JPH10245400A - トランスフェリンレセプターの安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明の課題は、トランスフェリンレセプター
（ＴｆＲ）、あるいはトランスフェリン−ＴｆＲコンプ
レックス（ＴＲＣ）を安定化する技術を提供することで
ある。 【解決手段】本発明は、ＴｆＲやＴＲＣにアルブミンと
糖類を加えた組成物、ならびにこれらの安定化剤による
安定化方法を提供する。 【効果】本発明により、凍結−融解に伴うＴｆＲ測定値
の低下を防止することができ、標準物質の信頼性が向上
する。本発明はＴｆＲの免疫学的分析用の標準物質に有
用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト体液中のトランス
フェリンレセプター（以下ＴｆＲと省略する）の安定化
に関する。ＴｆＲは各種細胞の表層に存在し、鉄輸送蛋
白であるトランスフェリン（以下Ｔｆと省略する）と結
合する役割を持ち、生体内で鉄の代謝に深く関与してい
る。ＴｆＲとＴｆの親和性は約１０^-9と抗原抗体反応に
匹敵するほど強く、そのうえ一般には血中のＴｆがＴｆ
Ｒの１０³倍も多量に存在することから、血中において
はほとんどのＴｆＲがＴｆと結合した形（Transferrin-
Transferrin receptor Complex;以下ＴＲＣと省略す
る）で存在する。血中ＴｆＲ濃度は、癌[ 1]や造血機能
[ 2][ 3]等の指標として有用であることが知られてい
る。

【０００２】ＴｆＲの測定には、免疫学的な手法を中心
としていろいろな分析技術が知られているが、どのよう
な分析手法を利用するにしろ、分析に当たってはＴｆＲ
の標準物質が必要となる。標準物質は、分析対象成分の
含有量を検定したものである。その表示濃度は、保存中
も常に保証できるようにしておかなくてはならない。標
準物質の測定値が表示値とずれるようなことがあって
は、たとえ測定操作そのものに問題がなくても正確な値
を得ることはできない。したがって標準物質として用い
るＴｆＲの安定化は、その測定技術と同様に大切な課題
である。

【０００３】

【従来の技術】体液中のＴｆＲを測定する方法として
は、標識免疫測定法を応用した報告[ 1][ 4][ 5]があっ
た。またこのような背景を基に既にＴｆＲ測定用の試薬
キットも販売されている。これらの報告で標準として使
われているのは、ヒトの胎盤等から抽出精製したＴｆＲ
である。精製ＴｆＲを、適当な緩衝液に溶解して標準と
している。溶解にあたっては、ｐＨ８前後の弱アルカリ
が利用され必要に応じて防腐剤や蛋白成分が保護剤とし
て加えられていた。しかしこのような条件でＴｆＲの標
準を調製すると、標準のＴｆＲ測定値が低下する現象が
しばしば観察される。具体的には、精製ＴｆＲを放置し
ておくと不溶性のアグリゲートもしくはオリゴマーの形
成が観察されるのである。精製ＴｆＲがアグリゲートを
形成していることはゲルろ過のパターンで確認できる。
またアグリゲートを解離させるために界面活性剤処理す
ると、反応性が約２倍に上がるケースが有ることも確認
した。このような不安定な標準物質に基づいて得られた
測定値の信頼性には限界が有る。

【０００４】加えて精製ＴｆＲと血中に存在するＴＲＣ
とでは同じ抗体に対する反応性に違いの観察されること
がある。本発明者の得た知見によれば、血清から精製し
たＴＲＣは精製ＴｆＲに比べて４倍も高い反応性を示し
た。たとえば今までの報告ではＴｆＲとして正常値が約
５０００ng/mL、また測定範囲として１０００〜５００
００ng/mLとある。しかしこれは用いた標準が胎盤等の
組織に由来する精製ＴｆＲであるため、その値の信頼性
には問題のある可能性も推測される。したがってＴｆＲ
の測定技術を一般に普及させるには、測定のための標準
物質を安定な状態で流通させるための配慮が求められ
る。

【０００５】このような背景のもとで、より広い測定レ
ンジを実現するために、本出願人はラテックス凝集反応
法を利用したＴｆＲの測定法[ 6][ 7]を完成している。
この測定法では、抗ＴｆＲ抗体を感作したラテックス粒
子を、ＴＲＣを標準として組み合せることにより従来に
ない広い測定範囲を実現している。またＴＲＣを標準と
することによって、精製ＴｆＲを材料としたときに観察
されるアグリゲートの形成といった問題点が解消され
た。これらの先行技術では、標準物質にはグリセロール
を添加しており、希釈に当たってウシ血清アルブミン
（以下ＢＳＡと省略する）を加えた希釈溶液を組み合せ
ている。測定対象はあくまでもＴｆＲであるが、標準と
してはＴＲＣの状態で保存した方が安定性の点で有利で
あり、しかも血中のＴｆＲの大部分がＴＲＣとして存在
していることから考えても標準はＴＲＣを使うべきであ
ろう。なおＴＲＣを標準として利用する試みは、ＥＬＩ
ＳＡでも報告[ 5]されている。

【０００６】ＴＲＣを標準に利用することにより、Ｔｆ
Ｒ単独で標準物質としたときのアグリゲートやオリゴマ
ー形成に伴うＴｆＲ測定値の低下という問題は解消し
た。しかし単にＴＲＣを利用することだけでは解決する
ことのできない新たな問題点の存在が明らかとなった。
その問題点とは、血清から精製したＴＲＣの抗ＴｆＲ抗
体に対する反応性が、凍結−融解によって低下してしま
う現象である。ＴｆＲ単独では保存中に徐々にＴｆＲ測
定値が低下するが、ＴＲＣの場合には凍結−融解を境に
反応性の変化が起きる。この現象は、ＴＲＣ濃度が低い
場合に特に顕著に現れる。凍結−融解の前後でＴＲＣを
ゲルろ過で分析したところ、免疫活性の高いダイマーか
ら活性の低いモノマー（ＴＲＣモノマー、あるいはＴｆ
が解離したＴｆＲ）が生成していることを推測させる結
果を得た。本発明者は、一般的な凍結保護剤[ 8]である
タンパク質や糖類の添加によって凍結−融解の影響を小
さくできるのではないかと考え、いくつかの化合物につ
いて安定化作用を調査した。ところが、公知の保護剤単
独ではこのような現象を抑制することができないことが
明かとなった。具体的には、たとえば凍結保護剤として
一般に利用されているシュークロースを添加した場合、
シュークロース濃度が高いと測定値が低下する現象が観
察された。つまりシュークロースは免疫学的な反応に対
して阻害的な影響を及ぼすことが推測された。シューク
ロースの使用量を少なくすれば免疫学的な反応に対する
影響を抑制できるが、そのような使用量ではもはやＴｆ
Ｒの安定化効果は期待できない。他方、やはり一般的な
保護剤であるアルブミン類を添加した場合、ある程度の
保護作用は得られるもののその効果は十分とは言えない
面がある。標準物質を凍結することなく保存すれば、凍
結−融解に伴う問題は避けられる。しかし現実には凍結
乾燥をはじめとして製造工程においても凍結は行われ
る。また商品として流通させるときには、たとえ冷蔵を
指示したとしても輸送中に凍結されてしまう可能性は考
慮すべきである。またＴＲＣを高濃度で保存すれば反応
性の低下を防ぐことも可能だが、現実には高濃度から低
い濃度までいくつかの濃度で標準を用意する必要が有
る。したがって、ＴＲＣの凍結−融解にともなうＴｆＲ
測定値の低下現象は、ＴｆＲの測定を行うに当たって解
決すべき重要な課題である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、Ｔｆ
Ｒの標準として利用するＴＲＣの保存安定性を改善する
技術の提供にある。ＴｆＲ測定用の標準とするのである
から、単にＴＲＣを安定に保持するだけでなく、測定の
ための反応系に影響を与えることなく安定化効果をもた
らす技術でなければならない。より具体的には、免疫学
的な反応系に影響を与えることなく、ＴｆＲを安定に維
持し、しかもＴＲＣ溶液の凍結−融解にともなう測定値
の変化をも防ぐことのできる新しい技術の提供が本発明
の課題である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の課題は、アルブ
ミンと糖類を含む、ＴｆＲ組成物によって解決される。
本発明はまた、アルブミンと糖類によるＴｆＲの安定化
方法、具体的には凍結による測定値の低下を防止するた
めの技術を提供する。

【０００９】本発明に用いるアルブミンは、ウサギやウ
シ等の動物血清に由来するものが好適である。ＴｆＲ組
成物が液状であるとき、アルブミンは０．５−３０%w/
v、望ましくは１−１０%w/vの濃度範囲で用いれば、糖
類と組み合せたときに優れた安定化作用をもたらす。ア
ルブミンは血清から精製されたもののみならず、遺伝子
組み換え体として得たものであってもよい。

【００１０】一方本発明の糖類には、シュークロース、
フルクトース、ラクトース、マルトース、あるいはトレ
ハロース等の２糖類が有効である。中でもシュークロー
スは、アルブミンと組み合せることによって広い濃度範
囲にわたってＴｆＲ測定値の低下を防止する。ＴｆＲ組
成物が液状の場合、糖類は０．５−３０%w/v、より好ま
しくは１−１０%w/vとなるように加えると良い。シュー
クロースを多量に添加するとＴｆＲ−抗体間の免疫学的
な反応に対して阻害的な作用を示すことから、できれば
１０%以下で用いるのが望ましい。本発明で組み合わせ
て用いる安定化剤は、互いに安定化効果を補い合う関係
に有るので、一方の濃度が低い場合には他方の使用量を
高めに設定することで十分な安定化効果を期待できる。

【００１１】ここで例示したアルブミンや糖類の濃度
は、本発明によるＴｆＲ組成物を液状に限定するもので
はない。ＴｆＲが凍結乾燥等の操作によって乾燥状態で
流通するのであれば、乾燥前の溶液や、あるいは最終的
な使用時の溶液中における濃度としてこれらの濃度範囲
を適用することができる。

【００１２】本発明のＴｆＲ組成物におけるＴｆＲは、
ＴＲＣとして添加するのが望ましい。特に血中のＴｆＲ
濃度を検定するための標準としてＴｆＲ組成物を利用す
るときには、保存上ＴＲＣの方が安定性の点で有利なた
めである。また可能ならば胎盤ではなく血液材料に由来
するＴＲＣを標準物質として用いると良い。細胞から血
中に遊離したＴｆＲは組織から抽出したＴｆＲとは構造
が違うことから、精製ＴｆＲを標準とする方法では反応
性の違いのために正確な結果を期待できない可能性が有
る。実際、血中に遊離したＴｆＲは組織に存在する完全
なＴｆＲに比べてＮ末端側の１００アミノ酸残基が欠損
している。また血中ＴｆＲの大部分がＴＲＣとなってい
ることから考えて、血中ＴｆＲの値を得るにはＴＲＣと
して測定すべきであろう。なお血中のＴｆとコンプレッ
クスを形成していない遊離のＴｆＲを測定するのであれ
ば、遊離のＴｆＲを標準として用いることにも意味は有
る。本発明のＴｆＲ組成物に用いるＴＲＣは様々な方法
で得ることができる。一般的なＴＲＣの調製方法では、
血液等の生物材料からＴＲＣを精製している。あるいは
まずＴｆＲを血液やＫ５６２のような細胞株の培養上清
から精製し、これに遊離のＴｆを加えて飽和させＴＲＣ
とすることができる。なおＴｆＲの大部分がＴｆに結合
して存在しているとはいえ、遊離のＴｆＲが存在する可
能性は否定できないし、その割合も材料によって変動す
ることが予想されるので、ＴＲＣとして回収した場合で
あっても改めてＴｆで飽和させる工程を実施している例
も有る。このとき原料に用いるＴｆＲやＴｆは、原則的
には測定対象である動物種にそろえるようにする。しか
しながら、ヒトの生物材料のように必ずしも安定して供
給できるとは限らないものでは、他の動物種に由来する
もので代用することもできる。すなわちヒトＴｆＲにブ
タのＴｆを反応させたり、あるいはＴｆＲにも他の動物
種のものを利用しても差し支えない。ただし異なる動物
種を組み合わせる時には、免疫学的な反応に利用する抗
体との反応性を維持できる範囲から選択しなければなら
ないことは言うまでもない。

【００１３】この他に天然のＴｆＲのアミノ酸配列を再
現した遺伝子組み換え体[ 9][10]を利用することも可能
である。遺伝子組み換え体を用いるときには、そのアミ
ノ酸配列は必ずしも天然のＴｆＲに忠実である必要はな
く、測定反応において天然のＴｆＲと同様の挙動を示す
ものであれば、そのアミノ酸配列に置換や欠損などの変
異を加えたものであってもかまわない。あるいは、保存
安定性の改善や容器への吸着防止を目的として、積極的
にアミノ酸配列に変異を加えることもできる。このよう
なアミノ酸配列の変異によって蛋白質に望ましい形質を
もたらす技術は公知である。

【００１４】本発明のＴｆＲ組成物が液状であるとき、
そのｐＨは６−９とすると特に優れた安定化効果を期待
できる。たとえばＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpipera
zine-N'-2-ethanesulfonic acid）やＭＥＳ（2-(N-Morp
holino)ethanesulfonic acid）は、アルブミンと糖類と
の組み合せによりＴｆＲの測定値の低下を効果的に防止
する優れた緩衝剤である。

【００１５】

【作用】本発明でＴｆＲ組成物の安定化に必要なアルブ
ミンと糖類は、両者の組合せにより効果的にＴｆＲの測
定値の低下を防止する作用を持つ。アルブミンも糖類も
一般的な凍結保護剤である。しかしこれらの保護剤を単
独で添加してＴｆＲ組成物としたときには、安定化効果
が不十分であったり、あるいは有効量では測定に影響を
与えるといった問題点が生じる。本発明者は、これらの
保護剤を組み合せたときに互いの問題点を解消し、特に
凍結安定性に優れたＴｆＲ組成物とすることができるこ
とを見出し本発明を完成した。一般的な凍結保護剤であ
るシュークロースが、有効濃度ではＴｆＲ−抗体間の免
疫学的な反応系に対して阻害的に働くこと、そしてシュ
ークロースの使用量を抑制することによる安定化作用の
不足をアルブミンとの組み合せにより補えることは、ま
ったく予期し得ない作用であった。

【００１６】

【発明の効果】本発明によって、たとえＴｆＲが低い濃
度であっても凍結にともなう測定値の低下を効果的に防
止することができる。本発明によるＴｆＲの安定化技術
は、血中のＴＲＣ濃度の測定を目的とする免疫学的な測
定のための標準物質において有用である。本発明の安定
化方法は、免疫学的な測定に影響を与えないので、標準
物質としてのＴｆＲ組成物で特に有用性が高い。

【００１７】

【実施例】

１．試薬の調製 抗ＴｆＲ抗体の作成：公知の方法[12]で胎盤から精製し
たヒトＴｆＲをフロイントのコンプリート・アジュバン
トと等量混合し、充分乳化した後、家兎フットパットに
初回の免疫を行い、４週毎に背部皮内に２回の追加免疫
を行った。精製ヒトＴｆＲとのオクテロニー法により抗
体価の上昇を確認して、最終免疫後２週目に採血を行い
抗血清を分離した。抗血清をＤＥＡＥ−セルロース・イ
オン交換クロマトグラフィーで精製し、そのＩｇＧ分画
をもって抗ＴｆＲ抗体とした。

【００１８】抗ＴｆＲモノクローナル抗体の作成：前記
精製ＴｆＲをフロイントのコンプリート・アジュバント
と等量混合しＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に免疫した。２
週間おきに免疫をくり返し、４回の免疫の後に５０μg
のＴｆＲを腹腔内に免疫した。最終免疫の３日後に抗体
価の上昇していることを確認して脾臓を摘出し、常法[1
1]によってマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８．
６５３と細胞融合させた。

【００１９】ハイブリドーマは精製ＴｆＲを抗原とする
イムノブロッティングアッセイによって、まずＴｆＲに
特異的な抗体についてスクリーニングした。ＴｆＲを認
識するモノクローナル抗体を産生するクローンは、更に
ＴｆＲとＴｆを用いたインヒビションアッセイによりス
クリーニングしてＴｆ結合部位以外の部分に存在する抗
原決定基を認識するモノクローナル抗体を産生するもの
をセレクションした。こうしてＴｆＲのＴｆ結合部位以
外を認識するモノクローナル抗体を得た。このモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを、プリスタン処
理したマウスの腹腔に接種し、２週間後に腹水を採集し
た。得られた腹水を遠心（３０００rpm、５分）後、上
清から硫安分画によってＩｇＧを回収してリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２、以下ＰＢＳと省略する）に溶解し、同じ
ＰＢＳに対して透析して抗ＴｆＲモノクローナル抗体と
した。

【００２０】ＴｆＲのＥＬＩＳＡ用試薬の調製：上記抗
ＴｆＲモノクローナル抗体をグリシン−塩酸で酸処理後
に炭酸緩衝液で６．６７mg/Lとし、９６穴マイクロタイ
タープレート（ヌンク社製）のウエルに１５０μLづつ
分注（１．０μg/wellとなる）して４℃で２晩静置し抗
ＴｆＲモノクローナル抗体を吸着させた。吸着後のウエ
ルを、３%シュークロース、０．０５%ＢＳＡ、および
０．０５%のＴｗｅｅｎ−２０を含む５０mMのＰＢ（ｐ
Ｈ７．２）で洗浄・ブロック操作をほどこしてＥＬＩＳ
Ａ用固相プレートとした。また抗ＴｆＲ抗体は、ペプシ
ン処理によりＦ（ａｂ）’２とした後に２官能性リンカ
ーであるN-(8-Maleimidocapryloxy)succinimide（ＨＭ
ＣＳ）を利用してＰＯＤ標識しＥＬＩＳＡ用標識抗体と
した。ＰＯＤの発色系には、以下の組成を持つ基質溶液
を用時調製して利用した。 基質溶液の組成 ・５０mMクエン酸緩衝液（ｐＨ４．１） ・０．０５%のＨ₂Ｏ₂ ・０．１%のプロピレングリコール ・オルトフェニレンジアミン２塩酸塩１錠を上記組成の
溶液１２mLで溶解

【００２１】ＴｆＲのＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡの操作は
次のとおりである。固相プレートにウエル当たり１００
μLの試料液を分注し、プレートをシールして室温で１
時間ミキシングした。０．１MのＮａＣｌと０．０２５%
のＴｗｅｅｎ−２０を加えた０．２５mMのＰＢ（ｐＨ
７．４）で３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗体を１００μLを
加え、プレートをシールして室温で１時間反応させた。
同じ洗浄液で３回洗浄して基質溶液１００μLを分注
し、室温で３０分間反応させた。１００μLの反応停止
液（３NのＨ₂ＳＯ₄）を加えて反応停止後に４９２nmと
６３０nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで
測定した。

【００２２】２．ＴＲＣの調製 血清を４５〜７０%飽和硫安で分画後、沈澱を回収して
２０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）で透析し、陰イ
オン交換カラム（Ｑ−セファロース、ファルマシア社）
にアプライした。２０mMのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
６）でリニアグラジエント（ＮａＣｌを０．４Mまで上
昇）に溶出した。ＥＬＩＳＡによってＴｆＲ濃度を追跡
してＴＲＣに富む分画をプールし、抗Ｔｆ抗体を固定化
したアフィニティーカラムにかけた。このカラムを以下
に示す洗浄液で順次洗浄し、最終的に洗浄液ｄによる溶
出分画をプールした。 洗浄液ａ：０．１MのＮａＣｌを含む５０mMのＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．５） 洗浄液ｂ：１００mMのＮａＣｌと１mMの desferroxamin
e mesilateを含む５０mMのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．
９） 洗浄液ｃ：０．１MのＮａＣｌを含む５０mMのＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．５） 洗浄液ｄ：３MのＫＣｌを含む５０mMのＨＥＰＥＳ緩衝
液（ｐＨ７．５） プールした溶出分画に鉄飽和Ｔｆを加えて完全にＴＲＣ
を形成させた後、２０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
６）で透析し、更に陰イオン交換カラム（リソース−
Ｑ、ファルマシア製）にアプライした。このカラムをＮ
ａＣｌ濃度を０．３Mまで上昇させてリニアグラディエ
ントに溶出した。ＴＲＣ含有分画をプールして０．０２
MのＰＢＳ−生理食塩水（ｐＨ７．２）で透析し精製Ｔ
ＲＣを得た。この方法によるＴＲＣの収率は約５０%で
あった（２０００ng/mLのＴＲＣを含む血清２Lから約
２．０mgのＴＲＣを回収）。

【００２３】精製物は、非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより分子量約８５kDaと６５kDaの２つのバンドが認
められた。還元状態では、Ｔｆは分子内ＳＳ結合がはず
れて見かけの分子量が大きくなるので、２つのバンドが
近接する。ＰＶＤＦ膜へブロッティング後それぞれの蛋
白についてアミノ酸配列分析を行ったところ、８５kDa
はＴｆＲの１０１番目からの配列と一致し、６５kDaは
ＴｆのＮ末端からの配列と一致することが確認できた。
ＴｆＲとＴｆの組成比率は、染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルのデンシトグラムからほぼ４７％対５３％であり、
アミノ酸残基数がＴｆＲが６６０、Ｔｆが７１９の比と
一致した。つまりモル比として１対１であったと考えら
れる。蛋白量にＴｆＲの濃度比（４７％）を乗じた値を
精製したコンプレックス中のＴｆＲ量として決定した。
なお精製ＴＲＣの蛋白量は、ＢＣＡ蛋白定量法により決
定した。

【００２４】３．本発明によるＴＲＣ安定化効果 本発明によるＴＲＣの安定化効果を確認するために、以
下の濃度の保護剤（組み合せ）を含むＴＲＣ溶液（５０
mMのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）を−２０
℃、４℃、および３７℃で１０日間保存してその間の安
定性を追跡した。ＴＲＣ濃度は０−９６ng/mLとした。
凍結−融解の影響を調べるために、−２０℃で保存した
ＴＲＣ溶液は保存期間中に２回（１日目と６日目）融解
し室温に戻してＥＬＩＳＡで測定（安定性の比較）を行
うとともに残ったＴＲＣ溶液は再び凍結した。そして１
０日後に３回目の融解を行ってＥＬＩＳＡによる測定を
行った。このようにして凍結−融解を繰り返す条件を設
けた。 保護剤： ＢＳＡ １．０%、５．０% シュークロース １．０%、２．５%、５．０%

【００２５】結果は図１−４に示した。本発明による保
護剤を加えた場合、ＴＲＣの測定値はいずれの温度条件
においても安定に推移する（図１−２）。また全てのＴ
ＲＣ濃度において免疫学的反応に対する保護剤の影響は
見られない（図３）。更に１０日間の保存期間中に凍結
−融解（Freeze-Thawing、以下F.T.と省略する）を３回
繰り返したものでも吸光度の低下はほとんど見られず
（図４）、本発明によるＴＲＣの安定化技術は、十分な
安定化効果を示すと同時に凍結−融解を繰り返しても免
疫学的な反応系への影響が小さいことが確認できた。な
お一連の実験結果から導かれるＴＲＣ溶液の保存に最も
適した条件は、以下のとおりである。 ５０mMのＨＥＰＥＳ緩衝液 ０．９%のＮａＣｌ（生理食塩水） ５．０%のＢＳＡ ２．５%のシュークロース （ｐＨ７．４）

【００２６】４．公知の保護剤単独添加（安定性） 比較のために以下のような公知の保護剤を単独で用い、
ＴＲＣの安定化効果と免疫学的反応への影響を観察し
た。保護剤には、ウシ胎児血清、ウマ血清、Ｔｆ、Ｆｅ
³⁺（クエン酸鉄(III)アンモニウム）、アスコルビン
酸、コール酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ−２０、グリセロ
ール、ブロックエース（雪印乳業製、商品名）、Ａｌ³⁺
（硫酸アルミニウム）、ＥＤＴＡ、ウサギ血清アルブミ
ン、ヒト血清アルブミン、ＢＳＡ、およびシュークロー
スを用意した。各保護剤を加えてＴＲＣ溶液を、−２０
℃および４℃で保存し安定性に及ぼす影響を観察した。
その結果、シュークロースではＴＲＣに対する安定化効
果が確認されたが、添加量に依存して保存状態にかかわ
らずＥＬＩＳＡの測定値が低く出る傾向が見られた（図
６）。その他の保護剤では、−２０℃で保存したとき
（−●−）に凍結−融解にともなって明らかに測定値が
低下する現象が観察された。この現象は、ＴＲＣ濃度が
低いとき、そして保護剤濃度が低いときにより大きく現
れた。ＢＳＡの結果を図５に示す。次いでこれらの化合
物がＴＲＣのＥＬＩＳＡにおいて免疫学的な反応に及ぼ
す影響を調査してみた。

【００２７】５．公知の保護剤単独添加（免疫学的な反
応に及ぼす影響） ４．である程度ＴＲＣの安定化効果が確認された４種の
保護剤が、免疫学的な反応に対してどのような影響を与
えるのかを調査した。４種の保護剤、すなわちウマ血
清、ＢＳＡ、シュークロースそしてグリセロールをＴＲ
Ｃ溶液に添加した。ＴＲＣ濃度は０−９６ng/mLとし
た。各溶液を−２０℃および４℃で保存し、１日後に−
２０℃保存のものを融解してF.T.１回のものとして測定
し４℃で保存したものの測定値と比較した。同じＴＲＣ
溶液を再び−２０℃で保存し、４日後に融解してF.T.２
回目として同じように測定値を比較した。その結果、シ
ュークロース（図９）やグリセロール（図１０）では添
加濃度に依存して測定値が低く出る現象が観察された。
同様の現象はウマ血清（図７）でも観察され、免疫学的
な反応に影響を与えないのはＢＳＡ（図８）のみであっ
た。これらの結果を総合すると、保護剤の単独添加で
は、シュークロースで安定化効果は期待できるものの免
疫学的な反応に対して阻害的に作用するため免疫学的な
測定用の標準物質としては適当とは言えない。他方、免
疫学的な反応に対して影響を与えないＢＳＡでは、凍結
−融解にともなう測定値の低下現象が観察されるため保
護剤としては不十分と言わざるを得ない。

【００２８】５．緩衝液の比較 ＴＲＣ溶液の保存に有利な緩衝液を選択するために、以
下のような実験を行った。すなわち、ＨＥＰＥＳ、ＭＥ
Ｓ、Ｔｒｉｓ、およびＰＢＳを用い、保護剤の有無とｐ
Ｈによって凍結−融解に伴うＴＲＣの測定値の変化がど
のような影響を受けるかを調査した。保護剤やｐＨ等の
条件は結果とともに表１に示した。ＴＲＣ濃度は３０ng
/mLとし、−２０℃、および４℃で保存し、２日後、次
いで９日後にＥＬＩＳＡを行って吸光度とＴｆＲの測定
値を比較した。この間、−２０℃で保存したものについ
て２、４、７、９日目に融解と凍結を行って１〜４回の
F.T.に相当する試料とした。

【００２９】

【表１】

【００３０】結果は表１にまとめた。表中の％は、４℃
保存のもので得られたＥＬＩＳＡの吸光度を１００とす
るF.T.を行った時の吸光度の％を示す。表１からわかる
ように、ＨＥＰＥＳでは４℃保存で比較的測定値が安定
に推移するが、それでも９日保存では測定値が２０．２
ng/mLに低下する（吸光度では１０５６から８８５への
低下）。一方ＨＥＰＥＳのみならず、単独ではあまり保
護作用を示さないＴｒｉｓ緩衝液でも、ＮａＣｌやＢＳ
Ａを加えることで、４℃保存における測定値の低下が防
止できることも確認された。ただしこのときのF.T.の測
定値はＨＥＰＥＳ単独のものに劣る結果となり、４℃と
−２０℃との間で安定性を両立させることはできなかっ
た。これらの結果からＴＲＣ溶液の緩衝剤としてはＨＥ
ＰＥＳが望ましいものの、ＮａＣｌやＢＳＡの添加のみ
ではＴＲＣの測定値を完全に安定化することは困難であ
ると考えられた。

【００３１】引用文献 [ 1] 特開昭６２−６１６９ [ 2] Blood,Vol.81,No.15,1067-1076;1993 [ 3] Clin.Chem.41/7,1053-1064;1995 [ 4] Biochim.Biophys.Acta.884,225-233;1986 [ 5] J.Lab.Clin.Med.,114,368-377;1989 [ 6] Clin.Chim.Acta.254,159-172;1996 [ 7] 特願平７−２７１９１７ [ 8] 凍結・乾燥と保護物質；根井外喜男（東京大学出
版会、1972年） [ 9] J.Biol.Chem.263: 13386-92;1988 [10] Curr.Stud.Hematol.Blood Transfus.: 109-14;199
1 [11] J.Immunol.123,1548-1550,1979 [12] J.Biol.Chem.,263,8318-8325,1988

【図面の簡単な説明】

【図１】−２０℃における本発明によるＴＲＣの安定化
効果を示す。縦軸は４℃で保存したもののＥＬＩＳＡに
よる吸光度を１００としたときの吸光度（％）を、横軸
は保存時間（日）である。

【図２】３７℃における本発明によるＴＲＣの安定化効
果を示す。縦軸は４℃で保存したもののＥＬＩＳＡによ
る吸光度を１００としたときの吸光度（％）を、横軸は
保存時間（日）である。

【図３】種々のＴＲＣ濃度における本発明の安定化剤の
効果（保存温度は４℃）を示す。縦軸は波長４９２nmに
おける吸光度を、横軸はＴＲＣ濃度(ng/mL)である。

【図４】凍結−融解(F.T.)を３回繰り返したときの種々
のＴＲＣ濃度における本発明の安定化剤の効果を示す。
縦軸は波長４９２nmにおける吸光度を、横軸はＴＲＣ濃
度(ng/mL)をである。

【図５】凍結−融解(F.T.)を２回繰り返したときの種々
のＴＲＣ濃度におけるＢＳＡ単独添加の効果。縦軸は波
長４９２nmにおける吸光度を、横軸はＢＳＡ濃度(%)で
ある。

【図６】凍結−融解(F.T.)を２回繰り返したときの種々
のＴＲＣ濃度におけるシュークロース単独添加の効果。
縦軸は波長４９２nmにおける吸光度を、横軸はシューク
ロース濃度(%)である。

【図７】凍結−融解(F.T.)を２回繰り返したときの種々
のＴＲＣ濃度におけるウマ血清単独添加の効果。縦軸は
波長４９２nmにおける吸光度を、横軸はＴＲＣ濃度(ng/
mL)である。

【図８】凍結−融解(F.T.)を２回繰り返したときの種々
のＴＲＣ濃度におけるＢＳＡ単独添加の効果。縦軸は波
長４９２nmにおける吸光度を、横軸はＴＲＣ濃度(ng/m
L)である。

【図９】凍結−融解(F.T.)を２回繰り返したときの種々
のＴＲＣ濃度におけるシュークロース単独添加の効果。
縦軸は波長４９２nmにおける吸光度を、横軸はＴＲＣ濃
度(ng/mL)である。

【図１０】凍結−融解(F.T.)を２回繰り返したときの種
々のＴＲＣ濃度におけるグリセロール単独添加の効果。
縦軸は波長４９２nmにおける吸光度を、横軸はＴＲＣ濃
度(ng/mL)である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 35/16 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アルブミンと糖類を含む、トランスフェリ
   ンレセプター組成物
2. 【請求項２】アルブミンが動物の血清アルブミンである
   請求項１の組成物
3. 【請求項３】動物が、ウサギまたはウシから選択される
   請求項２の組成物
4. 【請求項４】組成物が液状であり、アルブミンの濃度が
   ０．５−３０%w/vである請求項１の組成物
5. 【請求項５】糖類が、シュークロース、フルクトース、
   ラクトース、マルトース、およびトレハロースで構成さ
   れる群から選択される２糖類である請求項１の組成物
6. 【請求項６】組成物が液状であり、糖類として０．５−
   ３０%w/vのシュークロースを含む請求項１の組成物
7. 【請求項７】トランスフェリンレセプターが、ヒト・ト
   ランスフェリンレセプターである請求項１の組成物
8. 【請求項８】トランスフェリンレセプターが、ヒト血清
   由来のトランスフェリン−トランスフェリンレセプター
   複合体として存在している請求項１の組成物
9. 【請求項９】組成物が液状であり、溶液のｐＨが６−９
   である請求項１の組成物
10. 【請求項１０】アルブミンおよび糖類を共存させること
    による、トランスフェリンレセプターの安定化方法
11. 【請求項１１】トランスフェリンレセプターがトランス
    フェリンとの複合体として液体中に存在するものである
    請求項１０の安定化方法
12. 【請求項１２】アルブミンおよび糖類を共存させること
    によって、凍結によるトランスフェリンレセプターの反
    応性の低下を防止する方法