JPH10248566A - 細胞容量調節ヒトキナーゼｈ−ｓｇｋ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞容量の変化に依存して転写調節を受ける
遺伝子を利用する細胞容量の変化を伴う疾患の診断方法
の開発。 【解決手段】 本発明は、ヒトセリン／スレオニンキナ
ーゼ（ｈ−ｓｇｋ：血清およびグルココルチコイド依存
性キナーゼ）のクローニングおよび特性解明に関する。
本発明はさらに，生体内の細胞容量および／または「マ
クロ分子のクラウディング（crowding）」の変化に伴う
状態、たとえば高ナトリウム血症、低ナトリウム血症、
糖尿病、腎不全、異化亢進、肝性脳症、炎症および微生
物またはウイルス感染症の診断のための試薬に関する。
本発明はさらに、ｈ−ｓｇｋ、ｈ−ｓｇｋをコードする
核酸、またはｈ−ｓｇｋに特異的に結合する受容体とく
に抗体からなる医薬に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトセリン／スレ
オニンキナーゼ（ｈ−ｓｇｋ：血清およびグルココルチ
コイド依存性キナーゼ）のクローニングおよび特性解明
に関する。本発明はさらに、生体内の細胞容量および/
または「マクロ分子のクラウディング（crowding）」の
変化に伴う状態、たとえば高ナトリウム血症、低ナトリ
ウム血症、糖尿病、腎不全、異化亢進、肝性脳症、炎症
および微生物またはウイルス感染症の診断のための試薬
に関する。本発明はさらに、ｈ−ｓｇｋ、ｈ−ｓｇｋを
コードする核酸、またはｈ−ｓｇｋに特異的に結合する
受容体とくに抗体からなる医薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞外の浸透圧が一定の場合でも、細胞
容量の恒常性は、細胞膜を横切る輸送および細胞の代謝
すなわち浸透圧活性物質の産生および分解により絶えず
攻撃を受けている。

【０００３】細胞の膨潤および収縮は、それぞれ細胞の
マクロ分子の希釈および濃縮により細胞内環境を妨害
し、それが細胞機能の広範な損傷を招来する。これは、
細胞が多数の細胞容量調節機構を発達させてきた理由で
ある。細胞の膨潤は、大部分の組織においてイオンチャ
ンネルの活性化およびＫＣｌ共輸送によりイオンの細胞
性放出を招くことになる。逆に、細胞の収縮はＮａＣｌ
／ＫＣｌ共輸送系およびＮａ⁺／Ｈ⁺交換系の活性化によ
るイオンの細胞内取り込みを招く。

【０００４】さらに、細胞の収縮は、浸透圧電解質、す
なわち細胞内浸透圧の発生に特異的に使用される分子の
細胞内蓄積を刺激し、一方、細胞の膨潤はそれらの細胞
外放出を刺激する［Burg, M.B., Am. J. Physiol. 268:
F983-F996, 1995］。

【０００５】最後に、肝細胞容量の変化は肝細胞の代謝
および遺伝子発現に影響する［Haeussingerら(1994) A
m. J. Physiol. 267: E343-E355］。細胞の膨潤は、同
化シグナルと同様に作用してタンパク質およびグリコー
ゲンの合成を刺激し、タンパク質およびグリコーゲンの
分解を阻害する。逆に、細胞の収縮は、異化シグナルと
同様に作用して、タンパク質およびグリコーゲンの分解
を促進し、タンパク質およびグリコーゲンの合成を阻害
する［Haeussingerら (1994) Am. J. Physiol. 267: E3
43-E355］。

【０００６】細胞の容量は、ホルモン、細胞内アミノ酸
取り込みおよび酸化ストレスによる肝細胞代謝の調節に
おける重要なエレメントとして認識されてきた。

【０００７】細胞機能を細胞の水和状態の変化にカップ
リングさせるシグナル機構についてはほとんど不明であ
る。細胞容量の変化は、一部は特定の遺伝子の発現の刺
激または抑制、ついでそれらの産物による多数の細胞成
分の発現または活性への影響による細胞機能に対する様
々な作用を達成する。細胞の膨潤に際して発現が増大す
る遺伝子を発見するため、本発明者らは、等張性または
非等張性細胞外液のいずれかに暴露された肝細胞からの
ｃＤＮＡについて、判別ｍＲＮＡフィンガープリンティ
ングアッセイを実施した。これにより、様々なプライマ
ーの使用に対し特異な発現速度を示す複数個のバンドが
生じた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】驚くべきことに、これ
らのバンドの一つの発現は高張性条件下に刺激され、低
張性条件下に阻害されることが見出されたのである。細
胞容量の変化によって特定の様式でその発現が影響され
るこのバンドのｃＤＮＡ配列を詳細に分析した。配列の
比較により、従来既知のヒト遺伝子とは全く類似性を示
さないことが見出された。配列番号１にそのヌクレオチ
ド配列を示す見出された遺伝子は、驚くべきことにセリ
ン/スレオニンキナーゼと思われる一つのキナーゼをコ
ードする。その配列を配列番号２ならびに配列番号１に
示す。それは、発現が血清およびグルココルチコイドに
よって上昇する従来既知のラットｓｇｋ（血清およびグ
ルココルチコイド依存性キナーゼ）と高いホモロジーを
有する。しかしながら、ラットｓｇｋの細胞容量に対す
る依存性はこれまで報告されていない。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明はしたがって、ヒ
ト細胞容量調節キナーゼ（ｈ−ｓｇｋ）および遺伝子操
作によるその製造方法に関する。

【００１０】ｈ−ｓｇｋの発現は細胞容量に著しく依存
する。細胞の膨潤はｈ−ｓｇｋの発現を阻害し、一方、
細胞の収縮はｈ−ｓｇｋの発現を刺激する。さらにｈ−
ｓｇｋの発現は尿素によって阻害される。尿素は細胞容
量の変化と同様に、細胞タンパク質の安定性すなわちそ
の機能、およびマクロ分子クラウディングと呼ばれる細
胞マクロ分子の充填密度に障害を及ぼす［Minton, A.
P., Mol. Cell. Biochem. 55: 119-140, 1983］。ｈ−
ｓｇｋの発現はしたがって細胞マクロ分子のクラウディ
ングの指標となる。しかしながら、ｈ−ｓｇｋの転写
は、ラットｓｇｋとは異なりコルチコイドまたは胎児ウ
シ血清（ＦＣＳ）のいずれによっても影響されない。

【００１１】ｈ−ｓｇｋは、多くのヒト組織、たとえば
肝臓、心臓、膵臓、筋肉、腎臓、肺臓、胎盤、リンパ球
および脳内の数種の構造（海馬、尾状核、脳梁、黒質、
視床下核および視床）において発現する。

【００１２】ｈ−ｓｇｋは、細胞容量の変化が重要な病
態生理学的役割を果たしている多くの疾患に対してかな
りの診断能力を有することが明らかにされた。ｈ−ｓｇ
ｋの発現は、適当なプローブを用いて、たとえばノーザ
ンブロットまたはインシトゥハイブリダイゼーションに
よるｍＲＮＡの検出および／または定量によって証明す
ることが可能であり、またｈ−ｓｇｋ自体を、たとえば
適当な抗体を用い、ウエスタンブロットまたは免疫組織
化学で検出することができる。適当なプローブおよび抗
体は既に有用性のチェックに成功している。

【００１３】したがって、本発明はまたｈ−ｓｇｋ、そ
のフラグメントまたはそれをコードする関連核酸の診断
的使用に関する。使用できる診断方法は熟練した研究者
には周知である。これらには従来技術として知られるす
べてのイムノアッセイフォーマット、たとえばウエスタ
ンブロットまたは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）ならび
に固相に結合させないすべての均一アッセイフォーマッ
トが包含される。考えられる例には競合アッセイの変法
があるが、サンドイッチ原理に基づく間接アッセイまた
は設計も直接可能である。同様に、熟練した研究者には
周知の標識技術も使用できる。すべての種類の核酸検出
法、たとえばサザンブロット、ノーザンブロットおよび
ハイブリダイゼーション法のすべての変法がインシトゥ
ハイブリダイゼーションを含めて使用できる。

【００１４】

【発明の実施の形態】ｈ−ｓｇｋは、体液中たとえば血
液、血漿または血清中および固体組織中たとえば生検材
料中の両者で検出することができる。ｈ−ｓｇｋの検出
は、生体内の細胞容量またはマクロ分子クラウディング
に変化が生じるすべての場合、たとえば、高ナトリウム
血症、低ナトリウム血症、糖尿病、腎不全、異化亢進、
肝性脳症、炎症および感染症において示される。

【００１５】さらに、ｈ−ｓｇｋの機能不全は肝臓代謝
の調節障害を招来することがある。したがって、ｈ−ｓ
ｇｋの検出はフルクトース不耐性ならびに高血糖および
低血糖状態の診断的解明に有用である。

【００１６】高ナトリウム血症：これは、たとえば中枢
性または腎性尿崩症による浸透圧利尿および水利尿があ
る場合に起こる生命に危険のある障害である。中枢性尿
崩症は、遺伝性欠損、頭蓋脳外傷、炎症による視床下部
ニューロンの損傷、低灌流、腫瘍、アルコール、オピエ
ートおよびある種の薬物の消費により生じる。腎性尿崩
症は、遺伝子欠損、低カリウム血症、高カルシウム血
症、タンパク質欠乏、腎盂腎炎、および様々な薬物によ
る処置等により起こる。培養肝細胞および腎細胞での実
験によって示されるように、常に細胞外浸透圧の上昇も
伴う細胞外Ｎａ⁺濃度の上昇は、ｈ−ｓｇｋの発現の増
大を生じる。すなわち、このキナーゼは細胞収縮の程度
の指示薬として使用可能であり、また治療のモニタリン
グに採用できる。この種の監視は、細胞外高浸透圧にも
かかわらず高ナトリウム血症の矯正が迅速すぎると致命
的な細胞の膨潤を生じる場合があることから重要であ
る。

【００１７】低ナトリウム血症：１３０mmol／Ｌ未満の
低ナトリウム血症は、全入院患者の約１〜２％に認めら
れる。この生命に危険のある障害の原因には、糖尿病、
ケトン尿症、肝不全、利尿剤、オピエート、各種薬物、
浸透圧利尿、重炭酸塩尿症、副腎不全、塩類消失性腎
炎、ネフローゼ症候群、ＡＤＨの分泌増加、および水の
みの置換による等張性液体の喪失（たとえば下痢）があ
る。低ナトリウム血症が血液中の他の浸透圧電解質の増
加の結果であれば、細胞容量およびｈ−ｓｇｋの発現は
正常に維持される。しかしながら、低ナトリウム血症が
細胞の膨張を伴う低浸透圧を反映するものであればｈ−
ｓｇｋの発現は低下する。すなわちｈ−ｓｇｋの測定は
細胞膨潤の存在についての情報を提供し、治療操作につ
いての合理的な決定を可能にする。このキナーゼは治療
に際して進行のチェックに採用できる。急速すぎる低ナ
トリウム血症の矯正は細胞の収縮を生じて、これが致命
的になる場合がある。

【００１８】糖尿病：高血糖は糖尿病で起こり、細胞外
浸透圧の上昇を生じ、したがって細胞の収縮の原因とな
る。糸球体ろ過を受けるグルコースは最大腎輸送率を越
え、この様式で浸透圧利尿が強化されＮａ⁺および水が
失われる。これは低ナトリウム血症の発症をもたらすこ
とがある。細胞外浸透圧の上昇およびグルコースの過剰
供給はソルビトールの細胞内産生を促進し、これは細胞
外浸透圧低下時に細胞の膨潤を生じる。糖尿病に伴う細
胞収縮および細胞膨潤はその病態生理において極めて重
要であると考えられている［McManusら, New England
J. Med. 333: 1260-1266, Dermadashら, Kidney Inter
n. 50: 2032-2040, 1996］。糖尿病患者におけるｈ−ｓ
ｇｋの測定は細胞容量の変化の評価を可能にし、電解質
障害の補償に確実な基盤を提供する。この場合も進行の
観察は過剰な補正を防止できる。

【００１９】腎不全：腎不全においては、尿素濃度の著
しい上昇がタンパク質に対して不安定化作用を示すレベ
ルにまで達して、細胞の収縮を生じ、またｈ−ｓｇｋの
発現の低下をもたらす。尿素の不安定化作用はトリメチ
ルアミンの形成によって減弱する。尿素濃度の変化が急
速な場合にはトリメチルアミンの蓄積が維持できず、細
胞容量の変化による細胞代謝の妨害が予想されるところ
となる。ｈ−ｓｇｋの測定は不安定化する尿素と安定化
するトリメチルアミンの間の不均衡を明らかにできる。
ｈ−ｓｇｋが著しく低下しているならば、必要に応じて
トリメチルアミンの治療的投与が適用される。

【００２０】異化亢進：多くの異化状態、たとえば敗血
症、火傷、急性膵炎、大きな手術において、異化亢進の
程度に相関する筋肉細胞の容量変化が検出されている。
実際に、細胞収縮はタンパク質分解の促進を、細胞の膨
潤はタンパク質分解の阻害を招来する。ｈ−ｓｇｋの測
定は、細胞の収縮に対する拮抗に適当な治療手段の使
用、たとえばグルタミン投与［Haeussingerら, Lancet,
341: 1330-1332,1993］あるいは浸透圧電解質の投与
［Burg, M.B., J. Exp. Zool. 268 (2): 171-5, 1994］
を個々の症例において正当化することができる。

【００２１】肝性脳症：肝性脳症がグリア細胞の膨潤に
よってもたらされることには、注目すべき証拠がある
［Norenberg, M.D., Exp. Neurol. 53 (3): 213-220, 1
994］。実際、肝疾患の場合には、脳内の浸透圧電解質
イノシトールの低下が検出できる［Kreisら, NMR Biome
d. 4: 109-116, 1991］。完全な消失と一致して脳症が
発症する。ｈ−ｓｇｋに対する適当な基質が開発され使
用されれば、肝性脳症が起こる前でも脳内ｈ−ｓｇｋ活
性の測定および均衡調節が可能と思われる。必要に応じ
て、より迅速に入手できる組織におけるｈ−ｓｇｋの発
現もグリア細胞における容量変化の指標として使用でき
る。

【００２２】アルツハイマー病：最近の証明では、アル
ツハイマー病における末梢細胞容量の上昇が指摘されて
いる。しかも浸透圧電解質イノシトールが、アルツハイ
マー病患者では上昇しているが、他の原因の痴呆では上
昇は認められない。ｈ−ｓｇｋの発現はアルツハイマー
病の診断に寄与するものと思われる。

【００２３】感染症／炎症：敗血症は、異化亢進の存在
に相当する広範な細胞の収縮を伴う［Haeussingerら, L
ancet 1993, 341: 1330-1332］。実際、細胞容量は病原
体−宿主の関係に重要な役割を果たしている。ｈ−ｓｇ
ｋの発現は感染症の病態生理の評価に有用なパラメータ
ーである可能性がある。インシトゥハイブリダイゼーシ
ョンにより、炎症疾患たとえば肝炎、膵炎、クローン
病、または糸球体腎炎においてｈ−ｓｇｋの組織レベル
の著しい上昇が明らかにされた。さらに、ｈ−ｓｇｋの
発現は、肝硬変、肺線維症および進行性腎不全のような
進行性の線維症に関連するとされているＴＧＦβによっ
て増大する。ｈ−ｓｇｋの発現は実際に、慢性腎不全の
患者で増大が見出されている。

【００２４】高血糖／低血糖／乳酸アシドーシス：ｈ−
ｓｇｋの発現および／または機能の低下または上昇は、
細胞収縮および細胞膨潤に伴う炭水化物代謝の障害を生
じる場合がある［Langら, Pfluegers Arch. 413: 209-2
16, 1989］。機能の低下は低血糖の脅威を生じることが
ある。機能の上昇は、一方では高血糖を、他方では乳酸
アシドーシスを起こす可能性がある。したがって、起源
不明の高血糖、低血糖および乳酸アシドーシスの診断的
解明には、ｈ−ｓｇｋの発現および機能の検討も常に有
用である。

【００２５】本発明をついで、以下の詳細な記述により
さらに説明し、さらに実施例および請求の範囲によって
記述する。

【００２６】〔発明の詳述〕 材料および方法 材料：ウシ胎児血清およびＤＭＥＭ（ダルベッコ改良イ
ーグル培地）は Gibco／ＢＲＬ（Eggenstein, German
y）、酵素はStratagene（Heidelberg, Germany）および
Boehringer Mannheim（Mannheim, Germany）、α−[³⁵
Ｓ]−ｄＡＴＰはＩＣＮ（Eschwege, Germany）、SuperS
cript（登録商標）逆転写酵素はGibco／ＢＲＬから購入
した。ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）はCrocodil
e（登録商標）IIサーモサイクラー（Appligene Oncor,
Heidelberg, Germany）によりPrime Zyme（登録商標）
ＤＮＡポリメラーゼおよびBiometra（Goettingen, Germ
any）からのＰＣＲ緩衝液を用いて実施した。ＲＡＰ−
ＰＣＲプライマーはStratageneから、配列決定プライマ
ーはＭＷＧ（Ebersberg, Germany）から購入した。手動
配列決定はFidelity（登録商標）ＤＮＡ配列決定システ
ム（Appligene Oncor）を用いGibco／ＢＲＬからのＳ２
シークエンサーによって実施した。

【００２７】細胞培養：HepG2ヒト肝癌細胞は１０％（v
ol/vol）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）補充５％ＣＯ₂、５mM
グルコース含有ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）ｐＨ ７.４中３７℃で培養した。ＲＮＡの単離の前
に細胞を９０％コンフルーエントに培養し、ウシ胎児血
清を含まないイーグルの基礎培地（ＢＭＥ，Gibco／BR
L）中に１２時間保持した。細胞外浸透圧は、ＢＭＥ培
地の他の成分は変えないで食塩の特定量を添加または除
去することにより変動させた。アミノ酸の効果を試験す
る実験では、アミノ酸を添加する前２時間、アミノ酸を
含まない細胞外溶液中に細胞を保持した。

【００２８】ＲＡＰ−ＰＣＲ：ＲＮＡフィンガープリン
ティングＰＣＲ（ＲＡＰ−ＰＣＲ）は既報のようにして
［McClellandら, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4419-
4431］行った。４％アクリルアミド／７Ｍ尿素ポリアク
リルアミドゲルを通して電気泳動を実施したのち、ＰＣ
Ｒ産物は、銀染色によって可視化した［Sanguinetti
ら，Biotechniques 17: 914-921, 1994］。次いで１つ
の条件（高張性または低張性）のみで、可視化されたバ
ンドすべてを、逆転写および新たな培養体からのＲＮＡ
とのＰＣＲによって確認した。ＲＡＰ−ＰＣＲはｃＤＮ
Ａ合成およびＰＣＲ増幅のための４つの異なるプライマ
ーペアにより実施した。さらに、最初の増幅ラウンドで
は３０℃〜４０℃の間の異なる温度を選択した。これら
の修飾とともに、計６４回のＰＣＲ試行を行った。

【００２９】バンドの単離：再現可能な差を示したバン
ドを滅菌条件下に切り出した。このアンプリコンを１０
０μlの緩衝液（５０mM ＫＣｌ、１０mM Tris−Ｃｌ、
ｐＨ９.０、０.１％Triton Ｘ100）中７０℃にて一夜溶
出した。ＰＣＲによる再増幅は３.０μlの溶出液によっ
て、適当なプライマー（２５０nM）、２００μM ｄＮＴ
Ｐ、１.５mM ＭｇＣｌ₂含有１×低塩緩衝液（Stratagen
e）および５単位のＴaq＋（登録商標）ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Stratagene）を用い、以下の温度サイクル：９５
℃、６０秒で１サイクル、９５℃（１５秒）、５５℃
（１５秒）、７２℃（６０秒）で３０サイクル、および
最後に７２℃、５分間で実施した。期待された長さを有
する１つの特定のアンプリコンのみが生成されたことを
ＰＡＧＥで確認したのち、このアンプリコンを直接プロ
ーブの形成に使用した。

【００３０】ノーザン分析：ジゴキシゲニン (ＤＩＧ)
−カップリングプローブは、各種のアンプリコンの直接
ＰＣＲ標識により、以下のｄＮＴＰ濃度：２００μM ｄ
ＡＴＰ、２００μM ｄＣＴＰ、２００μM ｄＧＴＰ、１
９０μM ｄＴＴＰおよび１０μM ＤＩＧ−ｄＵＴＰ（Bo
ehringer）を用いたほかは、上述のように適当なプライ
マーおよび条件を使用して生成させた。ノーザンブロッ
トは、２.２Ｍホルムアルデヒドの存在下に１％アガロ
ースゲルを通して電気泳により分離した２０μgの総Ｒ
ＮＡまたは２μgのポリ(Ａ)−ＲＮＡを用いて調製し
た。ポリ(Ａ)−ＲＮＡの検討では、プローブの等量負荷
をリボソームＲＮＡバンドのエチジウムブロミド染色、
または内部標準としてヒト異種核リボヌクレオプロテイ
ンＣ１を用いるＤＩＧ−標識アンチセンスＲＮＡプロー
ブによりチェックした。ＲＮＡのサイズはＤＩＧ−標識
分子量マーカーI（Boehringer）を用いて推定した。陽
性に荷電したナイロン膜（Boehringer）への移送には真
空ブロッティング（AppligeneOncor Trans DNA Express
Vacuum Blotter）を用い、これを紫外線［StratageneU
V Stratalinker（登録商標）2400］により、ついで架橋
した。ハイブリダイゼーションは、DIG-Easy-Hyb（登録
商標, Boehringer）により、ＤＮＡプローブまたはＲＮ
Ａプローブについて、プローブ濃度２５ng／mlまたは１
００ng／ml、５０℃または６５℃において一夜実施し
た。異なる発現を示したプローブはｐＣＲ−Ｓcript Ｓ
Ｋ(＋) クローニングキット（Stratagene）を用いてサ
ブクローニングして、ノーザンブロットによってチェッ
クした。以下に示すノーザンブロットは、これらのサブ
クローンに由来する。

【００３１】他の方法：ｐＣＲクローンのＤＮＡ配列決
定はFidelity（登録商標）ＤＮＡ配列決定システム（Ap
pligene Oncor）を用いて実施した。配列決定生成物は
α−[ ³⁵Ｓ]−ｄＡＴＰで標識し、６％ポリアクリルアミ
ド／８Ｍ尿素配列決定ゲル上で分画化した。ＦＡＳＴＡ
コンピュータープログラム［Pearson, W.R. & Lipman,
D.J. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-24
48］を用いて、相同の配列についてGenBankのデータを
走査した。完全なｈ−ｓｇｋ ｃＤＮＡの配列は、ＴＩ
ＧＲ/ＡＴＣＣヒトｃＤＮＡクローン特殊収集機関から
のＩ.Ｍ.Ａ.Ｇ.Ｅ.共同体クローンＩＤ42669 を用いて
得られた。遺伝子データは欧州分子生物学試験所ＥＭＢ
Ｌ（Heidelberg）、ＢＬＡＳＴネットワークサービス、
タンパク質アラインメントについてはSwissProtタンパ
ク質データベース最新版のＢＬＩＴＺサーバーを用いて
検索した。

【００３２】ヌクレオチド配列受入番号：ｈ−ｓｇｋ
ｃＤＮＡ配列はＧenＢank データベースに受入番号：Ｙ
10032として登録された。1997年３月１日まで閲覧でき
なかった。

【００３３】結果 低張性、等張性および高張性細胞外液中のHepG2細胞に
おける遺伝子発現の相違：ｍＲＮＡは、低張性（低張性
IおよびII：等張性対照培地と比較して、５０mM ＮａＣ
ｌの除去により−１００mosmol／Ｌおよび２５mM Ｎａ
Ｃｌの除去により−５０mosmol／Ｌ）、等張性（総浸透
圧 ２９０mosmol／Ｌ、ＮａＣｌ濃度１１４mM）または
高張性（５０mMラフィノースの添加により＋５０mosmol
／Ｌ）培地で１〜２時間前処置したHepG2細胞から単離
した。ｍＲＮＡは、任意のプライマーによるＲＡＰ−Ｐ
ＣＲの鋳型として用いた。ＲＡＰ−ＰＣＲの産物を変性
ポリアクリルアミドゲルに負荷し、比較のために平行し
たレーンで分画化した。数種のプライマーの使用に対し
て、数種のバンドが異なる発現を示した。ＲＡＰ−ＰＣ
Ｒゲルからの４つの特異的なバンドをさらに分析した。
２つは以後のノーザンブロット分析において偽陽性であ
ることがわかり、１つのバンドは低張性および高張性条
件で増強されたが、その配列は既知のクローン化された
遺伝子とは類似性を示さなかった。約５００塩基ペアの
１つのバンドは細胞外浸透圧の上昇とともに発現の増大
を示した（低張性Ｉ−低張性II−等張性−高張性）。こ
のバンドをゲルから精製し、プライマーＲＡＰ−Ａ４を
用いて再増幅した。ジゴキシゲニンでＰＣＲ標識後、低
張性Ｉ、等張性および高張性培地で２時間前処置した様
々の細胞プレパレーションにおける異なる発現を確認す
るため、上記アンプリコンを用いてノーザンブロットを
行った。

【００３４】約２.６キロベースの単一の転写体が、細
胞外浸透圧の変化によって著しく影響された（配列番号
１）。転写体の量は浸透圧が低下すると減少し、浸透圧
が上昇すると増加した。

【００３５】異なる調節を受けたｈ−ｓｇｋ遺伝子のク
ローニングおよび配列決定：長さ５００塩基ペアのＰＣ
Ｒ産物をＰＣＲIIベクターにサブクローニングし、この
構築体により、元のＤＮＡフラグメントとサブクローニ
ングされたＤＮＡフラグメントの間の同一性を証明する
ために新たなプローブを生成させた。このプローブを用
いたノーザンブロットの再ハイブリダイゼーションで
は、元のプローブの場合と同じ結果が得られた。さら
に、この新たな構築体を用いてサザンブロット分析を実
施し、元の構築体とハイブリダイズさせた。２回の高緊
縮洗浄後の強力なハイブリダイゼーションにより、配列
の同一性が確認された。

【００３６】両方向の配列分析では、アンプリコンの両
側で使用したプライマーの存在が示された。ヌクレオチ
ド配列の１つのリーディングフレームによって翻訳され
たアミノ酸配列は、ラット乳癌細胞系からクローン化さ
れたセリン／スレオニンプロテインキナーゼタンパク質
ファミリーの新しいメンバーである（Websterら, Mol.
Cell.Biol. 13: 2031-2040, 1993a）ラットｓｇｋ（血
清およびグルココルチコイド調節タンパク質キナーゼ）
のカルボキシル末端アミノ酸配列と９５％の同一性を示
した。著しい類似性により、この新しいタンパク質にｈ
（ヒト）−ｓｇｋの名称が選択された。

【００３７】類似のヒト配列についてGenBankデータベ
ースをＦＡＳＴＡコンピュータープログラムを用いて走
査した。ＴＩＧＲ／ＡＴＣＣヒトｃＤＮＡクローン特殊
収集機関からの数種のＥＳＴ（発現配列タグ）ＤＮＡ配
列が、ｈ−ｓｇｋ ｃＤＮＡのフラグメントの部分と100
％の配列一致を示した。３０の異なるＴＩＧＲ／ＡＴＣ
ＣヒトｃＤＮＡクローンをラットｓｇｋ ｃＤＮＡ配列
（GenBank受入番号Ｌ01624）とｈ−ｓｇｋ ＤＮＡフラ
グメントと多重アラインメントしたのち、ヒト小児脳ラ
イブラリーからのクローンＩＤ 42669のＩ.Ｍ.Ａ.Ｇ.
Ｅ.共同体構築体がｈ−ｓｇｋの完全コード配列を有す
ると推定された。この構築体の、センスおよびアンチセ
ンス方向で一致する配列との配列分析により、約２.４
キロベースのｃＤＮＡ配列が明らかにされた。完全ｈ−
ｓｇｋの包含を証明するために、このクローンの５′−
末端（コード配列のヌクレオチド１〜２８５）をＰＣＲ
IIベクターにサブクローニングし、すなわち、この構築
体で新たなプローブを生成させた。このプローブのノー
ザンブロットのハイブリダイゼーションでは元のプロー
ブの場合と同一の結果が得られた（配列番号１）。検討
したクローン中の最長のリーディングフレーム（１.３k
b）はラットｓｇｋタンパク質と全体で９８％の同一性
を有する４３１アミノ酸のタンパク質を与えた。

【００３８】細胞外浸透圧の変化によるｈ−ｓｇｋの発
現の調節：ｈ−ｓｇｋ転写体の量に対する細胞外浸透圧
の変化の影響を検討するために、HepG2細胞を様々な時
間低張性（１９０mosmol／Ｌ）、等張性（２９０mosmol
／Ｌ）および高張性（３９０mosmol／Ｌ）のＦＣＳを含
まないＢＭＥ培地中でインキュベートした。高張性溶液
中では、６０分以内にｈ−ｓｇｋ ｍＲＮＡの濃度が著
しく上昇した。初期の上昇は30分以内に明らかで、２時
間以内に最大に達した。したがって、ｈ−ｓｇｋの誘導
は浸透圧の変化に続いて直ちに起こる。高張性細胞外Ｂ
ＭＥ培地中では、転写体の濃度は４〜８時間にわたって
さらに上昇し、ついで以後１６〜２４時間の経過で徐々
に再び低下して初期濃度に復した。一方、低張性細胞外
溶液中では、ｈ−ｓｇｋ転写体の濃度は急速に低下し、
わずか３０分後に低下が認められ、２時間以内に低下は
最大に達した。

【００３９】異なる浸透圧（140, 190, 240, 290, 340,
390および440mosmol／Ｌ）は２時間以内にｈ−ｓｇｋ
の発現の差を示した。ｈ−ｓｇｋの発現と細胞外浸透圧
の急峻な相関は全範囲にわたって検出された。浸透圧の
３０％の上昇はキナーゼの発現の約３倍の増加を伴っ
た。浸透圧の２９０mosmol／Ｌから３４０mosmol／Ｌへ
の上昇、および２９０mosmol／Ｌから２４０mosmol／Ｌ
への低下はｈ−ｓｇｋ発現の有意な変化を誘導した。し
たがって、転写制御機構は浸透圧の変化に極めて敏感に
反応することが明らかである。ｈ−ｓｇｋ ＲＮＡの誘
導は新しいタンパク質合成とは無関係だった。高張性Ｂ
ＭＥ培地中における転写体濃度の上昇は、タンパク質合
成阻害剤シクロヘキシミド（１０μg／ml）の存在下の
方が阻害剤の不存在下よりも大であった。

【００４０】細胞外浸透圧の低下後直ちにｈ−ｓｇｋ転
写体の濃度が急速に低下したことはｈ−ｓｇｋ ｍＲＮ
Ａの半減期が短いことを示唆している。ｈ−ｓｇｋ転写
体の濃度の低下速度を検討するために、HepG2細胞を高
張性培地（３９０mosmol／Ｌ）で２時間処置し、ｈ−ｓ
ｇｋ転写体濃度の最大上昇を得た。ついで一部の細胞
を、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤のアクチノマイシンＤ
（５μg／ml）に暴露し、残りの細胞は低張性培地（１
９０mosmol／Ｌ）に暴露した。様々な時間後にＲＮＡを
調製させて２つの細胞群の転写体濃度を比較した。アク
チノマイシンＤ処置では、ｈ−ｓｇｋ転写体濃度の急速
な低下を生じ、半減期は約３０分と評価された。低張性
細胞外培地による細胞の処置も同様に急速な転写体濃度
の低下を生じた。

【００４１】細胞容量の等張性変化によるｈ−ｓｇｋ転
写体濃度の調節：細胞容量、イオン強度および浸透圧の
変化の影響の間の識別を可能にするため、細胞容量を２
つの異なる方法で操作し、この間イオン強度と浸透圧は
変化させなかった。ブメタニドおよび３−メチルスルホ
ニル−４−（１−ピペリジノ）ベンゾイルグアニジン
（EP−0 416 499）でのＮａＣｌ／ＫＣｌ共輸送系およ
びＮａ⁺／Ｈ⁺交換系の阻害による等張性細胞収縮の２時
間以内に、ｈ−ｓｇｋ発現の増加が見られ、この効果
は、さらに細胞外浸透圧を上昇させることによって、さ
らに増強された。様々なアミノ酸（１×ＢＭＥアミノ酸
のアミノ酸混合物，Gibco/BRL）の供給による細胞の膨
潤は、逆に２時間以内にｈ−ｓｇｋ転写体濃度の低下を
生じさせた。したがって、ｈ−ｓｇｋの発現を調節する
のは、細胞容量であり、浸透圧でもイオン強度でもな
い。

【００４２】HepG2細胞内におけるｈ−ｓｇｋの発現
が、乳癌細胞におけるラットのｓｇｋの場合［Webster,
M.K.ら (1993), Mol. Cell. Biol. 13: 2031-2040］と
同様に、グルココルチコイドまたはウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）によって調節されるかどうかをチェックするため
に、HepG2細胞をデキサメタゾン（１μＭ）またはＦＣ
Ｓ（１０％）と２〜１２時間インキュベートした。HepG
2細胞内ｈ−ｓｇｋ転写体濃度に対するグルココルチコ
イドまたはＦＣＳの影響は、ノーザンブロットでは見出
すことができなかった。

【００４３】Madin Darby イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞に
おける細胞外浸透圧によるｓｇｋ転写体濃度の調節：細
胞容量に対するｈ−ｓｇｋ発現の観察された依存性がHe
pG2細胞に特殊なものかどうかをチェックするために、
イヌ腎臓上皮細胞ＭＤＣＫを低張性（１９０mosmol／
Ｌ）および高張性（３９０mosmol／Ｌ）ＢＭＥ培地に２
時間暴露した。０.５×ＳＳＣ（標準クエン酸塩食塩溶
液）による65℃での数回の高緊縮洗浄後にも長さ約２.
６キロベースのｈ−ｓｇｋ転写体の検出が可能で、異な
る種の間のｓｇｋ遺伝子配列の高いホモロジーが指示さ
れた。

【００４４】細胞外浸透圧の変化は、ＭＤＣＫ細胞にお
ける転写体の濃度にもHepG2細胞の場合と同様の作用を
示した。

【００４５】ｈ−ｓｇｋの組織特異的発現：予め作成し
た多重ノーザンブロット（Clontech,Heidelberg, Germa
ny）をｈ−ｓｇｋ ＤＮＡプローブで検討した。ｈ−ｓ
ｇｋの発現はある程度の組織特異性を示し、膵臓、肝臓
および心筋で最大の発現が認められる。胎盤、肺臓およ
び骨格筋での発現は若干低い。脳および腎臓では、低い
が検出可能な発現が見られる。ヒト脳組織では、発現は
黒質および脳梁において最大、扁桃体、海馬、尾状核お
よび視床下核で平均、視床で最小である。７キロベース
の第二の転写体がほとんどすべての組織で見出され、膵
臓で最大の発現を示したことは興味深い。この転写体
は、別のスプライシングまたはｈ−ｓｇｋに対して同種
の遺伝子による他のｈ−ｓｇｋ ｍＲＮＡである可能性
がある。７キロベースの転写体はHepG2ノーザンブロッ
トには見出されていない。

【００４６】尿素によるｈ−ｓｇｋ発現の調節：細胞外
空間における尿素の存在はｈ−ｓｇｋの発現を低下させ
る。ｈ−ｓｇｋ発現の減少は５０mmol／Ｌの尿素では中
等度であり、１００mmol／Ｌの尿素では著しい。

【００４７】考察 転写が細胞容量の変化によって調節されているヒト遺伝
子ｈ−ｓｇｋは、ラット脳におけるＣＮＳ損傷後の損傷
誘導遺伝子として（Imaizumiら, Mol. Brain Res. 26,
189-196, 1994）またラット卵巣の顆粒膜細胞において
テストステロンおよび下垂体前葉卵胞刺激ホルモンによ
り誘導される遺伝子として（Richardsら, Recent Prog.
Horm. Res. 50, 223-254, 1995）、最近記載されたラ
ット乳癌細胞からの血清およびグルココルチコイド調節
遺伝子であるラットｓｇｋ配列と高いホモロジーを有す
るセリン／スレオニンプロテインキナーゼ候補をコード
する。４９kDのｈ−ｓｇｋタンパク質は、実質的に保存
性のアミノ酸交換を含めてラットｓｇｋタンパク質とほ
ぼ９８％のホモロジーを示す。その触媒ドメインは、セ
カンドメッセンジャーファミリーの数種のキナーゼ、た
とえばｒａｃプロテインキナーゼ、プロテインキナーゼ
Ｃ、リボソームプロテインＳ６キナーゼ、およびｃＡＭ
Ｐ依存性プロテインキナーゼ［Websterら (1993b), J.
Biol. Chem.,268, 11482-11485; Websterら (1993a) Mo
l. Cell. Biol. 13, 2031-2040］と約５０％のホモロジ
ーを示す。

【００４８】HepG2細胞における２.６キロベースｈ−ｓ
ｇｋ転写体の発現レベルは細胞外浸透圧の変化によって
著しく影響される。細胞外浸透圧の上昇後３０分以内に
転写体濃度の上昇が認められた。この誘導は、新たなタ
ンパク質合成とは無関係だった。この転写体濃度は、細
胞外浸透圧の低下後３０分以内にの低下した。この低下
はアクチノマイシンＤによる転写の阻害後の低下と同様
に急速であった。

【００４９】したがって、細胞容量の変化はｈ−ｓｇｋ
転写速度に影響する。浸透圧性の細胞膨潤後のｈ−ｓｇ
ｋ転写速度の低下および短い半減期により、HepG2細胞
におけるｈ−ｓｇｋ ＲＮＡ転写体濃度の迅速かつ効率
的な関係が確認される。

【００５０】細胞容量の等浸透圧性の変化はｈ−ｓｇｋ
の発現に同様に影響する。細胞の収縮は、Ｎａ⁺／Ｈ⁺交
換系およびＮａＣｌ／ＫＣｌ共輸送系の必須のイオン輸
送機構を、それらの特異的遮断剤、３−メチルスルホニ
ル−４−（１−ピペリジノ）ベンゾイルグアニジン（EP
−0416 499）およびブメタニドで阻害することによって
達成された。細胞の膨潤は、アミノ酸の添加、ついでた
とえばシステムＡ、ＮおよびＡＳＣのようなＮａ⁺依存
性アミノ酸輸送系を介したアミノ酸の肝細胞蓄積によっ
てもたらされた。転写体濃度は浸透圧ではなく細胞容量
に相関した。

【００５１】長時間の浸透圧性細胞収縮ののちに、転写
体の濃度は初期の半時間以内に急峻に上昇し、ついで８
時間上昇したままに維持されたのち、再び徐々に低下し
た。この長時間の上昇は、細胞容量の調節の迅速性と明
らかに矛盾している。浸透圧によって収縮または膨潤し
た肝細胞は、しかしながら、それらの細胞容量を完全に
は調節せず、容量調節の迅速な相の後にもなお中等度に
収縮または膨潤したままに維持された［Haeussingerら
(1994) Am. J. Physiol. 267, E343-E355］。

【００５２】細胞容量における残りの変化はｈ−ｓｇｋ
発現の変化が関与するものと考えられる。

【００５３】細胞容量自体のほかに、尿素もｈ−ｓｇｋ
の発現対して著しい作用を有する。尿素はタンパク質に
対して不安定化作用を発揮し、この方式で細胞膨潤の効
果を模倣する。したがって、ｈ−ｓｇｋはタンパク質の
安定性または細胞マクロ分子の充填密度のセンサーとも
いえる。尿素の不安定化作用はトリメチルアミンの形成
によって消失し、尿素の不安定化作用は腎不全の症例で
もこれによって消失するものと思われる。

【００５４】ｈ−ｓｇｋの細胞作用は依然として不確定
である。とくに、現時点でもまだ、ｈ−ｓｇｋの作用が
細胞容量の調節に関与しているのかどうかを確信をもっ
て述べることはできない。しかしながら、ｈ−ｓｇｋの
作用は、診断の補助としてのｈ−ｓｇｋの使用には重要
ではない

【００５５】ラットｓｇｋ配列との明らかなホモロジー
にもかかわらず、本発明者らはラットｓｇｋの調節に相
当する事象を見出すことはできなかった。血清（ＦＣ
Ｓ）もグルココルチコイド（デキサメタゾン）も、いず
れもラット乳癌細胞におけるｓｇｋの転写には強い影響
を示したが、HepG2細胞におけるｈ−ｓｇｋの発現には
影響しなかった。したがって、様々なｈ−ｓｇｋプロモ
ーター配列が様々なタイプの細胞においてこのタンパク
質の発現を調節しているものと思われる。すなわち、ｈ
−ｓｇｋの発現は、細胞容量または充填密度によって専
ら調節されるものではないことが想像される。本発明者
らはまた、腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）およびマクロファ
ージでも、細胞容量に対するｈ−ｓｇｋ発現の依存性を
検出することができた。すなわち、ｈ−ｓｇｋ発現の細
胞容量依存性はHepG2細胞に独特のもではない。様々な
細胞において、ｈ−ｓｇｋの５′−隣接配列はｓｇｋ転
写体の発現における差に関与する調節エレメントを明ら
かにする可能性がある。ラットにおけるｓｇｋの前述の
グルココルチコイドおよび血清誘導性の発現と同様に、
ｈ−ｓｇｋ ＲＮＡの細胞容量誘導性発現はわずか３０
分で起こる。HepG2細胞におけるｈ−ｓｇｋ転写体の３
０分の半減期は、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤アクチノマ
イシンＤでの実験によって示されたように、ラット乳癌
細胞におけるｓｇｋの半減期と同様に短い。

【００５６】ｈ−ｓｇｋの転写体は、これまでに検討さ
れたすべてのヒト組織において発現される。発現はとく
に膵臓および肝臓で著しく、これは多分、これらの組織
の特殊な上皮機能によるものと考えられる。

【００５７】タンパク質のリン酸化は、細胞外空間から
多数の細胞機能の変化へシグナルを変換するための迅速
かつ可逆性の機構である。ｈ−ｓｇｋプロテインキナー
ゼは、細胞容量を調節する機構の一部である特異的タン
パク質のリン酸化によって誘導され、細胞の水和と細胞
機能の間の従来知られていない連結を提供するものと思
われる。

【００５８】

【実施例】

１．ノーザンハイブリダイゼーションの操作：１０〜２
０mgの完全ＲＮＡまたは１〜２mgのポリ(Ａ)−ＲＮＡ
を、２.２Ｍホルムアルデヒドの存在下に１％アガロー
スゲル中電気泳動によって分画化した。陽性に荷電した
ナイロン膜への移送は、Vacuum Blotterにより、移送緩
衝液として１０×ＳＳＣを用いて２時間の間行った。つ
いでＲＮＡを強度制御紫外線照射によって膜に共有結合
で架橋した。特異的プローブ（２５ng／ml）のハイブリ
ダイゼーションは、非放射性ハイブリダイゼーションの
目的にてとくに開発された緩衝液（Dig Easy Hyb, Boeh
ringer）中５０℃で一夜実施した。この場合に用いたプ
ローブは、関連ｈ−ｓｇｋのコード配列の３′−末端
（ヌクレオチド９８０〜１４８０）からポリメラーゼチ
ェーン反応により増幅し、反応緩衝液中にDig−ｄＵＴ
Ｐを包含させることにより同時標識した。ブロットを室
温で２×ＳＳＣおよび65℃で０.５×ＳＳＣにより２回
洗浄したのち、標識されたプローブをアルカリホスファ
ターゼにカップリングした抗ジゴキシゲニン抗体を用い
て、ＥＬＩＳＡにより検出した。これはＣＤＰ−Ｓtar
（Boehringer）中化学ルミネッセンス反応を生じて、オ
ートラジオグラフィー（平均露出時間約２分）によって
検出された。

【００５９】２．ウエスタンブロット分析： 抗体の産生の詳細：ウサギはｈ−ｓｇｋアミノ酸配列か
らの２つのペプチド：Pos.386−Pos.404（ＤＰＥＦＴＥ
ＥＰＶＰＮＳＩＧＫＳＰＤＳ），Pos.416−Pos.431（Ｅ
ＡＦＬＧＦＳＹＡＰＰＴＤＳＦＬ） を用いて免疫処置した。この２つのペプチドをそれぞれ
キャリアーとしてＫＬＨおよびＭＡＰに接合させ、それ
ぞれフロインド完全および不完全アジュバントとともに
皮内注射した。注射および血液サンプリングのプロトコ
ルは標準操作に従った。免疫血清は親和性クロマトグラ
フィーによって精製し、抗体分画を収集し、約１mg／ml
の濃度で使用した。

【００６０】イムノブロット分析：約６０mgの総細胞タ
ンパク質を、ＳＤＳ／７.５％ポリアクリルアミドゲル
を通した電気泳動によって分画化し、ニトロセルロース
膜に移した。膜はＰＢＳ中３％ＢＳＡ／５％粉乳／０.
０６％Tween 20で一夜ブロックした。一次（親和性精製
抗ｈ−ｓｇｋ）および二次（西洋ワサビペルオキシダー
ゼ接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ；Bio-Rad）抗体は、それぞ
れＰＢＳ中３％ＢＳＡ／０.０６％Tween中室温で１時間
インキュベートした。免疫検出には増強化学ルミネッセ
ンスキット（ＥＣＬ, Amersham）を使用した。

【００６１】３．インシトゥハイブリダイゼーション：
４％ホルムアルデヒド中で２０分間カウンター固定を行
った１５mmの凍結切片を、次に１００mMのリン酸緩衝液
ｐＨ７.２中各回５分の２回の洗浄工程に付した。プロ
テイナーゼＫ処置（１mg／１００ml）後、０.１Ｍトリ
エタノールアミン／０.２２５％酢酸中で１０分間イン
キュベートした。１００mMリン酸緩衝液で再度洗浄した
のち、切片を上昇アルコール系列で脱水した。プレハイ
ブリダイゼーションはハイブリダイゼーション緩衝液中
５５℃で行い、ハイブリダイゼーションは一夜実施し
た。用いたプローブはノーザンブロットについて記述し
たプローブに相当する。検出は抗ジゴキシゲニン抗体に
カップリングしたアルカリホスファターゼによって触媒
されるＸ−ホスフェート溶液の酵素的切断によって行っ
た。

【００６２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：2370塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No 起源： 生物名：ホモサピエンス 株名：Caucasian 直接の起源： クローン名：HSRNASTPK 配列の特徴： 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：43..1335 配列： CACGAGGGAG CGCTAACGTC TTTCTGTCTC CCCGCGGTGG TG ATG ACG GTG AAA 54 Met Thr Val Lys 1 ACT GAG GCT GCT AAG GGC ACC CTC ACT TAC TCC AGG ATG AGG GGC ATG 102 Thr Glu Ala Ala Lys Gly Thr Leu Thr Tyr Ser Arg Met Arg Gly Met 5 10 15 20 GTG GCA ATT CTC ATC GCT TTC ATG AAG CAG AGG AGG ATG GGT CTG AAC 150 Val Ala Ile Leu Ile Ala Phe Met Lys Gln Arg Arg Met Gly Leu Asn 25 30 35 GAC TTT ATT CAG AAG ATT GCC AAT AAC TCC TAT GCA TGC AAA CAC CCT 198 Asp Phe Ile Gln Lys Ile Ala Asn Asn Ser Tyr Ala Cys Lys His Pro 40 45 50 GAA GTT CAG TCC ATC TTG AAG ATC TCC CAA CCT CAG GAG CCT GAG CTT 246 Glu Val Gln Ser Ile Leu Lys Ile Ser Gln Pro Gln Glu Pro Glu Leu 55 60 65 ATG AAT GCC AAC CCT TCT CCT CCA CCA AGT CCT TCT CAG CAA ATC AAC 294 Met Asn Ala Asn Pro Ser Pro Pro Pro Ser Pro Ser Gln Gln Ile Asn 70 75 80 CTT GGC CCG TCG TCC AAT CCT CAT GCT AAA CCA TCT GAC TTT CAC TTC 342 Leu Gly Pro Ser Ser Asn Pro His Ala Lys Pro Ser Asp Phe His Phe 85 90 95 100 TTG AAA GTG ATC GGA AAG GGC AGT TTT GGA AAG GTT CTT CTA GCA AGA 390 Leu Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Leu Leu Ala Arg 105 110 115 CAC AAG GCA GAA GAA GTG TTC TAT GCA GTC AAA GTT TTA CAG AAG AAA 438 His Lys Ala Glu Glu Val Phe Tyr Ala Val Lys Val Leu Gln Lys Lys 120 125 130 GCA ATC CTG AAA AAG AAA GAG GAG AAG CAT ATT ATG TCG GAG CGG AAT 486 Ala Ile Leu Lys Lys Lys Glu Glu Lys His Ile Met Ser Glu Arg Asn 135 140 145 GTT CTG TTG AAG AAT GTG AAG CAC CCT TTC CTG GTG GGC CTT CAC TTC 534 Val Leu Leu Lys Asn Val Lys His Pro Phe Leu Val Gly Leu His Phe 150 155 160 TCT TTC CAG ACT GCT GAC AAA TTG TAC TTT GTC CTA GAC TAC ATT AAT 582 Ser Phe Gln Thr Ala Asp Lys Leu Tyr Phe Val Leu Asp Tyr Ile Asn 165 170 175 180 GGT GGA GAG TTG TTC TAC CAT CTC CAG AGG GAA CGC TGC TTC CTG GAA 630 Gly Gly Glu Leu Phe Tyr His Leu Gln Arg Glu Arg Cys Phe Leu Glu 185 190 195 CCA CGG GCT CGT TTC TAT GCT GCT GAA ATA GCC AGT GCC TTG GGC TAC 678 Pro Arg Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ala Ser Ala Leu Gly Tyr 200 205 210 CTG CAT TCA CTG AAC ATC GTT TAT AGA GAC TTA AAA CCA GAG AAT ATT 726 Leu His Ser Leu Asn Ile Val Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile 215 220 225 TTG CTA GAT TCA CAG GGA CAC ATT GTC CTT ACT GAT TTC GGA CTC TGC 774 Leu Leu Asp Ser Gln Gly His Ile Val Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys 230 235 240 AAG GAG AAC ATT GAA CAC AAC AGC ACA ACA TCC ACC TTC TGT GGC ACG 822 Lys Glu Asn Ile Glu His Asn Ser Thr Thr Ser Thr Phe Cys Gly Thr 245 250 255 260 CCG GAG TAT CTC GCA CCT GAG GTG CTT CAT AAG CAG CCT TAT GAC AGG 870 Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu His Lys Gln Pro Tyr Asp Arg 265 270 275 ACT GTG GAC TGG TGG TGC CTG GGA GCT GTC TTG TAT GAG ATG CTG TAT 918 Thr Val Asp Trp Trp Cys Leu Gly Ala Val Leu Tyr Glu Met Leu Tyr 280 285 290 GGC CTG CCG CCT TTT TAT AGC CGA AAC ACA GCT GAA ATG TAC GAC AAC 966 Gly Leu Pro Pro Phe Tyr Ser Arg Asn Thr Ala Glu Met Tyr Asp Asn 295 300 305 ATT CTG AAC AAG CCT CTC CAG CTG AAA CCA AAT ATT ACA AAT TCC GCA 1014 Ile Leu Asn Lys Pro Leu Gln Leu Lys Pro Asn Ile Thr Asn Ser Ala 310 315 320 AGA CAC CTC CTG GAG GGC CTC CTG CAG AAG GAC AGG ACA AAG CGG CTC 1062 Arg His Leu Leu Glu Gly Leu Leu Gln Lys Asp Arg Thr Lys Arg Leu 325 330 335 340 GGG GCC AAG GAT GAC TTC ATG GAG ATT AAG AGT CAT GTC TTC TTC TCC 1110 Gly Ala Lys Asp Asp Phe Met Glu Ile Lys Ser His Val Phe Phe Ser 345 350 355 TTA ATT AAC TGG GAT GAT CTC ATT AAT AAG AAG ATT ACT CCC CCT TTT 1158 Leu Ile Asn Trp Asp Asp Leu Ile Asn Lys Lys Ile Thr Pro Pro Phe 360 365 370 AAC CCA AAT GTG AGT GGG CCC AAC GAG CTA CGG CAC TTT GAC CCC GAG 1206 Asn Pro Asn Val Ser Gly Pro Asn Glu Leu Arg His Phe Asp Pro Glu 375 380 385 TTT ACC GAA GAG CCT GTC CCC AAC TCC ATT GGC AAG TCC CCT GAC AGC 1254 Phe Thr Glu Glu Pro Val Pro Asn Ser Ile Gly Lys Ser Pro Asp Ser 390 395 400 GTC CTC GTC ACA GCC AGC GTC AAG GAA GCT GCC GAG GCT TTC CTA GGC 1302 Val Leu Val Thr Ala Ser Val Lys Glu Ala Ala Glu Ala Phe Leu Gly 405 410 415 420 TTT TCC TAT GCG CCT CCC ACG GAC TCT TTC CTC TGAACCCTGT TAGGGCTTGG 1355 Phe Ser Tyr Ala Pro Pro Thr Asp Ser Phe Leu 425 430 TTTTAAAGGA TTTTATGTGT GTTTCCGAAT GTTTTAGTTA GCCTTTTGGT GGAGCCGCCA 1415 GCTGACAGGA CATCTTACAA GAGAATTTGC ACATCTCTGG AAGCTTAGCA ATCTTATTGC 1475 ACACTGTTCG CTGGAATTTT TTGAAGAGCA CATTCTCCTC AGTGAGCTCA TGAGGTTTTC 1535 ATTTTTATTC TTCCTTCCAA CGTGGTGCTA TCTCTGAAAC GAGCGTTAGA GTGCCGCCTT 1595 AGACGGAGGC AGGAGTTTCG TTAGAAAGCG GACCTGTTCT AAAAAAGGTC TCCTGCAGAT 1655 CTGTCTGGGC TGTGATGACG AATATTATGA AATGTGCCTT TTCTGAAGAG ATTGTGTTAG 1715 CTCCAAAGCT TTTCCTATCG CAGTGTTTCA GTTCTTTATT TTCCCTTGTG GATATGCTGT 1775 GTGAACCGTC GTGTGAGTGT GGTATGCCTG ATCACAGATG GATTTTGTTA TAAGCATCAA 1835 TGTGACACTT GCAGGACACT ACAACGTGGG ACATTGTTTG TTTCTTCCAT ATTTGGAAGA 1895 TAAATTTATG TGTAGACTTT TTTGTAAGAT ACGGTTAATA ACTAAAATTT ATTGAAATGG 1955 TCTTGCAATG ACTCGTATTC AGATGCCTAA AGAAAGCATT GCTGCTACAA ATATTTCTAT 2015 TTTTAGAAAG GGTTTTTATG GACCAATGCC CCAGTTGTCA GTCAGAGCCG TTGGTGTTTT 2075 TCATTGTTTA AAATGTCACC TGTAAAATGG GCATTATTTA TGTTTTTTTT TTTGCATTCC 2135 TGATAATTGT ATGTATTGTA TAAAGAACGT CTGTACATTG GGTTATAACA CTAGTATATT 2195 TAAACTTACA GGCTTATTTG TAATGTAAAC CACCATTTTA ATGTACTGTA ATTAACATGG 2255 TTATAATACG TACAATCCTT CCCTCATCCC ATCACACAAC TTTTTTTGTG TGTGATAAAC 2315 TGATTTTGGT TTGCAATAAA ACCTTGAAAA ATAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 2370

【００６３】配列番号：２ 配列の長さ：431 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met Thr Val Lys Thr Glu Ala Ala Lys Gly Thr Leu Thr Tyr Ser Arg 1 5 10 15 Met Arg Gly Met Val Ala Ile Leu Ile Ala Phe Met Lys Gln Arg Arg 20 25 30 Met Gly Leu Asn Asp Phe Ile Gln Lys Ile Ala Asn Asn Ser Tyr Ala 35 40 45 Cys Lys His Pro Glu Val Gln Ser Ile Leu Lys Ile Ser Gln Pro Gln 50 55 60 Glu Pro Glu Leu Met Asn Ala Asn Pro Ser Pro Pro Pro Ser Pro Ser 65 70 75 80 Gln Gln Ile Asn Leu Gly Pro Ser Ser Asn Pro His Ala Lys Pro Ser 85 90 95 Asp Phe His Phe Leu Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val 100 105 110 Leu Leu Ala Arg His Lys Ala Glu Glu Val Phe Tyr Ala Val Lys Val 115 120 125 Leu Gln Lys Lys Ala Ile Leu Lys Lys Lys Glu Glu Lys His Ile Met 130 135 140 Ser Glu Arg Asn Val Leu Leu Lys Asn Val Lys His Pro Phe Leu Val 145 150 155 160 Gly Leu His Phe Ser Phe Gln Thr Ala Asp Lys Leu Tyr Phe Val Leu 165 170 175 Asp Tyr Ile Asn Gly Gly Glu Leu Phe Tyr His Leu Gln Arg Glu Arg 180 185 190 Cys Phe Leu Glu Pro Arg Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ala Ser 195 200 205 Ala Leu Gly Tyr Leu His Ser Leu Asn Ile Val Tyr Arg Asp Leu Lys 210 215 220 Pro Glu Asn Ile Leu Leu Asp Ser Gln Gly His Ile Val Leu Thr Asp 225 230 235 240 Phe Gly Leu Cys Lys Glu Asn Ile Glu His Asn Ser Thr Thr Ser Thr 245 250 255 Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu His Lys Gln 260 265 270 Pro Tyr Asp Arg Thr Val Asp Trp Trp Cys Leu Gly Ala Val Leu Tyr 275 280 285 Glu Met Leu Tyr Gly Leu Pro Pro Phe Tyr Ser Arg Asn Thr Ala Glu 290 295 300 Met Tyr Asp Asn Ile Leu Asn Lys Pro Leu Gln Leu Lys Pro Asn Ile 305 310 315 320 Thr Asn Ser Ala Arg His Leu Leu Glu Gly Leu Leu Gln Lys Asp Arg 325 330 335 Thr Lys Arg Leu Gly Ala Lys Asp Asp Phe Met Glu Ile Lys Ser His 340 345 350 Val Phe Phe Ser Leu Ile Asn Trp Asp Asp Leu Ile Asn Lys Lys Ile 355 360 365 Thr Pro Pro Phe Asn Pro Asn Val Ser Gly Pro Asn Glu Leu Arg His 370 375 380 Phe Asp Pro Glu Phe Thr Glu Glu Pro Val Pro Asn Ser Ile Gly Lys 385 390 395 400 Ser Pro Asp Ser Val Leu Val Thr Ala Ser Val Lys Glu Ala Ala Glu 405 410 415 Ala Phe Leu Gly Phe Ser Tyr Ala Pro Pro Thr Asp Ser Phe Leu 420 425 430

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/573 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＶ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
   ヒト細胞容量調節キナーゼｈ−ｓｇｋをコードする核
   酸。
2. 【請求項２】 配列番号１に示すヌクレオチド配列を有
   する核酸。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の核酸と緊縮条
   件下においてハイブリダイズし、ウシ胎児血清（ＦＣ
   Ｓ）またはグルココルチコイドのいずれによってもその
   転写を誘導できない機能的に活性な細胞容量調節キナー
   ゼをコードする核酸。
4. 【請求項４】 請求項１または２に記載の核酸と緊縮条
   件下においてハイブリダイズし、ラットｓｇｋとは同一
   でない機能的に活性な細胞容量調節キナーゼをコードす
   る核酸。
5. 【請求項５】 請求項１または２に記載の核酸のヌクレ
   オチド位置およそ980〜1480 の領域からなる核酸フラグ
   メント。
6. 【請求項６】 ヒト細胞容量調節キナーゼｈ−ｓｇｋの
   免疫学的に活性なフラグメントをコードする核酸フラグ
   メント。
7. 【請求項７】 以下のアミノ酸配列： ＤＰＥＦＴＥＥＰＶＰＮＳＩＧＫＳＰＤＳ （１） ＥＡＦＬＧＦＳＹＡＰＰＴＤＳＦＬ （２） の少なくとも一方を有するフラグメントをコードする請
   求項６に記載の核酸フラグメント。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか一項に記載の核
   酸の組換え発現によって得られるヒト細胞容量調節キナ
   ーゼｈ−ｓｇｋまたはそのフラグメント。
9. 【請求項９】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
   ヒト細胞容量調節キナーゼｈ−ｓｇｋ。
10. 【請求項１０】 以下のアミノ酸配列： ＤＰＥＦＴＥＥＰＶＰＮＳＩＧＫＳＰＤＳ （１） ＥＡＦＬＧＦＳＹＡＰＰＴＤＳＦＬ （２） の少なくとも一方を有する免疫原性ペプチド。
11. 【請求項１１】 請求項８または９に記載のヒト細胞容
    量調節キナーゼｈ−ｓｇｋに特異的に結合する受容体。
12. 【請求項１２】 モノクローナルまたはポリクローナル
    抗体からなる請求項１１に記載の受容体。
13. 【請求項１３】 請求項１〜７のいずれか一項に記載の
    核酸またはこの核酸のフラグメントの、ヒト細胞容量調
    節キナーゼｈ−ｓｇｋをコードする核酸の検出のための
    使用。
14. 【請求項１４】 請求項１〜７のいずれか一項に記載の
    核酸またはこの核酸のフラグメントの、ヒト細胞容量調
    節キナーゼｈ−ｓｇｋをコードする核酸をノーザンブロ
    ットまたはハイブリダイゼーションによって検出するた
    めの使用。
15. 【請求項１５】 請求項８または９のいずれかに記載の
    ヒト細胞容量調節キナーゼｈ−ｓｇｋまたは請求項１０
    に記載のペプチドの、ｈ−ｓｇｋに結合する受容体を検
    出するための使用。
16. 【請求項１６】 請求項１１または１２のいずれかに記
    載の受容体の、ヒト細胞容量調節キナーゼｈ−ｓｇｋの
    定性的または定量的検出のための使用。
17. 【請求項１７】 免疫化学的方法を包含する請求項１６
    に記載の使用。
18. 【請求項１８】 請求項１０に記載のペプチドの少なく
    とも１種を実験動物の免疫処置に使用することからなる
    ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の製造方法。
19. 【請求項１９】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の
    核酸または請求項５〜７のいずれか一項に記載のフラグ
    メントまたは請求項８もしくは９に記載のヒト細胞容量
    調節キナーゼｈ−ｓｇｋまたは請求項１０に記載のペプ
    チドの、細胞容量の変化の検出のための使用。
20. 【請求項２０】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の
    核酸または請求項５〜７のいずれか一項に記載のフラグ
    メント、または請求項８および９のいずれか一項に記載
    のヒト細胞容量調節キナーゼｈ−ｓｇｋまたは請求項１
    ０に記載のペプチド、または請求項１１および１２のい
    ずれか一項に記載の受容体からなる医薬。