JPH10234380A - フザリウム属菌検出用の核酸配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 土壌原害真菌のフザリウム属菌を簡便、迅
速、かつ高感度で検出または同定するためのオリゴヌク
レオチドを提供することを課題とする。 【解決手段】 配列番号：1から配列番号：8のいずれか
の塩基配列、またはそれらに相補的な塩基配列を含む、
フザリウム属に属する真菌を検出または同定するための
オリゴヌクレオチドを提供した。これらのオリゴヌクレ
オチドは、フザリウム属菌の簡便、迅速、かつ高感度な
検出または同定に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、土壌伝染性病原真
菌の検出・同定に有効なオリゴヌクレオチドに関する。
さらに詳しくは、作物の土壌病害を引き起こす病原真菌
のフザリウム属に属する真菌を、該属に特有な18Sリボ
ゾームRNA（以下「18S rRNA」と称する）の配列を利用
して迅速、簡便かつ正確に感度よく検出・同定するため
のオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドを
用いたフザリウム属に属する真菌の検出・同定法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】農業分野における作物土壌病原菌の防除
は重要な課題である。特に畑作農業に起こる連作障害
は、土壌伝染性の真菌（カビ）が最大の原因となってい
る。作物土壌病原菌を検出・同定する一般的な手法とし
ては、病害部を直接顕微鏡観察したり、病害部から病原
菌を分離培養してから判定する手法（一戸正勝：防菌防
黴、18、399-406 (1990)）が従来からとられているが、
これらの方法は、判定までに長時間を要し、検出感度が
低く、さらに少なくとも植物病理学的な専門知識や技術
が必要となるという欠点がある。一方、土壌病原菌に対
する抗体を利用して、目的とする土壌病原菌を検出・同
定しようとする抗原抗体反応を応用した免疫学的手法
（Schots et al.,Modern Assays for Plant Pathogenic
Fungi: Identification, Detection and Quantificati
on: CAB INERNATIONAL (1994)）は、簡便で判定時間も
短縮できるが、反応の特異性そのものに限界があるとい
う欠点がある。従って、早期に適切な病害防除対策を行
うために、発病を引き起こしている土壌病原菌を簡便に
素早く特定できる診断・同定キットの開発が農業現場で
は望まれている。

【０００３】ところで、作物土壌微生物病原菌の中でも
フザリウム属菌は、長期間の生存に耐えられる菌糸の一
部が厚い膜をかぶった厚膜胞子という耐久体の状態土壌
中に生息しているため、熱や薬剤に対する抵抗性が分生
胞子の他の糸状菌よりもはるかに高いという特徴があ
る。そのため、フザリウム属菌の土壌病害が一度発生す
ると翌年も発生するだけでなく、数年間の作物の輪作を
しても発病が完全になくならないことが多い深刻な土壌
病原菌である。

【０００４】土壌病害を引き起こすフザリウム属菌には
いろいろな種類がある。この菌は作物の根冠から水や養
分を地上部に運ぶ導管に侵入して、導管閉塞を起こした
り、茎葉の導管に広がって増殖して作物を枯死、萎ちょ
うさせる種と、至る所の根から侵入して、導管に入らず
に根の表面近くの皮層組織で増殖して作物の根や茎を褐
変、腐敗させる種がある。

【０００５】導管病を起こすフザリウム・オキシスポラ
ム（Fusarium oxysporum）には、多数の分化型の菌が存
在し、特定の種類の作物だけにしか寄生しない特徴があ
る。一方、皮層組織を侵す代表菌であるフザリウム・ソ
ラニー（Fusarium solani）にも、多数の分化型が存在
しており、この種の菌はオキシスポラム種と同様に1種
類の作物しか侵さないものと、数種の作物を侵すものが
ある。それに伴い、感染する作物の種類も多種多様な野
菜から、果樹、草花と広範囲に及んでいる。フザリウム
属菌は典型的な導管病菌であるため、この菌の感染を受
けると作物被害は急速に進行する。

【０００６】そこで、作物土壌微生物病原菌の中でも特
にフザリウム属菌については、簡便で、迅速かつ正確で
あり高感度な検出または同定法の開発が望まれていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、土壌伝染性
病原真菌であるフザリウム属菌を簡便、迅速かつ正確に
感度よく検出し同定するために利用できる新規なオリゴ
ヌクレオチドを提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、相補的な
塩基配列同士の親和性を利用することにより、従来の病
害部の顕微鏡観察や病害部から病原菌の分離培養による
方法よりも迅速かつ高感度で、また従来の抗原抗体反応
を用いる方法よりも高い特異性でフザリウム属菌の検出
または同定が可能であると考えた。特に、本発明者ら
は、進化が遅いため属菌間ごとに特徴的な塩基配列が高
度に保存されている領域が存在するという特性を有する
18S rRNA遺伝子に着目し、該遺伝子に含まれる塩基配列
のうちフザリウム属菌に特異的な塩基配列を選抜し、該
配列を利用することによりフザリウム属菌を効率的に検
出または同定できるのではないかと考えた。

【０００９】本発明者らはかかる考えに基づき鋭意研究
を行った結果、フザリウム属菌から18S rRNA遺伝子を単
離してその全塩基配列を決定し、他の属に属する菌の18
S rRNAの塩基配列と比較することにより、フザリウム属
菌に特異的な塩基配列を選抜し特定することに成功し
た。さらに、本発明者らは、実際にこのフザリウム属菌
に特異的な塩基配列を基にプローブおよびプライマーを
調製し、これら核酸分子を用い簡易かつ迅速な検出が可
能なPCR法およびハイブリダイゼーション法によりフザ
リウム属菌の検出を行った。この結果、本発明者らは、
これら核酸分子の使用によりフザリウム属菌を特異的か
つ高感度で検出できることを見いだし、本発明を完成す
るに至った。

【００１０】なお、カンジダ（Candida）またはクリプ
トコッカス（Cryptococcus）などの真菌に関しては、18
S rRNA遺伝子の塩基配列とハイブリダイズする検出用オ
リゴヌクレオチドが開示されているが（特開平8-8925
4）、フザリウム属菌への応用は全く知られていない。

【００１１】即ち、本発明は、簡便、迅速、特異的、か
つ高感度でフザリウム属菌を検出、同定することが可能
な核酸分子、および該核酸分子を用いたフザリウム属菌
の検出方法に関する。より具体的には、本発明は、
（1）配列番号：1から配列番号：8のいずれかの塩基配
列、またはそれらに相補的な塩基配列を含む、フザリウ
ム属に属する真菌を検出または同定するためのオリゴヌ
クレオチド、例えば（2）（1）に記載のオリゴオチドか
らなるプローブ、（3）（1）に記載のオリゴオチドから
なるプライマー、に関する。

【００１２】また、本発明は、（4）(2）に記載のプロ
ーブまたは（3）に記載のプライマーを用いることを特
徴とするフザリウム属に属する真菌を検出または同定す
る方法、に関する。

【００１３】なお、本発明においてフザリウム属菌と
は、フザリウム属に属する真菌をさし、例えば、フザリ
ウム・アクミナタム（Fusarium acuminatum）、フザリ
ウム・エキュイセティ（Fusarium equiseti）、フザリ
ウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザ
リウム・モニリフォルメ（Fusarium moniliforme）、フ
ザリウム・ニヴァレ（Fusarium nivale）、フザリウム
・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム
・ポアエ（Fusarium poae）、フザリウム・ロゼウム（F
usarium roseum）、フザリウム・ソラニー（Fusarium s
olani）、フザリウム・スポロトリッチオイデス（Fusar
ium sporotrichioides）、およびフザリウム・トリシン
クタム（Fusarium tricinctum）などが含まれる。

【００１４】なお、本発明のオリゴヌクレオチドは、DN
AまたはRNAのいずれであってもよく、RNAの場合には、
本明細書における配列の記載においてチミジン残基
（T）をウリジン残基（U）と読み替えるものとする。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明のオリゴヌクレオチドは、
特異的かつ高感度な検出を可能とするためにできるだけ
フザリウム属菌に対して特異性が高い塩基配列であるこ
とが好ましい。このような配列には、例えば、配列番
号：1〜8のいずれかの塩基配列、またはそれらに相補的
な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。

【００１６】本発明のオリゴヌクレオチドは、フザリウ
ム属菌の18S rRNA遺伝子との特異的な親和性を有する限
り、フザリウム属菌が天然に有する18S rRNAに対して1
個または複数個の塩基が置換、欠失、付加した塩基配列
を含有していてもよい。

【００１７】本発明のオリゴヌクレオチドの由来には、
特に制限はない。本発明のオリゴヌクレオチドは、主に
化学合成法により調製することができる。

【００１８】本発明のオリゴヌクレオチドは、第一にフ
ザリウム属菌の18S rRNA遺伝子を検出または同定するた
めのハイブリダイゼーション用プローブとして用いられ
る。

【００１９】本発明のオリゴヌクレオチドがプローブと
して用いられる場合には、該オリゴヌクレオチドは通常
標識される。オリゴヌクレオチドの標識としては、例え
ば、ビオチン、ジゴキシゲニン、酵素、蛍光物質、発光
物質等の非放射性物質、または放射性同位元素などが用
いられるがこれらに制限されない。標識の方法には、3'
-テイリング法、3'末端ラベル法、及び5'末端ラベル法
等がある。また、PCR等により増幅させた配列を検出す
るために本プローブを用いる場合には、プローブは、そ
の増幅させた配列の範囲内のものを選択する。

【００２０】本発明のプローブを用いたフザリウム属菌
の検出または同定は、公知の方法、例えば、サザンハイ
ブリダイゼーション（Southern, E. M.: J. Mol. Bio
l., 98, 503-517 (1975)）、ノーザンハイブリダイゼー
ション（Thomas, P. S.: Proc.Natl. Acad. Sci. USA,
77, 5201 (1980)）、ドットハイブリダイゼーション（V
ries, M. V. et al: Gene, 50, 313-320 (1986)）など
により行うことが可能である。

【００２１】本発明のオリゴヌクレオチドはまた、核酸
増幅用のプライマーとしても有用である。本発明のプラ
イマーは、ホスホロアミダイト法などの化学合成法に
て、自動DNA合成機により自動的に合成する等の方法で
調製することが可能である。

【００２２】また、本発明のプライマーを用いたフザリ
ウム属菌の検出または同定は、公知の方法による核酸の
増幅、例えば、本発明のプライマーを用いてPCRを行う
ことにより試料中のDNAを増幅し、増幅されたDNAを検出
するという方法により行うことができる。試料がRNAで
ある場合は、第1回目の反応に逆転写酵素を用いること
により、RNAをcDNAとして増幅させる（RT-PCR）。増幅
したDNAは、アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブ
ロマイドで染色することにより容易に検出することが可
能である。または、本発明のプローブを用いたハイブリ
ダイゼーション法により検出してもよい。

【００２３】なお、上記の検出または同定法において用
いられるフザリウム属菌由来の被検試料には、作物の罹
病組織、作付け土壌、寄生小動物、培養物、またはそれ
らから単離されたDNA、RNA、増幅されたDNAなどが含ま
れる。DNA、RNAの調製は、セチルトリメチルアンモニウ
ムブロマイド（CATB）及びチオシアン酸グアニジン処理
後に、フェノール抽出、クロロホルム抽出、フェノール
・クロロホルム抽出、及び超遠心法などの方法により行
うことができる。

【００２４】本発明の検出または同定法は、例えば、連
作障害等の病害被害の回避、早期の防除対策、及び最適
な使用農薬の選定などのような利用が可能である。

【００２５】

【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明を具体的に
説明するが、本実施例は、本発明を制限するものではな
い。

【００２６】[実施例１] フザリウム属に特異的な18S
rRNA遺伝子中の塩基配列の選別および特定 フザリウム属菌の代表としてフザリウム・オキシスポラ
ム エフ. エスピー.フラガリアエ（Fusarium oxysporu
m f.sp.fragariae）およびフザリウム・ソラニー エ
フ. エスピー. ファセオリ（Fusarium solani f.sp. ph
aseoli）、リゾクトニア属菌としてリゾクトニア・ソラ
ニー AG-1 Cs-Gi（Rhizoctonia solaniAG-1 Cs-Gi）お
よびリゾクトニア・ソラニー AG-2-2 OPR-4（Rhizocton
ia solani AG-2-2 OPR-4）、ピシウム属としてピシウム
・ミリオティルム KPMS（Pythiummyriotylum KPMS）お
よびピシウム・スピノサム OPA-1（Pythium spinosum O
PA-1）を選択した。これらの菌株からムリー（Murry）
らの文献（Nucleic Acids Res.,8:4321-4325（1980））
に記載のCTAB（Cetyltrimethylammonium bromide）法に
従ってDNAを抽出したのち、遺伝子配列データバンク（G
enBank)に登録されているカンジダ・アルビカンス（Can
dida albicans）の18S rRNA遺伝子配列を参考にして作
製したプライマー 5’-CTGGTTGATYCTGCCAGT-3'（配列番
号：14）と5’-CYGCAGGTTCACCTACRG-3'（配列番号：2
9）を用いてPCRを行うことにより、これらの菌株の18S
リボソームDNA（以下、18S rDNAと称す）配列領域を増
幅した。これを大腸菌にクローニングし、組換えプラス
ミドとして単離した後、カンジダ・アルビカンスの18S
rRNA遺伝子配列を参考にして作製した16種類のプライマ
ー5'-CTGGTTGATYCTGCCAGT-3'（配列番号：14）、5'-GAA
ACTGCGAATGGCTCATT-3'（配列番号：15）、5'-AGGGYTCGA
YYCCGGAGA-3'（配列番号：16）、5'-CGCGGTAATTCCAGCTC
CA-3'（配列番号：17）、5'-TTRATCAAGAACGAAAGT-3'
（配列番号：18）、5'-AATTTGACTCAACACGGG-3'（配列番
号：19）、5'-ATAACAGGTCTGTGATGCCC-3'（配列番号：2
0）、5'-TTTGYACACACCGCCCGTCG-3'（配列番号：21）
（以上８種はセンスプライマー：RはA又はG、YはC又はT
を表す）と5'-AATGAGCCATTCGCAGTTTC-3'（配列番号：2
2）、5'-TCTCCGGRRTCGARCCT-3'（配列番号：23）、5'-A
TTACCGCGGCTGCTGGC-3'（配列番号：24）、5'-TTGGYRAAT
GCTTTCGC-3'（配列番号：25）、5'-CCGTCAATTYYTTTRAGT
TT-3'（配列番号：26）、5'-GGGCATCACAGACCTGTTAT-3'
（配列番号：27）、5'-GACGGGCGGTGTGTRC-3'（配列番
号：28）、5'-CYGCAGGTTCACCTACRG-3'（配列番号：29）
（以上８種はアンチセンスプライマー：RはA又はG、Yは
C又はTを表す）を用いて上記菌株の18SrDNAの全塩基配
列を決定した（図1〜9）。特に、フザリウム・オキシス
ポラム エフ. エスピー. フラガリア（Fusarium oxyspo
rum f.sp. fragariae）の全遺伝子配列を配列番号：12
に、フザリウム・ソラニー エフ. エスピー. ファセオ
リ（Fusarium solani f.sp. phaseoli）の全遺伝子配列
を配列番号：13に示す。

【００２７】上記の3属6菌株の18S rDNA全塩基配列を並
べて比較して（図1〜9）、フザリウム2菌株間で共通の
配列であり、他2属菌とは配列が大きく異なるフザリウ
ム属に特徴的な配列領域を見い出した。なお、図1〜9に
おいて、四角で囲まれた部分は6菌間で相同な配列であ
る。それらの特徴的な配列を、現在までに決定された真
菌の遺伝子データバンク（GenBank）に登録されている1
8S rRNA遺伝子と比較して、配列番号：1〜8に記載され
た塩基配列が、フザリウム属菌に特異的な塩基配列であ
ることを見出した。検索に用いたGenBankの配列の菌株
名を以下に列挙する。なお、括弧内は、GenBank登録番
号、寄託番号、遺伝子配列領域等の情報を示す。レプト
スファエリア・ビコール（LBU04202 Leptosphaeria bic
olor ATCC42652 18S ribosomal RNA gene）、レプトス
ファエリア・ドリオラム（LDU04205Leptosphaeria doli
olum IMI 199775 18S ribosomal RNA gene）、レプトス
ファエリア・マクランス（LMU04233 Leptosphaeria mac
ulans inernal transcribed spacer 1 and 18S ribosom
al RNA gene）、レプトスファエリア・ミクロスコピカ
（LMU04235 Leptosphaeria microscopica ATCC 38151 1
8S ribosomal RNA gene）、レプトスファエリア・マク
ランス（LMU04238 Leptosphaeria maculans 18S riboso
mal RNA gene）、プレオスポラ・ハーバラム（PHU05201
Pleospora herbarum DAOM 150679 nuclear 18S riboso
mal RNA gene）、サッカロミセス・セルビシアエ（CU02
969 Saccharomyces cerevisiae nucleocytoplasmic 18S
ribosomal RNA gene）、セプトリア・ノドラム（SNU04
236 Septoria nodorum DAOM 215173 18S ribosomal RNA
gene）、ディポダスコプシス・ウニヌクレアタ（U0096
9 Dipodascopsis uninucleata 18S ribosomal RNA gen
e）、ユーロチウム・ルブラム（U00970 Eurotium rubru
m 18S ribosomal RNA gene）、タフリナ・デフォルマン
ス（U00971 Taphrina deformans 18S ribosomal RNA ge
ne）、エンドマイセス・ゲオトリチュ-ム（U00974 Endo
myces geotrichum 18S ribosomal RNA gene）、プレオ
スポラ・ルディス（U00975 Pleospora rudis 18S ribos
omal RNA gene）、ティレティア・カリエス（U00972 Ti
lletia caries 18S ribosomal RNA gene）、ウスティラ
ゴ・ホルデイ（U00973 Ustilago hordei 18S ribosomal
RNAgene）、トレメーラ・グロボスポラ（U00976 Treme
lla globospora 18S ribosomal RNA gene）、トレメー
ラ・モリフォルミス（U00977 Tremella moriformis 18S
ribosomal RNA gene）、アルタナリア・アルタナテ（A
AU05194 Alternaria alternata AA6 nuclear 18S ribos
omal RNA gene）、アルタナリア・ブラシカエ（ABU0519
6 Alternaria brassicae AB11 nuclear 18S ribosomal
RNA gene）、アルタナリア・ブラシシコラ（ABU05197 A
lternaria brassicicola ABc2 nuclear18S ribosomal R
NA gene）、アルタナリア・ラファニ（ARU05199 Altern
aria raphani AR6 nuclear 18S ribosomal RNA gen
e）、オウキサルスロン・ズフィアナム（AUXRGEA Auxar
thron zuffianum 18S ribosomal RNA (18S rRNA) gen
e）、ブルメリア・グラミニス（BMRRGE Blumeria grami
nis 18S ribosomal RNA gene）、コンドア・マルビネラ
（KONRDNA2 Kondoa malvinella small subunit ribosom
al DNA）、マルブランチェア・アルボルテア（MBCRGEA
Malbranchea albolutea18S ribosomal RNA (18S rRNA)
gene）、マルブランチェア・デンドリティカ（MBCRGEB
Malbranchea dendritica 18S ribosomal RNA (18S rRN
A) gene）、マルブランチェア・フィラメントサ（MBCRG
EC Malbranchea filamentosa 18S ribosomal RNA (18S
rRNA) gene）、マルブランチェア・ギプセア（MBCRGED
Malbranchea gypsea 18S ribosomal RNA (18S rRNA) ge
ne）、スポリディオボラス・ジョンソニイ（SOIRG18SA
Sporidiobolus johnsonii 18S ribosomal RNA gene）、
ウンシノカルプッス・レッシイ（UNCI1RRG Uncinocarpu
s reesii 18S ribosomal RNA small nucler subunit ge
ne）、アスコスファエリア・アピス（AOSRR18S Ascosph
aeria apis 18S ribosomal RNA gene）、ビソチャラミ
ス・ニベア（BYSRR18S Byssochlamys nivea 18S riboso
mal RNA gene）、チャエトミウム・エラタム（CEMRR18S
Chaetomium elatum 18S ribosomal RNA gene）、エレ
マスカス・アルブス（ERERR18S Eremascus albus 18S r
ibosomal RNA gene）、ヒポマイセス・チェリソスペル
マス（HYYRRNA Hypomyces chrysospermus partial 18S
ribosomal RNA sequence）、ロウコストマ・ペルソニイ
（LEARR18S Leucostoma persoonii 18S ribosomal RN
A）、モナスカス・プルプレウス（MOARR18S Monascus p
urpureus 18S ribosomal RNA）、オピオストマ・ウルミ
（OPHRR18S Ophiostoma ulmi 18S ribosomal RNA）、オ
ピオストマ・ステノセラス（OPHRR18SA Ophiostomasten
oceras 18S ribosomal RNA）、スポロトリクス・スチェ
ンキイ（OPHRR18SBSporothrix schenckii 18S ribosoma
l RNA）、タラロマイセス・フラブス（TALRR18S Talaro
myces flavus 18S ribosomal RNA）、サーモアスカス・
クルスタセウス（THSRR18S Thermoascus crustaceus 18
S ribosomal RNA）、チューバー・メラノスポラム（TUQ
RROA Tuber melanosporum small subunit ribosomal RN
A）、ロドスポリジウム・ダクリオイダム（RHDSSRD1 Rh
odosporidium dacryoidum gene for small subunit rib
osomal DNA）、シンポジオマイコプシス・パフィオペデ
ィリ（SPASSRD3 Sympodiomycopsis paphiopedili gene
for small subunitribosomal DNA）。

【００２８】［実施例２］ アガロースゲル電気泳動に
よる検出 (1) ゲノムDNA試料の調製 PCRの試料として使用した菌株（ポテトデキストロース
液体培地で25℃、10日間静置培養した菌体）のゲノムDN
Aの調製は、ムリー（Murry）らのCTAB法（Murry et a
l., Nucleic Acids Res.,8:4321-4325（1980））に従っ
て行った。当該菌株をポテトデキストロース液体培地10
0mlで25℃で3週間静置培養して得た菌体1gを液体窒素で
凍結させたのち、パウダー状になるまで乳鉢ですりつぶ
し、2×CTAB溶液（2％ CTAB、0.1M Tris-HCl,pH8.0、1.
4M NaCl、1％ ポリビニルピロリドン）を3ml加えて55℃
で10分間加温した。加温後、クロロホルム−イソアミル
アルコール（1：1）溶液3mlで抽出し、上清をさらにク
ロロホルム−イソアミルアルコール（24：1）溶液3mlで
3回繰り返し抽出した。次に、CTAB溶液（10％ CTBA、0.
7％ NaCl）1／10量と等量の沈殿用緩衝液（1％ CTAB、5
mM Tris-HCl,pH8.0、10mM EDTA）溶液を加えて混合した
のち、室温で30分間放置した。得られた沈殿を2回アル
コール沈殿させたのち、常法のフェノール−クロロホル
ム（1：1）溶液処理、エタノール沈殿を行ってゲノムDN
A試料液を調製した。

【００２９】(2) PCR反応 プライマーはすべて宝酒造（株）カスタムサービスセン
ターで合成したものを使用した。

【００３０】PCR反応はパーキンエルマー社のPCRキット
「AmpliTaq DNA polymerase」を使用した。反応はフザ
リウム属菌の18S rDNAの特徴的な塩基配列から作製した
プライマーセット5’-CAACTTTCGGATGTTTGG-3’（配列番
号：9／配列番号：2を含む／図2を参照）および5’-AAA
GTCCTGTTTCCCCGCCA-3’（配列番号：10／配列番号：4に
相補的な配列を含む／図4を参照）の50pMをそれぞれ2μ
l、各種の鋳型DNA試料（100μg／ml）を2μl、10×PCR
緩衝液（100mM Tris-HCl,pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl
₂、 0.01％ ゼラチン）を10μl、10mMのdATP、dCTP、dGT
P、およびdTTPをそれぞれ2μl、滅菌蒸留水を75.5μl、
「AmplTaq DNA polymerase」を0.5μl、混合して行っ
た。PCRは、DNAサーマルサイクラー（Perkin-Elmer社
製）で、変性95℃1分、アニーリング60℃1分、伸長72℃
5分を25サイクル、72℃7分を1サイクルの反応条件で行
った。

【００３１】(3) 検出 反応液3μlと、色素液（0.25％ BPB、0.25％ XC、30％
グリセロール、10mM Tris-HCl,pH8.0）1μlとを混合
し、2％アガロースゲルで電気泳動させた。エチジウム
ブロマイド染色した後、紫外線照射によってDNAバンド
の観察を行い、反応液と同時に泳動させた分子量マーカ
ー（φX174／Hinf I digest）の泳動距離との比較か
ら、検出されたDNA断片の長さを算出した。

【００３２】この結果、フザリウム属菌株のすべての試
料で理論値の約430bpに相当するDNA断片のみが出現し、
他属であるリゾクトニアおよびピシウム属菌株の試料で
は全くDNA断片の出現が認められなかった（図10／レー
ン1：フザリウム・オキシスポラム エフ. エスピー.
フラガリアエ（Fusarium oxysporum f.sp. fragariae）
レーン2：フザリウム・ソラニー エフ. エスピー. フ
ァセオリ（Fusarium solani f.sp. phaseoli） レーン3
：ピシウム・スピノサム OPA-1（Pythium spinosum OP
A-1） レーン4：ピシウム・ミリオティルム KPMS（Pyth
ium myriotylum KPMS） レーン5：リゾクトニア・ソラ
ニー AG-1 Cs-Gi（Rhizoctonia solani AG-1 Cs-Gi）
レーン6：リゾクトニア・ソラニー AG-2-2 OPR-4（Rhiz
octonia solani AG-2-2 OPR-4））。

【００３３】従って、本発明の核酸配列をPCRに用いれ
ばフザリウム属菌を特異的に検出できることが実証され
た。

【００３４】［実施例３］ 標識プローブによるドット
ハイブリダイゼーションによる検出 (1) ビオチン標識プローブの調製 実施例２の(2)のプライマーセットで増幅されるフザリ
ウム属菌の18S rDNA増幅範囲内でフザリウム属に特徴的
な塩基配列である5'-CCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATGCC
CTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGA-3'（配列番号：11／配
列番号：3及び4を含む／図3及び4を参照)を宝酒造
（株）カスタマーサービスセンターにて5’-末端ビオチ
ン標識したものを標識プローブに用いた。

【００３５】(2) ドットブロットハイブリダイゼーシ
ョン 実施例２の(1)〜(2)の操作で得られたPCR反応液3μlを9
5℃で10分間加熱変性させてナイロン膜（アマシャム社
製 Hybond-N⁺)上にスポットし、UVを5分間照射してDNA
を膜に固定した。この膜をハイブリダイゼーションパッ
クに入れ、ハイブリダイゼーション緩衝液（5×デンハ
ルト溶液、5×SSC、0.1％SDS、0.1％変性サケ精巣DNA）
と上記の標識プローブを加え、50℃で2時間のハイブリ
ダイゼーションを行なった。

【００３６】次に膜を2×SSCと0.1％SDSを含む溶液で室
温で10分間、0.2×SSCと0.1％SDSを含む溶液で55℃で15
分間、それぞれ2回ずつ洗浄した。膜を新しいハイブリ
ダイゼーションパックに移し、ビオチン化アルカリホス
ファターゼ液と37℃で30分間反応させたのち、発色基質
液（0.03％ニトロブルーテトラゾリウム、0.03％ブロム
クロロインドリルリン酸）を加えて37℃で1時間反応さ
せた。

【００３７】(3) 結果 目視による青紫色のスポットの存在の有無で判定を行っ
たところ、フザリウム属菌株では青紫色のスポットの出
現が確認されて陽性と判定した。一方、他属の真菌では
すべてスポットが出現しない陰性を示した。

【００３８】

【発明の効果】本発明によって、作物の土壌病害を引き
起こす病原菌フザリウム属菌を、遺伝子レベルで簡単に
素早くしかも正確に、罹病作物から検出または同定する
ことが可能となった。本発明の検出法により、長期間を
要すわずらわしい菌の培養を行うことなく、短時間に素
早く原因病原菌を特定することができる。そのため、時
期を逸せず迅速な防除対策を講じることができ、さらに
作付け前の土壌を診断することにより連作障害を予防す
ることができるため、本発明の方法は、農業分野に大き
く貢献することが期待される。

【００３９】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：6 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCTCGA 8 配列番号：2 配列の長さ：6 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TTTGGG 6 配列番号：3 配列の長さ：6 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ACCCCA 6 配列番号：4 配列の長さ：9 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TGGCGGGGA 9 配列番号：5 配列の長さ：9 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCGTATTGC 9 配列番号：6 配列の長さ：10 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ACGGTGTTAT 10 配列番号：7 配列の長さ：5 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TACGC 5 配列番号：8 配列の長さ：7 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCAGAGA 7 配列番号：9 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CAACTTTCGG ATGTTTGG 18 配列番号：10 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AAAGTCCTGT TTCCCCGCCA 20 配列番号：11 配列の長さ：59 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCGGGCCTTT CCCTCTGTGG AACCCCATGC CCTTCACTGG GTGTGGCGGG GAAACAGGA 59 配列番号：12 配列の長さ：1771 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フザリウム・オキシスポラム エフ．エスピ
ー．フラガリアエ（Fusarium oxysporum f.sp.fragaria
e） 配列 CTGGTTGATT CTGCCAGTAG TCATATGCTT GTCTCAAAGA TTAAGCCATG CATGTCTAAG 60 TATAAGCAAT TATACCGTGA AACTGCGAAT GGCTCATTAT ATAAGTTATC GTTTATTTGA 120 TAGTACCTTA CTACTTGGAT AACCGTGGTA ATTCTAGAGC TAATACATGC TAAAAATCCC 180 GACTTCGGAA GGGATGTATT TATTAGATTA AAAACCAATG CCCTTCGGGC TCACTGGTGA 240 TTCATGATAA CTCCTCGAAT CGCATGGCCT GTGCCGGCAA TGGTTCATTC AATTTCTTCC 300 CTATCAACTT TCGGATGTTT GGGTATTGNN CAAACATGGT TGCAACGGGT AACGNAGGGT 360 TAGGGCTCGA TTCCGGAGAA GGAGCCTGAG AAACGGCTAC TACATCCAAG GAAGGCAGCA 420 GGCGCGCAAA TTACCCAATC CCGACACGGG GAGGTNGCGG ACAATAAATA CTTGNTACAG 480 GGCTTTTCTG GGGTCTTGTA ATTGGAATGA GTACANTTTA ANTCCCTTAA CGAGGAACAN 540 TTGGGGGAAG TCTGTGCCAA GCAGCCGCGG TAATTCCAGC TCCAATAGCG TATATTAAAG 600 TTGNTGTGGT TAAAAAGCTC GNNGTTGANC CTTGGGCCTG GCTGGCGGTC CGCCTACCGC 660 GTGTACTGGT CCGGCCGGGC CTTTCCCTCT GTGGAACCCC ATGCCCTTCA CTGGGTGTGG 720 CGGGGAAACA GGACTTTTAC TGTGAAAAAA TTAGAGTGCT CCAGGCAGGC CTATGCTCGA 780 ATACATTGTG GTAGCATGGA ATAATAGGTG GTGACGTTCT ACTTTGTTGG TTTCTAGGAC 840 CGCCGTAATG ATTAATAGGG ACAGTCGGGG GCATCAGTAT TCAATTGTCA GAGGTGAAAT 900 TCTTGGATTT ATTGAAGACT AACTACTGCG AAAGCATTTG CAAGGATGTT TTCATTAATC 960 AGGAACGAAA GTTAGGGGAT CGAAGATGAT CAGATACCGT GTAGGTCTTA ACCARAAACT 1020 ATGCCGACTA GGGATCGGAC GGTGTTATTT TTTGACCCGT TCGGCACCTT ACGAGAAATC 1080 AAAGTGCTTG GGCTCCAGGG GGAGTATGGT CGCAAGGCTG AAACTTAAAG AAATTGACGG 1140 AAGGGCACCA CCAGGGGTGG AGCCTGCGGC TTAATTTGAC TCAACACGGG GGAAACTCAC 1200 CAGGTCCAGA CACAATGAGG ATTGACAGAT TGAGAGCTCT TTCTTGATTT TGTGGGTGGT 1260 GGTGCATGGC CGTTCGGAGT TGGTGGAGTG ATTTGTCTGC TTAATTGCGA TAACGAACGA 1320 GACCTTAACC TGCTAAATAG CCCGTATTGC TTTGGCAGTA CGCRGGCTTC TTAGAGGGAC 1380 TATCGGCTCA AGCCCGATGG AAGTTTGAGG CAATAACAGG TCRGTGATGC CCTTAGATGT 1440 TCTGGGCCGC ACGCGCGCTA CACTGACGGA GCCAGCGAGT ACTTCCTTGT CCGAAAGGTC 1500 CGGGTAATCT TGTTAAACTC CGCGTGCTGG GGATAGAGCA TTGCAATTCT TGCTCTTCAA 1560 CGAGGAATCC CTAGTAAGCG CAAGTCATCA GCTTGCGTTG GATTACGTCC CCGCCCTTTG 1620 TACACACCGC CCGTCGCTAC TACCGATTGA TTGGNTCAGT GAGGCGTCCG GTCTGGCCCA 1680 GAGAGGTGGG CATCTCNCAC TCAGGGCGGA AAGCTCTCCA TCTCGGACAT TTAGAGGAAG 1740 TAAAGTCGNA AGGTCTCCGT AGGTGAACCT G 1771 配列番号：13 配列の長さ：1840 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：フザリウム・ソラニー エフ．エスピー．
ファセオリ（Fusarium solani f.sp.phaseoli） 配列 CTGGTTGATT GCTGCCAGTA GTCATATGCT TGTCTCANAG ANTAAGCCAT GCATGTNCTA 60 AGTATAAGCA ATTATACAGC GAAACTGCGA ACGGCTCATT ATATAAAGTT ATCGTTTAAT 120 TTGATAGTAC CCTACTACTT GGATAAACCG TGGTAATTTC TAGAGCTAAT ACATGCTAGA 180 AAATCCCAAC TTCGGAAAGG GATGTATTTA TTAGATTAGA AAACCAATGC CCTCCGGGGC 240 TTACTGGTGA TTCATGATAA CTCCTCGAAT CGCATGGCCT TGCGCCGGCG ATGGTTCATT 300 CAAATTTCTT CCCTATCAAC TTTCGATGTT TGGGTGATTG GCCAAACATG GTTGCAACGG 360 GTAACGGAGG NGTTAGGGCT CGACCCCGGA GAAGGAGCCT GAGAAACGGC TACTACATCC 420 AAGGAAGGCA GCAGGCGCGC AAATTACCCA AATCCCGACA CGGGGAAGGT AGTGACAATA 480 AATACTTGAT ACAAGGGCTC TTTTGGGTCT TTGTAAATTG GAATTGAGTA CAATTTAAAT 540 CCCCTTAAAC GAGGAACAAA TTGGAGGGCA AGTCTTGGTG CCAGCAGCCG CGGTAATTCC 600 AAGCTCCAAT AGCGTATNTT AANNTTGTTG TGGNTAAAAA GCTCGTAGTT GAACCTTGGG 660 CCTGNCTGNC CGGTCCNCCT CACCGCGTGA NCACTGGTCC TGNCCGGCCG GGCCTTTCCC 720 TCTGTGGAAC CCCATGCCCT TCACTGGGTG TGGCGGGGAA ACNAGGACTT TTACNTGTGA 780 AAAAATTAGA GTGCTCCAGG CAGGCCTATG CTCGAATACA TTAGCATGGA ATAATAGAAT 840 AGGACGTGTG GTTCTATTTT GTTGGTTTCT AGGACCGCCG TAAATGATTA ATAGGGACAG 900 TCGGGGGCAT CAGTATTCAA TTGTCAGAGG TGAAATTCTT GGATTTATTG AAGACTAACT 960 ACTGCGAAAG CATTTGCCAA GGATGTTTTC ATTAATCAGG AACGAAAGTT AGGGGGATCG 1020 AAGACGATCA AGATACCGTC GTAGTCTTTA ACCCATAAAC TTATGCCGAC TAGGGATCGG 1080 ACGGTGTTAT ATTTTGGACC TGTTCGGCAC CTTACGAGAA ATCAAAGTGC TTGGGCTCCA 1140 GGGGGAGTAT GGTCGCAAGG CTGAAACTTA AAGAAATTGA CGGAAGGGCA CCACCAGGGG 1200 TGGAGCCTGC GGCGTTAATT TGACTCAACA CGGGGAAACT CACCAGGTCC AAGACACCAA 1260 TGAGGGATTG ACAAGATTGA GAGCTCTTTC TTGATTTTTG TGGGTGGTGG TGCATGGCCG 1320 TTCTTAGTTG GGTGGAGTGA TTTTGTCTGC TTAATTGCGA TAACGAAACG AGACCTTAAC 1380 CTACTAAATA GTCCGTATTG CTTTGGCAGT ACGCTGGCTT CTTAGAGGGA CTATCGGCTC 1440 AAGCCGATGG AAGTTTGAGC GCAAGTAACA GGTCTGTGAT GCCCTTAGAT GTTCTGGGCC 1500 GCACGCGCGC TACACTGACG GAGCCAGCGA GTACCTCCTT GGCCGAAAGG CCCGGGTAAT 1560 CTTGTTAAAC TCCGTCGGTG CTGGGGATAG AGCATTGCAA TTATTGCTCT TCAACGAGGA 1620 ATCCCCTAGT AAGCCGCAAG TCAATCAGCT TGCGTTGGAT TACGTCCCTG CCCTTTGTAC 1680 ANCNCCGCCC GTCGNTACTA CCGATTGAAT TGGCTCAGTG AGGCGTTCGG ACTGGCCCAG 1740 AGAGGTGGGC AACTACCACT CAGGGCCGGA AAGTTCTCCA AACTCGGTCA TTTAGAGGAA 1800 GTAAAAGTCG TAACAAGGTC TCCGTAGGTG AACCTGCAGA 1840 配列番号：14 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CTGGTTGATY CTGCCAGT 18 配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GAAACTGCGA ATGGCTCATT 20 配列番号：16 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AGGGYTCGAY YCCGGAGA 18 配列番号：17 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CGCGGTAATT CCAGCTCCA 19 配列番号：18 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TTRATCAAGA ACGAAAGT 18 配列番号：19 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AATTTGACTC AACACGGG 18 配列番号：20 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATAACAGGTC TGTGATGCCC 20 配列番号：21 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TTTGYACACA CCGCCCGTCG 20 配列番号：22 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AATGAGCCAT TCGCAGTTTC 20 配列番号：23 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TCTCCGGRRT CGARCCT 17 配列番号：24 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATTACCGCGG CTGCTGGC 18 配列番号：25 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TTGGYRAATG CTTTCGC 17 配列番号：26 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCGTCAATTY YTTTRAGTTT 20 配列番号：27 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGGCATCACA GACCTGTTAT 20 配列番号：28 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GACGGGCGGT GTGTRC 16 配列番号：29 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CYGCAGGTTC ACCTACRG 18

【図面の簡単な説明】

【図１】ピシウム・スピノサム OPA-1（Pythium spinos
um OPA-1）、ピシウム・ミリオティルム KPMS（Pythium
myriotylum KPMS）、フザリウム・オキシスポラム エ
フ. エスピー. フラガリエ（Fusarium oxysporum f.sp.
fragariae）、フザリウム・ソラニー エフ. エスピー.
ファセオリ（Fusarium solani f.sp.phaseoli）、リゾ
クトニア・ソラニー AG-1 Cs-Gi（Rhizoctonia solani
AG-1 Cs-Gi）、リゾクトニア・ソラニー AG-2-2 OPR-4
（Rhizoctonia solani AG-2-2 OPR-4）の18S rDNAの塩
基配列を示す図である。

【図２】ピシウム・スピノサム OPA-1（Pythium spinos
um OPA-1）、ピシウム・ミリオティルム KPMS（Pythium
myriotylum KPMS）、フザリウム・オキシスポラム エ
フ. エスピー. フラガリエ（Fusarium oxysporum f.sp.
fragariae）、フザリウム・ソラニー エフ. エスピー.
ファセオリ（Fusarium solani f.sp.phaseoli）、リゾ
クトニア・ソラニー AG-1 Cs-Gi（Rhizoctonia solani
AG-1 Cs-Gi）、リゾクトニア・ソラニー AG-2-2 OPR-4
（Rhizoctonia solani AG-2-2 OPR-4）の18S rDNAの塩
基配列を示す図である。配列番号：1、配列番号：2、及
び配列番号：9の位置が示されている。

【図３】ピシウム・スピノサム OPA-1（Pythium spinos
um OPA-1）、ピシウム・ミリオティルム KPMS（Pythium
myriotylum KPMS）、フザリウム・オキシスポラム エ
フ. エスピー. フラガリエ（Fusarium oxysporum f.sp.
fragariae）、フザリウム・ソラニー エフ. エスピー.
ファセオリ（Fusarium solani f.sp.phaseoli）、リゾ
クトニア・ソラニー AG-1 Cs-Gi（Rhizoctonia solani
AG-1 Cs-Gi）、リゾクトニア・ソラニー AG-2-2 OPR-4
（Rhizoctonia solani AG-2-2 OPR-4）の18S rDNAの塩
基配列を示す図である。配列番号：11（一部）の位置が
示されている。

【図４】ピシウム・スピノサム OPA-1（Pythium spinos
um OPA-1）、ピシウム・ミリオティルム KPMS（Pythium
myriotylum KPMS）、フザリウム・オキシスポラム エ
フ. エスピー. フラガリエ（Fusarium oxysporum f.sp.
fragariae）、フザリウム・ソラニー エフ. エスピー.
ファセオリ（Fusarium solani f.sp.phaseoli）、リゾ
クトニア・ソラニー AG-1 Cs-Gi（Rhizoctonia solani
AG-1 Cs-Gi）、リゾクトニア・ソラニー AG-2-2 OPR-4
（Rhizoctonia solani AG-2-2 OPR-4）の18S rDNAの塩
基配列を示す図である。配列番号：3、配列番号：4、配
列番号：10に相補的な配列、及び配列番号：11（一部）
の位置が示されている。

【図５】ピシウム・スピノサム OPA-1（Pythium spinos
um OPA-1）、ピシウム・ミリオティルム KPMS（Pythium
myriotylum KPMS）、フザリウム・オキシスポラム エ
フ. エスピー. フラガリエ（Fusarium oxysporum f.sp.
fragariae）、フザリウム・ソラニー エフ. エスピー.
ファセオリ（Fusarium solani f.sp.phaseoli）、リゾ
クトニア・ソラニー AG-1 Cs-Gi（Rhizoctonia solani
AG-1 Cs-Gi）、リゾクトニア・ソラニー AG-2-2 OPR-4
（Rhizoctonia solani AG-2-2 OPR-4）の18S rDNAの塩
基配列を示す図である。配列番号：6の位置が示されて
いる。

【図６】ピシウム・スピノサム OPA-1（Pythium spinos
um OPA-1）、ピシウム・ミリオティルム KPMS（Pythium
myriotylum KPMS）、フザリウム・オキシスポラムエ
フ. エスピー. フラガリエ（Fusarium oxysporum f.sp.
fragariae）、フザリウム・ソラニー エフ. エスピー.
ファセオリ（Fusarium solani f.sp.phaseoli）、リゾ
クトニア・ソラニー AG-1 Cs-Gi（Rhizoctonia solani
AG-1 Cs-Gi）、リゾクトニア・ソラニー AG-2-2 OPR-4
（Rhizoctonia solani AG-2-2 OPR-4）の18S rDNAの塩
基配列を示す図である。配列番号：5及び配列番号：7の
位置が示されている。

【図７】ピシウム・スピノサム OPA-1（Pythium spinos
um OPA-1）、ピシウム・ミリオティルム KPMS（Pythium
myriotylum KPMS）、フザリウム・オキシスポラムエ
フ. エスピー. フラガリエ（Fusarium oxysporum f.sp.
fragariae）、フザリウム・ソラニー エフ. エスピー.
ファセオリ（Fusarium solani f.sp.phaseoli）、リゾ
クトニア・ソラニー AG-1 Cs-Gi（Rhizoctonia solani
AG-1 Cs-Gi）、リゾクトニア・ソラニー AG-2-2 OPR-4
（Rhizoctonia solani AG-2-2 OPR-4）の18S rDNAの塩
基配列を示す図である。

【図８】ピシウム・スピノサム OPA-1（Pythium spinos
um OPA-1）、ピシウム・ミリオティルム KPMS（Pythium
myriotylum KPMS）、フザリウム・オキシスポラムエ
フ. エスピー. フラガリエ（Fusarium oxysporum f.sp.
fragariae）、フザリウム・ソラニー エフ. エスピー.
ファセオリ（Fusarium solani f.sp.phaseoli）、リゾ
クトニア・ソラニー AG-1 Cs-Gi（Rhizoctonia solani
AG-1 Cs-Gi）、リゾクトニア・ソラニー AG-2-2 OPR-4
（Rhizoctonia solani AG-2-2 OPR-4）の18S rDNAの塩
基配列を示す図である。配列番号：8の位置が示されて
いる。

【図９】ピシウム・スピノサム OPA-1（Pythium spinos
um OPA-1）、ピシウム・ミリオティルム KPMS（Pythium
myriotylum KPMS）、フザリウム・オキシスポラムエ
フ. エスピー. フラガリエ（Fusarium oxysporum f.sp.
fragariae）、フザリウム・ソラニー エフ. エスピー.
ファセオリ（Fusarium solani f.sp.phaseoli）、リゾ
クトニア・ソラニー AG-1 Cs-Gi（Rhizoctonia solani
AG-1 Cs-Gi）、リゾクトニア・ソラニー AG-2-2 OPR-4
（Rhizoctonia solani AG-2-2 OPR-4）の18S rDNAの塩
基配列を示す図である。

【図１０】本発明のプライマーを用いてPCR増幅した各
種真菌18S rDNAの電気泳動写真である。レーン1はフザ
リウム・オキシスポラム エフ. エスピー. フラガリア
エ（Fusarium oxysporum f.sp. fragariae）、レーン2
はフザリウム・ソラニー エフ. エスピー. ファセオリ
（Fusarium solani f.sp. phaseoli）、レーン3はピシ
ウム・スピノサム OPA-1（Pythium spinosum OPA-1）、
レーン4はピシウム・ミリオティルム KPMS（Pythium my
riotylum KPMS）、レーン５はリゾクトニア・ソラニー
AG-1 Cs-Gi（Rhizoctonia solani AG-1 Cs-Gi）、レー
ン6はリゾクトニア・ソラニー AG-2-2 OPR-4（Rhizocto
nia solani AG-2-2 OPR-4）の増幅DNAを泳動させた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:77） (72)発明者 高橋 勇 秋田県仙北郡西仙北町字刈和野241番地 株式会社真菌類機能開発研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：1から配列番号：8のいずれか
   の塩基配列、またはそれらに相補的な塩基配列を含む、
   フザリウム属に属する真菌を検出または同定するための
   オリゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドか
   らなるプローブ。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドか
   らなるプライマー。
4. 【請求項４】 請求項２に記載のプローブまたは請求項
   ３に記載のプライマーを用いることを特徴とする、フザ
   リウム属に属する真菌を検出または同定する方法。