JPH10229885A - 新規アルコールアルデヒド脱水素酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、アルコールおよび／またはアルデヒ
ド脱水素酵素活性を有するAADHの新規組換え酵素調製物
を提供することを課題とする。 【解決手段】グルコノバクターに存在する固有のアルコ
ールおよび／またはアルデヒド脱水素酵素遺伝子をクロ
ーン化し、発現させ、所望の酵素活性を有する酵素をコ
ードする遺伝子を取得することにより、配列番号:５、
配列番号:６、配列番号:７および配列番号:８により同
定されるポリペプチド、並びに配列番号:５、配列番号:
６、配列番号:７および配列番号:８により同定されるポ
リペプチドの間のキメラ組換え酵素、並びに一つまたは
それ以上のアミノ酸残基の付加、挿入、欠失および／ま
たは置換を含む上記で同定されるポリペプチドの機能可
能な誘導体からなる群より選択され、該酵素ポリペプチ
ドがアルコールおよび／またはアルデヒド脱水素酵素活
性を有する、一つまたはそれ以上の酵素ポリペプチドを
含んでなるアルコールおよび／またはアルデヒド脱水素
酵素活性を有する組換え酵素調製物が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アルコールおよび
/またはアルデヒド脱水素酵素活性を有するアルコール
／アルデヒド脱水素酵素（以下AADHと称する）の組換え
酵素調製物に関する。本発明はまた、AADHをコードする
新規組換えDNA分子、該DNAを含む組換え発現ベクター、
該組換えDNA分子および/または該組換え発現ベクターを
含有する組換え生物に関する。更に本発明は、AADHの組
換え酵素調製物の製造方法および該組換え酵素調製物を
利用するアルデヒド、カルボン酸、ケトン、特に２-ケ
ト-L-ギュロン酸(以下２KGAと称する）の製造方法およ
び該組換え生物を利用するアルデヒド、カルボン酸、ケ
トン、特に２KGAの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】２KGAはL-アスコルビン酸（ビタミンC)
生産の重要な中間体である。数多くの微生物がD-ソルビ
トールまたはL-ソルボースから２KGAを生産することが
知られている。特公昭51-40154(1976)はアセトバクター
（Acetobacter）属、バクテリウム（Bacterium）属また
はシュードモナス(Pseudomonas)属の微生物によるD-ソ
ルビトールからの２KGA生産を開示している。「Acta Mi
corobiologica Sinica 21巻 (2号）185〜191頁 (198
1)」によれば、２KGAはL-ソルボースから微生物の混合
培養物、特にシュードモナス ストリアータ（Pseudomo
nas striata）とグルコノバクター オキシダンス（Glu
conobacter oxydans）の混合培養により生産することが
可能である。ヨーロッパ特許出願公開第0221 707号は共
存微生物存在および非存在下でのシュードグルコノバク
ター サッカロケトゲネス(Pseudogluconobacter sacch
aroketogenes)によるL-ソルボースからの２KGA生産を開
示している。ヨーロッパ特許出願公開第0278 447号はDS
M番号4025（グルコノバクターオキシダンス)および他の
DSM番号4026(バチルス メガテリウム株、Bacillusmega
terium)を含む混合培養物によるL-ソルボースからの２K
GA製造方法を開示している。ヨーロッパ特許出願公開第
88116156号はG.オキシダンスDSM番号4025によるL-ソル
ボースからの２KGA製造方法を開示している。

【０００３】G.オキシダンスDSM番号4025からAADHが精
製され、アルコール、アルデヒドの酸化を触媒するとい
う性質が調べられた。すなわちAADHは、アルコールから
対応するアルデヒドおよびケトンを、アルデヒドからカ
ルボン酸を生産することができた（朝倉、星野、ヨーロ
ッパ特許出願公開第606621号）。更に、特に本AADHはL-
ソルボースからL-ソルボソンを経由して２KGAへの酸化
を触媒した。AADHの精製標品の物理化学的性質は、次の
通りである： １）至適pH：約7.0〜9.0 ２）至適温度：約20℃〜40℃ ３）分子量：135,000 +/- 5,000ダルトン（分子量64,50
0 +/- 2,000のアルファサブユニットと分子量62,500 +/
- 2,000のベータサブユニットのどの組み合わせでもよ
い２つのサブユニットを含む） ４）基質特異性：L-ソルボース、L-ソルボソン、D-ソル
ビトール、D-グルコース、D-マンニトール、D-フルクト
ース、DL-グリセルアルデヒド、エタノール、１-プロパ
ノール、１-ブタノール、１-ペンタノール、１-ヘキサ
ノール、１-ヘプタノール、２-プロパノール、２-ブタ
ノール、プロピオンアルデヒド、PEG1000、PEG2000、PE
G4000、PEG6000およびポリビニルアルコールを含む一級
および二級アルコールとアルデヒドに活性を有する ５）補欠分子族：ピロロキノリン キノン ６）等電点：約4.4。

【０００４】該AADHをコードする遺伝子をクローン化で
きれば、大量のAADH組換え酵素調製物の生産、ならびに
種々のアルデヒド、ケトンおよびカルボン酸、特に２KG
Aの生産が可能な組換え生物を作成するのに有用であ
る。しかし、今日までかかる遺伝子類のクローニングに
関する報告はない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アルコール
および/またはアルデヒド脱水素酵素活性を有するAADH
の新規組換え酵素調製物を提供することを課題とする。
また、本発明は、AADHをコードする新規組換えDNA分
子、該DNAを含む組換え発現ベクター、該DNAおよび/ま
たは組換え発現ベクターを有する組換え生物、組換えAA
DHの製造方法、組換えAADHまたは組換え生物を利用する
アルデヒド、カルボン酸、ケトン、特に２KGAの製造方
法を提供することを課題とする。

【０００６】より詳しくは、本発明の一面は配列番号:
５、配列番号:６、配列番号:７および配列番号:８によ
り同定されるポリペプチド、並びに配列番号:５、配列
番号:６、配列番号:７および配列番号:８により同定さ
れるポリペプチドの間のキメラ組換え酵素、並びに一つ
またはそれ以上のアミノ酸残基の付加、挿入、欠失およ
び/または置換を含む上記で同定されるポリペプチドの
機能的誘導体からなる群より選択され、該酵素ポリペプ
チドがアルコールおよび/またはアルデヒド脱水素酵素
活性を有する、一つまたはそれ以上の酵素ポリペプチド
を含むアルコールおよび/またはアルデヒド脱水素酵素
活性を有する組換え酵素調製物に関する。

【０００７】かかる同等の機能を有する誘導体は、当技
術分野において周知の化学的ペプチド合成、または本明
細書に開示されているような当技術分野において周知の
方法により、たとえばサムブルック(Sambrook)ら（分子
クローニング(Molecular Cloning), Cold Spring Harbo
ur Laboratory Press, New York, USA,第２版、1989)に
より開示されているようなDNA配列に基づいた組換えDNA
技術、のいずれの方法でも作成することが可能である。
蛋白質やペプチド中のアミノ酸をその分子の活性を概し
て変えずに置換することは、当技術分野において周知で
あり、たとえばH.ニューラス(Neurath) R. L.ヒル(Hil
l)により「蛋白質(The Proteins)」(Academic Press, N
ew York, 1979, 特に14頁の図6参照)に述べられてい
る。最も通常起こる置換は：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Gl
u、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Se
r/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Il
e、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Glyおよびこれらの逆であ
る。

【０００８】本発明の他の一面は、配列番号:５、配列
番号:６、配列番号:７および配列番号:８により同定さ
れるポリペプチド、並びに配列番号:５、配列番号:６、
配列番号:７および配列番号:８により同定されるポリペ
プチドの間のキメラ組換え酵素、並びに一つまたはそれ
以上のアミノ酸残基の付加、挿入、欠失および/または
置換を含む上記で同定されるポリペプチドの機能的誘導
体からなる群より選択され、該酵素ポリペプチドがアル
コールおよび/またはアルデヒド脱水素酵素活性を有す
る、少なくとも一つの酵素ポリペプチドをコードする組
換えDNA分子に関する。

【０００９】さらに本発明は、たとえば本配列表に開示
されているようなアルコールおよび/またはアルデヒド
脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA
配列、およびそれらの相補鎖、またはこれらの配列を含
むDNA配列、該配列またはそれらから誘導される断片と
標準的条件下でハイブリダイズするDNA配列、および遺
伝子コードの縮退という理由により上記DNA配列と標準
的条件下でハイブリダイズはしないが全く同じアミノ酸
配列を有するポリペプチドをコードするDNA配列に関す
る。

【００１０】ハイブリダイゼーションの「標準的条件」
とは、特異的ハイブリダイゼーションシグナルを検出す
るのに当業者により一般的に使用され、かつ例えばサム
ブルック(Sambrook)ら（分子クローニング(Molecular C
loning), Cold Spring Harbour Laboratory Press, New
York, USA, 第２版、1989)により述べられている条
件、好ましくは、当業者に公知のサムブルック(Sambroo
k)らにより述べられたいわゆるストリンジェントハイブ
リダイゼーション-非ストリンジェント洗浄条件、より
好ましくはいわゆるストリンジェントハイブリダイゼー
ション-ストリンジェント洗浄条件を意味する。さらに
当技術分野で周知の方法を使用し本明細書に開示されて
いるDNA配列に基づいて設計したプライマーを用いてポ
リメラーゼ連鎖反応(PCR)により作成できるDNA配列を提
供することもまた本発明の目的である。本発明のDNA配
列はまたヨーロッパ特許出願第747 483号に記載されて
いるように合成することも可能であると理解される。

【００１１】本発明の更なる一面は、上記で定義される
一つまたはそれ以上の組換えDNA分子を有する組換え発
現ベクターおよび上述の組換え発現ベクターおよび／ま
たは、一つまたはそれ以上のDNA分子を染色体上に有す
る組換え生物に関する。

【００１２】本発明の更なる一面は、適当な培地で上述
の組換え生物を培養し、該組換え酵素調製物を回収する
ことを含む、上記で定義されるアルコールおよび/また
はアルデヒド脱水素酵素活性を有する組換え酵素調製物
の製造方法に関する。

【００１３】本発明の他の一面は、上記で定義される組
換え生物を使用しての基質を生産物に変換することを含
むアルデヒド、ケトン、またはカルボン酸を対応する基
質から生産する製造方法に関する。

【００１４】本発明の更に他の一面は、L-ソルボースお
よび/またはD-ソルビトールを含有する適当な培地中で
の上記に定義する組換え生物の醗酵を含む２-ケト-L-ギ
ュロン酸の製造方法に関する。

【００１５】本発明の他の一面は、本発明の組換え酵素
調製物を含有する反応混合液をインキュベートすること
を含むアルデヒド、ケトンまたはカルボン酸を対応する
基質から生産する製造方法に関する。

【００１６】本発明の更に他の一面は、上記に定義する
組換え酵素調製物とL-ソルボースおよび/またはD-ソル
ビトールを含有する反応混合液をインキュベートするこ
とを含む２-ケト-L-ギュロン酸の製造方法に関する。

【００１７】上述のように２-ケト-L-ギュロン酸の製造
方法に効果的であり、該製造方法により得られる２-ケ
ト-L-ギュロン酸が当技術分野で既知の方法によりビタ
ミンC（L-アスコルビン酸）に変換されることを特徴と
する２-ケト-L-ギュロン酸からのビタミンCの製造方法
を提供することも本発明の課題である。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明に記述されている
AADH遺伝子は上述のように種々のアルコールおよびアル
デヒドの酸化を触媒することが可能なAADH酵素をコード
している。具体的には、グルコノバクターに存在する固
有のAADH酵素遺伝子をクローン化し、発現させた。当業
者であれば、本発明の知見に基づき、グルコノバクター
に加えて他のAADH酵素遺伝子の供給源も見出すことが可
能である。

【００１９】特定の好ましいグルコノバクター オキシ
ダンス株は、DSM番号4025の下、「Deutsche Sammlung v
on Mikroorganismen in Gottingen(ドイツ）」に寄託さ
れている。

【００２０】更に、本菌株の継代培養株は、寄託番号FE
RM BP-3812として、日本工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託されている。ヨーロッパ特許出願公開第0278
477号に本菌株の性質が開示されている。

【００２１】本発明で利用されるAADH遺伝子および組換
え微生物は以下の工程で取得できる： （１）コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイ
ブリダイゼーション、PCRクローニング、ウェスタンブ
ロット分析、サザンブロットハイブリダイゼーション等
の手法による染色体DNAからのAADH遺伝子のクローニン
グ （２）該AADH遺伝子の常法による塩基配列決定およびAA
DH遺伝子を含有しそれを効率良く発現する組換え発現ベ
クターの構築 （３）形質転換、形質導入、接合伝達およびエレクトロ
ポレーションによる組換え発現ベクターまたは染色体上
に組換えAADH遺伝子を有する組換え微生物の構築。

【００２２】本発明の上記見地に応用可能な材料および
技術を以下のように詳細に例示する。

【００２３】全染色体DNAは当業者に周知の方法（マー
マー(Marmaur) J., J. Mol. Biol. 3巻、208頁、1961)
により精製できる。次に目的遺伝子を有する菌株の遺伝
子ライブラリーは上記染色体DNAおよび以下に詳細に述
べられるベクターを用い構築可能である。AADHをコード
する遺伝子は、以下の方法で染色体DNAからプラスミド
またはファージどちらのベクターにもクローン化可能で
ある。

【００２４】１）精製酵素の部分アミノ酸配列を決定
し、その配列情報に従ってオリゴヌクレオチドを合成
し、遺伝子ライブラリーから目的の遺伝子をサザンブロ
ットハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼ
ーション、またはプラークハイブリダイゼーションによ
り選択する。

【００２５】２）上述のように合成したオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応(P
CR)により所望の遺伝子の部分配列を増幅し、そのPCR生
成物をプローブとして用い遺伝子ライブラリーから目的
の完全長の遺伝子をサザンブロットハイブリダイゼーシ
ョン、コロニーハイブリダイゼーション、またはプラー
クハイブリダイゼーションにより選択する。

【００２６】３）たとえば「Methods in Enzymology、7
3巻、46頁、1981」に述べられているような前述の方法
で所望の酵素蛋白質に対する抗体を調製し、ウェスタン
ブロット分析を含む免疫学的分析により所望のポリペプ
チドを発現するクローンを選択する。

【００２７】４）所望の酵素の一つに対する相同体（ho
mologs)のアミノ酸配列を整列し、相同体間で共通のア
ミノ酸配列を選択し、その共通配列をコードするオリゴ
ヌクレオチドを合成し、そのオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして用いるPCRにより所望の遺伝子部分配列を
増幅し、上記２）の方法で述べた完全配列を選択する。

【００２８】所望の遺伝子の塩基配列はM13ファージを
用いるダイデオキシチェインターミネーション法（サン
ガー(Sanger) F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、74
巻、5463〜5467頁、1977）のような公知の方法で決定で
きる。

【００２９】必要に応じて、このように決定された塩基
配列情報を（使用コドンを考慮して）利用することによ
り、進化的に分岐したアルコールおよび/またはアルデ
ヒド脱水素酵素をコードする遺伝子を、該塩基配列から
推定されるアミノ酸配列に従って合成されたプローブを
用いるコロニーハイブリダイゼーションまたはサザンブ
ロットハイブリダイゼーションにより、または該情報に
より合成されたプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反
応(PCR)により、異種の生物からも単離可能である。

【００３０】所望の遺伝子、すなわち本発明のDNA配列
を効率良く発現するために、種々のプロモーターを使用
することが可能である。たとえば、該遺伝子自身のプロ
モーターや、Tn5(D. E. Berg, C. M. Berg, 1983, Bio/
Technology 1巻、417〜435頁)のカナマイシン耐性遺伝
子、pBR322のアンピシリン耐性遺伝子のような抗生物質
耐性遺伝子のプロモーター、大腸菌(Escherichia coli)
のベータガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター(la
c)、trp、tac、trcプロモーター、ラムダファージのプ
ロモーターおよび大腸菌、シュードモナス プチダ(Pseu
domonas putida)、アセトバクター キシリナム(Acetob
acter xylinum)、アセトバクター パスチュリアヌス(A
cetobacter pasteurianus）、アセトバクター アセチ
(Acetobacter aceti）、アセトバクター ハンゼニイ(A
cetobacter hansenii）およびグルコノバクター オキ
シダンス等の細菌を含む微生物、哺乳動物細胞および植
物細胞を含む宿主中で機能しうるいずれのプロモーター
も使用可能である。

【００３１】さらに遺伝情報をコードする配列が導入さ
れる宿主細胞中で機能可能なシャインダルガノ(SD)配列
（たとえばAGGAGG等で、宿主細胞中で機能しうる天然お
よび合成配列も含む）および転写終結因子（宿主細胞中
で機能しうる天然および合成配列を含む逆位反復配列)
のような他の制御因子も上述のプロモーターとともに使
用することができる。

【００３２】ペリプラズムに局在するポリペプチド(AAD
H)の発現のためには、通常15〜50アミノ酸残基を含み全
体的に疎水性であるシグナルペプチドが不可欠である。
シグナルペプチドをコードするDNAは宿主細胞中で機能
しうるものであればどのような天然配列でも合成配列で
もよい。

【００３３】多様な宿主／クローニングベクターの組み
合わせを二重鎖DNAのクローニングに使用できる。クロ
ーニングベクターは一般的に複製起点、制御因子、マル
チクローニング部位を含むクローニング部位、およびア
ンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ストレ
プトマイシン、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン等
の抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーを含むプラ
スミドまたはファージである。

【００３４】大腸菌中での本発明のDNA配列の発現のた
めの好ましいベクターは、pBR322またはpUC18、pBluesc
riptIIを含むその誘導体、pACYC177、pACYC184(J. Bact
eriol.、134巻、1141〜1156頁、1978)およびその誘導
体、ならびにRK2、RSF1010のような広宿主域プラスミド
から誘導されるベクターのような大腸菌中で通常使用さ
れるどのようなベクターからも選択できる。G.オキシダ
ンスDSM番号4025を含むグルコノバクターおよびP.プチ
ダ中での本発明のDNA配列の発現のための好ましいベク
ターは、大腸菌のような好ましいクローニング宿主と同
様、グルコノバクターおよび／またはP.プチダ中で複製
できるどのようなベクターからも選択できる。好ましい
ベクターは、pVK102のようなコスミドベクターとその誘
導体、およびRSF1010とその誘導体、ならびにグルコノ
バクターで機能する複製起点および大腸菌で機能するも
う一つの複製起点を有するベクターのような広宿主域ベ
クターである。ベクターのコピー数および安定性はクロ
ーン化遺伝子の安定で効率よい発現のため、およびクロ
ーン化遺伝子を有する宿主細胞の効率よい培養のために
注意深く考慮すべきである。Tn5のような転位因子を含
むDNA分子も、本発明のDNA配列を好ましい宿主に、特に
染色体上に、導入するベクターとして使用可能である。
本発明の所望のDNA配列と共に、好ましい宿主から単離
されたどのようなDNAを含むDNA分子も、好ましい宿主
に、特に染色体上に、本発明の所望のDNA配列を導入す
るのに有用である。そのようなDNA分子は形質転換、形
質導入、接合伝達またはエレクトロポレーションにより
好ましい宿主に導入することが可能である。

【００３５】使用可能な宿主としては、微生物、哺乳動
物細胞および植物細胞等が挙げられる。好ましい微生物
としては、大腸菌、P.プチダ、A.キシリナム、A.パスチ
ュリアヌス、A.アセチ、A.ハンゼニイ、G.オキシダンス
および組換えAADHを生産可能ないずれのグラム陰性細菌
でもよい細菌が挙げられる。該微生物の機能的同等株、
継代培養株、変異株および変種も本発明に使用すること
が可能である。好ましい株は、大腸菌 K12株およびその
誘導株、P.プチダまたはG.オキシダンス DSM番号4025株
である。

【００３６】機能的なAADHをコードする本発明のDNA配
列を用い、当技術分野で周知の方法を用い上述の宿主中
で機能することが可能なプロモーターやリボゾーム結合
部位のような制御領域を有する適当なベクターに連結す
ることにより、発現プラスミドを産出する。そのような
組換え発現ベクターの構造を具体的に図１、２、４およ
び１０に示す。

【００３７】組換え発現ベクターを有する組換え微生物
を構築するためには、形質転換、形質導入、接合伝達
（フィリップゲンハート(Philipp Genhardt)ら、「一般
的分子細菌学に関する方法(Methods for general and m
olecular bacteriology)、14および15章、American Soc
iety for Microbiology、1994)およびエレクトロポレー
ションを含む種々の遺伝子導入方法を使用することが可
能である。組換え体を作成する方法としては、分子生物
学の分野で周知の方法の中から選択して使用できる。通
常の形質転換系は、大腸菌、シュードモナスおよびアセ
トバクターにおいて使用できる。形質導入系は、大腸菌
に使用できる。接合伝達系は、グラム陽性菌および大腸
菌、P.プチダおよびG.オキシダンスを含むグラム陰性菌
において広く使用できる。好ましい接合伝達方法は、国
際公開公報89/06688号に開示されている。接合伝達は、
液体培地中または固体培地表面において起こりうる。好
ましい受容菌は、適当な組換え発現ベクターを用い活性
を有するAADHを生産しうる大腸菌、P.プチダおよびG.オ
キシダンスから選択される。２KGA生産のための好まし
い受容菌は、G.オキシダンスDSM番号4025である。接合
伝達の受容菌には、通常選択マーカーが付与される。た
とえばナリディキシン酸またはリファンピシンに対する
耐性が通常選択される。

【００３８】本発明で提供されるAADHは、アルコールお
よび/またはアルデヒドの酸化を触媒し、該当する基質
からアルデヒド、ケトンまたはカルボン酸を生産でき
る。更に具体的には、本発明で提供されるAADHは、L-ソ
ルボースを酸化してL-ソルボソンを経由し２KGAを生成
する反応および/またはD-ソルビトールを酸化してL-ソ
ルボースを生成する反応を触媒することができる。更に
具体的には、本発明で提供されるAADHは、アミノ酸配列
が配列番号5、６、７および８で各々示される酵素A、酵
素 A'、酵素 A"および酵素 Bを含んでいる。

【００３９】塩基配列が配列番号１、２、３および４で
各々示される遺伝子で、その遺伝子がアミノ酸配列が配
列番号5、６、７および８で各々示されるポリペプチド
をコードする酵素 A、酵素 A'、酵素 A"および酵素 B遺
伝子は、G.オキシダンス株DSM番号4025から取得するこ
とができる。

【００４０】本発明で提供される酵素 A、酵素 A'、酵
素 A"および酵素 Bを含むAADHは、別個に、適当な生物
を培養し、その細胞を破砕し、その破砕された細胞の無
細胞抽出物、好ましくは微生物の可溶性画分から単離精
製することにより調製できる。

【００４１】本発明で提供される組換え生物は、好気的
条件下適当な栄養分を補足した水性培地中で培養するこ
とができる。該培養はpH約4.0から9.0の範囲、好ましく
はpH約6.0から8.0の範囲で行うことができる。培養期間
は、使用するpH、温度、栄養培地に応じて変わるが、通
常2から5日が好ましい結果をもたらす。培養を行うのに
好ましい温度範囲は約13℃から45℃、好ましくは18℃か
ら42℃である。

【００４２】培養培地として通常必要な栄養分は、同化
可能な炭素源、消化可能な窒素源、無機物質、ビタミン
類、微量元素および他の生育促進因子などである。同化
可能な炭素源としては、グリセロール、D-グルコース、
D-マンニトール、D-フルクトース、D-アラビトール、D-
ソルビトールおよびL-ソルボースなどが使用できる。

【００４３】酵母エキス、肉エキス、ペプトン、カゼイ
ン、コーンスティープリカー、尿素、アミノ酸、硝酸
塩、アンモニウム塩などの種々の有機または無機物質を
窒素源として使用できる。無機物質としては、硫酸マグ
ネシウム、リン酸カリウム、塩化第一鉄、塩化第二鉄、
炭酸カルシウムなどが使用できる。

【００４４】本発明に係る組換え酵素調製物において
は、[1] 配列番号:５、配列番号:６、配列番号:７およ
び配列番号:８により同定されるポリペプチド、並びに
配列番号:５、配列番号:６、配列番号:７および配列番
号:８により同定されるポリペプチドの間のキメラ組換
え酵素、並びに一つまたはそれ以上のアミノ酸残基の付
加、挿入、欠失および／または置換を含む上記で同定さ
れるポリペプチドの機能的誘導体からなる群より選択さ
れ、該酵素ポリペプチドがアルコールおよび／またはア
ルデヒド脱水素酵素活性を有する、一つまたはそれ以上
の酵素ポリペプチドを含む、アルコールおよび／または
アルデヒド脱水素酵素活性を有する組換え酵素調製物で
あることを特徴とする。

【００４５】また、本発明に係る組換え酵素調製物にお
いては、[2] ポリペプチドが、酵素A/B1、酵素 A/B2、
酵素 A/B3、酵素 B/A1、酵素 B/A2、酵素 B/A3、酵素 s
A2、酵素 sA21、酵素 sA22、酵素 sBおよびそれらの機
能的誘導体のキメラ酵素である、前記[1]に記載の組換
え酵素調製物であることを特徴とする。

【００４６】また、本発明に係る組換え酵素調製物にお
いては、[3] 酵素ポリペプチドが、ホモ二量体および／
またはヘテロ二量体の形態で存在する、前記[1]または
[2]に記載の組換え酵素調製物であることを特徴とす
る。

【００４７】また、本発明に係るDNA分子においては、
[4] 上記[1]または[2]で定義されるポリペプチドをコー
ドするDNA分子であることを特徴とする。

【００４８】また、本発明に係るDNA分子においては、
[5] 直鎖状もしくは環状DNAまたは染色体上での挿入DNA
断片のいずれかの形態で存在する、前記[4]に記載DNA分
子であることを特徴とする。

【００４９】また、本発明に係る組換え発現ベクターに
おいては、[6] 上記[4]または[5]のいずれかで定義され
る一つまたはそれ以上のDNA分子を含む、組換え発現ベ
クターであることを特徴とする。

【００５０】また、本発明に係る組換え発現ベクターに
おいては、[7] DNA分子が、一つまたはそれ以上の遺伝
子制御配列に機能的に結合しており、適当な宿主細胞に
おいて上記[1]〜[3]のいずれかに記載の酵素ポリペプチ
ドを発現可能である、前記[6]に記載の組換え発現ベク
ターであることを特徴とする。

【００５１】また、本発明に係る組換え発現ベクターに
おいては、[8] pSSA102R、pSSA'101R、pSSA"102、pSSB1
03R、pSSAp-B、pSSA/B101R、pSSA/B102R、pSSA/B103R、
pSSB/A101R、pSSB/A102R、pSSB/A103R、pSSsA2、pSSsA2
1、pSSsA22およびpSSsBからなる群より選択される、前
記[7]に記載の組換え発現ベクターであることを特徴と
する。

【００５２】また、本発明に係る組換え生物において
は、[9] 上記[6]〜[8]のいずれかに記載の組換え発現ベ
クターまたは上記[4]もしくは[5]のいずれかで定義され
る一つまたはそれ以上のDNA分子を有する、組換え生物
であることを特徴とする。

【００５３】また、本発明に係る組換え生物において
は、[10] 宿主細胞が、微生物、哺乳動物細胞および植
物細胞からなる群より選択される、前記[9]に記載の組
換え生物であることを特徴とする。

【００５４】また、本発明に係る組換え生物において
は、[11] 宿主細胞が、大腸菌(Escherichia coli)、シ
ュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)、アセトバ
クターキシリナム(Acetobacter xylinum)、アセトバク
ター パスチュリアヌス(Acetobacter pasteurianu
s）、アセトバクター アセチ(Acetobacter aceti）、
アセトバクター ハンゼニイ(Acetobacter hansenii）
およびグルコノバクター オキシダンス（Gluconobacte
r oxydans）等の細菌からなる群より選択される微生物
である、前記[9]または[10]に記載の組換え生物である
ことを特徴とする。

【００５５】また、本発明に係る組換え生物において
は、[12] 宿主細胞が、グルコノバクター オキシダン
ス[DSM番号４０２５]である、前記[11]に記載の組換え
生物であることを特徴とする。

【００５６】また、本発明に係る組換え酵素調製物の製
造方法においては、[13] 上記[10]〜[12]のいずれかで
定義される組換え生物を適当な培地で培養し、組換え酵
素を回収することを含む、前記[1]、[2]または[3]で定
義されるアルコールおよび／またはアルデヒド脱水素酵
素活性を有する組換え酵素調製物の製造方法であること
を特徴とする。

【００５７】また、本発明に係るアルデヒド、ケトンま
たはカルボン酸生成物の対応する基質からの製造方法に
おいては、[14] 上記[10]〜[12]のいずれかで定義され
る組換え生物の生化学的反応により基質を生産物に変換
することを含む、アルデヒド、ケトンまたはカルボン酸
生成物を対応する基質から製造する方法であることを特
徴とする。

【００５８】また、本発明に係るL-ソルボースおよび／
またはD-ソルビトールからの２-ケト-L-ギュロン酸の製
造方法においては、[15] 上記[10]〜[12]のいずれかで
定義される組換え生物の生化学的反応によりL-ソルボー
スおよび／またはD-ソルビトールを２-ケト-L-ギュロン
酸に変換することを含む、L-ソルボースおよび／または
D-ソルビトールから２-ケト-L-ギュロン酸を製造する方
法であることを特徴とする。

【００５９】また、本発明に係るアルデヒド、ケトン、
またはカルボン酸生成物の対応する基質からの製造方法
においては、[16] 上記[1]〜[3]のいずれかで定義され
る組換え酵素調製物および基質を含有する反応混合液を
インキュベートすることを含む、アルデヒド、ケトンま
たはカルボン酸生成物を対応する基質から製造する方法
であることを特徴とする。

【００６０】また、本発明に係る２-ケト-L-ギュロン酸
の製造方法においては、[17] 上記[1]〜[3]のいずれか
で定義される組換え酵素調製物とL-ソルボースおよび／
またはD-ソルビトールとを含有する反応混合液をインキ
ュベートすることを含む、２-ケト-L-ギュロン酸の製造
方法であることを特徴とする。

【００６１】また、本発明に係る２-ケト-L-ギュロン酸
からのL-アスコルビン酸の製造方法においては、[18]
上記[15]または[17]に記載の製造方法が達成され、該製
造方法により得られる２-ケト-L-ギュロン酸が、当技術
分野で既知の方法によりL-アスコルビン酸に変換される
ことを特徴とする、２-ケト-L-ギュロン酸からのL-アス
コルビン酸の製造方法であることを特徴とする。

【００６２】

【発明の実施の形態】以下に特にP.プチダから得られた
精製組換えAADH酵素の性質およびその生産方法を示す。

【００６３】（１） 酵素活性 本発明のAADHは以下の反応式に従い電子受容体存在下D-
ソルビトール、L-ソルボースおよびL-ソルボソンを含む
アルコールおよびアルデヒドの酸化を触媒する。 アルコール＋電子受容体 → アルデヒド＋還元型電子受
容体 アルコール＋電子受容体 → ケトン＋還元型電子受容体 アルデヒド＋電子受容体 → カルボン酸＋還元型電子受
容体 糖アルコール＋電子受容体 → アルドース＋還元型電子
受容体 糖アルコール＋電子受容体 → ケトース＋還元型電子受
容体 アルデヒドケトース＋電子受容体 → ケトカルボン酸＋
還元型電子受容体 カルボン酸＋電子受容体 → ケトカルボン酸＋還元型電
子受容体 酵素は分子酸素を受容体として用いない。受容体とし
て、２、６-ジクロロフェノールインドフェノール(DCI
P)、フェナジンメソサルフェート(PMS)、ウェスターブ
ルー、フェリサイアナイド、補酵素Qまたはチトクロー
ムcが使用できる。

【００６４】酵素活性１単位は１分間あたり1μモルのD
CIPの還元を触媒する酵素量と定義した。DCIPのpH 8.0
における分子吸光係数は15 mM^-1とした。標準反応混合
液(1.0 ml)は0.1 mM DCIP、1 mM PMS、2〜125 mM 基
質、50 mM Tris-リンゴ酸-NaOH緩衝液(pH 8.0)および10
μlの酵素液を含む。対照としては上記の組成から基質
を除いたものを用いた。

【００６５】（２） AADHの性質 ａ） 酵素反応の基質特異性と生成物 酵素 A、酵素 A'、酵素 A"および酵素 Bは８種の基質、
n-プロパノール、イソプロパノール、D-グルコース、D-
ソルビトール、L-ソルボソン、D-マンニトール、L-ソル
ボースおよびD-フルクトース、を用いた上記（１）にお
けるそれらの基質特異性によって特徴づけられる。結果
を表１に示した。

【００６６】

【表１】 酵素 Bはn-プロパノールおよびイソプロパノールに対し
て比較的低い反応性を示したが、D-グルコースおよびD-
マンニトールに対して高い反応性を示した。酵素 A、A'
およびA"は、D-グルコースおよびD-マンニトールに対し
て低い反応性を示したが、n-プロパノールおよびイソプ
ロパノールに対して高い反応性を示した。これら三酵素
は酵素 A'がL-ソルボースおよびD-フルクトースに対し
てきわめて低い反応性を示した以外には、類似した基質
特異性パターンを示した。

【００６７】酵素 A、酵素 A'、酵素 A"または酵素 Bを
用いた反応における基質からの生成物は、既知物質を用
いた薄層クロマトグラフィー(TLC)および／または高速
液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析された。酵素
A、酵素 A'、および酵素 A"（以後Aグループとする）
はD-ソルビトール、L-ソルボース、L-ソルボソン、D-マ
ンニトールおよびD-フルクトースをそれぞれL-ギュロー
スを伴うD-グルコース、２KGAを伴うL-ソルボソン、２K
GA、D-マンノース、および２-ケト-D-グルコン酸(２KD)
に変換した。酵素 B（以後Bグループとする）はD-グル
コース、D-ソルビトール、L-ソルボソン、D-マンニトー
ル、L-イドース、グリセロール、D-グルコン酸、D-マン
ノン酸をそれぞれD-グルコン酸、L-ソルボース、２KG
A、D-フルクトース、L-イドン酸、ジヒドロキシアセト
ン、5-ケト-D-グルコン酸および5-ケト-D-マンノン酸に
変換した。L-ソルボソンに対する反応性における類似性
から、D-グルコソンは上記すべてのAADHにより２KDに変
換されうる。事実、Aグループ酵素はその直接生成物がD
-グルコソンと考えられるD-フルクトースから２KDを生
成した。これらすべての酵素はD-ソルビトールやD-マン
ニトールのような糖アルコールを含むアルコール、なら
びにD-グルコースのようなアルドース、およびL-ソルボ
ソンのようなケトースを含むアルデヒドの両者に活性を
示した。

【００６８】b） 至適pH 表２に示すように、すべての酵素はそれらの至適点をpH
8.0〜8.5に有する。酵素 A"とBは、酵素 AとA'に比較
して低pH側に比較的広い至適pH範囲を持つ。

【００６９】

【表２】 ｃ） pH安定性 酵素 A、酵素 A'、酵素 A"および酵素 Bを様々なpH値の
緩衝液中３時間、25℃でインキュベートした後にその残
存活性を測定し、pH 8.0でインキュベートしなかった値
に対する相対活性として表示した。

【００７０】表３に示すように酵素 A、A、A" およびB
はpH 6から9の範囲で安定であった。

【００７１】

【表３】 ｄ） 温度安定性 表４に各酵素の4、20、30、40、50および60℃での５分
間処理後の残存活性を示す。

【００７２】

【表４】 ｅ） 金属イオンおよび阻害剤の影響 種々の金属及び阻害剤により酵素を処理した後の残存活
性を表５に示す。MgCl₂とCaCl₂はほぼ酵素に対して無影
響であったが、他の金属イオン、特にCuCl₂はその反応
性に強い影響をおよぼした。EGTAおよびEDTAは顕著に酵
素 A、A'およびA"を阻害した。しかし、酵素 BはAグル
ープ酵素群よりもEGTAとEDTAによる阻害が少なかった。

【００７３】

【表５】 ｆ） 分子量とサブユニット P.プチダ接合伝達体から精製された酵素 A、A'、A"およ
びBは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動(SDS-PAGE)での計測によると、分子量約64,0
00、62,500、62,500および60,000のそれぞれの単一種ユ
ニットを含む。酵素 A、A'、A"およびB遺伝子／DNA配列
類を同一宿主内で発現させた場合、酵素A、A'、A"およ
びBのユニット間のいかなる組み合わせでもヘテロ二量
体を形成しうる。

【００７４】ｇ） N-末端アミノ酸配列 成熟酵素 AおよびBのN-末端配列を以下に示す。 酵素 A ：Gln-Val-Thr-Pro-Val-Thr---- 酵素 A" ：ブロック化されたN-末端残基 酵素 B ：Gln-Val-Thr-Pro-Ile-Thr-Asp-Glu-Leu-Leu-A
la---- 成熟酵素 A'のN-末端は標品の純度不足のため決定され
ていない。

【００７５】（３） AADHの生産 細胞は遠心分離または濾過により発酵培養液より回収さ
れる。回収された細胞を緩衝溶液中に懸濁し、ホモジナ
イザー、超音波または溶菌酵素処理などによって破砕し
細胞の破砕溶液を得る。

【００７６】AADHは破砕された細胞の無細胞抽出液か
ら、好ましくは微生物の可溶性画分から硫安沈殿、透
析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーの
様な一般的蛋白質精製法により、単離精製される。

【００７７】（４） 酵素反応 酵素反応はTris-HCl緩衝液、燐酸緩衝液等の緩衝液中
で、例えばDCIP、PMS、ウェスターブルー、フェリサイ
アナイド、補酵素Q、チトクロームc等の電子受容体存在
下、約10℃から約50℃、好ましくは20℃から40℃、の温
度においてpH値約6.0から約9.0においてで実施される。
反応混合液中の基質の濃度は他の反応条件により変化さ
せうるが、一般的に約1〜200 g/l、最も好ましくは1〜1
00 g/lである。

【００７８】本酵素反応には、AADHは適当な担体を用い
る固定化状態においても使用できる。当技術分野におい
て一般に知られているいずれの酵素固定化法も使用可能
である。例えば、酵素を官能基を有する樹脂膜、顆粒な
どに直接結合させてもよく、または官能基を有する架橋
化合物、例えばグルタルアルデヒドを介して樹脂に結合
させてもよい。

【００７９】本発明で提供されるポリペプチドには、酵
素 A、酵素 A'、酵素 A"および酵素Bを含むAADH遺伝子
から調製される誘導体、および遺伝子コドンの縮退から
生ずる遺伝子相同体またはAADH遺伝子に相当な相同性の
ある天然、合成または組換え体のいずれの遺伝子配列か
ら調製される関連誘導体も含まれる。本誘導体は、配列
番号:５、配列番号:６、配列番号:７および配列番号:８
により同定されるポリペプチドと同等の機能を有し、そ
れが一つまたはそれ以上のアミノ酸残基の付加、欠失お
よび/または置換を含み、その該酵素ポリペプチドがア
ルコールおよび/またはアルデヒド脱水素酵素活性を有
する変異体でもよい。これらの変異遺伝子は、AADH遺伝
子を紫外線、エックス線、ガンマ線を照射することによ
り、または亜硝酸、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグ
アニジン(NTG)または他の適当な変異剤で処理すること
により、または自然変異を起こした株を分離することに
より、または当技術分野において周知の標準的インビト
ロ変異処理をすることにより作成することが可能であ
る。

【００８０】AADHポリペプチドの誘導体には、また配列
番号:５、配列番号:６、配列番号:７および配列番号:８
により同定されるポリペプチドの間のキメラ組換え酵素
が含まれる。このキメラ体は、図６に示されるように制
限酵素とT4-リガーゼを用い、遺伝子間で共通の制限酵
素部位で本発明のDNA配列の２つまたはそれ以上のDNA配
列を試験管内で組換えることにより、または図8に示さ
れるように二遺伝子間で共通の塩基配列の位置での２つ
のAADH遺伝子間の生体内組換えにより調製することがで
きる。

【００８１】AADHポリペプチドの誘導体には、またAADH
ポリペプチドのアミノ末端、カルボキシル末端および／
または内部に、ポリペプチドが付加されたポリペプチド
も含まれる。カルボキシル末端にG.オキシダンスDSM番
号4025のチトクロムcポリペプチド（17〜18 kDa)が融合
した酵素 B、酵素 A/B25および酵素 A/B3は、D-ソルビ
トールからL-ソルボースへの変換において実施例４に述
べられている酵素 Bと同様のAADH活性を示し、L-ソルボ
ースから２KGAへの変換において実施例14に述べられて
いる酵素 A/B25および酵素 A/B3と同様のAADH活性を示
した。このように本発明で提供されるAADHに、AADH活性
を維持したまま、かなり長いポリペプチドを付加または
挿入することが可能である。

【００８２】上述のAADHポリペプチドの誘導体は、所望
の基質特異性、基質への高親和性、阻害物質への低親和
性、温度および/またはpHに対する高安定性、および高
触媒速度のような好ましい性質を示す可能性が高い。以
下の実施例に述べられているように、該誘導体は目的の
生産物の生産性を改良することが可能であると思われ
る。

【００８３】本発明の酵素ポリペプチドは、通常二量体
の形態で生産される。このような二量体には、酵素 A、
A'、A"、またはBもしくはキメラを含むそれらの誘導体
のホモ二量体および上述の二つの異なった酵素ポリペプ
チドを含むヘテロ二量体が含まれている。本発明の組換
え酵素調製物はまた、一つまたはそれ以上の該ホモ二量
体および/またはヘテロ二量体を含んでいる。

【００８４】本発明で提供される組換え生物は、アルコ
ールおよび/またはアルデヒド脱水素酵素活性を有するA
ADHの組換え酵素調製物の生産に非常に有用である。該
組換え生物は、該組換え酵素調製物を利用することによ
る、および該組換え生物を利用することによるアルデヒ
ド、カルボン酸、ケトン、特に２KGAの生産にもまた有
用である。

【００８５】該組換え生物を用いる２KGAの生産は、上
述の培地および培養条件を用いる発酵により実施され得
る。２KGAの生産は、上述の組換え生物を大腸菌、P.プ
チダ、B.メガテリウムのような共存生物とともに用いて
も行い得る。

【００８６】

【実施例】

[実施例１] AADH遺伝子のクローニング （１）G.オキシダンスDSM番号4025のゲノムライブラリ
ーの構築 染色体DNAは以下のように調製した。G.オキシダンスDSM
番号4025は、20 mlのNS2培地[5.0% D-マンニトール、0.
25% MgSO₄・7H₂O、1.75% コーンスティープリカー（cor
n steep liquor: CSL)、5.0% パン酵母 (オリエンタル
酵母社製)、0.5% CaCO₃、0.5％ 尿素（別滅菌)、2.0%
寒天(滅菌前pH7.0)を含む寒天平板上で27℃で３日間培
養した。この寒天平板から細胞を集め、10 mlの1 mM ED
TAを含む10mM Tris-HCl(pH8.0)緩衝液で洗浄し、5 mlの
20 mM EDTAを含む10mM Tris-HCl(pH8.0)緩衝液に懸濁し
た。この細胞懸濁液を終濃度400μg/mlのリゾチーム(シ
グマケミカルズ社製(Sigma Chemicals))で37℃、30分間
処理し、次にプロナーゼ(400単位)で37℃、30分間処理
し、1%SDS で37℃、1時間処理した。染色体DNAは、マニ
アティス(Maniatis)らにより述べられている方法「分子
クローニング:研究室マニュアル(Molecular cloning: a
laboratory manual) Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N. Y., (1982)」に従いフェノー
ルとRNase A(ベーリンガーマンハイム社製(Boeheringer
Mannheim))で処理した。染色体DNA(200 μg)は、168単
位のSalI(ベーリンガーマンハイム社製(Boeheringer Ma
nnheim))で37℃、5〜90分間処理した。この処理で得ら
れた15〜35 kbの部分消化断片を分取アガロースゲル電
気泳動(アガロース0.7%)で単離した。単離は目的断片を
含むゲル断片を切り出し、その中のDNAをゲルから40 mM
Tris-酢酸と2 mM EDTAを含むTAE緩衝液中へ電気的に溶
出した。このようにして40 μgの目的DNAが得られた。
並行して、8 μgのコスミドベクターpVK102(ATCC 3715
8)をSalIで完全消化し、牛大腸アルカリフォスファター
ゼ(ベーリンガーマンハイム社製(Boeheringer Mannhei
m))で供給会社の指示に従い処理した。0.4 μgのpVK102
と15〜35 kbのSalI断片(0.2〜2 μg)をライゲーション
キット(宝酒造社製）を用い26℃で10分間処理した。結
合したDNAを今度は、供給会社（アマーシャム社(Amersh
am))の指示した方法に従って、インビトロパッケージン
グ(結合したDNAをファージコート蛋白質の部品と混合す
る）に使用した。このようにして生じたファージ顆粒を
大腸菌 ED8767[ミューレイ(Murray）, N. E., W. J. ブ
ランマー(Brammer)およびK. ミューレイ(Murray), Mol.
Gen. Genet.、150巻、53〜61頁、(1977)]に感染させ
た。約3,000個のカナマイシン耐性(Kmr)テトラサイクリ
ン感受性(Tcs)のコロニーが得られ、テストした24コロ
ニー全てが挿入DNAを有していた。その平均鎖長は26.5
kbであった。もう一つの55,000クローンを含むG.オキシ
ダンスDSM番号4025のコスミドライブラリーは、上述の
方法とほぼ同様にしてEcoRIで部分消化したG.オキシダ
ンスDSM番号4025の染色体DNAをコスミドpVK100のEcoRI
部位に挿入して構築した。テストした24コロニー全てが
平均鎖長27 kbの挿入断片を有していた。

【００８７】これら２種類の大腸菌 ED8767中に作成さ
れたコスミドライブラリーを、大腸菌 ED8767ライブラ
リーから抽出された組換えプラスミドDNA混合物を用い
て、大腸菌 S17-1[Tra+, Bio/Technology、1巻、784〜7
91頁、(1983)]へ移した。約4,000株の大腸菌 S17-1のKm
r形質転換株を爪楊枝で拾い上げ、各々別個に50 μg/ml
のカナマイシンを添加した10 g/lのバクトトリプトン
(ディフコ社製(Difco))、5g/lの酵母エキス(ディフコ社
(Difco))、5 g/lのNaClを含むLB培地100 μlを含むマイ
クロタイタープレート中で37℃で培養した後、15%グリ
セロール存在下、-80℃で大腸菌 S17-1中のコスミドラ
イブラリーとして保存した。

【００８８】この様に、G.オキシダンス DSM番号4025の
SalI-およびEcoRI-コスミドライブラリーが大腸菌S17-1
中に作成された。このライブラリーから各々1,400クロ
ーンずつが、別々に大腸菌 S17-1からP.プチダ ATCC218
12へ接合伝達により次のように移された。-80℃でマイ
クロタイタープレート中に保存していた1,400培養物を
融解し、各々の穴に100 μlの新鮮なLB培地を含むマイ
クロタイタープレートにプレート移し換えカートリッジ
(ナンク社製(Nunc))を用いて移し、37℃で一晩培養し
た。ナリディキシン酸耐性(Nalr)を付与されたP.プチダ
ATCC21812は、100mlの2.5%のマンニトール、0.5%の酵
母エキス(ディフコラボラトリー(Difco Laboratorie
s))、0.3%バクトトリプトン(ディフコ(Difco))を含むMB
培地中、30℃で一晩培養した。このP.プチダの培養液50
μlをコスミドライブラリーの培養液を含む1,400の穴
各々に添加した。この1,400の細胞混合液を、プレート
移し換えカートリッジを用いて5% フルクトース、1% 酵
母エキス (ディフコ(Difco))、1%ポリペプトン(大五栄
養社製)、1.8% 寒天を含むFB寒天培地表面に置いたニト
ロセルロースフィルター上にスポットし、27℃で一晩培
養した。ナリディキシン酸は、遺伝子供与体である大腸
菌から接合伝達体を選択するために用いた。フィルター
上に生育した細胞は、別々に50 μg/mlのナリディキシ
ン酸および50 μg/mlのカナマイシンを含有するMB寒天
培地(以下MNK寒天平板と称する）上に移植し、接合伝達
体を選択するために27℃で4日間培養した。この結果得
られたコロニーを上述のようにMNK寒天平板に移植して
精製した。このように1,400株のP.プチダ接合伝達体[G.
オキシダンス DSM番号4025のP.プチダ中での遺伝子ライ
ブラリー]を調製した。

【００８９】（２）G.オキシダンス DSM番号4025のAADH
遺伝子クローンの免疫学的スクリーニング まず、MNK寒天平板上に維持されている350株の接合伝達
体(SalIライブラリー175株、EcoRIライブラリー175株）
を別々に5 mlのMNK培地を含む試験管中で培養した。そ
の各々1.5 mlの培養液から細胞を集菌し、以下のように
ウェスタンブロット解析のための処理に供した。細胞
は、50 μlのLaemmli緩衝液[62.5 mM Tris-HCl(pH6.
8)、10% グリセロール、5% メルカプトエタノール、2%
SDS]に懸濁した。この細胞懸濁液を3分間煮沸し、その1
0 μlの細胞溶菌液をSDS-PAGEに供した。その結果得ら
れた蛋白質バンドを次に40V、200 mAで16時間操作され
る電気ブロット装置(マリソル社製）を用いて、20% メ
タノールを含む2.5 mM Tris-19.2 mM グリシン緩衝液(p
H8.6)中で16時間ニトロセルロースフィルターに電気的
に移した。そのフィルターは、次に20 mM Tris(pH7.
5)、500 mM NaClを含むTBS緩衝液中の3%ゼラチンの中で
1時間処理した。このフィルターを20mM Tris(pH7.5)、5
00 mM NaCl、0.05% Tween 20を含むTTBS緩衝液で軽く洗
浄した後、1% ゼラチンを含むTTBS緩衝液中で1/500に希
釈した抗AADH抗体を含む一次抗体で１時間処理した。こ
の抗AADH抗体は、G.オキシダンス DSM番号4025から精製
したAADH蛋白質をインコンプリートアジュバントと混合
し、その混合物を白兎に２週間間隔で２度インジェクト
し、２度目のインジェクトの１週間後全採血し、その血
清画分を抗AADH抗体として調製した。次に、このフィル
ターをTTBS緩衝液中で５分間ずつ２度洗浄し、1% ゼラ
チンを含むTTBS緩衝液中で1/3,000に希釈した二次抗体
を含む二次抗体（山羊-抗兎IgG-西洋わさびパーオキシ
ダーゼコンジュゲート）溶液で１時間処理した。そのフ
ィルターをTTBS緩衝液中で２度洗浄し、TBS緩衝液中で1
度洗浄した後、Konica Immunostaining HRP Kit IS-50B
(コニカ社製）を用い、青色バンドが観察されるまで供
給会社の推奨する方法に従いフィルターを発色試薬に浸
漬した。実際のスクリーニングには、ウェスタンブロッ
トの一次スクリーニングのために５つの細胞溶菌液を混
合したものを１レーンにのせた。70個の混合液の中で14
個の試料が陽性バンドを示した。その9つの試料が分子
量約64,000の免疫反応性を有する蛋白質を有していた
が、この中の2つの試料のシグナルは弱かった。別の1試
料は分子量約60,000の残りの4試料は分子量約55,000の
免疫反応性を有する蛋白質を有していた。

【００９０】分子量約64,000に強いシグナルを示した7
個の混合試料について、その混合試料中の陽性クローン
を同定するためにその個々の試料をウェスタンブロット
の二次スクリーニングに供した。1混合試料あたり、1陽
性クローンが同定された。得られた7クローンの有する
プラスミドを各々p6E10、p16C8、p16F4、p17E8、p1E2、
p24D4およびp26C3と命名した。制限酵素解析により、p6
E10、p16C8、p16F4およびp17E8の4プラスミドは同じDNA
領域を含み、他の3プラスミドは前者の4プラスミドとは
異なる領域を含むことが明らかになった。

【００９１】（３）コロニーブロットおよびサザンブロ
ットハイブリダイゼーションによるコスミドライブラリ
ーからのAADH遺伝子のスクリーニング 上述の免疫スクリーニングで得られた遺伝子以外のAADH
遺伝子を検索するために、G.オキシダンス DSM番号4025
の大腸菌 ED8767中で構築された全コスミドライブラリ
ー（SalI-およびEcoRI-ライブラリー）を、p24D4の0.9
kb SalI断片とのコロニーおよびサザンブロットハイブ
リダイゼーションによってスクリーニングした。この0.
9 kb SalI 断片とは、G.オキシダンス DSM番号4025から
精製された天然AADH酵素の一つの内部アミノ酸配列、Me
tMetValThrAsnValAspValGlnMetSerThrGlu、に従って合
成されたオリゴヌクレオチドプローブ ATGATGGT(GATC)
AC(GATC)AA(TC)GT とハイブリダイゼーションしたDNA
断片である。その内部アミノ酸配列は、天然AADH酵素消
化後、自動ガス層シークエンサー470A(アプライドバイ
オシステム社製(Applied Biosystems))を用いて決定さ
れたものである。上記コスミドライブラリーの細胞を適
当に希釈し、LK寒天平板に塗抹した。生じたコロニー
は、ナイロンフィルターに転写した後、³²P-標識0.9 kb
SalI断片とのハイブリダイゼーションにより解析し
た。約1%のコロニーが陽性シグナルを示した。SalIライ
ブラリーから41株、EcoRIライブラリーから20株を選択
し、それらを制限酵素解析後、サザンブロット解析に供
した。このスクリーニングで以下のように6種類の異な
るAADH遺伝子関連DNA領域を単離した。4種類は既に単離
していた領域でp24D4、p1E2、p26C3、p17E8が有してお
り、2種類は新規でpSS31およびpSS53と命名された2種類
の別個のプラスミドが有していた。残りのプラスミドpS
S33は、p24D4およびpSS31が有している2領域の両方を有
していた。

【００９２】（４）AADHクローンの免疫学的および酵素
学的解析 p24D4、p1E2、p26C3、pSS31およびp17E8を有するP.プチ
ダの細胞溶菌液のウェスタンブロット解析の結果、これ
らの5クローンは各々分子量約64,000、62,500、62,50
0、60,000および62,000の蛋白質をコードすることが示
された。プラスミドpSS33は、分子量約64,000および60,
000の2種類の免疫反応性を有する蛋白質をコードしてい
た。しかしpSS53は、いかなる免疫反応性を有する蛋白
質もコードしていなかった。

【００９３】各々のクローンの酵素活性(無細胞抽出
液、可溶画分および膜画分)を光学分析により測定し
た。各々のクローンの細胞を5 mlのMB培地を含む試験管
に植菌し、30℃で24時間培養した。その培養液を200 ml
の新鮮なMB培地を含む500 ml容のフラスコに移し、回転
フラスコ培養機上で30℃で24時間培養した。得られた細
胞を6,000 x g 10分間遠心分離により集菌した後、40 m
lの冷緩衝液（50 mM Tris-HCl、pH7.5、5 mM MgCl₂、0.
5 mM フェニルメチルスルフォニルフルオリド)で洗浄
し、同緩衝液に懸濁して5 mlあたり1 g 湿重量細胞濃度
の細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液は、フレンチ
プレス細胞破砕機で二回処理（1,500 kg/cm²)し、得ら
れたホモジネートを6,000 x g 10分間遠心分離し、細胞
破片を除去した。ここで得られた無細胞抽出液(CFE)を1
00,000 x g 60分間遠心分離した。この上清とペレット
を細胞質画分および膜画分として各々集め、以下のPMS-
DCIP分析に供した。酵素反応混合液(1.0 ml)には、100
μM DCIP、1 mM PMS、50 mM Tris-リンゴ酸-NaOH緩衝液
(pH8.0)、基質および酵素(10 μl)が含まれる。基質依
存の600 nmでのDCIPの吸光度の減少を、コントロン社製
(Kontron)の吸光度計UVIKON810を用いて25℃で測定し
た。表６はクローンの無細胞抽出液および可溶画分の酵
素活性のレベルを示している。基質特異性によれば、各
々のプラスミドにコードされている酵素は大きく三つの
グループ、A、B、Cグループに分類された。Aグループは
L-ソルボース、D-ソルビトール、1-プロパノールの酸化
を触媒し、BグループはD-グルコースおよびD-ソルビト
ールの酸化を触媒するが、Cグループは使用した基質に
対し明瞭に検出できる活性を示さなかった。Aグループ
には三種類のタイプA、A'、A"（各々のプラスミドが有
するDNAの物理地図によりお互い区別される）が存在し
ていた。B、Cグループは各々染色体DNAの一領域から由
来する一タイプの蛋白質のみから構成されていた。

【００９４】

【表６】 [実施例２] 塩基配列決定 酵素 A、酵素 A'、酵素 A"および酵素 B遺伝子の塩基配
列は、各々プラスミドp24D4、p1E2、p26C3およびpSS31
を用いてM13mp18およびM13mp19(ベーリンガーマンハイ
ム社製(Boehringer Mannheim))を用いるジデオキシチェ
ーン終結法により行った。各々の遺伝子について一つの
オープンリーディングフレーム(open reading frame、O
RF)が見つかった。これら４遺伝子の塩基配列を、配列
表中に配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番
号:4として示す。またそれら塩基配列から推定されるア
ミノ酸配列を配列番号:５、配列番号:６、配列番号:
７、配列番号:８に示す。酵素 A、酵素 A'、酵素 A"お
よび酵素 B遺伝子のORFは、各々1737、1737、1734およ
び1737 bp長であり、23アミノ酸残基のシグナル配列を
含む579、579、578および579アミノ酸残基をコードして
いる。酵素 A、酵素 A'、酵素A"および酵素 B間のホモ
ロジーを表７に示す。

【００９５】

【表７】 図５は成熟型酵素 A、酵素 B酵素のアミノ酸配列を相互
に比較できるように整列（アライメント）表示してい
る。

【００９６】酵素 A、酵素 A'、酵素 A"および酵素 Bの
ホモロジー検索の結果、A.アセチ(T.イノウエら、J. Ba
cteriol.、171巻、3115〜3122頁）またはA.ポリオキソ
ゲネス(Acetobacter polyoxogenes、T.タマキら、B. B.
A.、1088巻、292〜300頁)のアルコール脱水素酵素およ
びパラコッカス デニトリフィカンス(Paracoccus deni
trificans、N.ハームス(Harms)ら、J. Bacteriol.、169
巻、3966〜3975頁)、メチロバクテリウム オーガノフ
ィラム（Methylobacterium organophilum、S.M.マクリ
ン(Machlin)ら、J. Bacteriol.、170巻、4739〜4747
頁）またはメチロバクテリウム エクストーケンス(Met
hylobacterium extorquens、D. J.アンダーソン(Anders
on)ら、Gene、90巻、171〜176頁)のメタノール脱水素酵
素を含む幾つかのキノ蛋白質(quino-proteins)とは、む
しろ低いホモロジー（いずれのポリペプチド間において
も26〜31%の範囲のホモロジー）を示した。

【００９７】[実施例３] AADH遺伝子のサブクローニン
グ 酵素 A遺伝子は、最初pVK100のEcoRI切断部位に約25 kb
の挿入断片を有するコスミドクローンp24D4としてクロ
ーン化された。次にこの酵素 A遺伝子を、酵素A遺伝子
カセットとして使用するためにサブクローン化した。酵
素 A遺伝子のORFとその上流下流に約500bpの非コード領
域を有する2.7 kbのEcoRV断片を、p24D4からM13mp18中
に単離された3.4 kb NruI断片から切り出しpUC18のHind
III切断部位にHindIIIリンカー (CAAGCTTG)を用いて結
合した。その結果得られたプラスミドをpSSA202と命名
した。次に、酵素 A遺伝子カセット（2.7kb HindIII画
分）をpVK102のHindIII切断部位に挿入してpSSA102Rを
得た。このプラスミドpSSA102Rを実施例1-(1)に述べる
接合伝達方法によりナリディキシン酸耐性のP.プチダ[A
TCC21812]に導入した。このpSSA102Rを有するP.プチダ
の接合伝達体は、50 μg/ml ナリディキシン酸および10
μg/ml テトラサイクリンを含有するMB寒天培地(MNT寒
天培地)上で選択され、ミニ休止菌体反応に供された。2
0 g/lのL-ソルボース、3 g/lのNaCl、10 g/lのCaCO₃お
よび爪楊枝でMNT寒天培地から集菌した細胞を含む反応
混合液（100 μl)を室温で24時間、静かに振とうさせ
た。この反応混合液をTLCで分析して、その生産物が２K
GAであると同定した。一方宿主であるナリディキシン酸
耐性のP.プチダ[ATCC21812]を用いた同様の休止菌体反
応では、２KGAは観察されなかった。

【００９８】酵素 B遺伝子は、最初pVK102のSalI切断部
位に約30 kbの挿入断片を有するコスミドクローンpSS31
としてクローン化された。この酵素 B遺伝子を6.5 kbの
BglII 断片としてpVK101（ATCC37157）のBglII切断部位
にサブクローン化してpSSB102を得た。次に酵素 B遺伝
子をカセットとして使用するためにさらにサブクローン
化した。まず6.5 kbのBglII断片をpUC18のBamHI切断部
位にクローン化し、pSSB202を得た。次にpSSB202から2.
3 kb XhoII断片を切り出した。この2.3 kb XhoII断片
は、酵素 BのORFの他に、120bpの5'-非コード領域およ
び500 bpの3'-非コード領域を含む。この2.3 kb XhoII
断片をクレノウフラグメント(Klenow fragment)での処
理により接着末端を平滑化し、HindIIIリンカーを用い
てpUC18のHindIII切断部位にクローン化してpSSB203を
得た。この酵素 B遺伝子カセット(2.3 kbHindIII断片）
をpVK102のHindIII切断部位に挿入してpSSB103Rを作成
した。このプラスミドpSSB103Rを接合伝達方法によりナ
リディキシン酸耐性のP.プチダ[ATCC21812]に導入し
た。このpSSB103Rを有するP.プチダの接合伝達体は、MN
T寒天培地上で選択され、ミニ休止菌体反応に供され
た。このpSSB103Rを有するP.プチダの接合伝達体は休止
菌体反応において酵素 B活性（D-ソルビトールからL-ソ
ルボースを生成）を示した。酵素 B遺伝子カセットの塩
基配列を決定したところ、上記XhoII断片は、XhoII-Xho
II断片ではなくてXhoII-XhoI断片であることが判明し
た。おそらくXhoIがXhoII酵素標品に混入していたもの
と思われた。

【００９９】酵素 A'および酵素 A"遺伝子は、最初pVK1
02のSalI切断部位に約30 kbの挿入断片を持つp1E2およ
びp26C3のコスミドクローンとして得られ、更に基本的
に上述のようにサブクローン化をおこなった。3.5 kb X
hoII断片中の酵素 A'遺伝子をpVK102のBglII切断部位に
サブクローン化しpSSA'101Rを得た。2.7 kb EcoRV断片
中の酵素 A"遺伝子は、まずM13mp19にサブクローン化し
た後pVK102のHindIIIおよびBglII切断部位の間に再サブ
クローン化しpSSA"102を得た。

【０１００】[実施例４] P.プチダ接合伝達体からのAA
DHの単離と性質 （１） 微生物の培養 酵素 A、A'、A"およびBの遺伝子を含むpVK102コスミド
ベクター(それぞれpSSA102R、p1E2、p26C3およびpSSB10
3R)を持つP.プチダ[ATCC21812]を抗生物質存在下MB培地
で培養した。抗生物質は以下に示すように添加した。pS
SA102R（酵素 A）およびpSSB103R（酵素 B）に対しては
5 μg/mlテトラサイクリンを、p1E2（酵素 A'）およびp
26C3（酵素 A"）に対しては25 μg/ml カナマイシンを
添加した。各々の抗生物質を含んだMB寒天平板培地よ
り、細胞を5 mlの各々の抗生物質を含んだMB培地を含ん
だ１０本の試験管に植菌し30℃で振とう培養した。２日
培養後、細胞を100 mlの同培地を含む500 ml エーレン
マイヤーフラスコ１０本に移植し30℃で振とう培養し
た。１日培養後、以上の種培養を合わせて18 Lの培地を
含んだ30 L ジャーファーメンター（丸菱製）に移植し
攪拌回転数300 rpm、通気量1.0 vvm、30℃で18時間培養
した。細胞を6,000 x g、１０分の遠心操作で回収し、5
mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、0.2 M NaCl、2.5% スクロース
及び0.5 mM PMSFを含む1.5 Lの25 mM Tris-HCl緩衝液
（pH 7.5）で１度洗浄し使用時まで-20℃で保存した。
結果として湿重量で約150 gの菌体を得た。

【０１０１】（２）クローン化された酵素 A、A'、A"お
よびBの精製 酵素 A、A'、A"およびBの精製はほぼ同様のスケールで
同一の方法で行った。すべての操作は特に記載のない場
合4〜10℃で行った。酵素 A、A'、A"およびBの酵素活性
の測定は精製段階を通してそれぞれ、L-ソルボース、n-
プロパノール、n-プロパノールおよびD-グルコースを基
質として、実施例１に述べられた分光学的測定法により
行った。細胞（8〜10 g全蛋白質を含む湿重量で約100 g
の菌体）を融解し、約200 mlの25 mM Tris-HCl緩衝液(p
H 8.0)中に懸濁し、フレンチプレス（1500 kg/cm²）を
２回通過させることにより破砕した。DNAによる溶液の
粘性を軽減するため、DNAase及びMgCl₂をおのおの0.01
mg/ml及び1 mMの終濃度で溶液に添加した。細胞残骸は
6,000 x g、10分の遠心操作で除去した。得られた上清
を25 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で240 ml容に調整し、
不溶性膜画分を除去するため100,000 x g、90分間遠心
処理した。可溶性上清をTris緩衝液で240 ml容に調整
し、ピロロキノリンキノン（PQQ）及びCaCl₂をそれぞれ
終濃度12.5 μM及び5 mMで添加した後、溶液を室温下、
15分間激しく攪拌した。上記のように調整された可溶性
画分を硫安により分画した。硫安飽和35〜60%画分を沈
殿させ100 mlの5 mM CaCl₂及び5% スクロースを含む25
mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で再懸濁した後、PQQを再び
12.5 μM終濃度添加した。酵素溶液を1000 mlの同緩衝
液（PQQ非添加）で終夜透析した。固形ポリエチレング
リコール#6000を透析終了液に緩やかな攪拌下徐々に添
加した。30分間攪拌後、沈殿物を10,000 x g、20分間の
遠心操作で除去し、上清を上記の同緩衝液で200 ml容に
調整した。

【０１０２】上記のように調製した酵素溶液を以下の三
つのクロマトグラフィー操作で精製した。

【０１０３】第１段階：DEAE-トヨパール 650M 粗酵素液を5 mM CaCl₂および5% スクロースを含む25 mM
Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で平衡化したDEAE-トヨパール
650Mカラム（2.5 x 40 cm）に供した。カラムを400 ml
の同緩衝液で洗浄後、酵素の溶出を2000 ml同緩衝液中
の0〜0.5 M NaCl直線濃度勾配を用い流速150 ml/時で行
った。酵素活性画分を回収しNaClを含まない同緩衝液で
２倍容に希釈した。

【０１０４】第２段階：Q-セファロース（ファーストフ
ロー） 酵素溶液をNaClを含まない同緩衝液で平衡化したQ-セフ
ァロース（ファーストフロー）カラム（1.5 x 20 cm）
に供した。カラムを200 mlの0.2 M NaClを含む同緩衝液
で洗浄後、酵素の溶出を600 ml同緩衝液中の0.2〜0.6 M
NaCl直線濃度勾配を用い流速50 ml/時で行った。酵素
活性画分を回収し窒素ガス下、限界濾過膜(アミコン社
製、PM-30)を用い2.5 ml容に濃縮した。

【０１０５】第３段階：セファクリルS-300HR（ゲル濾
過） 濃縮された酵素を5 mM CaCl₂、5% スクロースおよび0.2
M NaClを含む25 mM HEPES緩衝液(pH 7.5)で平衡化した
セファクリルS-300HR（2.5 x 100 cm）でゲル濾過分画
した。カラムは同緩衝液で流速20 ml/時で展開した。酵
素活性画分を回収し上記と同様の限界濾過膜を用い1 ml
以下に濃縮した後、-80℃で保存した。HEPES緩衝液中濃
縮された酵素は-80℃下少なくとも２ヵ月は安定であっ
た。

【０１０６】結果として、26.0 mgの酵素 A、0.35 mgの
酵素 A'、0.41 mgの酵素 A"および5.0 mgの酵素 Bを得
た。

【０１０７】（３）酵素 A、A'、A"およびBの性質 ａ) 分子量およびサブユニット 酵素 A、A'、A"およびBは同一条件下のセファクリルS-3
00HRによるゲル濾過において同一位置に溶出された。酵
素の分子量は分子量標準蛋白質（SDS-PAGE スタンダー
ド、低分子用、バイオラド社製(Bio-Rad)）との比較に
より約135,000と推定された。酵素 A、A'、A"およびBは
SDS-PAGE分析においてそれぞれ64,000、62,500、62,500
および60,000の分子量を有する均一な単一バンドを示し
た。酵素A、A'、A"およびBのバンド全ては抗-AADHウサ
ギ血清を用いたウェスタンブロッティング分析により検
出された。従って、全酵素は２つの同一サブユニットを
含むホモ二量体であると結論づけられた。

【０１０８】ｂ) N-末端アミノ酸配列とアミノ酸組成 成熟酵素 A、A"およびBのN-末端アミノ酸配列をエドマ
ン法[Acta Chem. Scand.、4巻、283〜293頁 (1950年）]
による自動気相シーケンサー(470A,アプライドバイオシ
ステム社製(Applied Biosystems))を用いて分析した。
酵素 A'のN-末端は標品の純度不足のため決定されてい
ない。以下に結果を示す。 酵素 A ：Gln-Val-Thr-Pro-Val-Thr---- 酵素 A" ：ブロック化されたN-末端残基 酵素 B ：Gln-Val-Thr-Pro-Ile-Thr-Asp-Glu-Leu-Leu-A
la---- 決定された酵素 A及びBの配列は配列番号:５と配列番
号:８に記載された塩基配列より推定される配列（24番
目の残基より始まる）と同一であった。この結果は酵素
の初めの23残基がシグナル配列であることを示す。酵素
A及びBとの類似性から酵素 A'およびA"の初めの23残基
もシグナル配列であると推定される。

【０１０９】酵素 Aのアミノ酸組成を決定した。蛋白質
は6 N 塩酸で110℃、24時間または4M メタンスルホン酸
（過ギ酸酸化後）で115℃、24時間処理により加水分解
した。アミノ酸分析はコントロン社製(Kontron)のアミ
ノ酸分析機（ニンヒドリン型）で行った。分析結果を酵
素 AのDNA配列より推定されるアミノ酸組成と比較し
た。結果は精製された酵素 Aが明確に酵素 A遺伝子の産
物であることを示した。

【０１１０】ｃ) 基質特異性 酵素 A、A'、A"およびBを上述の８つの基質、n-プロパ
ノール、イソプロパノール、D-グルコース、D-ソルビト
ール、L-ソルボソン、D-マンニトール、L-ソルボース及
びD-フルクトースを用いたPMS-DCIP分析におけるそれら
の基質特異性で性格づけした。結果を表１に示す。

【０１１１】ｄ) 物理化学的性質 酵素 A（L-ソルボース脱水素酵素活性により）、酵素
A'（n-プロパノール脱水素酵素活性により）、酵素 A"
（L-ソルボース脱水素酵素活性により）および酵素 B
（D-ソルビトール脱水素酵素活性により）の物理化学試
験、至適pH、pH安定性および温度安定性をPMS-DCIP分析
により行った。

【０１１２】表２は酵素の至適pHの結果を要約したもの
である。酵素活性は様々なpHの緩衝液を用いてPMS-DCIP
分光学法分析により測定した。緩衝液は50 mM Tris-リ
ンゴ酸-NaOH緩衝液をpH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0およ
び8.5用に、50 mM Glycine-NaOH緩衝液をpH 9.0および
9.5用に用いた。各pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、
9.0および9.5におけるDCIPの分子吸光係数はそれぞれ1
0.8、13.2、14.5、14.9、15.0、15.1、15.1および15.1
とした。すべての酵素はその至適点をpH 8.0〜8.5に示
した。酵素 A"とBは酵素 AとA'に比較して低pH側に比較
的広い至適pH範囲を有していた。

【０１１３】表３は酵素のpH安定性の結果を示す。酵素
（約0.01 mg/ml）を5% スクロース、0.2 M NaClおよび5
mM CaCl₂を含む50 mM 各緩衝液中で３時間インキュベ
ートしPMS-DCIP分光学法分析により測定した。緩衝液は
pH 4と5の酢酸ソーダ、pH 6、7および8のTris-リンゴ酸
-NaOHおよびpH 9と10のGlycine-NaOH各緩衝液を用い
た。表中の値はpH 8.0でインキュベートしなかった値に
対する相対活性として表示した。各酵素に対して基質と
して酵素 A及びA"には125 mM L-ソルボース、酵素 A'に
は50 mM n-プロパノール、酵素 Bには125 mM D-ソルビ
トールを用いた。酵素 A、A'、A"およびBのpH-安定性は
ほぼ同様で、pH 6から9の範囲で安定であった。

【０１１４】表４は酵素の温度安定性試験の結果を示
す。5% スクロース、0.2 M NaCl及び5mM CaCl₂を含む25
mM HEPES緩衝液(pH7.5)中で酵素（約0.05 mg/ml）を表
に示した温度（4〜60℃）で５分間インキュベート後、
氷冷しPMS-DCIP分光学法分析により測定した。残存活性
を４℃でインキュベートした値に対する相対活性で表示
した。各酵素に対する基質として酵素 AおよびA"には12
5 mM L-ソルボース、酵素 A'には50 mM n-プロパノー
ル、酵素 Bには125 mM D-ソルビトールを用いた。40
℃、５分間処理の酵素の場合、残存活性は酵素 Aで20
%、酵素 A'、A"およびBで70〜85%であった。

【０１１５】ｅ) 阻害剤 5% スクロースを含む25 mM HEPES緩衝液(pH7.5)中で酵
素（約0.05 mg/ml）を金属または阻害剤とともに30分
間、25℃でインキュベートした。残存活性を実施例１に
記載したPMS-DCIP分光学法分析で測定した。残存活性は
対照に対する相対活性で表わしている。酵素に対する金
属イオンの影響を表５に記載した。MgCl₂とCaCl₂はほぼ
酵素に対して無影響であったが、他の金属イオン、特に
CuCl₂、は強い影響を及ぼした。酵素に対する阻害剤の
影響も表５に記載した。EGTAとEDTAは酵素 A、A'及びB
を強く阻害した。しかし、酵素 Bに対するEDTA及びEGTA
による阻害はAグループ酵素に対する阻害よりも軽度で
あった。

【０１１６】[実施例５] 大腸菌中での酵素 Bの効率的
生産 酵素 Bのシグナルペプチド領域を大腸菌のマルトース結
合蛋白質(malE)のシグナルペプチドと以下のように置換
した。２種のオリゴヌクレオチド(配列番号:9および配
列番号:10)をアプライドバイオシステム社製(Applied B
iosystems)の381A DNA合成機を用いて合成し、アニール
化しアミノ酸配列（配列番号:11)、MetLysIleLysThrGly
AlaArgIleLeuAlaLeuSerAlaLeuThrThrMetMetPheSerAlaSe
rAlaLeuAla(Gln)をコードする２本鎖DNA断片を生成さ
せ、この２本鎖DNA断片をT4ポリヌクレオチドキナーゼ
で処理した [J. Biol. Chem.、259巻、10606〜10613頁
(1984)]。pSSB203(実施例3 参照)を制限酵素SphIで切
断後、T4DNAポリメラーゼで処理しBstPIで切断した。得
られた元来のシグナル配列および成熟酵素 Bの一番めの
アミノ酸残基(Gln)をコードする領域のない酵素 B遺伝
子を有する1.72 kb DNA断片を、アガロースゲル電気泳
動を行った後アガロースゲルから単離した。大腸菌の発
現ベクター、pTrc99A(ファーマシア社製(Pharmacia))を
制限酵素NcoI(ATG開始コドンの位置）およびSmaIで切断
し、上記２DNA断片と結合した。この結果得られたプラ
スミドをpTrcMal-EnzBと命名し、大腸菌 JM109を形質転
換するのに用いた。得られた形質転換体を、100μg/ml
のアンピシリンを添加したLB600 mlを含む2 L容のフラ
スコ2本中で28℃で生育させ、細胞濃度が約1.5 OD600に
達した時に、IPTGを0.1mMになるよう添加し、さらに3〜
4時間培養を続けた。得られた細胞は、25℃、10分間の
遠心分離(4,000 x g)により集菌し、25℃で500 mlの20%
シュークロースを含む30 mM Tris-HCl(pH8.0)緩衝液に
懸濁した。この細胞懸濁液に終濃度1 mMのEDTAを添加
し、25℃でゆっくり振とうした後、細胞を4℃で15分間
遠心分離(8,000 x g)にかけた。得た細胞を500 mlの氷
冷した5 mM MgSO4に再懸濁し、4℃で5分間ゆっくり振と
うした。この細胞懸濁液を4℃で10分間遠心分離(8,000
x g)にかけ、その上清を冷浸透圧ショック抽出液として
得た。この抽出液には、SDS-PAGE分析で50〜60%以上の
純度を有する酵素 B蛋白質(分子量60,000)が含まれてい
た。この上清にまず終濃度20 mMになるようにTris-HCl
(pH8.0)を添加し、終濃度10 mM EDTAを添加後25℃10分
間インキュベートし、次に終濃度20 mMのCaCl₂を添加後
10分間インキュベートし、最後に終濃度25 μMのPQQを
添加後10分間インキュベートした。この上清に酵素の安
定化のため終濃度20 mMのα-メチル-D-グルコシド（競
合阻害剤）を加えた。酵素 Bはつぎの２種類のクロマト
グラフィーにより完全精製された。まず上記上清を1 mM
CaCl₂および20 mM α-メチル-D-グルコシドを含む20 m
M Tris-HCl(pH8.0)緩衝液で平衡化したQ-セファロース
カラム(1.6 x 12 cm)上に供し、酵素 Bを600 mlの0〜0.
4 M NaCl直線勾配を持つ同緩衝液で溶出した。約0.25 M
NaClの濃度で溶出された赤色蛋白質ピークを集め、Cen
tricon-30(アミコン社製(Amicon))により約0.5 mlにま
で濃縮した。最終的に、酵素 Bを0.2 M NaCl、1 mM CaC
l₂、および20 mM α-メチル-D-グルコシドを含む20 mM
HEPES(pH7.8)緩衝液を用い、セファクリルS-300HRカラ
ムを通過させた。分子量135,000ダルトンの付近に溶出
される赤色蛋白質ピークを最終精製酵素 Bとして集め
た。結果として約8mgの精製酵素 Bを1.2リッターの大腸
菌培養液から得た。

【０１１７】[実施例６] 宿主-ベクター系 G.オキシダンス[DSM番号4025]のための宿主-ベクター系
を広宿主域コスミドpVK102を使用する接合伝達系を用い
て確立した。最初は、ナリディキシン酸耐性を有するG.
オキシダンス[DSM番号4025]から唯一株の接合伝達体が
分離された。新たな宿主GOS2は、上記pVK102を有するG.
オキシダンス[DSM番号4025]の接合伝達体からpVK102を
除去することにより単離された。二番目の宿主GOS2R
は、DNA供与体である大腸菌から接合伝達体を簡便に選
択できるようにリファンピシン(100μg/ml)耐性をGOS2
に付与して誘導した。GOS2RへのプラスミドpVK102の導
入頻度は、受容菌あたり10^-3〜10^-4個の接合伝達体が得
られるものであった。しかし、GOS2Rの2KGA生産性はG.
オキシダンスDSM番号4025より約10%低かった。三番目の
宿主GORS6-35は、G.オキシダンス DSM番号4025からリフ
ァンピシン耐性、高2KGA生産性、比較的高い遺伝子導入
適格性を有する株を接合伝達、プラスミド除去、2KGA醗
酵を含む一連の実験を通して選択することにより得られ
た。

【０１１８】（１）GOS2の単離 G.オキシダンス[DSM番号4025]にナリディキシン酸耐性
を以下のように付与した。G.オキシダンス[DSM番号402
5]の細胞をTrypticase Soy Broth(BBL、BectonDickinso
n Microbiology Systems 社製)(以下Tと略す)寒天培地
に50 μg/mlのナリディキシン酸を含む寒天培地(以下TN
と略す)上に塗抹し、この塗抹平板を27℃で5日間培養し
た。その結果得られたコロニーを再度同上TN寒天培地に
塗抹し、ナリディキシン酸耐性G.オキシダンス[DSM番号
4025]、GONを得た。広宿主域コスミドpVK102(Kmr、Tcr)
を、pVK102を保持する大腸菌からGONへ以下のように三
者接合伝達により導入した。ヘルパー株であるpRK2013
を保持する大腸菌およびpVK102を保持するDNA供与体の
大腸菌は、50 μg/mlのカナマイシンを添加したLB培地
中で37℃一晩培養した。これらの培養液をカナマイシン
を添加した新鮮なLB培地に移植し、さらに5〜6時間培養
した。受容菌GONは、TN液体培地中で30℃一晩培養し
た。大腸菌およびGON株は別々に遠心分離し、各々等量
でもとの十分の一量のT培地に再懸濁した。各々の細胞
懸濁液100 μlを混合し、その混合液の30μlをNS2寒天
平板の表面上に置いたニトロセルロースフィルター上に
スポットした。接合伝達体の選択は、50 μg/mlのナリ
ディキシン酸および50 μg/mlのカナマイシンを含むT寒
天培地(TNK寒天培地)上で行われた。数個のコロニーが
選択平板上で得られたが、同時に多くの大腸菌自然変異
体(Nalr、Kmr)も出現した。これら接合伝達体の候補株
からプラスミドおよび染色体DNAを調製し、コントロー
ルのpVK102とG.オキシダンス[DSM番号4025]の染色体DNA
と、制限酵素解析およびサザンブロットハイブリダイゼ
ーションにより比較した。その結果、一株のpVK102を有
するG.オキシダンス[DSM番号4025]、GON8-1の分離を確
認した。GON8-1から調製されたプラスミドDNAはpVK102D
NAと同一であり、大腸菌中で複製できた。またGON8-1の
染色体DNAは、G.オキシダンスDSM番号4025の染色体と同
一であった。

【０１１９】高い接合伝達頻度を有する宿主として使用
できる株を分離するために、上記接合伝達体GON8-1から
プラスミドpVK102を以下のように除去した。GON8-1を抗
生物質非存在下、Tブロス中で30℃で2日間培養し、その
培養液を新鮮なTブロスに2%の割合で移植した。このよ
うな培養を３回繰り返し得られた細胞をT寒天平板に塗
抹し、27℃で4日間培養した。得られたコロニーをKms株
を分離するためにTNKおよびTN寒天平板上に拾い上げ
た。このKms株の一株はGOS2と命名され、サザンブロッ
トハイブリダイゼーションによりpVK102のいかなる領域
をも含まないことが確認された。次に、pVK102を接合伝
達によりGOS2に導入した。この株はG.オキシダンス[DSM
番号4025]よりも10²〜10³高い遺伝子導入適格性 (すな
わち10^-5〜10^-6接合伝達体／受容体)を示した。

【０１２０】（２）GOS2のリファンピシン耐性変異株、
GOS2Rの単離 GOS2細胞を20〜100 μg/mlのリファンピシンを含むT寒
天平板上を繰り返し移植することで、GOS2からのリファ
ンピシン耐性(Rif^r)変異株を単離した。得たRif^r株の一
つをGOS2Rと命名した。GOS2R株は非常に高い遺伝子導入
適格性を示し、TRK寒天(100 μg/mlのリファンピシンお
よび50 μg/mlのカナマイシンを含むT寒天培地)およびT
RT寒天(100 μg/mlのリファンピシンおよび3 μg/mlの
テトラサイクリンを含むT寒天培地)上でそれぞれ受容菌
あたり各々10^-2〜10^-3および10^-4の接合伝達体がGOS2R
株から得られた。

【０１２１】GOS2RのL-ソルボースからの2KGA生産性
を、G.オキシダンス[DSM番号4025]の2KGA生産性と以下
のように比較した。NS2寒天培地上で維持されている細
胞を5 mlの種培養培地[8% L-ソルボース(別滅菌)、0.05
% グリセロール、0.25 % MgSO₄・7H₂O、1.75% コーンス
ティープリカー(corn steep liquor)、5.0% パン酵母、
1.5% CaCO₃および0.5% 尿素(別滅菌)(滅菌前pH7.0)]に
植菌し、30℃で24時間培養した。得られた種培養液5 ml
を50 mlの生産培地PMS10[10% L-ソルボース(別滅菌)、
0.05% グリセロール、0.25 % MgSO₄・7H₂O、3% コーン
スティープリカー、6.25% パン酵母、1.5% CaCO₃および
1.6% 尿素(別滅菌)(滅菌前pH7.5)]を含む500mlのエルレ
ンマイヤーフラスコに植菌し、30℃で4日間振とう培養
(180 rpm)した。2KGAの定量は、高速液体クロマトグラ
フィー分析により行った。GOS2RおよびG.オキシダンス
[DSM番号4025]は、各々87.3および97.3 g/lの2KGAを生
産した。

【０１２２】（３）2KGA高生産性を有するGORS6-35の単
離 L-ソルボースからの2KGA生産性が、G.オキシダンス[DSM
番号4025]と同じである株中で、AADH遺伝子のセルフク
ローニングの評価を行うために、新たな宿主を以下のよ
うに作成した。すなわち、(1)200 μg/mlのリファンピ
シンに対する耐性を付与する、(2)pVK102を導入後、除
去する、(3)L-ソルボースからの2KGA高生産株を選択す
ることににより作成した。このようにして得られたGORS
6-35は次の二つの性質：(1)親株のG.オキシダンス[DSM
番号4025]とほぼ同等の2KGA生産性(10% L-ソルボースか
ら約100 g/lの2KGA生産)および(2)受容菌あたり10^-6〜1
0^-7の接合伝達体を与える遺伝子導入適格性を示した。

【０１２３】[実施例７] プロモーター置換酵素 B遺伝
子の構築 G.オキシダンスDSM番号4025株の無細胞抽出液をSDS-ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に供し、そのゲルをクマ
シーブリリアントブルー(Coomassie BrilliantBlue)R-2
50で染色した結果、酵素 Aは上記菌株細胞内において発
現量の最も高い蛋白質の一つであることが判明したの
で、酵素 A遺伝子のプロモーター（PA)はG.オキシダン
ス DSM番号4025株の中で強力なものと思われる。このPA
および、G.オキシダンス DSM番号4025株においてカナマ
イシン耐性を示しうるTn5のカナマイシン耐性遺伝子の
プロモーター(PTn5)を、図１０に示すように酵素 B遺伝
子のSD配列を含む構造遺伝子に連結した。

【０１２４】酵素 B遺伝子を含む2.3 kb HindIII断片を
M13 mp18に挿入し、得られたファージDNAをT7-GEN（登
録商標）インビトロ変異誘発キット(In vitro Mutagene
sis Kit(東洋紡社製）)を用いて、供給会社の推奨する
方法に従って部位特異的変異導入を行った（図９）。酵
素 B遺伝子の上流に、酵素 Bのプロモーターの代わりに
種々のプロモーターを導入するために、SD配列の上流に
BamHI部位を作成した。変異プライマーGTTAGCGCGGTGGAT
CCCCATTGGAGG（BamHI部位を含む２７塩基、配列番号：
１２）は、アプライドバイオシステム社製(Applied Bio
systems)の381A DNA合成機を用いて合成した。結果とし
て得られるBamHI-HindIII断片は、酵素 Bのプロモータ
ー(PB)を含まず、酵素 BのSDおよび構造遺伝子を有して
いる。

【０１２５】酵素 A遺伝子のプロモーター（PA)は、Hin
dIIIおよびBamHI部位を付加したプライマーを用いたPCR
法によりクローン化した。PCR反応は、GeneAmp（登録商
標）DNA増幅試薬キット(DNA Amplification Reagent Ki
t(宝酒造社製))を用い、サーマルサイクラー、Zymoreac
tor II(アトー社製)により行った。反応条件は、酵素添
加前処理（94℃、5分)、30サイクルの変性段階（94℃、
1分)、会合段階（60℃、1分)、合成段階（72℃、1分)
に、後処理（72℃、5分)で行った。鋳型のDNAは、プラ
スミドpSSA202（pUC18に酵素 A遺伝子を含む2.7 kbのHi
ndIII断片をクローン化したもの）を用いた。反応液の
組成は、添付のバファーに対して、200μMのdNTP等モル
混液、1 μMの各プライマー、1 ngの鋳型DNAおよび2.5
単位のAmpliTaq（登録商標）DNAポリメラーゼとした。
結果としてSD配列の上流の300 bpの断片が増幅され、こ
の断片をpUC18のHindIIIとBamHI 部位の間にクローン化
し配列に利用した。得られたクローンについては、PCR
のミスインコーポレーションによる変異が導入されてい
ないことを塩基配列決定により確認した。

【０１２６】カナマイシン耐性遺伝子のプロモーター
（PTn5）は、プラスミドpNeo (ファーマシア社製(Pharm
acia))からまずHindIII-PstI断片として単離し、pUC18
のマルチクローニング部位にクローン化し、PTn5をHind
III-BamHI断片として切り出した。

【０１２７】PAおよびPTn5プロモーターを含むHindIII-
BamHI断片を、PBプロモーターを除いた酵素 Bの構造遺
伝子を含むBamHI-HindIII 断片とともにpUC18のHindIII
部位に導入した。得られたプラスミドより調製したHind
III断片をpVK100にクローン化し、pSSAp-BおよびpSSPTn
5-Bを作成し、実施例６記載の接合伝達法によってGOS2R
に導入した。

【０１２８】[実施例８] フラスコ培養でのGOS2R接合
伝達株による２KGA生産 （１）酵素 A遺伝子増幅接合伝達体の単独菌フラスコ培
養におけるL-ソルボースからの２KGA生産 酵素 A発現プラスミドpSSA102Rおよびベクタープラスミ
ドpVK102を実施例６記載の接合伝達法によりGOS2Rへ導
入した。得られた接合伝達体は30 μg/mlのテトラサイ
クリンを含むNS2寒天平板培地で維持し、L-ソルボース
からの２KGA発酵に供した。接合伝達体細胞を実施例６
に示すように種培地５mlに接種し、30℃で24時間培養し
た。得られた種培養液５mlを、実施例６記載のPMS10生
産培地またはPMS12生産培地[12 % L-ソルボース（別滅
菌）、0.05% グリセロール、0.25% MgSO ₄・７H₂O、3%
コーンスティープリカー(CSL)、10% パン酵母、1.5% Ca
CO₃および2% 尿素（別滅菌）（pHは滅菌前に7.5に調
整）]50 mlの入った500 ml-エルレンマイヤーフラスコ
に接種した。培養は、30℃、180rpmで振とうし、4日な
いし5日行った。結果として、GOS2R(pSSA102R)およびGO
S2R(pVK102)は、10 %のL-ソルボースからは、４日間で
それぞれ92.2、89.1 g/lの２KGAを生産し、12 %のL-ソ
ルボースからは、5日間でそれぞれ105.7、99.9 g/lの２
KGAを生産した。

【０１２９】（２）GOS2R(pSSB103R)の単独菌フラスコ
培養におけるD-ソルビトールからの２KGA生産 酵素 B発現プラスミドpSSB103Rおよびベクタープラスミ
ドpVK102を実施例６記載の接合伝達法によりGOS2Rに導
入した。得られた接合伝達体は30 μg/mlのテトラサイ
クリンを含むNS2寒天平板培地で維持し、D-ソルビトー
ルからの２KGA発酵に供した。接合伝達体細胞を8% D-ソ
ルビトール、0.05% グリセロール、0.25% MgSO₄・7H
₂O、1.75% コーンスティープリカー(CSL)、5.0% パン酵
母、1.5% CaCO₃および0.5% 尿素（別滅菌）（pHは滅菌
前に7.0に調整)を含む種培地5 mlに接種し、30℃で24時
間培養した。得られた種培養液5 mlを、表８に示す３種
の生産培地50 mlの入った500 ml-エルレンマイヤーフラ
スコに接種し、3日間30℃で振とう培養した（180rpm)。
結果として、GOS2R(pSSB103R)は、およそ61.5、71.5お
よび73.0 g/lの２KGAを8%、10%および12%のD-ソルビト
ールからそれぞれ生産した。一方GOS2R(pVK102)は、そ
れぞれ19.5、25.4および30.2 g/lの２KGAを生産した。

【０１３０】

【表８】 滅菌前pH 7.5に調整^* :別滅菌。

【０１３１】（３）GOS2R(pSSAp-B)およびGOS2R(pSSPTn
5-B)単独菌フラスコ培養におけるD-ソルビトールからの
２KGA生産 GOS2R(pSSAp-B)、GOS2R(pSSPTn5-B)、GOS2R(pSSB103R)
およびGOS2R(pVK100)の細胞を、実施例８の（２）に示
したように、エルレンマイヤーフラスコでPMSL10生産培
地を用いて30℃で3日間培養した。生成した２KGA量は、
表９に示すとおりである。

【０１３２】

【表９】 [実施例９] 単独菌による3Lジャー培養でのD-ソルビト
ールからの２KGA生産GOS2R(pSSB103R)による単独菌発酵 実施例８の（２）に示したように試験管で調製した種培
養液５mlずつを、同じ種培地50 mlの入った500 ml-エル
レンマイヤーフラスコ４本に接種し、30℃で24時間振と
う培養した（180rpm)。得られた種培養液200 mlを、3 m
lの消泡剤を添加したPMSL10生産培地1800 mlを含む３L
ジャーファーメンターに接種した。ファーメンターは、
30℃、700 rpm、0.5 vvmで操作した。D-ソルビトールは
以下の２通りの方法で流加した。（１）24時間目から30
時間目までの6時間で、50% D-ソルビトール液200 mlを
流加、または（２）24時間目から32.3時間目までの8.3
時間で、50% D-ソルビトール液280 mlを流加。結果とし
て、（１）および（２）の方法の流加培養でそれぞれ、
99.0、103.4 g/lの２KGAを51時間で生産した。

【０１３３】[実施例１０] 酵素 B遺伝子増幅GOS2Rと
大腸菌とのフラスコでの混合培養によるD-ソルビトール
からの２KGA生産 （１）B.メガテリウム、大腸菌、P.プチダとの混合培養
系発酵 生育因子供給体として、B.メガテリウム[DSM番号402
6]、大腸菌 HB101およびP.プチダ[ATCC21812]を、0.3%
酵母エキス（Difco）、0.3% 肉エキス（極東製薬）、3%
コーンスティープリカー、1% ポリペプトン（極東）、
0.1% 尿素、0.1%KH₂PO₄、0.02% MgSO₄・7H₂O、2% L-ソ
ルボース、0.1% CaCO₃(滅菌前にpH7.1に調整）を含む種
培養培地150 mlで、24時間それぞれ37、37、30℃で培養
した。GOS2R(pSSB103R)株は、実施例８の（２）に示す
ように、5 mlの種培養培地を入れた２本の試験管で24時
間30℃で培養した。GOS2R(pSSB103R)の種培養液4 mlと
生育因子供給菌の種培養液3.5 mlを、8% D-ソルビトー
ル、0.01% MgSO₄o7H₂O、1% コーンスティープリカー、
0.1% KH₂PO₄、0.6% CaCO₃、1.5%尿素(別滅菌）および消
泡剤（フラスコあたり１滴）（滅菌前にpH7.0に調整）
を含む混合培養用生産培地50 mlを含む500 ml-エルレン
マイヤーフラスコに接種し、30℃で46.5時間振とう培養
した。結果として、B.メガテリウムDSM番号4026、大腸
菌 HB101およびP.プチダ[ATCC21812]との混合培養にお
いて、それぞれ49.9、54.1、31.3 g/lの2KGAを生産し
た。

【０１３４】（２）GOS2R(pSSAp-B)と大腸菌とのフラス
コでの混合培養系発酵 GOS2R(pSSAp-B)と大腸菌との混合培養を、大腸菌の種培
養培地における2% L-ソルボースを2% D-ソルビトールに
変えた以外は上記の方法と同じ様式で行った。結果とし
て、GOS2R(pSSAp-B)は10 %のD-ソルビトールから73.7 g
/lの２KGAを48.5時間で生産した。

【０１３５】[実施例１１] 組換え体のAADHによる２KG
Aの生産 1.7 mg/mlの精製酵素 A(実施例４によって精製）、50 m
M Tris-HCl、pH7.5、5mM CaCl₂、8 mg/ml ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）、1 mM PMS、20 μg/ml PQQおよび4%
L-ソルボースを含む反応液を、20時間ゆるやかに振とう
しながら30℃でインキュベートしたところ、約2 g/lの2
KGA（TLCで定量）が生成した。

【０１３６】また、各々2.4 mg/mlの精製酵素 Aおよび
酵素 B(実施例４によって精製)、50mM Tris-HCl (pH7.
5)、5 mM CaCl₂、8 mg/ml ＢＳＡ、1 mM PMS、20 μg/m
l PQQおよび2 % D-ソルビトールを含む反応液を、20時
間ゆるやかに振とうしながら30℃でインキュベートした
ところ、0.25 g/lの2KGA（HPLCで定量）および約5 g/l
のL-ソルボース（TLCで定量）が生成した。

【０１３７】[実施例１２] アルコールからアルデヒ
ド、アルコールまたはカルボン酸からケトン、アルデヒ
ドからカルボン酸の生産 様々な基質を用いて、精製酵素 Aまたは酵素 Bによる酵
素反応を実施例１１に示したように行った。生産物はTL
Cおよび／またはHPLCにより同定し、結果を表１０に示
した。

【０１３８】

【表１０】 酵素 AはD-フルクトースを２KDに変換したことから、D-
フルクトースからの中間体としてD-グルコソンを生成し
ていると考えられる。

【０１３９】[実施例１３] P.プチダの接合伝達体によ
る２KGAおよびL-ソルボースの生産 1% CaCO₃、0.3% NaCl、1 mM PMS、5 μg/ml PQQ、2% L-
ソルボースおよびOD600ユニット10の、pSSA102Rまたはp
VK100を保有するナリディキシン酸耐性（Nal^r）P.プチ
ダ[ATCC21812]を含む休止菌体混液（2 ml)を30℃で緩や
かに振とうしながら17時間インキュベートした。結果と
して、pSSA102RないしpVK100を保有するNal^r P.プチダ
[ATCC21812]は、それぞれ18.9、0.0 g/lの２KGAを生成
した。

【０１４０】また、1 % CaCO₃、0.3 % NaCl、1 mM PM
S、5 μg/ml PQQ、2 % D-ソルビトールおよびOD600ユニ
ット10のpSSB103RまたはpVK100を保有するNal^r P.プチ
ダ[ATCC21812]を含む休止菌体混液（2 ml)を30℃で緩や
かに振とうしながら17時間インキュベートした。結果と
して、pSSB103RまたはpVK100を保有するNal^r P.プチダ
[ATCC21812]は、それぞれ7.8または0.0 g/lのL-ソルボ
ースを生成した。

【０１４１】[実施例１４] キメラAADH酵素の作成とそ
の性質 （１） キメラAADH酵素の作成 AADH酵素の基質特異性を変えるために、酵素 Aと酵素 B
間の種々のキメラ酵素を作成した。

【０１４２】１） 図２は方策I(制限酵素切断-連結
法）によって作成したキメラ遺伝子の構造を示してい
る。両遺伝子で共通の制限酵素切断部位、AvaI（酵素 A
遺伝子の塩基番号603）、EcoRI（塩基番号1084）、Sal
I（塩基番号1470)（図７）をその作成のために使用し
た。まず、酵素 Aおよび酵素 Bの遺伝子カセット（それ
ぞれ2.7 kb、2.3 kbのHindIII断片)を、この順番で同じ
向きにpUC18にクローン化して、プラスミドpSSAB201を
作成した。また、酵素 B、酵素 A遺伝子の順で、同様に
カセットをpUC18に導入し、プラスミドpSSBA201を得た
（図３）。次に、これらのプラスミドを各制限酵素で部
分切断したのち連結して大腸菌JM109を形質転換した。
得られたアンピシリン耐性形質転換体からプラスミドを
分析し、酵素A遺伝子を頭とするキメラ遺伝子カセット
の場合には2.7 kb、酵素 Bを頭とするキメラ遺伝子カセ
ットの場合には2.3 kbの期待される構造を有するHindII
I断片を与えるものを選んだ。このようにして作成した
キメラ遺伝子のカセットをpVK102のHindIII部位に導入
し、それぞれ酵素 A/B1、酵素 A/B2、酵素 A/B3、酵素
B/A1、酵素 B/A2、および酵素 B/A3をコードする遺伝子
をもつプラスミドpSSA/B101R、pSSA/B102R、pSSA/B103
R、pSSB/A101R、pSSB/A102RおよびpSSB/A103Rを図２に
示すように作成した。これら６つのプラスミドは実施例
１に示したように接合伝達法により、Nal^r P.プチダに
導入した。

【０１４３】２） 図８は方策IIによるキメラ遺伝子の
作成の概略を示している。方策IIでは、AADH酵素の基質
特異性を変えるのに、任意の位置で組換えたキメラが作
成される細胞内相同組換え法を採用している。この方法
の原理は以下のようである。 （i)選択マーカーを持つ一つのプラスミド上に、２つの
相同性のある遺伝子を直列に並べ,（ii)２つの遺伝子の
間に存在する制限酵素部位で切断し、直鎖状になったプ
ラスミドを用いて、野性型recAを有する大腸菌を形質転
換し、（iii)2つの遺伝子間の様々な位置で、組換えた
結果環化したDNAを保有する形質転換体を、選択マーカ
ーを指標に選択する、というものである。図８に示すよ
うに、２種の制限酵素を用いて、プラスミドpSSAB201お
よびpSSBA201[pUC18上に酵素 Aおよび酵素 B両遺伝子を
有するプラスミド（図３）]を直鎖状とし、大腸菌 JM10
1(recA+)株を形質転換した。形質転換体は１μgのDNAあ
たり10¹〜10²得られた。不当な組換えを起こしたもの
を、DNA鎖長を指標に除去した結果、正しい組換え体の
比率は30 %であった。酵素 A遺伝子のC末端側約３分の
２を失う形のXhoI-BalI断片を用いると、効率よくN末端
側３分の１以内で組換えたキメラが得られた。次に、得
られた組換え体を特定の３つのSmaI、SphI、SalIおよび
BalI切断部位（図７）によって区切られる組換え位置グ
ループに分類した。このようにして作成した様々なキメ
ラ遺伝子をHindIII断片のカセットとしてpVK100にクロ
ーン化し、Nal^r P.プチダに接合伝達法により導入し
た。

【０１４４】（２）キメラAADH酵素の性質 １） 制限酵素切断-連結法により得られたキメラの性
質 Nal^r P.プチダで発現したキメラ酵素の酵素学的性質
を、実施例１に記載したように接合伝達体細胞の可溶性
画分を用いて調べた。図１１に示すように８種類の基質
をこの評価に用いた。酵素 A/B1および酵素 A/B3は、酵
素 Aに比べて発現レベルが低いものの、酵素 A型の基質
特異性を示した。一方、酵素 B/A1、酵素B/A2、酵素 B/
A3は、酵素 Aに由来する領域が増加するとともに、n-プ
ロパノールに対する活性（酵素 A型）が高まるものの、
酵素 B型の基質特異性を示した。酵素 B/A1遺伝子の発
現レベルは野生型の酵素 B遺伝子よりも高く約２倍であ
った。制限酵素切断-連結法によって得たキメラ酵素の
性質から、酵素 Aまたは酵素 BにおけるN末側３分の１
が基本的に基質特異性を決定していると結論された。

【０１４５】２） 相同組換え法によって得られたキメ
ラの性質 上記のように、この方法により得られたキメラの中で、
図７に示されるSmaI2とSalI切断部位の間で組換えた18
のキメラ酵素のうち７つが好ましい基質特異性を示し
た。この７つのキメラ酵素は、D-ソルビトールからはL-
ソルボースを生成し、酵素 Aで生成されるD-グルコース
を生じなかった。そしてL-ソルボースからは、酵素 Aと
同様に２KGAを生成した。キメラ遺伝子の組換え位置
は、実施例２に示すように塩基配列の決定により確定し
た。大まかな構造が「N末側９分の２が酵素 A、残りのC
末側９分の７が酵素 B」となっているこのタイプのキメ
ラ酵素は、酵素 superA型として分類した。その結果、
酵素 superA型に属する７つのキメラ酵素の組換え位置
は３種類であった。すなわち、酵素 A/B21（酵素 Aの第
１〜１２８残基に加えて、酵素 Bの第１２９〜５５６残
基を含むキメラ酵素）、酵素 A/B22（酵素 Aの第１〜１
２５残基に加えて、酵素 Bの第１２６〜５５６残基を含
むキメラ酵素）および酵素 A/B25（酵素 Aの第１〜１３
５残基に加えて、酵素 Bの第１３６〜５５６残基を含む
キメラ酵素）である。酵素 A/B21、酵素 A/B22、または
酵素 A/B25遺伝子を発現するP.プチダ接合伝達体は、D-
ソルビトールをD-グルコースには変換せずにL-ソルボー
スに変換した。その他に得られたキメラ酵素酵素 A/B31
（酵素 Aの第１〜９５残基に加えて、酵素 Bの第９６〜
５５６残基を含むキメラ酵素）は、D-ソルビトールを効
率よくL-ソルボースに変換したが、L-ソルボースを２KG
Aには変換しなかった。すなわち、このキメラ酵素は酵
素 B型の活性を示した。上述したキメラの発現レベル
は、野性型の酵素 Bに比べて高かったが、これは酵素 B
遺伝子が、酵素 A遺伝子には見られない「まれなコドン
（rare codon)」を多く含むためと思われる。尚、この
コドン解析は、プログラム「Codon Preference」（Wisc
onsin Sequence Analysis Package(登録商標)、Genetic
s Computer Group）により行った。

【０１４６】（３）キメラ遺伝子におけるコドン使用の
改良 好ましいコドン使用という点においてキメラ酵素(酵素
A/B21、酵素 A/B22、酵素 A/B25および酵素 A/B31)遺伝
子をさらに改良するために、それらの酵素 B残基からの
配列を有するC末側の３分の２の領域を、酵素 A遺伝子
残基のC末側の３分の２と置き換えた。酵素 A/B21、酵
素 A/B22、酵素 A/B25および酵素 A/B31遺伝子を用い
て、それぞれ以下の４つの新しいキメラ遺伝子を構築し
た。すなわち、酵素 sA21（酵素 Aの第１〜１２８残
基、酵素 Bの第１２９〜１８０残基、そして酵素 Aの第
１８０〜５５６残基を含むキメラ酵素）遺伝子、酵素 s
A22（酵素 Aの第１〜１２５残基、酵素 Bの第１２６〜
１８０残基、そして酵素 Aの第１８０〜５５６残基を含
むキメラ酵素）遺伝子、酵素 sA2（酵素 Aの第１〜１３
５残基、酵素 Bの第１３６〜１８０残基、そして酵素 A
の第１８０〜５５６残基を含むキメラ酵素）遺伝子、お
よび酵素 sB（酵素 Aの第１〜９５残基、酵素 Bの第９
６〜１８０残基、そして酵素 Aの第１８０〜５５６残基
を含むキメラ酵素）遺伝子である（図４）。酵素 sA2お
よび酵素 sB遺伝子の置換実験の実際は、それぞれpUC18
に酵素 sA遺伝子と酵素 B/A1遺伝子を並べた形でもつプ
ラスミドおよびpUC18に酵素 A/B31遺伝子と酵素 B/A1遺
伝子を並べた形でもつプラスミドを、AvaIによって部分
切断後連結し、大腸菌 JM109を形質転換した後、形質転
換体のプラスミドの構造を制限酵素切断様式で解析する
とともに、塩基配列を決定して期待される組み換え部位
のAvaI切断部位で置換されていることを確認した。酵素
sA21および酵素 sA22遺伝子作成のための置換実験は、
酵素 sA2のN末端部をコードするHindIII-SspI断片を、
それぞれ酵素 A/B21および酵素 A/B22遺伝子の組換え位
置を含んでいるHindIII-SspI断片と置換することにより
行った（図４）。

【０１４７】（４）キメラ酵素の速度論的解析 表１１および表１２に酵素 sA2および酵素 sBの速度論
的性質を、それぞれ酵素 Aおよび酵素 Bと比較してまと
めた。

【０１４８】

【表１１】 酵素 sA2および酵素 AによるL-ソルボースからの生成物
は２KGAであった。D-ソルビトールからの生成物は、酵
素 sA2では微量のD-グルコースを伴うもののL-ソルボー
スであり、酵素 AではD-グルコースのみであった。この
ように、酵素 sA2はD-ソルビトールからの２KGA生産に
望ましい性質、すなわち、酵素 A同様のL-ソルボースか
ら２KGAを生成するためのL-ソルボース／L-ソルボソン
脱水素酵素活性、および酵素 B同様のD-ソルビトールか
らL-ソルボースを生成するD-ソルビトール脱水素酵素活
性を示した。

【０１４９】

【表１２】 酵素 Bと比較して、酵素 sBはD-ソルビトールに対する
親和性が高く、またD-ソルビトールからL-ソルボースへ
の変換に対して阻害剤となるD-ソルビトールの酸化生成
物であるL-ソルボースに対する親和性は低くなってい
た。

【０１５０】[実施例１５] キメラAADH酵素を増幅した
GOS2R誘導株によるD-ソルビトールからの２KGA生産 酵素 sA2および酵素 sBを評価するにあたり、GOBΔKお
よびGOI13株を作成した。GOBΔKは、自殺ベクターpSUP2
01[アンピシリン耐性(Amp^r)、クロラムフェニコール耐
性(Cm^r)、mob⁺、pBR325誘導体、Bio/Technology, 1巻、
784〜791頁、1983]を使ってGOS2R株に対して酵素 B遺伝
子全体を欠失させ、代わりにプラスミドpUC4K[4.1 kb、
Km^r、Amp^r、ファーマシア社製(Pharmacia)、ヴィエラ(V
iera), J.およびメッシング(Messing), J.、Gene 19
巻、259頁、(1982)]から単離した1.28kb Km^r 遺伝子カ
セットを挿入することにより作成した。

【０１５１】GOI13はGOBΔKからさらに野性型酵素 A遺
伝子を酵素 sB遺伝子に置換し、野性型酵素 A"遺伝子
を、自殺ベクターpSUP202[Amp^r、Cm^r、Tc^r、mob⁺、pBR3
25誘導体、Bio/Technology、1巻、784〜791頁、(198
3）]を用いてゲンタマイシン耐性(Gm^r)遺伝子カセット
と置換することによって欠失させて作成した。Gm^r遺伝
子カセットは、DNA断片Tn5-GM[ササガワら、Gene 56
巻、 283〜288頁、(1987)]を鋳型としたPCR増幅法によ
り、PstI切断部位を両端に付加するように設計し、得ら
れたPCR産物をpUC4KのPstI切断部位に挿入することによ
ってpUC8Gとして得た。Gm^r遺伝子は、pUC8GからEcoRI、
BamHI、SalIまたはPstIで切断することによって単離す
ることが可能である。

【０１５２】（１） ２KGA生産における酵素 sA2増幅
の効果 プラスミドpSSsA2(pVK100に酵素 sA2遺伝子を含む2.7 k
b HindIIIカセットを導入したもの)および対照となるプ
ラスミドpSSA102R(pVK102に酵素 A遺伝子を含む2.7 kb
HindIIIカセットを導入したもの）を実施例６記載の接
合伝達法によってGOI13に導入した。得られた接合伝達
体を実施例８に示すように、PMSL10培地を用いて30℃で
４日間培養した。pSSsA2およびpSSA102Rを有するGOI13
は、それぞれ66.3および38.5 g/lの２KGAと、それぞれ
8.4 および25.9 g/lの２KD（D-ソルビトールからの２KG
A生産において、D-ソルビトールからD-グルコースおよ
びD-グルコン酸を経て生成する副産物）を生成した。

【０１５３】（２）プラスミドpSSsA21およびpSSsA22[p
VK100に、それぞれ酵素 sA21および酵素 sA22遺伝子を
含む2.7 kb HindIIIカセットを導入したもの(図4)]を実
施例６記載の接合伝達法によってGOI13に導入した。得
られた接合伝達体を実施例８に示すように、PMSL10培地
を用いて30℃で４日間培養した。pSSsA21およびpSSsA22
を有するGOI13は、それぞれ66.8および77.4g/lの2KGA
と、それぞれ0.3および0.4 g/lの2KDを生成した。

【０１５４】（３）2KGA生産における酵素 sBの効果 プラスミドpSSsB[pVK100に酵素 sB遺伝子を含む2.7 kb
HindIIIカセットを導入したもの(図４)]および対照とな
るプラスミドpSSB103R(pVK102に酵素 B遺伝子を含む2.3
kb 酵素 B遺伝子を導入したもの）を接合伝達法によっ
てGOBΔKに導入した。pSSsBを有するGOBΔK、pSSB103R
を有するGOBΔKおよびGOBΔKを実施例８の（２）に記載
したようにPMSL8培地で培養したところ、それぞれ52.
0、46.8、および1.1 g/lの2KGAと、それぞれ6.9、9.3、
32.3 g/lの2KDを生成した。

【０１５５】GOI13(野性型の酵素 B、酵素 Aおよび酵素
A"を欠失し、染色体DNA上に１コピーの酵素 sB遺伝子
を有する）をPMSL10培地で２日間培養したところ、79.3
g/lのL-ソルボースを生成した。

【０１５６】

【発明の効果】アルコールおよび／またはアルデヒド脱
水素酵素活性を有するアルコールおよび／またはアルデ
ヒド脱水素酵素遺伝子をクローン化したことにより、組
換えDNA技術を用いて、クローン化した遺伝子を含むDNA
分子、該DNA分子を含む組換え発現ベクター、該DNA分子
または該発現ベクターを含む組換え体を作成することが
可能となり、また、これらを用いてクローン化した遺伝
子を発現させることにより、種々のアルデヒド、ケト
ン、カルボン酸、特に２-ケト-L-ギュロン酸、の生成に
有用なアルコールおよび／またはアルデヒド脱水素酵素
の組み換え調製物を製造することが可能となった。

【０１５７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1740 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：グルコノバクターオキシダンス(Gluconobacter
oxydans) 株名：DSM 4025 配列の特徴： 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1737 特徴を決定した方法：E 配列 ATGAAACCGA CTTCGCTGCT TTGGGCCAGT GCTGGCGCAC TTGCATTGCT 50 TGCCGCACCC GCCTTTGCTC AAGTGACCCC CGTCACCGAT GAATTGCTGG 100 CGAACCCGCC CGCTGGTGAA TGGATCAGCT ACGGTCAGAA CCAAGAAAAC 150 TACCGTCACT CGCCCCTGAC GCAGATCACG ACTGAGAACG TCGGCCAACT 200 GCAACTGGTC TGGGCGCGCG GCATGCAGCC GGGCAAAGTC CAAGTCACGC 250 CCCTGATCCA TGACGGCGTC ATGTATCTGG CAAACCCGGG CGACGTGATC 300 CAGGCCATCG ACGCCAAAAC TGGCGATCTG ATCTGGGAAC ACCGCCGCCA 350 ACTGCCGAAC ATCGCCACGC TGAACAGCTT TGGCGAGCCG ACCCGCGGCA 400 TGGCGCTGTA CGGCACCAAC GTTTACTTTG TTTCGTGGGA CAACCACCTG 450 GTCGCCCTCG ACACCGCAAC TGGCCAAGTG ACGTTCGACG TCGACCGCGG 500 CCAAGGCGAA GACATGGTTT CGAACTCGTC GGGCCCGATC GTGGCAAACG 550 GCGTGATCGT TGCCGGTTCG ACCTGCCAAT ACTCGCCGTT CGGCTGCTTT 600 GTCTCGGGCC ACGACTCGGC CACCGGTGAA GAGCTGTGGC GCAACTACTT 650 CATCCCGCGC GCTGGCGAAG AGGGTGATGA GACTTGGGGC AACGATTACG 700 AAGCCCGTTG GATGACCGGT GCCTGGGGCC AGATCACCTA TGACCCCGTC 750 ACCAACCTTG TCCACTACGG CTCGACCGCT GTGGGTCCGG CGTCGGAAAC 800 CCAACGCGGC ACCCCGGGCG GCACGCTGTA CGGCACGAAC ACCCGTTTCG 850 CGGTGCGTCC TGACACGGGC GAGATTGTCT GGCGTCACCA GACCCTGCCC 900 CGCGACAACT GGGACCAGGA ATGCACGTTC GAGATGATGG TCACCAATGT 950 GGATGTCCAA CCCTCGACCG AGATGGAAGG TCTGCAGTCG ATCAACCCGA 1000 ACGCCGCAAC TGGCGAGCGT CGCGTGCTGA CCGGCGTTCC GTGCAAAACC 1050 GGCACCATGT GGCAGTTCGA CGCCGAAACC GGCGAATTCC TGTGGGCCCG 1100 TGATACCAAC TACCAGAACA TGATCGAATC CATCGACGAA AACGGCATCG 1150 TGACCGTGAA CGAAGATGCG ATCCTGAAGG AACTGGATGT TGAATATGAC 1200 GTCTGCCCGA CCTTCTTGGG CGGCCGCGAC TGGCCGTCGG CCGCACTGAA 1250 CCCCGACAGC GGCATCTACT TCATCCCGCT GAACAACGTC TGCTATGACA 1300 TGATGGCCGT CGATCAGGAA TTCACCTCGA TGGACGTCTA TAACACCAGC 1350 AACGTGACCA AGCTGCCGCC CGGCAAGGAT ATGATCGGTC GTATTGACGC 1400 GATCGACATC AGCACGGGTC GTACGCTGTG GTCGGTCGAA CGTGCTGCGG 1450 CGAACTATTC GCCCGTCTTG TCGACCGGCG GCGGCGTTCT GTTCAACGGT 1500 GGTACGGATC GTTACTTCCG CGCCCTCAGC CAAGAAACCG GCGAGACCCT 1550 GTGGCAGACC CGCCTTGCAA CCGTCGCGTC GGGCCAGGCC ATCTCTTACG 1600 AGGTTGACGG CATGCAATAT GTCGCCATCG CAGGTGGTGG TGTCAGCTAT 1650 GGCTCGGGCC TGAACTCGGC ACTGGCTGGC GAGCGAGTCG ACTCGACCGC 1700 CATCGGTAAC GCCGTCTACG TCTTCGCCCT GCCGCAATAA 1740 配列番号：２ 配列の長さ：1740 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：グルコノバクターオキシダンス(Gluconobacter
oxydans) 株名：DSM 4025 配列の特徴： 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1737 特徴を決定した方法：E 配列 ATGAAGACGT CGTCTTTGCT GGTTGCGAGC GTTGCCGCGC TTGCAAGCTA 50 TAGCTCCTTT GCGCTTGCTC AAGTGACCCC CGTCACCGAT GAATTGCTGG 100 CGAACCCGCC CGCTGGTGAA TGGATCAGCT ACGGTCAGAA CCAAGAAAAC 150 TACCGTCACT CGCCCCTGAC GCAGATCACG ACTGAGAACG TCGGCCAACT 200 GCAACTGGTC TGGGCGCGCG GCATGCAGCC GGGCAAAGTC CAAGTCACGC 250 CCCTGATCCA TGACGGCGTC ATGTATCTGG CAAACCCGGG CGACGTGATC 300 CAGGCCATCG ACGCCAAAAC TGGCGATCTG ATCTGGGAAC ACCGCCGCCA 350 ACTGCCGAAC ATCGCCACGC TGAACAGCTT TGGCGAGCCG ACCCGCGGCA 400 TGGCGCTGTA CGGCACCAAC GTTTACTTTG TTTCGTGGGA CAACCACCTG 450 GTCGCCCTCG ACACCGCAAC TGGCCAAGTG ACGTTCGACG TCGACCGCGG 500 CCAAGGCGAA GACATGGTTT CGAACTCGTC GGGCCCGATC GTGGCAAACG 550 GCGTGATCGT TGCCGGTTCG ACCTGCCAAT ACTCGCCGTT CGGCTGCTTT 600 GTCTCGGGCC ACGACTCGGC CACCGGTGAA GAGCTGTGGC GCAACTACTT 650 CATCCCGCGC GCTGGCGAAG AGGGTGATGA GACTTGGGGC AACGATTACG 700 AAGCCCGTTG GATGACCGGC GTCTGGGGTC AGATCACCTA TGACCCCGTT 750 GGCGGCCTTG TCCACTACGG CTCGTCGGCT GTTGGCCCGG CTTCGGAAAC 800 CCAGCGCGGC ACCACCGGCG GCACCATGTA CGGCACCAAC ACCCGTTTCG 850 CTGTCCGTCC CGAGACTGGC GAGATCGTCT GGCGTCACCA AACTCTGCCC 900 CGCGACAACT GGGACCAAGA GTGCACCTTC GAGATGATGG TTGCCAACGT 950 TGACGTGCAG CCCGCAGCTG ACATGGACGG CGTCCGCTCG ATCAACCCGA 1000 ACGCCGCCAC CGGCGAGCGT CGCGTTCTGA CCGGCGTTCC GTGCAAAACC 1050 GGCACCATGT GGCAGTTCGA CGCCGAAACC GGCGAATTCC TGTGGGCCCG 1100 TGACACCAGC TACGAGAACA TCATCGAATC GATCGACGAA AACGGCATCG 1150 TGACCGTCGA CGAGTCGAAA GTTCTGACCG AGCTGGACAC CCCCTATGAC 1200 GTCTGCCCGC TGCTGCTGGG TGGCCGTGAC TGGCCGTCGG CTGCGCTGAA 1250 CCCCGATACC GGCATCTACT TTATCCCGCT GAACAACACC TGCATGGATA 1300 TCGAAGCTGT CGACCAGGAA TTCAGCTCGC TGGACGTGTA CAACCAAAGC 1350 CTGACCGCCA AAATGGCACC GGGTAAAGAG CTGGTTGGCC GTATCGACGC 1400 CATCGACATC AGCACAGGCC GCACCCTGTG GACCGCTGAG CGCGAAGCCT 1450 CGAACTACGC GCCTGTCCTG TCGACCGCTG GCGGCGTTCT GTTCAACGGC 1500 GGCACCGACC GTTACTTCCG CGCTCTCAGC CAAGAGACCG GCGAGACCCT 1550 GTGGCAGACC CGTCTGGCGA CTGTCGCTTC GGGCCAAGCT GTCTCGTACG 1600 AGATCGACGG CGTCCAATAC ATCGCCATCG GCGGCGGCGG CACGACCTAT 1650 GGTTCGTTCC ACAACCGTCC CCTGGCCGAG CCGGTCGACT CGACCGCGAT 1700 CGGTAATGCG ATGTACGTCT TCGCGCTGCC CCAGCAATAA 1740 配列番号：３ 配列の長さ：1737 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：グルコノバクターオキシダンス(Gluconobacter
oxydans) 株名：DSM 4025 配列の特徴： 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1734 特徴を決定した方法：E 配列 ATGAAACTGA CGACCCTGCT GCAAAGCAGC GCCGCCCTGC TTGTGCTTGG 50 CACCATTCCC GCCCTTGCCC AAACCGCCAT CACCGATGAA ATGCTGGCGA 100 ACCCGCCCGC TGGTGAATGG ATCAACTACG GTCAGAACCA AGAGAACTAC 150 CGCCACTCGC CCCTGACGCA GATTACCGCA GACAACGTCG GCCAACTGCA 200 ACTGGTCTGG GCGCGCGGTA TGGAAGCGGG CAAGATCCAA GTGACCCCGC 250 TTGTCCATGA CGGCGTCATG TATCTGGCAA ACCCCGGTGA CGTGATCCAG 300 GCCATCGACG CCGCGACCGG CGATCTGATC TGGGAACACC GCCGCCAACT 350 GCCGAACATC GCCACGCTGA ACAGCTTTGG TGAGCCGACC CGCGGCATGG 400 CCCTCTATGG CACCAACGTC TATTTCGTCT CGTGGGACAA CCACTTGGTC 450 GCGCTGGACA CCTCGACCGG CCAAGTCGTA TTCGACGTCG ATCGCGGTCA 500 AGGCACGGAT ATGGTCTCGA ACTCGTCCGG CCCGATTGTC GCCAATGGCG 550 TCATCGTTGC GGGCTCGACC TGTCAGTATT CGCCGTTCGG CTGTTTCGTT 600 TCGGGCCACG ACTCGGCCAC CGGTGAAGAG CTGTGGCGCA ACAACTTTAT 650 CCCGCGCGCC GGCGAAGAGG GTGATGAGAC CTGGGGCAAT GATTACGAGG 700 CCCGCTGGAT GACCGGCGTT TGGGGCCAGA TCACCTATGA CCCCGTTGGC 750 GGCCTTGTCC ACTACGGCAC CTCAGCAGTT GGCCCTGCGG CCGAGATTCA 800 GCGCGGCACC GTTGGCGGCT CGATGTATGG CACCAACACC CGCTTTGCTG 850 TCCGCCCCGA GACCGGCGAG ATCGTCTGGC GTCACCAAAC TCTGCCCCGC 900 GACAACTGGG ACCAAGAGTG TACGTTCGAG ATGATGGTCG TCAACGTCGA 950 CGTCCAGCCC TCGGCTGAGA TGGAAGGCCT GCACGCCATC AACCCCGATG 1000 CCGCCACGGG CGAGCGTCGC GTTGTGACCG GCGTTCCGTG CAAGAACGGC 1050 ACCATGTGGC AGTTCGACGC CGAAACCGGC GAATTCCTGT GGGCGCGCGA 1100 CACCAGCTAT CAGAACCTGA TCGAAAGCGT CGATCCCGAT GGTCTGGTGC 1150 ATGTGAACGA AGATCTGGTC GTGACCGAGC TGGAAGTGGC CTATGAAATC 1200 TGCCCGACCT TCCTGGGTGG CCGCGACTGG CCGTCGGCTG CGCTGAACCC 1250 CGATACTGGC ATCTATTTCA TCCCGCTGAA CAACGCCTGT AGCGGTATGA 1300 CGGCTGTCGA CCAAGAGTTC AGCTCGCTCG ATGTGTATAA CGTCAGCCTC 1350 GACTATAAAC TGTCGCCCGG TTCGGAAAAC ATGGGCCGTA TCGACGCCAT 1400 CGACATCAGC ACCGGCCGCA CGCTGTGGTC GGCTGAACGC TACGCCTCGA 1450 ACTACGCGCC TGTCCTGTCC ACCGGCGGCG GCGTGCTGTT CAACGGCGGC 1500 ACCGACCGTT ACTTCCGCGC CCTCAGCCAA GAGACCGGCG AGACGCTGTG 1550 GCAGACCCGT CTGGCGACTG TCGCCTCGGG TCAAGCGATT TCCTATGAGA 1600 TCGACGGCGT GCAATATGTC GCCATCGGGC GCGGCGGCAC CAGCTATGGC 1650 AGCAACCACA ACCGCGCCCT GACCGAGCGG ATCGACTCGA CCGCCATCGG 1700 CAGCGCGATC TATGTCTTTG CTCTGCCGCA GCAGTAA 1737 配列番号：４ 配列の長さ：1740 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：グルコノバクターオキシダンス(Gluconobacter
oxydans) 株名：DSM 4025 配列の特徴： 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1737 特徴を決定した方法：E 配列 ATGAACCCCA CAACGCTGCT TCGCACCAGC GCGGCCGTGC TATTGCTTAC 50 CGCGCCCGCC GCATTCGCGC AGGTAACCCC GATTACCGAT GAACTGCTGG 100 CGAACCCGCC CGCTGGTGAA TGGATTAACT ACGGCCGCAA CCAAGAAAAC 150 TATCGCCACT CGCCCCTGAC CCAGATCACT GCCGACAACG TTGGTCAGTT 200 GCAACTGGTC TGGGCCCGCG GGATGGAGGC GGGGGCCGTA CAGGTCACGC 250 CGATGATCCA TGATGGCGTG ATGTATCTGG CAAACCCCGG TGATGTGATC 300 CAGGCGCTGG ATGCGCAAAC AGGCGATCTG ATCTGGGAAC ACCGCCGCCA 350 ACTGCCCGCC GTCGCCACGC TAAACGCCCA AGGCGACCGC AAGCGCGGCG 400 TCGCCCTTTA CGGCACGAGC CTCTATTTCA GCTCATGGGA CAACCATCTG 450 ATCGCGCTGG ATATGGAGAC GGGCCAGGTC GTATTCGATG TCGAACGTGG 500 ATCGGGCGAA GACGGCTTGA CCAGTAACAC CACGGGGCCG ATTGTCGCCA 550 ATGGCGTCAT CGTCGCGGGT TCCACCTGCC AATATTCGCC CTATGGATGC 600 TTTATCTCGG GGCACGATTC CGCGACGGGT GAGGAGCTGT GGCGCAACCA 650 CTTTATCCCG CAGCCGGGCG AAGAGGGTGA CGAGACTTGG GGCAATGATT 700 TCGAGGCGCG CTGGATGACC GGCGTCTGGG GTCAGATCAC CTATGATCCC 750 GTGACGAACC TTGTGTTCTA TGGCTCGACC GGCGTGGGCC CAGCGTCCGA 800 AACCCAGCGC GGCACGCCGG GCGGCACGCT GTATGGCACC AACACCCGCT 850 TTGCGGTGCG TCCCGACACG GGCGAGATTG TCTGGCGTCA CCAGACCCTG 900 CCGCGCGACA ACTGGGACCA AGAATGCACG TTCGAGATGA TGGTCGCCAA 950 CGTCGATGTG CAACCCTCGG CCGAGATGGA GGGTCTGCGC GCCATCAACC 1000 CCAATGCGGC GACGGGCGAG CGCCGTGTGC TGACGGGTGC GCCTTGCAAG 1050 ACCGGCACGA TGTGGTCGTT TGATGCGGCC TCGGGCGAAT TCCTGTGGGC 1100 GCGTGATACC AACTACACCA ATATGATCGC CTCGATCGAC GAGACCGGCC 1150 TTGTGACGGT GAACGAGGAT GCGGTGCTGA AAGAGCTGGA CGTTGAATAT 1200 GACGTCTGCC CGACCTTCCT GGGTGGGCGC GACTGGTCGT CAGCCGCACT 1250 GAACCCGGAC ACCGGCATTT ACTTCTTGCC GCTGAACAAT GCCTGCTACG 1300 ATATTATGGC CGTTGATCAA GAGTTTAGCG CGCTCGACGT CTATAACACC 1350 AGCGCGACCG CAAAACTCGC GCCGGGCTTT GAAAATATGG GCCGCATCGA 1400 CGCGATTGAT ATCAGCACCG GGCGCACCTT GTGGTCGGCG GAGCGCCCTG 1450 CGGCGAACTA CTCGCCCGTT TTGTCGACGG CAGGCGGTGT GGTGTTCAAC 1500 GGCGGGACCG ACCGCTATTT CCGTGCCCTC AGCCAGGAAA CCGGCGAGAC 1550 TTTGTGGCAG GCCCGTCTTG CGACGGTCGC GACGGGGCAG GCGATCAGCT 1600 ACGAGTTGGA CGGCGTGCAA TATATCGCCA TCGGTGCGGG CGGTCTGACC 1650 TATGGCACGC AATTGAACGC GCCGCTGGCC GAGGCAATCG ATTCGACCTC 1700 GGTCGGTAAT GCGATCTATG TCTTTGCACT GCCGCAGTAA 1740 配列番号：５ 配列の長さ：579 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：グルコノバクターオキシダンス(Gluconobacter
oxydans) 株名：DSM 4025 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-23..-1 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..556 特徴を決定した方法：E Met Lys Pro Thr Ser Leu Leu Trp Ala Ser Ala Gly Ala Leu Ala -20 -15 -10 Leu Leu Ala Ala Pro Ala Phe Ala Gln Val Thr Pro Val Thr Asp -5 1 5 Glu Leu Leu Ala Asn Pro Pro Ala Gly Glu Trp Ile Ser Tyr Gly 10 15 20 Gln Asn Gln Glu Asn Tyr Arg His Ser Pro Leu Thr Gln Ile Thr 25 30 35 Thr Glu Asn Val Gly Gln Leu Gln Leu Val Trp Ala Arg Gly Met 40 45 50 Gln Pro Gly Lys Val Gln Val Thr Pro Leu Ile His Asp Gly Val 55 60 65 Met Tyr Leu Ala Asn Pro Gly Asp Val Ile Gln Ala Ile Asp Ala 70 75 80 Lys Thr Gly Asp Leu Ile Trp Glu His Arg Arg Gln Leu Pro Asn 85 90 95 Ile Ala Thr Leu Asn Ser Phe Gly Glu Pro Thr Arg Gly Met Ala 100 105 110 Leu Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Phe Val Ser Trp Asp Asn His Leu 115 120 125 Val Ala Leu Asp Thr Ala Thr Gly Gln Val Thr Phe Asp Val Asp 130 135 140 Arg Gly Gln Gly Glu Asp Met Val Ser Asn Ser Ser Gly Pro Ile 145 150 155 Val Ala Asn Gly Val Ile Val Ala Gly Ser Thr Cys Gln Tyr Ser 160 165 170 Pro Phe Gly Cys Phe Val Ser Gly His Asp Ser Ala Thr Gly Glu 175 180 185 Glu Leu Trp Arg Asn Tyr Phe Ile Pro Arg Ala Gly Glu Glu Gly 190 195 200 Asp Glu Thr Trp Gly Asn Asp Tyr Glu Ala Arg Trp Met Thr Gly 205 210 215 Ala Trp Gly Gln Ile Thr Tyr Asp Pro Val Thr Asn Leu Val His 220 225 230 Tyr Gly Ser Thr Ala Val Gly Pro Ala Ser Glu Thr Gln Arg Gly 235 240 245 Thr Pro Gly Gly Thr Leu Tyr Gly Thr Asn Thr Arg Phe Ala Val 250 255 260 Arg Pro Asp Thr Gly Glu Ile Val Trp Arg His Gln Thr Leu Pro 265 270 275 Arg Asp Asn Trp Asp Gln Glu Cys Thr Phe Glu Met Met Val Thr 280 285 290 Asn Val Asp Val Gln Pro Ser Thr Glu Met Glu Gly Leu Gln Ser 295 300 305 Ile Asn Pro Asn Ala Ala Thr Gly Glu Arg Arg Val Leu Thr Gly 310 315 320 Val Pro Cys Lys Thr Gly Thr Met Trp Gln Phe Asp Ala Glu Thr 325 330 335 Gly Glu Phe Leu Trp Ala Arg Asp Thr Asn Tyr Gln Asn Met Ile 340 345 350 Glu Ser Ile Asp Glu Asn Gly Ile Val Thr Val Asn Glu Asp Ala 355 360 365 Ile Leu Lys Glu Leu Asp Val Glu Tyr Asp Val Cys Pro Thr Phe 370 375 380 Leu Gly Gly Arg Asp Trp Pro Ser Ala Ala Leu Asn Pro Asp Ser 385 390 395 Gly Ile Tyr Phe Ile Pro Leu Asn Asn Val Cys Tyr Asp Met Met 400 405 410 Ala Val Asp Gln Glu Phe Thr Ser Met Asp Val Tyr Asn Thr Ser 415 420 425 Asn Val Thr Lys Leu Pro Pro Gly Lys Asp Met Ile Gly Arg Ile 430 435 440 Asp Ala Ile Asp Ile Ser Thr Gly Arg Thr Leu Trp Ser Val Glu 445 450 455 Arg Ala Ala Ala Asn Tyr Ser Pro Val Leu Ser Thr Gly Gly Gly 460 465 470 Val Leu Phe Asn Gly Gly Thr Asp Arg Tyr Phe Arg Ala Leu Ser 475 480 485 Gln Glu Thr Gly Glu Thr Leu Trp Gln Thr Arg Leu Ala Thr Val 490 495 500 Ala Ser Gly Gln Ala Ile Ser Tyr Glu Val Asp Gly Met Gln Tyr 505 510 515 Val Ala Ile Ala Gly Gly Gly Val Ser Tyr Gly Ser Gly Leu Asn 520 525 530 Ser Ala Leu Ala Gly Glu Arg Val Asp Ser Thr Ala Ile Gly Asn 535 540 545 Ala Val Tyr Val Phe Ala Leu Pro Gln 550 555 配列番号：６ 配列の長さ：579 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：グルコノバクターオキシダンス(Gluconobacter
oxydans) 株名：DSM 4025 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-23..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..556 特徴を決定した方法：S 配列 Met Lys Thr Ser Ser Leu Leu Val Ala Ser Val Ala Ala Leu Ala -20 -15 -10 Ser Tyr Ser Ser Phe Ala Leu Ala Gln Val Thr Pro Val Thr Asp -5 1 5 Glu Leu Leu Ala Asn Pro Pro Ala Gly Glu Trp Ile Ser Tyr Gly 10 15 20 Gln Asn Gln Glu Asn Tyr Arg His Ser Pro Leu Thr Gln Ile Thr 25 30 35 Thr Glu Asn Val Gly Gln Leu Gln Leu Val Trp Ala Arg Gly Met 40 45 50 Gln Pro Gly Lys Val Gln Val Thr Pro Leu Ile His Asp Gly Val 55 60 65 Met Tyr Leu Ala Asn Pro Gly Asp Val Ile Gln Ala Ile Asp Ala 70 75 80 Lys Thr Gly Asp Leu Ile Trp Glu His Arg Arg Gln Leu Pro Asn 85 90 95 Ile Ala Thr Leu Asn Ser Phe Gly Glu Pro Thr Arg Gly Met Ala 100 105 110 Leu Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Phe Val Ser Trp Asp Asn His Leu 115 120 125 Val Ala Leu Asp Thr Ala Thr Gly Gln Val Thr Phe Asp Val Asp 130 135 140 Arg Gly Gln Gly Glu Asp Met Val Ser Asn Ser Ser Gly Pro Ile 145 150 155 Val Ala Asn Gly Val Ile Val Ala Gly Ser Thr Cys Gln Tyr Ser 160 165 170 Pro Phe Gly Cys Phe Val Ser Gly His Asp Ser Ala Thr Gly Glu 175 180 185 Glu Leu Trp Arg Asn Tyr Phe Ile Pro Arg Ala Gly Glu Glu Gly 190 195 200 Asp Glu Thr Trp Gly Asn Asp Tyr Glu Ala Arg Trp Met Thr Gly 205 210 215 Val Trp Gly Gln Ile Thr Tyr Asp Pro Val Gly Gly Leu Val His 220 225 230 Tyr Gly Ser Ser Ala Val Gly Pro Ala Ser Glu Thr Gln Arg Gly 235 240 245 Thr Thr Gly Gly Thr Met Tyr Gly Thr Asn Thr Arg Phe Ala Val 250 255 260 Arg Pro Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Arg His Gln Thr Leu Pro 265 270 275 Arg Asp Asn Trp Asp Gln Glu Cys Thr Phe Glu Met Met Val Ala 280 285 290 Asn Val Asp Val Gln Pro Ala Ala Asp Met Asp Gly Val Arg Ser 295 300 305 Ile Asn Pro Asn Ala Ala Thr Gly Glu Arg Arg Val Leu Thr Gly 310 315 320 Val Pro Cys Lys Thr Gly Thr Met Trp Gln Phe Asp Ala Glu Thr 325 330 335 Gly Glu Phe Leu Trp Ala Arg Asp Thr Ser Tyr Glu Asn Ile Ile 340 345 350 Glu Ser Ile Asp Glu Asn Gly Ile Val Thr Val Asp Glu Ser Lys 355 360 365 Val Leu Thr Glu Leu Asp Thr Pro Tyr Asp Val Cys Pro Leu Leu 370 375 380 Leu Gly Gly Arg Asp Trp Pro Ser Ala Ala Leu Asn Pro Asp Thr 385 390 395 Gly Ile Tyr Phe Ile Pro Leu Asn Asn Thr Cys Met Asp Ile Glu 400 405 410 Ala Val Asp Gln Glu Phe Ser Ser Leu Asp Val Tyr Asn Gln Ser 415 420 425 Leu Thr Ala Lys Met Ala Pro Gly Lys Glu Leu Val Gly Arg Ile 430 435 440 Asp Ala Ile Asp Ile Ser Thr Gly Arg Thr Leu Trp Thr Ala Glu 445 450 455 Arg Glu Ala Ser Asn Tyr Ala Pro Val Leu Ser Thr Ala Gly Gly 460 465 470 Val Leu Phe Asn Gly Gly Thr Asp Arg Tyr Phe Arg Ala Leu Ser 475 480 485 Gln Glu Thr Gly Glu Thr Leu Trp Gln Thr Arg Leu Ala Thr Val 490 495 500 Ala Ser Gly Gln Ala Val Ser Tyr Glu Ile Asp Gly Val Gln Tyr 505 510 515 Ile Ala Ile Gly Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Gly Ser Phe His Asn 520 525 530 Arg Pro Leu Ala Glu Pro Val Asp Ser Thr Ala Ile Gly Asn Ala 535 540 545 Met Tyr Val Phe Ala Leu Pro Gln Gln 550 555 配列番号：７ 配列の長さ：578 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：グルコノバクターオキシダンス(Gluconobacter
oxydans) 株名：DSM 4025 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-23..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..555 特徴を決定した方法：S 配列 Met Lys Leu Thr Thr Leu Leu Gln Ser Ser Ala Ala Leu Leu Val -20 -15 -10 Leu Gly Thr Ile Pro Ala Leu Ala Gln Thr Ala Ile Thr Asp Glu -5 1 5 Met Leu Ala Asn Pro Pro Ala Gly Glu Trp Ile Asn Tyr Gly Gln 10 15 20 Asn Gln Glu Asn Tyr Arg His Ser Pro Leu Thr Gln Ile Thr Ala 25 30 35 Asp Asn Val Gly Gln Leu Gln Leu Val Trp Ala Arg Gly Met Glu 40 45 50 Ala Gly Lys Ile Gln Val Thr Pro Leu Val His Asp Gly Val Met 55 60 65 Tyr Leu Ala Asn Pro Gly Asp Val Ile Gln Ala Ile Asp Ala Ala 70 75 80 Thr Gly Asp Leu Ile Trp Glu His Arg Arg Gln Leu Pro Asn Ile 85 90 95 Ala Thr Leu Asn Ser Phe Gly Glu Pro Thr Arg Gly Met Ala Leu 100 105 110 Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Phe Val Ser Trp Asp Asn His Leu Val 115 120 125 Ala Leu Asp Thr Ser Thr Gly Gln Val Val Phe Asp Val Asp Arg 130 135 140 Gly Gln Gly Thr Asp Met Val Ser Asn Ser Ser Gly Pro Ile Val 145 150 155 Ala Asn Gly Val Ile Val Ala Gly Ser Thr Cys Gln Tyr Ser Pro 160 165 170 Phe Gly Cys Phe Val Ser Gly His Asp Ser Ala Thr Gly Glu Glu 175 180 185 Leu Trp Arg Asn Asn Phe Ile Pro Arg Ala Gly Glu Glu Gly Asp 190 195 200 Glu Thr Trp Gly Asn Asp Tyr Glu Ala Arg Trp Met Thr Gly Val 205 210 215 Trp Gly Gln Ile Thr Tyr Asp Pro Val Gly Gly Leu Val His Tyr 220 225 230 Gly Thr Ser Ala Val Gly Pro Ala Ala Glu Ile Gln Arg Gly Thr 235 240 245 Val Gly Gly Ser Met Tyr Gly Thr Asn Thr Arg Phe Ala Val Arg 250 255 260 Pro Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Arg His Gln Thr Leu Pro Arg 265 270 275 Asp Asn Trp Asp Gln Glu Cys Thr Phe Glu Met Met Val Val Asn 280 285 290 Val Asp Val Gln Pro Ser Ala Glu Met Glu Gly Leu His Ala Ile 295 300 305 Asn Pro Asp Ala Ala Thr Gly Glu Arg Arg Val Val Thr Gly Val 310 315 320 Pro Cys Lys Asn Gly Thr Met Trp Gln Phe Asp Ala Glu Thr Gly 325 330 335 Glu Phe Leu Trp Ala Arg Asp Thr Ser Tyr Gln Asn Leu Ile Glu 340 345 350 Ser Val Asp Pro Asp Gly Leu Val His Val Asn Glu Asp Leu Val 355 360 365 Val Thr Glu Leu Glu Val Ala Tyr Glu Ile Cys Pro Thr Phe Leu 370 375 380 Gly Gly Arg Asp Trp Pro Ser Ala Ala Leu Asn Pro Asp Thr Gly 385 390 395 Ile Tyr Phe Ile Pro Leu Asn Asn Ala Cys Ser Gly Met Thr Ala 400 405 410 Val Asp Gln Glu Phe Ser Ser Leu Asp Val Tyr Asn Val Ser Leu 415 420 425 Asp Tyr Lys Leu Ser Pro Gly Ser Glu Asn Met Gly Arg Ile Asp 430 435 440 Ala Ile Asp Ile Ser Thr Gly Arg Thr Leu Trp Ser Ala Glu Arg 445 450 455 Tyr Ala Ser Asn Tyr Ala Pro Val Leu Ser Thr Gly Gly Gly Val 460 465 470 Leu Phe Asn Gly Gly Thr Asp Arg Tyr Phe Arg Ala Leu Ser Gln 475 480 485 Glu Thr Gly Glu Thr Leu Trp Gln Thr Arg Leu Ala Thr Val Ala 490 495 500 Ser Gly Gln Ala Ile Ser Tyr Glu Ile Asp Gly Val Gln Tyr Val 505 510 515 Ala Ile Gly Arg Gly Gly Thr Ser Tyr Gly Ser Asn His Asn Arg 520 525 530 Ala Leu Thr Glu Arg Ile Asp Ser Thr Ala Ile Gly Ser Ala Ile 535 540 545 Tyr Val Phe Ala Leu Pro Gln Gln 550 555 配列番号：８ 配列の長さ：579 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：グルコノバクターオキシダンス(Gluconobacter
oxydans) 株名：DSM 4025 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-23..-1 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..556 特徴を決定した方法：E 配列 Met Asn Pro Thr Thr Leu Leu Arg Thr Ser Ala Ala Val Leu Leu -20 -15 -10 Leu Thr Ala Pro Ala Ala Phe Ala Gln Val Thr Pro Ile Thr Asp -5 1 5 Glu Leu Leu Ala Asn Pro Pro Ala Gly Glu Trp Ile Asn Tyr Gly 10 15 20 Arg Asn Gln Glu Asn Tyr Arg His Ser Pro Leu Thr Gln Ile Thr 25 30 35 Ala Asp Asn Val Gly Gln Leu Gln Leu Val Trp Ala Arg Gly Met 40 45 50 Glu Ala Gly Ala Val Gln Val Thr Pro Met Ile His Asp Gly Val 55 60 65 Met Tyr Leu Ala Asn Pro Gly Asp Val Ile Gln Ala Leu Asp Ala 70 75 80 Gln Thr Gly Asp Leu Ile Trp Glu His Arg Arg Gln Leu Pro Ala 85 90 95 Val Ala Thr Leu Asn Ala Gln Gly Asp Arg Lys Arg Gly Val Ala 100 105 110 Leu Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Phe Ser Ser Trp Asp Asn His Leu 115 120 125 Ile Ala Leu Asp Met Glu Thr Gly Gln Val Val Phe Asp Val Glu 130 135 140 Arg Gly Ser Gly Glu Asp Gly Leu Thr Ser Asn Thr Thr Gly Pro 145 150 155 Ile Val Ala Asn Gly Val Ile Val Ala Gly Ser Thr Cys Gln Tyr 160 165 170 Ser Pro Tyr Gly Cys Phe Ile Ser Gly His Asp Ser Ala Thr Gly 175 180 185 Glu Glu Leu Trp Arg Asn His Phe Ile Pro Gln Pro Gly Glu Glu 190 195 200 Gly Asp Glu Thr Trp Gly Asn Asp Phe Glu Ala Arg Trp Met Thr 205 210 215 Gly Val Trp Gly Gln Ile Thr Tyr Asp Pro Val Thr Asn Leu Val 220 225 230 Phe Tyr Gly Ser Thr Gly Val Gly Pro Ala Ser Glu Thr Gln Arg 235 240 245 Gly Thr Pro Gly Gly Thr Leu Tyr Gly Thr Asn Thr Arg Phe Ala 250 255 260 Val Arg Pro Asp Thr Gly Glu Ile Val Trp Arg His Gln Thr Leu 265 270 275 Pro Arg Asp Asn Trp Asp Gln Glu Cys Thr Phe Glu Met Met Val 280 285 290 Ala Asn Val Asp Val Gln Pro Ser Ala Glu Met Glu Gly Leu Arg 295 300 305 Ala Ile Asn Pro Asn Ala Ala Thr Gly Glu Arg Arg Val Leu Thr 310 315 320 Gly Ala Pro Cys Lys Thr Gly Thr Met Trp Ser Phe Asp Ala Ala 325 330 335 Ser Gly Glu Phe Leu Trp Ala Arg Asp Thr Asn Tyr Thr Asn Met 340 345 350 Ile Ala Ser Ile Asp Glu Thr Gly Leu Val Thr Val Asn Glu Asp 355 360 365 Ala Val Leu Lys Glu Leu Asp Val Glu Tyr Asp Val Cys Pro Thr 370 375 380 Phe Leu Gly Gly Arg Asp Trp Ser Ser Ala Ala Leu Asn Pro Asp 385 390 395 Thr Gly Ile Tyr Phe Leu Pro Leu Asn Asn Ala Cys Tyr Asp Ile 400 405 410 Met Ala Val Asp Gln Glu Phe Ser Ala Leu Asp Val Tyr Asn Thr 415 420 425 Ser Ala Thr Ala Lys Leu Ala Pro Gly Phe Glu Asn Met Gly Arg 430 435 440 Ile Asp Ala Ile Asp Ile Ser Thr Gly Arg Thr Leu Trp Ser Ala 445 450 455 Glu Arg Pro Ala Ala Asn Tyr Ser Pro Val Leu Ser Thr Ala Gly 460 465 470 Gly Val Val Phe Asn Gly Gly Thr Asp Arg Tyr Phe Arg Ala Leu 475 480 485 Ser Gln Glu Thr Gly Glu Thr Leu Trp Gln Ala Arg Leu Ala Thr 490 495 500 Val Ala Thr Gly Gln Ala Ile Ser Tyr Glu Leu Asp Gly Val Gln 505 510 515 Tyr Ile Ala Ile Gly Ala Gly Gly Leu Thr Tyr Gly Thr Gln Leu 520 525 530 Asn Ala Pro Leu Ala Glu Ala Ile Asp Ser Thr Ser Val Gly Asn 535 540 545 Ala Ile Tyr Val Phe Ala Leu Pro Gln 550 555 配列番号：９ 配列の長さ：82 配列の型：ヌクレオチド トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 起源：他の核酸 他の核酸の説明：合成オリゴヌクレオチド 配列 CATGAAAATA AAAACAGGTG CACGCATCCT CGCATTATCC GCATTAACGA 50 CGATGATGTT TTCCGCCTCG GCTCTCGCCC AG 82 配列番号：１０ 配列の長さ：83 配列の型：ヌクレオチド トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 起源：他の核酸 他の核酸の説明：合成オリゴヌクレオチド 配列 GTTACCTGGG CGAGAGCCGA GGCGGAAAAC ATCATCGTCG TTAATGCGGA 50 TAATGCGAGG ATGCGTGCAC CTGTTTTTAT TTT 83 配列番号：１１ 配列の長さ：27 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：大腸菌 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..26 特徴を決定した方法：S 配列 Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu 1 5 10 15 Thr Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Gln 20 25 27 配列番号：１２ 配列の長さ：27 配列の型：ヌクレオチド トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 起源：他の核酸 他の核酸の説明：合成オリゴヌクレオチド 配列 GTTAGCGCGG TGGATCCCCA TTGGAGG 27

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の組換え酵素 Aまたは酵素 Bをコード
する組換えDNA分子を各々有する組換え発現ベクターの
構造の概略図である。

【図２】 本発明のキメラ酵素をコードする組換えDNA
分子を各々有する組換え発現ベクターの構造の概略図で
ある。

【図３】 相同組換え法によるキメラの構築のための直
列に並ぶ酵素 Aおよび酵素 Bの構造遺伝子を含有する組
換えDNA分子を有する材料プラスミドの構造の概略図で
ある。

【図４】 好ましいコドンを用いたキメラ酵素 sA2、酵
素 sA21、酵素 sA22または酵素 sBを各々コードする組
換え発現ベクターの構造の概略図である。酵素 sA2は
「酵素 Aの第１〜第１３５残基と酵素 Bの第１３６〜第
１８０残基と酵素 Aの第１８０〜第５５６残基」を含む
構造を有する。酵素 sA21は「酵素 Aの第１〜第１２８
残基と酵素 Bの第１２９〜第１８０残基と酵素 Aの第１
８０〜第５５６残基」を含む構造を有する。酵素 sA22
は「酵素 Aの第１〜第１２５残基と酵素 Bの第１２６〜
第１８０残基と酵素 Aの第１８０〜第５５６残基」を含
む構造を有する。酵素 sBは「酵素 Aの第１〜第９５残
基と酵素 Bの第９６〜第１８０残基と酵素 Aの第１８０
〜第５５６残基」を含む構造を有する。上述の番号は各
々の成熟(mature)酵素のアミノ酸残基の番号である。図
中、^*１、^*２、^*３、^*４および^*５は塩基配列におけるA
vaI切断部位に相当する組換え部位を示し、各々成熟型
酵素 Aのアミノ酸残基番号１３５、１２８、１２５、９
５および１８０を示す。

【図５】 成熟酵素 Aと酵素 Bのアミノ酸配列の並列図
である。図中、^*で示した領域をコードする塩基配列
は、図２に示されるキメラ遺伝子を構築するために用い
た、AvaI、EcoRIおよびSalI切断部位を表す。

【図６】 本発明のキメラ酵素をコードする組換え遺伝
子の構築法を図示したものである。

【図７】 酵素 A遺伝子と酵素 B遺伝子の制限酵素地図
を図示している。図中、^*は図２および図６に示したキ
メラ遺伝子を作成するのに用いたAvaI、EcoRIおよびSal
I切断部位を表す。

【図８】 二つのAADH遺伝子中の共通塩基配列における
生体内相同組換えによるキメラ遺伝子の構築法を図示し
ている。

【図９】 酵素 B遺伝子の上流にBamHI部位を導入する
ための部位特異的変異法を示す。

【図１０】 酵素 B遺伝子のプロモーターの置換方法を
図示している。

【図１１】 本発明のキメラ酵素の基質特異性のグラフ
を示す。図中、酵素活性は（１）では、n-プロパノール
に対する、（２）ではD-グルコースに対する相対活性と
して表した。酵素 A/B2はシュードモナス プチダにお
ける発現レベルが低かったため測定対象から除外した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 19/02 Ｃ１２Ｐ 19/02 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 尾島 せつ子 神奈川県藤沢市善行団地３−22−304 (72)発明者 新城 雅子 神奈川県鎌倉市台５−５−30 (72)発明者 富山 哲史 神奈川県藤沢市川名１−１−27 サングレ イス藤沢壱番館305

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号:５、配列番号:６、配列番号:
   ７および配列番号:８により同定されるポリペプチド、
   並びに配列番号:５、配列番号:６、配列番号:７および
   配列番号:８により同定されるポリペプチドの間のキメ
   ラ組換え酵素、並びに一つまたはそれ以上のアミノ酸残
   基の付加、挿入、欠失および／または置換を含む上記で
   同定されるポリペプチドの機能的誘導体からなる群より
   選択され、該酵素ポリペプチドがアルコールおよび／ま
   たはアルデヒド脱水素酵素活性を有する、一つまたはそ
   れ以上の酵素ポリペプチドを含む、アルコールおよび／
   またはアルデヒド脱水素酵素活性を有する組換え酵素調
   製物。
2. 【請求項２】 ポリペプチドが、酵素 A/B1、酵素 A/B
   2、酵素 A/B3、酵素B/A1、酵素 B/A2、酵素 B/A3、酵素
   sA2、酵素 sA21、酵素 sA22、酵素 sBおよびそれらの
   機能的誘導体のキメラ酵素である、請求項１記載の組換
   え酵素調製物。
3. 【請求項３】 酵素ポリペプチドが、ホモ二量体および
   ／またはヘテロ二量体の形態で存在する、請求項１また
   は２記載の組換え酵素調製物。
4. 【請求項４】 請求項１または２で定義されるポリペプ
   チドをコードするDNA分子。
5. 【請求項５】 直鎖状もしくは環状DNAまたは染色体上
   での挿入DNA断片のいずれかの形態で存在する、請求項
   ４記載のDNA分子。
6. 【請求項６】 請求項４または５のいずれか１項で定義
   される一つまたはそれ以上のDNA分子を含む、組換え発
   現ベクター。
7. 【請求項７】 DNA分子が、一つまたはそれ以上の遺伝
   子制御配列に機能的に結合しており、適当な宿主細胞に
   おいて請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵素ポリペ
   プチドを発現可能である、請求項６記載の組換え発現ベ
   クター。
8. 【請求項８】 pSSA102R、pSSA'101R、pSSA"102、pSSB1
   03R、pSSAp-B、pSSA/B101R、pSSA/B102R、pSSA/B103R、
   pSSB/A101R、pSSB/A102R、pSSB/A103R、pSSsA2、pSSsA2
   1、pSSsA22およびpSSsBからなる群より選択される、請
   求項７記載の組換え発現ベクター。
9. 【請求項９】 請求項６〜８のいずれか１項に記載の組
   換え発現ベクターまたは請求項４もしくは５のいずれか
   １項で定義される一つまたはそれ以上のDNA分子を有す
   る組換え生物。
10. 【請求項１０】 宿主細胞が、微生物、哺乳動物細胞お
    よび植物細胞からなる群より選択される、請求項９記載
    の組換え生物。
11. 【請求項１１】 宿主細胞が、大腸菌(Escherichia col
    i)、シュードモナスプチダ(Pseudomonas putida)、アセ
    トバクター キシリナム(Acetobacter xylinum)、アセ
    トバクター パスチュリアヌス(Acetobacter pasteuria
    nus）、アセトバクター アセチ(Acetobacter acet
    i）、アセトバクター ハンゼニイ(Acetobacter hansen
    ii）およびグルコノバクター オキシダンス（Gluconob
    acter oxydans）等の細菌類からなる群より選択される
    微生物である、請求項９または１０記載の組換え生物。
12. 【請求項１２】 宿主細胞が、グルコノバクター オキ
    シダンス[DSM番号４０２５]である、請求項１１記載の
    組換え生物。
13. 【請求項１３】 請求項１０〜１２のいずれか１項で定
    義される組換え生物を適当な培地で培養し、組換え酵素
    を回収することを含む、請求項１、２または３で定義さ
    れるアルコールおよび／またはアルデヒド脱水素酵素活
    性を有する組換え酵素調製物の製造方法。
14. 【請求項１４】 請求項１０〜１２のいずれか１項で定
    義される組換え生物の生化学的反応により基質を生産物
    に変換することを含む、アルデヒド、ケトンまたはカル
    ボン酸生成物を対応する基質から製造する方法。
15. 【請求項１５】 請求項１０〜１２のいずれか１項で定
    義される組換え生物の生化学的反応によりL-ソルボース
    および／またはD-ソルビトールを２-ケト-L-ギュロン酸
    に変換することを含む、L-ソルボースおよび／またはD-
    ソルビトールから２-ケト-L-ギュロン酸を製造する方
    法。
16. 【請求項１６】 請求項１〜３のいずれか１項で定義さ
    れる組換え酵素調製物および基質を含有する反応混合液
    をインキュベートすることを含む、アルデヒド、ケト
    ン、またはカルボン酸生成物を対応する基質から製造す
    る方法。
17. 【請求項１７】 請求項１〜３のいずれか１項で定義さ
    れる組換え酵素調製物とL-ソルボースおよび／またはD-
    ソルビトールとを含有する反応混合液をインキュベート
    することを含む、２-ケト-L-ギュロン酸の製造方法。
18. 【請求項１８】 請求項１５または１７記載の製造方法
    が達成され、該製造方法により得られる２-ケト-L-ギュ
    ロン酸が、当技術分野で既知の方法によりL-アスコルビ
    ン酸に変換されることを特徴とする、２-ケト-L-ギュロ
    ン酸からのL-アスコルビン酸の製造方法。