JPH10248558A

JPH10248558A - 超臨界流体中での酵素反応方法

Info

Publication number: JPH10248558A
Application number: JP5656297A
Authority: JP
Inventors: Shigeo Okahata; 恵雄岡畑; Toshiaki Mori; 俊明森
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1997-03-11
Filing date: 1997-03-11
Publication date: 1998-09-22

Abstract

(57)【要約】【課題】有機溶媒中での酵素反応が有する酵素の失活
等に起因する反応性の低さの欠点を改良し、新しい酵素
反応方法を提供する。【解決手段】脂質単分子膜で酵素表面を被覆してなる
脂質修飾酵素を用いて超臨界流体中で反応させる。【効果】単なる有機溶媒中での酵素反応に比べ、酵素
が失活することがなく反応を高速、高収率、高選択率で
行うことができ、反応生成物の精製も容易になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、超臨界流体中で酵
素反応を行わせる際に、脂質単分子膜で酵素表面を被覆
してなる脂質修飾酵素を用いる酵素反応方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】医薬品工業、食品工業、農水産分野、高
分子分野及び有機中間体原料の製造分野等において、酵
素の有する優れた特性を利用し、エステル類やペプチド
類等の生理活性物質、光学活性な有機中間体原料等の様
々な化合物を合成しようとする工業的製造法が研究され
ている。これらの研究において、酵素反応の基質及び生
成物の溶解度の観点から、近年有機溶媒の使用が盛んに
検討されるようになった。

【０００３】有機溶媒中での酵素反応には、酵素を有機
溶媒に懸濁して反応させる不均一系の反応と、酵素を有
機溶媒に完全に溶解して反応させる均一系の反応とがあ
る。不均一系の反応では通常、粗酵素が用いられるが、
酵素が有機溶媒に懸濁しているため基質の酵素内部への
拡散が低く反応性が低い。均一系の反応の例としては、
酵素をポリエチレングリコールで修飾し、有機溶媒に可
溶化する方法(Y.Inada et al.,Biochem.Biophys.Res.Co
mmun.,vol.122,845,(1984))があるが、調製方法が煩雑
であり酵素活性も低い。また、酵素と脂質の複合体を形
成させ、有機溶媒に可溶化する方法（特開昭64-80282
号)があるが、複合体中に含まれる酵素量が低い等の問
題点がある。

【０００４】以上のように、有機溶媒を使用する方法に
ついては種々検討されてきたが、反応速度が遅く工業的
生産には適さなかった。また、有機溶媒の生成物中への
残留等の品質面での問題及び環境面での問題があり地球
環境保全型プロセスとは言い難い側面を持っている。

【０００５】一方、超臨界流体中での有機触媒反応が、
省エネルギーかつ高生産性の効率的プロセス、及び地球
環境保全型プロセスとして注目され盛んに研究されてい
る。超臨界流体とは、気体、液体および固相の３状態の
ほかに臨界点以上で圧力をかけても凝縮しない流体相を
いう。圧力を変えることにより、気体に近い状態から液
体に近い状態まで密度を連続的に変化させることがで
き、流体物質の粘度、拡散係数や極性などの諸物性を変
えることができるため、触媒反応の選択性を制御できる
ことが期待されている。また、気相に近い状態で反応を
行うことができるので、超臨界流体のもつ低粘度性かつ
高拡散性のため反応速度の向上も期待されている。さら
に、反応終了後に圧力を常圧にすることにより媒体は気
体となり、生成物が反応器内に残るため、超臨界流体中
で反応を行えばその後の精製プロセスを簡略化できる。

【０００６】上記の超臨界流体中での酵素反応に関して
は、低毒性の二酸化炭素を媒体とした加水分解、エステ
ル化、及び酸化反応が検討されている（O.Aaltonen et
al.,CHEMTECH,vol.21,p.240,(1991))。また、固定化リ
パーゼを用いる超臨界流体中での反応についても報告が
ある（特開昭61-21098号、特開平8-256783号）。しか
し、これらの場合には酵素の失活が生じたり、生成物と
の分離を主眼とした固定化を行っているために、いずれ
の場合にも超臨界流体中での反応効率は悪かった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、脂質単分子膜で酵素表面を被覆してなる脂
質修飾酵素を用いて超臨界流体中で反応させることによ
り、反応を高速、高収率、高選択率で行うことを可能と
し、さらに、簡単な精製法が可能な環境に優しい工業的
プロセスを提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意検討し
た結果、脂質単分子膜で酵素表面を被覆してなる脂質修
飾酵素を用い超臨界流体中で反応させることにより、単
なる有機溶媒中での反応に比べ、酵素が失活することな
く反応を高速、高収率、高選択率で行うことができるこ
とを見いだし本発明を完成した。

【０００９】即ち、本発明は脂質単分子膜で酵素表面を
被覆してなる脂質修飾酵素を用いることを特徴とする超
臨界流体中での酵素反応方法である。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明に使用できる酵素は、酵素
の分類上における特定のものに限定されるものではな
く、加水分解酵素、転移酵素、酸化還元酵素、付加酵素
及、異性化酵素、合成酵素を挙げることができる。

【００１１】具体的に述べると、まず加水分解酵素につ
いては、エステルを加水分解するエステラーゼとしてリ
パーゼを挙げることができる。リパーゼは微生物により
生産されたものでもよいし、動物の臓器や植物の種子等
から得られたものでもよい。

【００１２】ペプチド結合を加水分解するプロテアーゼ
やペプチダーゼとして、ペプシン、キモトリプシン、カ
ルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、ジペプチ
ダーゼ、パパイン、プロメリン、ズブチリシン、サーモ
リシン等が挙げられる。

【００１３】糖のグリコシド結合に作用するグリコシダ
ーゼでは、α−及びβ−グルコシダーゼ、α−及びβ−
ガラクトシダーゼ、α−及びβ−マンノシダーゼ、β−
フルクトシダーゼ等のオリゴサッカラーゼ、さらには各
種のアミラーゼ類、セルラーゼ、イヌリナーゼ等のポリ
サッカラーゼ等が挙げられる。

【００１４】リン酸結合の加水分解に関与するホスファ
ターゼでは、ホスホモノエステラーゼ、ホスホジエステ
ラーゼ、ピロホスファターゼ等が挙げられる。

【００１５】加水分解酵素以外の酵素の例としては、ホ
スホトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラー
ゼ、ペプチジルトランスフェラーゼ、アミノトランスフ
ェラーゼ、トランスグルタミナーゼ等の転移酵素、アル
コールデヒドロゲナーゼ、アミンオキシダーゼ、モノフ
ェノールモノオキシゲナーゼ等の酸化還元酵素、アルド
ラーゼ、アコニターゼ、エノラーゼ、アスパルターゼ等
の付加酵素、ラセマーゼ、ムターゼ、シス−トランスイ
ソメラーゼ等の異性化酵素等が挙げられる。

【００１６】上記のいずれの酵素を用いる場合にも酵素
は必ずしも精製されたものである必要はなく、粗酵素、
あるいは当該酵素を多量に含有する生物の臓器や細胞の
抽出物であっても構わない。

【００１７】本発明に用いることのできる脂質は、例え
ば、天然に存在するものとして、中性脂質ではモノガラ
クトシルジグリセリド、ガラクトシルグルコシルジグリ
セリド等のグリセロ糖脂質、モノグリコシルセラミド、
セラミドヘキソシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖
脂質、ステロール配糖体、カルデノリド配糖体、サポニ
ン等のステロイド配糖体、ジアシルトレハロース、トリ
アシルグルコース等の脂肪酸配糖体等を挙げることがで
きる。また、アニオン性脂質では、ホスファチジルイノ
シトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジ
ン酸等のリン脂質、そして両性脂質では、ホスファチジ
ルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルセリン等のリン酸脂質等を挙げることができる。

【００１８】一方、合成脂質としては、合成２分子膜形
成化合物を挙げることができる。すなわち、炭素数６〜
３０の２本の炭化水素鎖を疎水部分とし、糖等のポリヒ
ドロキシ基、リン酸基、スルホン酸基、アンモニウム塩
等の官能基を親水部分として有する化合物、またはビフ
ェニル基などの分子間相互作用を有する官能基を炭化水
素鎖中に含む１本鎖の化合物である。具体的には、ジア
ルキルホスフェート、ジアルキル型ポリエチレングリコ
ール、ジアルキルスルホコハク酸、ジアルキル型糖脂
質、ジアルキルアンモニウム塩等を挙げることができ
る。

【００１９】本発明の脂質修飾酵素とは、酵素表面を脂
質単分子膜で被覆したものであって、化学的に見れば酵
素の表面と脂質の親水基が水素結合により結合している
ものをさす。この特徴を有する脂質修飾酵素は、特開昭
64-80282号に記載の方法にて、簡単に得ることができ
る。すなわち、酵素をｐＨ５．０〜９．０の緩衝液に溶
解させておく。脂質を少量のメタノール、エタノール、
プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、その他
の親水性有機溶媒に溶解し、緩衝液に混ぜ脂質の溶解し
た懸濁液を調製し、先に調製した酵素含有緩衝液に冷却
下に滴下し、脂質修飾酵素を析出させる。この析出物を
遠心分離または濾過等により分離した後、緩衝液、つい
で蒸留水で洗浄し、そのまま凍結乾燥や流動層乾燥し、
または、少量の蒸留水に分散させた後にスプレー乾燥す
ることにより、粉末状の脂質修飾酵素を得ることができ
る。さらに、脂質修飾酵素内の酵素含有量を向上させる
ためには、特開平3-280880号に記載の方法に従い界面活
性剤等の分散剤を第３成分として添加することもでき
る。この場合、酵素−界面活性剤−脂質の複合体を反応
に用いることになる。また、有効に無駄なく酵素及び脂
質を利用するため、酵素含有緩衝液と脂質含有緩衝液の
混合後、単に減圧下に水を留去することにより残った脂
質修飾酵素、酵素及び脂質を含んだ残存物をそのまま酵
素反応に使用することも可能である。

【００２０】本発明で用いることができる超臨界流体
は、耐熱性酵素の従来の知見から判断し臨界温度が１５
０℃未満のものに限定されると考えられる。具体的には
二酸化炭素が最も一般的であるが、その他にもエタン、
エチレン、プロパン、プロピレン、キセノン、フルオロ
ホルム（フレオン２３）、六フッ化硫黄等を挙げること
ができる。必要に応じていずれかの媒体を組み合わせて
用いることも可能である。また、基質の溶解性を考慮
し、これらの媒体に対して重量比で０．１〜４００％の
範囲の割合で水を加えた二相系で反応を行うことが好ま
しい場合もある。

【００２１】反応の方法は、耐圧性のステンレス、ガラ
ス等の適切な容器に、上記にて調製した脂質修飾酵素と
基質を入れ密閉し、その状態で超臨界流体を徐々に送入
した後、所定圧を保ち、所定温度にて酵素反応を行う。
反応時の圧力は４〜５０ＭＰａ、好ましくは４〜２０Ｍ
Ｐａ、反応時の温度は５〜１５０℃、好ましくは１０〜
１００℃である。反応終了後には、徐々に系を減圧し常
温、常圧に戻すだけで、媒体を気体として除去すること
ができる。

【００２２】

【実施例】以下、実施例により本発明の内容をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。実施例１（１）脂質修飾酵素の調製Bacillus circulans由来のβ−ガラクトシダーゼ（大和
化成製）５０ｍｇを酢酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．
０）２５ｍｌに溶解した酵素溶液を作成し、４℃に冷却
した。ジドデシル−Ｎ−Ｄ−グルコノ−Ｌ−グルタミン
酸エステル（化１）５０ｍｇをエタノール０．５ｍｌに
溶解した溶液を上記酵素溶液に滴下し、４℃で１時間撹
拌した。その後、この混合液を４℃で１５時間放置して
生じた白色沈殿を遠心分離により回収し、上記の酢酸緩
衝液で２回、蒸留水で１回洗浄した。洗浄後の固形物を
凍結乾燥し、２１．０ｍｇの粉末を得た。得られた脂質
修飾酵素はＵＶスペクトルと元素分析により同定した。
この脂質修飾酵素のタンパク含有量は１０．０％であっ
た。

【００２３】

【化１】

【００２４】（２）超臨界流体中での酵素反応次に、１０ｍｌの耐圧ガラス容器（耐圧硝子工業製）の
中にこの脂質修飾酵素１ｍｇと糖供与体としてｐ−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１μｍｏ
ｌ）、糖受容体として５−フェニルペンタノール（１０
μｍｏｌ）を入れ、さらに水を５ｍｌ入れた後、炭酸ガ
スボンベから５ｍｌの二酸化炭素を−５℃以下に冷却し
つつ送液ポンプで容器に注入した。反応は３５℃の温度
で圧力を１５ＭＰａに保って行い、生成するｐ−５−フ
ェニルペンチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの量を高
速液体クロマトグラフィーにより測定し、ｐ−ニトロフ
ェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからの糖転移率を
求めた。結果を表１（表１）に示した。比較例として未
修飾酵素を用いた場合には目的の生成物が得られず、ま
た、イソプロピルエーテル中での単なる有機溶媒を用い
た反応（常圧、３５℃）では反応速度が非常に遅かっ
た。

【００２５】

【表１】

【００２６】実施例２Rhizopus delemar由来のリパーゼＤ（生化学工業製）を
用い、実施例１と同様の方法で脂質−酵素複合体を形成
させ、タンパク含有量４．２％の脂質修飾酵素を得た。

【００２７】実施例１で用いた耐圧ガラス容器にこの脂
質修飾酵素を１ｍｇ、モノラウリンを０．５ｍｍｏｌ、
ラウリン酸を５ｍｍｏｌ入れ、炭酸ガスボンベから１０
ｍｌの二酸化炭素を−５℃以下に冷却しつつ送液ポンプ
で容器に注入した。その後、モノラウリンのエステル化
反応を４０℃、１５ＭＰａの条件で行った。生成したラ
ウリン酸トリグリセリドは液体クロマトグラフィーによ
り定量した。その結果、エステル化反応の初速度は０．
９４ｍｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ−タンパク質と算出され
た。比較例としてベンゼンを有機溶媒として用い（常
圧、４０℃）反応させたところ、初速度は０．１６ｍｍ
ｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ−タンパク質と算出された。

【００２８】実施例３実施例２の基質のうち０．５ｍｍｏｌのモノラウリンの
代わりに０．５ｍｍｏｌの（Ｒ）−または（Ｓ）−１−
フェニルエタノールを用い、実施例２と同様の条件下で
ラウリン酸の不斉選択エステル化反応を行った。生成し
たラウリン酸−１−フェニルエチルエステルはガスクロ
マトグラフィーにより定量した。その結果、超臨界二酸
化炭素中での反応において高いＲ−体選択性（ｋ_R／ｋ_S
＝７７）が認められた。

【００２９】

【発明の効果】本発明の脂質単分子膜で酵素表面を被覆
してなる脂質修飾酵素を用い超臨界流体中で反応させる
ことにより、酵素が失活することなく反応を高速、高収
率、高選択率で行うことができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】脂質単分子膜で酵素表面を被覆してなる
脂質修飾酵素を用いることを特徴とする超臨界流体中で
の酵素反応方法。
【請求項２】酵素がグリコシダーゼまたはリパーゼで
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の酵素
反応方法。