングを行い、抗ヒ
トMT1-MMP モノクローナル抗体113-15E7 (Nature, 370:
61 〜65, 1995) あるいは抗ヒトMT3-MMP モノクローナ
ル抗体117-4E1 (J. Biol. Chem., 270: 23013〜23020,
1995)あるいは実施例2 で得られた抗マウスMT2-MMP モ
ノクローナル抗体162-4E3 と反応後、HRP 標識ヤギ抗マ
ウス免疫グロブリン抗体 (Cappel Lab.)を用いた間接法
により免疫染色を行った。

【００９９】抗ヒトMT1-MMP モノクローナル抗体113-15
E7による免疫染色では、pSGHMT1 をトランスフェクショ
ンしたCOS-1 細胞溶解液より、63kDa のヒトMT1-MMP
を、抗ヒトMT3-MMP モノクローナル抗体117-4E1 による
免疫染色では、pSGHMT3 をトランスフェクションしたCO
S-1 細胞溶解液より、66kDa のヒトMT3-MMP を検出し
た。抗マウスMT2-MMP モノクローナル抗体162-4E3 によ
る免疫染色では、pSGHMT2およびpSGMMT2 をトランスフ
ェクションしたCOS-1 細胞溶解液の両方より、70kDa の
ヒトMT2-MMP およびマウスMT2-MMP をそれぞれ検出し
た。ベクターpSG5をトランスフェクションしたCOS-1 細
胞溶解液にはいずれの抗体に反応するタンパク質は見ら
れなかった。抗マウスMT2-MMP モノクローナル抗体162-
4E3 は、マウスMT2-MMP のほかにヒトMT2-MMP と反応す
ることが確認された。ヒトMT1-MMP およびヒトMT3-MMP
に対する抗マウスMT2-MMP モノクローナル抗体162-4E3
の交差反応は認められなかった。ここで用いたマウスMT
2-MMP を適当な発現ベクターに移すことで、大腸菌、枯
草菌、酵母、動物細胞等を宿主としてマウスMT2-MMP を
大量生産できる。pSGMMT2 をCOS-1 に導入した本実施例
では、マウスMT2-MMP の産生は短期的 (transient expr
ession) であるが、適当な選択マーカー (neo 遺伝子、
dehydrofolate reductase 遺伝子等) を有する発現ベク
ターを使用し、CHO 細胞等に導入することにより長期間
生産可能な細胞株を得ることもできる。このようなマウ
スMT2-MMPを継続的に発現する細胞株は、アンチセンス
オリゴマーおよびその誘導体によるマウスMT2-MMP 発現
の阻害の様子をモニターするのに有用である。

【０１００】実施例４ マウスMT2-MMP の発現による潜在型ゼラチナーゼ Aの活
性化 実施例3 で使用したpSGMMT2 、あるいはpSGHMT1 、ある
いはpSGHMT2 、あるいはヒトMT3-MMP cDNAをクローン化
したプラスミドpSGHMT3 、あるいはベクターpSG5のそれ
ぞれと、ヒトゼラチナーゼ A cDNA をクローン化したプ
ラスミドpSGHGELAを、実施例3 に記載したリン酸カルシ
ウム法によりCOS-1 にコトランスフェクションした。得
られたトランスフェクタントを無血清DMEM中で24時間培
養し、回収した培養上清をザイモグラフィーにかけた。
培養上清をSDS ポリアクリルアミド電気泳動用サンプル
緩衝液 (非還元; 10％glycerol 、2 ％ SDS 0.1％ brom
ophenol blue 含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH6.5)と混
和後37℃で20分間インキュベートした後、0.1 ％ gelat
in含有10％ポリアクリルアミドゲルを用い電流20mA、4
℃で電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルを2.5 ％ Tri
ton X-100 溶液中で1 時間ゆっくり振盪させながら洗浄
し、次にゼラチナーゼ用緩衝液 (10mM CaCl₂、0.15M Na
Cl、0.02％ NaN₃ 含有50mM Tris-HCl 緩衝液，pH7.6)中
で37℃で24時間ゆっくり振盪させながらインキュベート
した。緩衝液を廃棄し、ゲルを0.1 ％ coomassie brill
iant blue R250 (50％メタノール-10 ％ 酢酸に溶解)
で1 時間染色後、脱色液 (5 ％メタノール-7.5 ％酢酸)
に浸し脱色した。得られたザイモグラフィーの結果を
図３に示した。レーン１にはpSGHGELAをトランスフェク
ションした、レーン２、３、４および５にはpSGHMT1 、
pSGHMT2 、pSGMMT2 およびpSGHMT3 のそれぞれとpSGHGE
LAをコトランスフェクションしたCOS-1 細胞の培養上清
が展開されている。

【０１０１】ベクターpSG5とpSGHGELAをコトランスフェ
クションしたCOS-1 の培養上清では、ヒト潜在型ゼラチ
ナーゼ A の68kDa のバンドのみが検出され、活性化に
伴う分子量変化は観察されなかった (図３、レーン１)
。一方、pSGHMT1 、あるいはpSGHMT2 、あるいはpSGHM
T3 のそれぞれとpSGHGELAをコトランスフェクションし
たCOS-1 の培養上清では、新たにゼラチナーゼ A活性中
間体と活性型ゼラチナーゼ Aに相当する64kDa と62kDa
のバンドが出現 (図３、レーン２、３および５)し、ヒ
ト潜在型ゼラチナーゼ Aの活性化が観察された。pSGMMT
2 とpSGHGELAをコトランスフェクションしたCOS-1 の培
養上清では、上記ヒトMT-MMPs の場合と同様にゼラチナ
ーゼ A活性中間体とゼラチナーゼ A活性型に相当する64
kDa と62kDa のバンドが出現 (図３、レーン４) し、ヒ
ト潜在型ゼラチナーゼ Aの活性化が確認された。この方
法を用いれば、マウスMT2-MMP と潜在型ゼラチナーゼ A
の混合液中に添加した任意の物質にマウスMT2-MMP の有
する潜在型ゼラチナーゼ A活性化能を阻害する効果があ
るか否かの判定が可能である。またザイモグラフィーの
基質を適宜選択することで、マウスMT2-MMP の有する細
胞外マトリクス分解活性を阻害する物質の検出が可能で
ある。

【０１０２】

【発明の効果】潜在型MMP-2 の活性化能を有するMMP の
一種であり且つMT1-MMP 以外のマウス由来の潜在型ゼラ
チナーゼ A活性化因子であるマウスMT2-MMP と実質的に
同等な活性を有するタンパク質またはその塩を得ること
ができ、さらにそのタンパク質をコードする核酸が得ら
れたことで、癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の
診断治療に関わる研究に有用な手段が得られることにな
った。特にマウスを用いた実験医学的生理学的用途に有
用である。また、本発明によって該タンパク質の遺伝子
工学的製造方法、該タンパク質に結合するモノクローナ
ル抗体およびその製造方法、さらには該タンパク質およ
び抗体および核酸オリゴマーの用途が提供される。これ
らは該タンパク質および遺伝子の検出、定量に有用であ
るだけでなく、該タンパク質の潜在型ゼラチナーゼ A活
性化能を阻害する物質あるいは細胞外マトリクス分解活
性を阻害する物質の検出にも有用である。該物質はその
潜在型ゼラチナーゼ A活性化阻害あるいは細胞外マトリ
クス分解活性阻害機能により抗癌剤、癌転移抑制剤等の
薬剤および薬剤原料としても有用である。またそれら薬
剤の研究に有効な手段が提供される。特には癌の浸潤転
移の過程に重要な役割を担っていると考えられるゼラチ
ナーゼ Aの活性化機構の解明に資することができ、潜在
型ゼラチナーゼ Aの活性化因子と同定されたMT-MMPファ
ミリーのヒトMT1-MMP およびMT3-MMP の解析や新規のゼ
ラチナーゼ A活性化因子の探索・同定をすすめることが
できるようになる。さらにゼラチナーゼ A活性化に関連
した疾患の診断や医薬品等の開発に役に立つ。またゼラ
チナーゼ Aにはアルツハイマー病の発症に関与するβア
ミロイドタンパク質の分解活性が見出されていることか
らこうした疾患に関連した病気の診断やそのための医薬
品等の開発に役に立つ。

【０１０３】

【配列表】

【配列番号：１】 配列の長さ：３３３９ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物種：マウス 配列 CGGACTCCCC TTTCTCTGAC TCTGGAGCAT GGGCAGCGAC CGGAGCGCAC TCGGACGTCC 60 AGGCTGCACT GGCAGCTGCC TCAGCAGCCG AGCTTCGCTG CTCCCGCTGC TACTGGTGCT 120 TCTGGACTGT CTGGGCCATG GTACAGCGTC TAAAGACGCC GAAGTGTACG CCGCGGAGAA 180 CTGGCTGCGG CTCTATGGCT ACCTACCCCA GCCCAGCCGC CACATGTCCA CCATGCGCTC 240 TGCCCAGATC CTGGCCTCCG CCCTTGCCGA GATGCAGAGT TTCTATGGGA TCCCTGTCAC 300 GGGTGTGCTT GATGAAGAGA CGAAAACGTG GATGAAGCGG CCCCGATGTG GGGTTCCTGA 360 TCAGTTTGGG GTACATGTGA AAGCCAACCT GCGTCGACGG CGGAAACGTT ACACCCTGAC 420 AGGAAAGGCA TGGAACAATT ACCACCTGAC CTTCAGCATC CAGAACTACA CTGAGAAGCT 480 GGGCTGGTAC AACTCCATGG AGGCGGTGCG CAGGGCTTTC CAAGTGTGGG AGCAGGTCAC 540 ACCATTGGTC TTCCAGGAAG TATCCTATGA TGACATTCGG CTACGAAGGC GAGCGGAGGC 600 TGACATCATG GTACTCTTTG CCTCTGGCTT CCATGGCGAC AGCTCACCGT TTGATGGCGT 660 GGGTGGCTTT CTGGCCCACG CTTATTTCCC CGGCCCTGGT CTGGGTGGGG ACACCCATTT 720 CGACGCAGAT GAACCCTGGA CCTTCTCCAG CACTGACCTG CATGGAATCA GCCTCTTTCT 780 GGTGGCCGTG CATGAGCTGG GCCATGCCCT GGGGCTAGAA CACTCAAGTA ACCCCAGCGC 840 TATTATGGCA CCCTTCTACC AGTGGATGGA TACCGACAAC TTCCAGCTGC CCGAAGATGA 900 CCTTCGGGGC ATCCAGCAGC TGTATGGCTC CCCAGATGGT AAGCCACAGC CCACCCGGCC 960 TCTCCCCACT GTAAGGCCCC GGCGGCCAGG ACGGCCAGAT CACCAGCCAC CTCGGCCTCC 1020 CCAGCCACCA CATCCAGGTG GGAAGCCAGA AAGGCCCCCC AAACCAGGGC CCCCACCCCA 1080 GCCCCGAGCC ACAGAGAGGC CTGACCAGTA TGGCCCCAAC ATCTGCGATG GCAACTTCGA 1140 CACAGTGGCT GTGCTCCGCG GAGAGATGTT TGTGTTCAAG GGCCGCTGGT TCTGGCGAGT 1200 CAGGCACAAC CGCGTTCTAG ACAACTACCC CATGCCAATT GGCCACTTCT GGCGCGGTCT 1260 GCCGGGGAAC ATCAGTGCTG CCTACGAGCG CCAGGATGGA CATTTTGTCT TCTTCAAAGG 1320 TAACCGCTAC TGGCTTTTCC GAGAAGCCAA TCTGGAGCCC GGCTACCCAC AGCCGCTGAG 1380 CAGCTATGGC ACAGACATCC CCTATGACCG CATTGACACA GCCATCTGGT GGGAGCCCAC 1440 AGGTCACACC TTCTTCTTTC AAGCAGACAG GTACTGGCGC TTCAACGAGG AGACACAGCA 1500 TGGAGACCCT GGCTACCCCA AGCCCATCAG TGTCTGGCAG GGGATCCCCA CCTCTCCCAA 1560 AGGGGCCTTC CTCAGCAACG ATGCAGCCTA CACCTACTTC TACAAGGGCA CCAAGTACTG 1620 GAAATTCAAC AACGAACGCC TACGGATGGA ACCCGGCCAC CCCAAATCCA TCCTGCGGGA 1680 CTTCATGGGC TGCCAGGAGC ACGTGGAGCC CCGATCGCGA TGGCCCGATG TGGCTCGTCC 1740 ACCCTTCAAC CCCAACGGGG GTGCCGAGCC TGAGGCAGAT GGTGACAGCA AGGAAGAGAA 1800 CGCGGGTGAC AAGGATGAGG GCAGCCGCGT GGTGGTGCAG ATGGAGGAGG TGGTCCGGAC 1860 AGTGAACGTG GTGATGGTGT TGGTCCCCTT GCTGCTGTTG CTCTGTATTC TGGGCCTGGC 1920 CTTTGCTCTG GTGCAGATGC AGCGCAAGGG CGCCCCTCGC ATGCTGCTCT ACTGCAAGCG 1980 CTCACTGCAG GAGTGGGTGT GATCAGGTAG CACCCGCAGC ACCCGGTGCT CAGGTCTGCA 2040 GGGACAGGAG ACGTGTGGAT CCCAGATGCT CCCTCGGCGC GGCAGGATGC CTCCTAGCCA 2100 CACACATCCC CCTGCCAGCC TTGCCCCCCA CCCCCGTCCT CCTTTATTTA TGCCCAGGTG 2160 CCTCTTCTTT TTGGCACCCT CTCTCAGCCT TTGGTTCCGC TTTCCTGACT CGGGCCAGGA 2220 GATGCTTTGA GATCTCCCGG AGTGTAGTAC CGCCCCAGGC AGGAACGAAG GGACAGAGGC 2280 TCACACCTCT GGAAGATGGC AGAGGGCTGG GAAGCTTCTC TGGCTCTGGC TTTTCAGCCT 2340 GAACCTCTCC TCCCACGACA AGAACTGTGT TTGCCTTGAA GGAGCCCACC TCGGCTCTGC 2400 CCTCCTGAAT TTGCCTTAGG GAGAGTATAT GCTCCCCCCT GGGGGGGCAC CCTGATAACC 2460 TTGAGACTTG GTTCCTTCTT CTTAGGCTCC TAAGAAGCCC AGAAGCCTAA AAGCCCTCCC 2520 CCATCCTAGC ATTCTGCAGC TTCTTTCCTC TAGGAAGGGG CCCTGGACAT GTCTCACCTA 2580 GGACCAAAGG GAGCCTGCCA AGCTCCCCTC CCAATGCTAG TGACTAGCTC CTCCTTCCCT 2640 AGGCTGCCCA TATTCTCTTT CAGTGCCCCA TAGGTCTCCG GAGGCTGGCA CTCCCCGCCC 2700 GCCCCCACCC CCAGCTTCTG CAGTCCTTGT CCCAACTCTT AATGACATGG GGCAGACACA 2760 CCCACTAGGG TACCAGAGGT CCCTGGGCAG TGTGTGTGAT TGTGGATGCT CAGCAGGTCA 2820 CAGACCAAGC TTATGGGCTT CCTCCCTTCC AGATTCCTGT CCCCACACAA CACTACTAGG 2880 CTCAGGCCAG CAGCTCACCC CACACAGAGT CTGTGGAACC CCCAAAGGAA TCCACTAAGG 2940 CCTGGGAAGT CTGTCCTAAG GGTGAAAGGG GCCCTCCCTT CCTCTTCTCA TCCTGGAGTC 3000 AGCAGGAGGC TTCTGTGGGA AATGGTACTG TACAGCTGTG GCTCTGTCTC CTCTGCCTCC 3060 CTAAAGCCTT GAGCAGTAAA GGGCTGCCAG CCAGGATCCT CTGGGTCACC GCCGCTTTCC 3120 AAGTGGTGGA TTCTTATAGC CTGGCACTAG AGGTGACAGA TCGGAGGGGC ATGTCCTGCA 3180 GCACTCTAGA TGTCCCCTCT GCAGAACCTG AGAGTCAGCA AGGGGTGGGG CGTCCACCCC 3240 CCCACTCCCC ATCGTTTAGT TCTGTAGATA ATCAGCACTG ATTAAATGTC CAGCCAGCGA 3300 GCGTGGCTGC ACTTGTACGC TCAAAAAAAA AAAAAACCG 3339

【０１０４】

【配列番号：２】 配列の長さ：６５７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：マウス 配列 Met Gly Ser Asp Arg Ser Ala Leu Gly Arg Pro Gly Cys Thr Gly Ser 1 5 10 15 Cys Leu Ser Ser Arg Ala Ser Leu Leu Pro Leu Leu Leu Val Leu Leu 20 25 30 Asp Cys Leu Gly His Gly Thr Ala Ser Lys Asp Ala Glu Val Tyr Ala 35 40 45 Ala Glu Asn Trp Leu Arg Leu Tyr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser Arg 50 55 60 His Met Ser Thr Met Arg Ser Ala Gln Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ala 65 70 75 80 Glu Met Gln Ser Phe Tyr Gly Ile Pro Val Thr Gly Val Leu Asp Glu 85 90 95 Glu Thr Lys Thr Trp Met Lys Arg Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Gln 100 105 110 Phe Gly Val His Val Lys Ala Asn Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Tyr 115 120 125 Thr Leu Thr Gly Lys Ala Trp Asn Asn Tyr His Leu Thr Phe Ser Ile 130 135 140 Gln Asn Tyr Thr Glu Lys Leu Gly Trp Tyr Asn Ser Met Glu Ala Val 145 150 155 160 Arg Arg Ala Phe Gln Val Trp Glu Gln Val Thr Pro Leu Val Phe Gln 165 170 175 Glu Val Ser Tyr Asp Asp Ile Arg Leu Arg Arg Arg Ala Glu Ala Asp 180 185 190 Ile Met Val Leu Phe Ala Ser Gly Phe His Gly Asp Ser Ser Pro Phe 195 200 205 Asp Gly Val Gly Gly Phe Leu Ala His Ala Tyr Phe Pro Gly Pro Gly 210 215 220 Leu Gly Gly Asp Thr His Phe Asp Ala Asp Glu Pro Trp Thr Phe Ser 225 230 235 240 Ser Thr Asp Leu His Gly Ile Ser Leu Phe Leu Val Ala Val His Glu 245 250 255 Leu Gly His Ala Leu Gly Leu Glu His Ser Ser Asn Pro Ser Ala Ile 260 265 270 Met Ala Pro Phe Tyr Gln Trp Met Asp Thr Asp Asn Phe Gln Leu Pro 275 280 285 Glu Asp Asp Leu Arg Gly Ile Gln Gln Leu Tyr Gly Ser Pro Asp Gly 290 295 300 Lys Pro Gln Pro Thr Arg Pro Leu Pro Thr Val Arg Pro Arg Arg Pro 305 310 315 320 Gly Arg Pro Asp His Gln Pro Pro Arg Pro Pro Gln Pro Pro His Pro 325 330 335 Gly Gly Lys Pro Glu Arg Pro Pro Lys Pro Gly Pro Pro Pro Gln Pro 340 345 350 Arg Ala Thr Glu Arg Pro Asp Gln Tyr Gly Pro Asn Ile Cys Asp Gly 355 360 365 Asn Phe Asp Thr Val Ala Val Leu Arg Gly Glu Met Phe Val Phe Lys 370 375 380 Gly Arg Trp Phe Trp Arg Val Arg His Asn Arg Val Leu Asp Asn Tyr 375 390 395 400 Pro Met Pro Ile Gly His Phe Trp Arg Gly Leu Pro Gly Asn Ile Ser 405 410 415 Ala Ala Tyr Glu Arg Gln Asp Gly His Phe Val Phe Phe Lys Gly Asn 420 425 430 Arg Tyr Trp Leu Phe Arg Glu Ala Asn Leu Glu Pro Gly Tyr Pro Gln 435 440 445 Pro Leu Ser Ser Tyr Gly Thr Asp Ile Pro Tyr Asp Arg Ile Asp Thr 450 455 460 Ala Ile Trp Trp Glu Pro Thr Gly His Thr Phe Phe Phe Gln Ala Asp 455 470 475 480 Arg Tyr Trp Arg Phe Asn Glu Glu Thr Gln His Gly Asp Pro Gly Tyr 485 490 495 Pro Lys Pro Ile Ser Val Trp Gln Gly Ile Pro Thr Ser Pro Lys Gly 500 505 510 Ala Phe Leu Ser Asn Asp Ala Ala Tyr Thr Tyr Phe Tyr Lys Gly Thr 515 520 525 Lys Tyr Trp Lys Phe Asn Asn Glu Arg Leu Arg Met Glu Pro Gly His 530 535 540 Pro Lys Ser Ile Leu Arg Asp Phe Met Gly Cys Gln Glu His Val Glu 545 550 555 560 Pro Arg Ser Arg Trp Pro Asp Val Ala Arg Pro Pro Phe Asn Pro Asn 565 570 575 Gly Gly Ala Glu Pro Glu Ala Asp Gly Asp Ser Lys Glu Glu Asn Ala 580 585 590 Gly Asp Lys Asp Glu Gly Ser Arg Val Val Val Gln Met Glu Glu Val 595 600 605 Val Arg Thr Val Asn Val Val Met Val Leu Val Pro Leu Leu Leu Leu 610 615 620 Leu Cys Ile Leu Gly Leu Ala Phe Ala Leu Val Gln Met Gln Arg Lys 625 630 635 640 Gly Ala Pro Arg Met Leu Leu Tyr Cys Lys Arg Ser Leu Gln Glu Trp 645 650 655 Val 657

【０１０５】

【配列番号：３】 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Thr Asp Asn Phe Gln Leu Pro Glu Asp Asp Leu Arg Gly 1 5 10 14

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のマウスMT2-MMP (mMT2-MMP ）のアミノ
酸配列と既知のヒトMT-MMP (hMT-MMP)ファミリーのアミ
ノ酸配列との相同性を比較した図で、図２に続いてい
る。下線を引いた部分は、各IS-1領域及びIS-2領域に相
当する配列を示す。

【図２】本発明の mMT2-MMP のアミノ酸配列と既知のhM
T-MMP ファミリーのアミノ酸配列との相同性を比較した
図で、図１の続きである。下線を引いた部分は、IS-3領
域に相当する配列を示す。

【図３】MT-MMPs の発現によるヒト潜在型ゼラチナーゼ
Aの活性化の結果をザイモグラフィーの模式図で示す。
レーン１にはpSGHGELAをトランスフェクションしたCOS-
1 細胞の培養上清が、そしてレーン２、３、４および５
にはpSGHMT1 、pSGHMT2 、pSGMMT2 およびpSGHMT3 のそ
れぞれとpSGHGELAをコトランスフェクションしたCOS-1
細胞の培養上清が展開されている。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 9/48 9/48 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/02 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 吉田 真一 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 潜在型ゼラチナーゼ Aの活性化能を有す
   るMMP の一種であり且つマウスMT1-MMP 以外の潜在型ゼ
   ラチナーゼ A活性化因子である天然のマウスMT-MMP活性
   を有するかあるいはそれと実質的に同等な活性を有する
   ことを特徴とするマウス由来のタンパク質またはその
   塩。
2. 【請求項２】 該タンパク質がマウスMT2-MMP またはそ
   の塩と、実質的に同等な活性を有するか、あるいは実質
   的に同等の一次構造コンフォメーションを持つものであ
   ることを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 C 末端領域に、配列表の配列番号：2 の
   Val⁶¹⁴〜Val⁶³⁵で表されるアミノ酸配列またはそれと実
   質的に同等のアミノ酸配列を有することを特徴とする請
   求項１または２記載のタンパク質。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号：2 で表されるアミノ
   酸配列またはそれと実質的に同等のアミノ酸配列を有す
   るマウスMT2-MMP またはその塩であることを特徴とする
   請求項１〜３のいずれか一記載のタンパク質。
5. 【請求項５】 外因性DNA 配列を原核生物において発現
   して得たものであるか、あるいは真核生物で発現させて
   得たものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれ
   か一記載のタンパク質。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一記載のタンパ
   ク質の部分ペプチドまたはその塩。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか一記載のタンパ
   ク質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を有
   することを特徴とする核酸。
8. 【請求項８】 請求項２〜４のいずれか一記載のタンパ
   ク質をコードする塩基配列を有するDNA 遺伝子であるこ
   とを特徴とする請求項７記載の核酸。
9. 【請求項９】 配列表の配列番号：１で表される塩基配
   列のうちオープンリーディングフレーム部分またはそれ
   と実質的に同等な活性を有する塩基配列を有することを
   特徴とする請求項７または８記載の核酸。
10. 【請求項１０】 請求項７〜９のいずれか一記載の核酸
    を含有することを特徴とするベクター。
11. 【請求項１１】 請求項７〜９のいずれか一記載の核酸
    または請求項10記載のベクターを保有することを特徴と
    する形質転換体。
12. 【請求項１２】 請求項11記載の形質転換体を増殖可能
    な栄養培地中で培養し、組換えタンパク質としてマウス
    MT2-MMP またはその塩を包含する請求項１〜６のいずれ
    か一記載のタンパク質またはその部分ペプチドを生成せ
    しめることを特徴とするマウスMT2-MMP またはその塩を
    包含する請求項１〜６のいずれか一記載のタンパク質ま
    たはその部分ペプチドの製造方法。
13. 【請求項１３】 請求項１のタンパク質またはその塩あ
    るいはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
14. 【請求項１４】 マウスMT2-MMP またはその塩と、実質
    的に同等な活性を有するか、あるいは実質的に同等の一
    次構造コンフォメーションを持つものであるタンパク質
    に対する抗体であることを特徴とする請求項13記載の抗
    体。
15. 【請求項１５】 配列表の配列番号：2 で表されるアミ
    ノ酸配列またはそれと実質的に同等のアミノ酸配列を有
    するマウスMT2-MMP またはその塩であるタンパク質に対
    する抗体であることを特徴とする請求項13または14記載
    の抗体。
16. 【請求項１６】 外因性DNA 配列を原核生物において発
    現して得たものであるかあるいは真核生物で発現させて
    得たものであるタンパク質に対する抗体であることを特
    徴とする請求項13〜15のいずれか一記載の抗体。
17. 【請求項１７】 タンパク質の部分ペプチドまたはその
    塩に対する抗体であることを特徴とする請求項13〜16の
    いずれか一記載の抗体。
18. 【請求項１８】 請求項17記載のタンパク質の部分ペプ
    チドまたはその塩が配列表の配列番号：２のAsp²⁸¹〜Gl
    y²⁹⁴で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする
    請求項17記載の抗体。
19. 【請求項１９】 抗血清であることを特徴とする請求項
    13〜18のいずれか一記載の抗体。
20. 【請求項２０】 モノクローナル抗体であることを特徴
    とする請求項13〜18のいずれか一記載の抗体。
21. 【請求項２１】 マウスMT2-MMP またはその塩に対する
    モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項13〜
    18および20のいずれか一記載の抗体。
22. 【請求項２２】 請求項13の抗体を得ることを特徴とす
    る請求項１のタンパク質またはその塩あるいはその部分
    ペプチドまたはその塩に対する抗体の製造方法。
23. 【請求項２３】 請求項１のタンパク質またはその塩あ
    るいはその部分ペプチドまたはその塩で免疫した動物か
    ら得られた、請求項１のタンパク質またはその塩あるい
    はその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を産生す
    る細胞を、継代培養可能な細胞と融合せしめ、継代培養
    可能でかつマウスMT2-MMP を包含するタンパク質に対す
    る抗体を産生するハイブリッド細胞を選別することを特
    徴とする請求項20または21記載の抗体の産生方法。
24. 【請求項２４】 請求項１のタンパク質またはその塩あ
    るいはその部分ペプチドまたはその塩を試薬として用い
    るか、あるいは請求項13〜21のいずれか一記載の抗体を
    試薬として用いることを特徴とするMT2-MMP の検出・測
    定方法。
25. 【請求項２５】 請求項24のMT2-MMP の検出・測定方法
    に用いる標識化されたMT2-MMP に対する抗体。
26. 【請求項２６】 請求項24のMT2-MMP の検出・測定方法
    に用いる請求項１のタンパク質またはその塩あるいはそ
    の部分ペプチドまたはその塩であることを特徴とする標
    識化されたタンパク質またはその塩あるいは部分ペプチ
    ドまたはその塩。
27. 【請求項２７】 標識化された請求項７の核酸。
28. 【請求項２８】 ハイブリダイゼーション・プローブで
    あることを特徴とする請求項27記載の核酸。
29. 【請求項２９】 請求項１のタンパク質またはその塩の
    有する潜在型ゼラチナーゼ A活性化能を阻害する化合物
    およびタンパク質またはその塩を検出する方法。
30. 【請求項３０】 請求項１のタンパク質またはその塩の
    有する潜在型ゼラチナーゼ A活性化能を阻害する化合物
    およびタンパク質またはその塩。
31. 【請求項３１】 請求項１のタンパク質またはその塩の
    有する細胞外マトリクス分解活性を阻害する化合物およ
    びタンパク質またはその塩を検出する方法。
32. 【請求項３２】 請求項１のタンパク質またはその塩の
    有する細胞外マトリクス分解活性を阻害する化合物およ
    びタンパク質またはその塩。
33. 【請求項３３】 配列表の配列番号：１で表される塩基
    配列を含むDNA およびRNA 配列にハイブリダイズするア
    ンチセンスオリゴマー。