JPH10248582A - 新規な７回膜貫通型受容体蛋白質ｊｅｇ１８ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な７回膜貫通型受容体蛋白質、その蛋白
質をコードするｃＤＮＡ、その蛋白質の発現系、さらに
その蛋白質の抗体を提供する。 【解決手段】 白血球細胞株Ｊｕｒｋａｔより、７回膜
貫通型受容体ＪＥＧ１８ｃＤＮＡ断片を取得した。その
ｃＤＮＡコード領域全長を取得し、そのコードする新規
蛋白質の発現系を作成し、この蛋白質を発現させた。さ
らにその抗体を作成した。７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ１８は、白血球の機能を制御する医薬品の検索に使
用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、白血球に発現する
新規な７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８、それを構
成している部分ペプチドまたはこれらの塩に関する。ま
た、本発明は、前記７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１
８、それを構成している部分ペプチドをコードする核酸
あるいはその誘導体に関する。さらに、本発明は、この
核酸を用いて遺伝子操作により７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８を発現させる７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ１８の製造方法、及びそれに使用される発現ベクタ
ー及び形質転換体に関する。また、さらに本発明は、７
回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を用いて、この蛋白
質に対するリガンドを決定する方法、この蛋白質との結
合を阻害する化合物をスクリーニングする方法あるいは
この蛋白質に対する抗体に関する。本発明では、７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を用いて白血球の機能を
抑制する医薬品を開発することができる。

【０００２】

【従来の技術】白血球は血液細胞の一種であり、免疫・
炎症の種々の機能を司る。特に、感染の際には、種々の
有益な免疫・炎症反応のメカニズムによって、生体を防
御する（麻生芳郎 訳、一目でわかる免疫学、メディカ
ル・サイエンス・インターナショナル発行、48-61,1933
年) 。しかし、その一方で自己免疫など望ましくない免
疫・炎症作用をも引き起こす（麻生芳郎 訳、一目でわ
かる免疫学、メディカル・サイエンス・インターナショ
ナル発行、62-73,1993年) 。従って、白血球の機能を制
御する方法を得ることによって、有益な免疫応答を引き
起こし、感染や腫瘍の治癒をもたらしたり、あるいは有
害な免疫応答を減退させることにより、自己免疫性疾患
などを治療したりすることが可能になると予想される。

【０００３】白血球の機能、すなわち、その増殖、分
化、活性化、化学遊走等は白血球に発現している様々な
受容体蛋白質によって制御されている。受容体とは、細
胞表面に存在し、他の細胞の表面や体液中に存在するシ
グナル分子と高い親和性で結合するものである。そして
その結合という細胞外の出来事を細胞内シグナルに変換
して細胞の応答を引き起こす（中村桂子・松原健一監
修、細胞の分子生物学（第２版）、教育社、693,1990
年) 。従って、これらの受容体の機能を変化させるも
の、すなわちその受容体と結合して刺激するものや、受
容体と結合して刺激を遮るもの、その刺激が細胞内に伝
達されることを阻害するものを得ることができれば、白
血球の機能を正や負に制御し、さらには、白血球の機能
の不足や過剰に起因する疾患の治療に役立つ物質を得ら
れることが予想される。

【０００４】白血球の受容体としては、サイトカイン受
容体ファミリー、ＥＧＦ (Epidermal Growth Factor)
受容体ファミリー、７回膜貫通型受容体ファミリーなど
種々の受容体蛋白質が知られており(The Leucocyte Ant
igen FactsBook、アカデミックプレス、38-49,1993年)
、その機能は多岐にわたっている。７回膜貫通型受容
体蛋白質ファミリーは、このような受容体ファミリーの
一つであり、Ｇ蛋白質共役型受容体(G-protein coupled
receptor)、ロドプシン型受容体などとも呼ばれる。白
血球における７回膜貫通型受容体蛋白質の研究は比較的
新しく開始されており、いまだ数多くの未知の７回膜貫
通型受容体蛋白質が存在すると考えられている。

【０００５】現在までに白血球に存在する７回膜貫通型
受容体蛋白質として同定されたものとしては、アナフィ
ラトキシンと結合する受容体群、ケモカインと結合する
受容体群、ＰＡＦ（血小板活性化因子）と結合する受容
体などがある。例えば、アナフィラトキシンの受容体
は、好中球やマクロファージの機能、例えば、活性酸素
の産生、化学遊走、細胞接着の活性化に関与している
(Bouley,F.ら、 Biochemistry 30, 2993-2999,1991年)
。ケモカインと結合する受容体群の一つ、マウスのＩ
Ｌ―８（インターロイキン８）受容体ホモログの欠損マ
ウスでは、炎症誘導物質の腹腔内投与による好中球浸潤
が減少したと同時に好中球増加症、骨髄やリンパ節での
顆粒球、形質細胞の増加が観察された（飯笹久、松島綱
治、臨床免疫、28, 731-737,1996年) 。従って、これら
の７回膜貫通型受容体蛋白質は、白血球の増殖、分化、
活性化、化学遊走等を制御している。

【０００６】これらの受容体に作用する化合物のうち、
疾患の治療剤として可能性があると考えられているもの
の中には、ＩＬ−８、ＭＣＰ１(Monocyte Chemotactic
Protein 1)のように受容体に結合して刺激するものや、
ＩＬ−８変異体のように受容体と結合して刺激を遮るも
のがある(Howard, O. M. Z. ら、TIBTECH,14, 46-51,19
96年）。

【０００７】７回膜貫通型受容体においては、多くの場
合、受容体とシグナル分子の関係は１対１対応に対応し
ているのではない。従って、疾患の治療を考えた場合に
はシグナル分子を知ることだけでは不十分である。例え
ば、セロトニンの場合には、セロトニンという単一のシ
グナル分子に対し、イオンチャンネル型受容体という全
く異なるシグナル伝達経路の受容体を含む１４種の受容
体が知られており、さらに、個々の受容体に特異的に結
合する化合物も知られており(1996 Receptor &Ion Chan
nel Nomenclature Supplement、Trends Phamacol. Sc
i.,1996年) 、それぞれ異なる疾患の治療への応用も考
えられている。また、ケモカイン群の場合には、単一の
シグナル分子が多数の受容体と反応すると同時に、単一
の受容体が多数のシグナル分子と反応する例も多く知ら
れている(C. A. Powerら、Trends Pharmacol. Sci. 17,
209-213, 1996年）。

【０００８】従って、仮に単一のシグナル分子が疾患の
原因であるとしても、細胞の種類によって異なる受容体
が場合によっては複数存在し、疾患の原因である特定の
細胞群の機能を特異的に制御する場合には、その細胞に
作用するシグナル分子の特定よりもその細胞に発現して
いる受容体を特定することが重要となる。例えば、白血
球に作用するシグナル分子群ケモカイン群の場合、シグ
ナル分子ＲＡＮＴＥＳ(Regulated on Activation、Norm
al T expressed and secreted)に対しては種々の白血球
が反応するが、好酸球にはケモカイン受容体の一つＣＣ
Ｒ３が特異的に発現しており、好酸球を特異的に制御す
る方法を検索する際には受容体ＣＣＲ３が必要となる
(Howard, O. M. Z.ら、TIBTECH, 14, 46-51,1996
年）。

【０００９】現在に至るまで、白血球に作用するシグナ
ル分子のうち、例えばロイコトリエンＢ４および既知の
ケモカインのうちＰＦ４、ＨＣＣ１などの受容体につい
ては７回膜貫通型受容体蛋白質であると推定されている
ものの、受容体タンパク質は同定されていない(Premack
B. A.ら、Nature Medicine 2, 1174-1178, 1996年；Lo
etscher M. ら、J. Exp. Med. 184, 963-969, 1996
年）。特にケモカイン群については、さらに多くの新規
ケモカインが存在すると推定されており(Howard,O. M.
Z. ら、TIBTECH, 14, 46-51, 1996年) 、さらに多くの
受容体が存在することが期待される。以上のように、白
血球に作用する分子の受容体はすべて理解されたわけで
はなく、白血球にはさらに多くの７回膜貫通型受容体蛋
白質が存在し、かつ、それらの受容体の作用を変化させ
るものを得ることによって、白血球の機能を制御し、ひ
いては、疾患を制御する方法が得られると期待される。

【００１０】７回膜貫通型受容体蛋白質に作用する内因
性の物質は様々な受容体に対し様々な物質が知られてい
る。例えば、生理アミンであるグルタミン酸、ドーパミ
ンはそれぞれグルタミン酸受容体群、ドーパミン受容体
群に結合する。また、ペプチドである神経ペプチドＹ、
エンドセリンはそれぞれ神経ペプチドＹ受容体群、エン
ドセリン受容体群に結合する (Watson, S.および Steve
Arkinstall 著、TheG-protein linked receptor Facts
Book, Academic Press Inc., 1994 年) 。これらの中
には、ケモカイン群、ＰＡＦのように白血球に作用する
ことが知られているものとそうでないものがある。

【００１１】これらの７回膜貫通型受容体蛋白質を活性
化する物質は、天然・非天然を問わず、その物質と７回
膜貫通型受容体蛋白質、受容体を発現している細胞の３
者に依存して様々な細胞内シグナル分子の変動を引き起
こす。そのシグナル分子の変動は、例えば、細胞内ｃＡ
ＭＰ濃度の上昇・下降、イノシトールリン酸濃度の上
昇、細胞内カルシウム濃度の上昇、といった反応があり
(Watson, S.および Steve Arkinstall 著、The G-prot
ein linked receptor FactsBook, Academic Press In
c., 1994年）、そのそれぞれを測定する方法も開発され
ている。従って、これらの反応を測定することにより、
特定の物質が特定の７回膜貫通型受容体蛋白質を活性化
するかどうかあるいはその活性化を妨げるかどうかを判
断する事ができる。このような物質が７回膜貫通型受容
体蛋白質と結合して生じる、増殖・遺伝子発現の変動・
化学遊走などの生理学的な現象を観察する方法も知られ
ており、同じく、特定の物質が特定の７回膜貫通型受容
体蛋白質を活性化するかどうかあるいはその活性化を妨
げるかどうかを判断することができる。

【００１２】このように７回膜貫通型受容体蛋白質に作
用する物質の同定方法としては種々の方法が知られてお
り、これらの方法を利用するためには、７回膜貫通型受
容体蛋白質を同定することが肝要である。以上のことを
考えると、白血球の機能を制御し、疾患の制御を行うた
めには、これまで知られていない７回膜貫通型受容体を
取得することが大きな課題である。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、白血球
の機能を制御し、疾患をコントロールする手法はいまだ
完成されていない。その最大の原因は、疾患と関連した
白血球の機能を制御している受容体蛋白質、特に７回膜
貫通型受容体蛋白質が同定されていない点にある。本発
明の課題は、新規な７回膜貫通型受容体蛋白質、またそ
の蛋白質をコードするｃＤＮＡ、その蛋白質の発現系、
この蛋白質の応用、さらにその蛋白質の抗体を提供する
ことにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、白血球に
新規７回膜貫通型受容体が存在することを予想し、これ
らが白血球の機能を制御する医薬品の探索に役立つと考
えた。そこで実際に白血球に発現している新規な７回膜
貫通型受容体蛋白質ｃＤＮＡを取得するために、Differ
ential Display法（例えば、Liang, P. ら、Curr. Bio
l. 7, 274-280,1995年）、ＲＤＡ法(Lisitsyn, N. ら、
Science 259, 946-951, 1993年) 、degenerative ＰＣ
Ｒ法(Innis M. A.ら、ＰＣＲ Protocols, pp39-53, 19
90年）など種々の方法を、種々のヒト組織、白血球、白
血球細胞株などを材料に検討した。特にdegenerative
ＰＣＲ法については、実施例１に示すプライマーを一例
とする２０種以上のプライマーを試験した。このような
鋭意努力の結果、白血球細胞株 Jurkat より、本発明の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のｃＤＮＡ断片を
取得した。そののち、そのｃＤＮＡコード領域全長を取
得し、それをコードする新規タンパク質の発現系を作成
し、さらにその抗体を作成することにより、本発明を完
成した。

【００１５】すなわち、本発明は配列表配列番号１に記
載のアミノ酸配列を含有する７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ１８に関する。また、配列表配列番号１に記載の
アミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする核
酸、これら核酸群の中から選ばれる核酸と、宿主細胞中
で発現可能なベクター核酸とを連結してなる組み換えＤ
ＮＡ体ベクター、これら組み換えＤＮＡ体ベクターによ
り形質転換された７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８
発現細胞、これらの細胞を培養し培養細胞から生産され
た化合物を採取する配列表配列番号１に記載のアミノ酸
配列を含有するポリペプチド（７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８）の製造方法に関する。また、本発明は、
この７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８に対するリガ
ンドのスクリーニング方法に関する。さらに、本発明
は、この７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を特異的
に認識する抗体に関する。

【００１６】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
１８のアミノ酸配列を、配列表配列番号１に示し、それ
らをコードするＤＮＡ配列を配列表配列番号２に示し
た。これらの配列をデータベース (Genbank リリース9
7.0、October,1996年) で比較したところ、これらは新
規な配列であった。また該７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ１８の部分ペプチドを免疫原として各々に対する抗
体（抗体を含有する抗血清も含む）を作製し、この７回
膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の精製法を確立し、本
発明を完成した。

【００１７】以下、本発明を詳細に説明する。配列表に
おいて、配列番号１のアミノ酸配列は、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のアミノ酸配列である。
また、配列番号２の配列は本発明の７回膜貫通型受容体
蛋白質ＪＥＧ１８の全アミノ酸配列及びそれをコードし
ているｃＤＮＡ配列であり、配列番号３の配列は本発明
の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８に相補的なｃＤ
ＮＡ配列である。なお、配列表に記載されたアミノ酸配
列の左端及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下、Ｎ末
という）及びカルボキシル基末端（以下、Ｃ末という）
であり、また塩基配列の左端及び右端はそれぞれ5'末端
及び3'末端である。

【００１８】また、図に関しては、図１は本発明の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のNorthern 解析の結
果である。また、表に関しては、表１は本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８と既知の遺伝子とをアミ
ノ酸配列での相同性を比較したものである。Genetyx-Ma
c/CD ver.35. 0.0(Software Development Co.,Ltd.) を
用いて Swiss-Prot(リリース33.0、Feburuary 1996年)
をサーチしたのち、上位１０種について Genetyx-Mac(S
oftware Development Co.,Ltd.)ver.8.0を用いてアミノ
酸の同一度を計算させた結果である。表２は本発明の７
回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８と既知の遺伝子とを
ｃＤＮＡ配列での相同性を比較したものである。Genety
x-Mac(Software Development Co.,Ltd.)/CD ver.35. 0.
0 を用いて GenBank (リリース97.0、October, 1996
年) をサーチしたのち、上位２０種についてGenetyx-Ma
c ver.8.0 を用いてｃＤＮＡ配列の同一度を計算した結
果である。

【００１９】また、本発明で述べられる遺伝子操作に必
要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検
討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組
換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡ
ライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通
常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前
記の通常の実験書としては、たとえば、 Molecular Clo
ning, A laborartorymanual, 1989年, Eds., Sambrook,
J., Fritsch, E. F.,and Maniatis,T., ColdSpring Ha
rbor Loboratory Press を挙げることができる。

【００２０】本発明のポリペプチドは、少なくとも配列
表配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有
するが、自然界で生じることが知られている生物種内変
異、アレル変異等の突然変異及び人為的に作製可能な点
変異による変異によって生じる改変体も、配列表配列番
号１のポリペプチドの性質を失わない限り配列表配列番
号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するものとして本発明の新規化合物に含まれ
る。そのアミノ酸の改変、置換に関しては例えば Benne
ttらの特許出願(WO 96/2645)などに詳しく記載されてお
り、これらを参考にして作製することができ、これらの
方法によって改変、置換されたポリペプチドも本発明に
含まれる。

【００２１】配列表配列番号１のアミノ酸配列から予想
されることとして、糖鎖が付加される部分がある。Ｎ-
グリコシド結合の共通配列は、Asn-X-Ser/Thr であるこ
とが知られているが、配列番号１で４番目の Asn(Asn-T
yr-Thr) 及び、164 番目の Asn(Asn-Arg-Thr) がそれと
同等な配列を有しＮ−グリコシド修飾を受けている可能
性がある。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの
Ｏ−グリコシド結合を推定する部分として、セリンまた
はスレオニン残基が頻出する部分が考えられる。これら
の糖鎖が付加されたタンパクの方がポリペプチドそのも
のよりも一般に生体内での分解に対して安定であり、ま
た強い生理活性を有していると考えられる。したがっ
て、配列番号１の配列を含有するポリペプチドのアミノ
酸配列の中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンやＮ−グ
ルコシドやＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖
鎖がＮ−グルコシドあるいはＯ−グルコシド結合してな
るポリペプチドも本発明に含まれる。

【００２２】また、実施例1, 2及び３に示すように、本
発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の天然のｃ
ＤＮＡ断片は白血病細胞 Jurkat およびその亜株 Jurka
t Z18に由来するｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡ
から取得された（亜株JurkatZ18は受託番号：ＦＥＲＭ
ＢＰ−５８６６として平成９年３月11日に日本国通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる) 。従って、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ１８のｍＲＮＡは白血球細胞に発現していることが
示された。また、実施例４に示したように本発明の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の天然のｍＲＮＡは白
血球の多いと考えられるヒト組織、胸腺および脾臓に検
出された。従って、これらの材料を用いても、本発明の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の天然のｃＤＮＡ
を取得することができる。ｍＲＮＡは、細胞内のメカニ
ズムにより蛋白質へと翻訳されるので、白血球における
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の天然の
ｍＲＮＡの検出は７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８
の発現と同等と考えられる。

【００２３】これら配列番号１で表されるアミノ酸配列
を含有する７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８または
その塩、または、その蛋白質の部分ペプチドまたはその
塩は、診断を目的とした抗体の作成や、治療を目的とし
た医薬品の検索に有用である。配列番号１のアミノ酸配
列をデータベース(Swiss-Prot リリース33.0、Feburuar
y 1996、 GenBank リリース97.0、October 、1996) で比
較したところ、これらは新規な配列であった。該アミノ
酸配列を Kyte-Doolittle の方法(J. Mol.Biol.157:10
5, 1982) に従って、アミノ酸配列から疎水性部分、親
水性部分を解析した。その結果、本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ１８は細胞膜通過部分を７つ有する
細胞膜蛋白質として、細胞上に発現されることが明らか
となった。

【００２４】表１に本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ１８と上記データベースとの比較で類似度が高い
とされた、これまで知られている７回膜貫通型受容体蛋
白質の配列の相同性の比較を示した。本発明の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８は、既知のヒトおよびその
他のほ乳類の７回膜貫通型受容体蛋白質と30％程度の相
同性を示し、新規なヒト７回膜貫通型受容体蛋白質であ
ることが示された（表１）。既知の受容体の種間の相同
性は、例えば、アンジオテンシン受容体１ａの場合、ヒ
ト(Swiss-Prot Entry AG2R-Human) とラット(Swiss-Pro
t Entry AG22-Rat)間で90％を越える。従って、本発明
の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８はこれまでヒト
以外の種で知られている受容体蛋白質のヒトにおける対
応物ではないと考えられる。しかし、ほかの７回膜貫通
型受容体蛋白質との相同性が30％であり、本発明のペプ
チドＪＥＧ１８が７回膜貫通型受容体に属する蛋白質で
あることがこのことからも示された。これらの相同性か
ら期待される既知のリガンドとしては、例えば、アンジ
オテンシン、ブラディキニンなどの小ペプチドのホルモ
ンなどが挙げられる。

【００２５】

【表１】

【００２６】また、配列表配列番号１のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドをコードする本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質の天然のｃＤＮＡ配列については，配列表
配列番号２にアミノ酸配列とともに示した。これらの遺
伝子配列に関し、アミノ酸レベルの変異がなくとも、自
然界から分離した、染色体ＤＮＡ、またはｃＤＮＡにお
いて、遺伝コードの縮重により、そのＤＮＡがコードす
るアミノ酸配列を変化させることなくＤＮＡの塩基配列
が変異した例はしばしば認められる。また、5'非翻訳領
域及び3'非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸配列の規
定には関与しないので、それらの領域のＤＮＡ配列は変
異しやすい。このような変異や遺伝コードの縮重によっ
て得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含まれる。以
下、これらＤＮＡ群を本発明のＤＮＡとよぶ。

【００２７】配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列
と実質的に同等なポリペプチドをコードする本発明のＤ
ＮＡは、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８
を製造する上で有用である。配列表配列番号２のＤＮＡ
配列をデータベース (GenBank リリース97.0、October,
1996)で比較したところ、これは新規な配列であった。
表２に配列番号２の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１
８のｃＤＮＡ配列とこれまで知られている７回膜貫通型
受容体蛋白質のｃＤＮＡの配列の相同性の比較を示し
た。本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のｃ
ＤＮＡは、既知のヒトおよびその他のほ乳類の受容体と
50％以下の相同性を示し、新規なヒトの７回膜貫通型受
容体蛋白質ｃＤＮＡであることが示された。既知の受容
体ｃＤＮＡの種間の相同性は、例えば、アンジオテンシ
ン受容体の場合、ヒト(GenBank Entry HSU20860)とラッ
ト(GenBank Entry S67465)間で８４％程度である。従っ
て、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８はｃ
ＤＮＡ配列からみてもこれまでヒト以外の種で知られて
いる受容体蛋白質のヒトにおける対応物ではないと考え
られる。また、他の遺伝子との相同性が50％以下である
ので、他の既知の遺伝子を用いて一般的に行われている
クロスハイブリダイセーションを用いたスクリーニング
でクローニングすることは困難であると考えられる。

【００２８】

【表２】

【００２９】実際に、クロスハイブリダイゼーションの
アプローチを用いた例も数多くあるが、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８はクローニングされてい
ない（例えば、Murphy, P. M. ら、Science 253, 1280-
1283、1991年；Combadiere C. ら、J. Biol. Chem. 27
0, 16491-16494, 1995 年）。実施例４に示すように、
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のｃＤＮ
Ａ配列の一部を用いて Northern 解析を行ったところ、
既知の受容体遺伝子と考えられる転写産物は検出されな
かった。また、実施例２に示すように、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のｃＤＮＡ配列の一部を
用いてｃＤＮＡライブラリースクリーニングを行ったと
ころ、既知の受容体遺伝子と考えられるクローンは検出
されなかった。このことから、実際に既知の遺伝子を用
いたクロスハイブリダイセーションを用いたスクリーニ
ングでクローニングすることは困難であることが示され
た。配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡは、
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を作成す
る上で、また、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥ
Ｇ１８の詳細な機能を検討する上で有用である。

【００３０】さらに、配列表配列番号２の遺伝子配列の
少なくとも一部の遺伝子配列を有する 12merから 16mer
以上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及びその誘
導体、および／または、配列表配列番号３の遺伝子配列
の少なくとも一部の遺伝子配列を有する 12merから 16m
er以上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及びその
誘導体、を用いれば、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８のｃＤＮＡクローン、ｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡ、ゲノム遺伝子クローンなどを検出することができ
る。必要な核酸の長さはその配列の特異性、検出しよう
としている核酸との結合の安定性によって異なるが、Ｄ
ＮＡを用いてＰＣＲによって検出する場合には、Ｔｍ
（２本鎖解離温度）が45℃以上であることが望ましい。
ＰＣＲのようにＤＮＡ同志が結合する場合には、一つの
ＧＣ結合を４度とし、一つのＡＴ結合を２度として合算
し、Ｔｍを推定することができる。従って、ＧＣコンテ
ントが高い場合には 12merの、一般的な50％ぐらいのＧ
Ｃコンテント領域で16mer の核酸が必要となる。よりＤ
ＮＡとの結合が安定な核酸誘導体を用いる場合にはさら
に短い核酸を用いて検出することが可能である。ハイブ
リダイゼーションによるｃＤＮＡクローンの検出の例
は、実施例２に示し、20mer 以上の核酸を用いたＰＣＲ
によるｃＤＮＡの検出の例を実施例３，５に示した。例
えば、遺伝子診断を目的としてこれらの遺伝子を調べる
方法として、配列表配列番号２および３の一部の遺伝子
配列を有する12mer から 16mer以上、さらに望ましくは
20mer以上の核酸、つまりＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれら
がメチル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、ま
たはチオフォスフェート化された誘導体を用い、ハイブ
リダイゼーション、ＰＣＲ等の手法によって行うことが
あげられる。同様な方法でマウス等の他の生物の本発明
の遺伝子のホモログの検出や遺伝子クローニングができ
る。さらに、ヒトを含めたゲノム上の遺伝子のクローニ
ングも同様に可能である。従って、そのようにしてクロ
ーニングされたこれら遺伝子を用いれば、本発明の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の更に詳細な機能も明
らかにすることが出来る。例えば、近年の遺伝子操作技
術を用いれば、トランスジェニックマウス、ジーンター
ゲッティングマウス、また、本発明の遺伝子と関連する
遺伝子を共に不活化したダブルノックアウトなどのあら
ゆる方法を用いることが出来る。また、本発明の遺伝子
のゲノム上の異常があれば、遺伝子診断、遺伝子治療へ
の応用も可能である。

【００３１】配列表配列番号３の遺伝子配列の少なくと
も一部の遺伝子配列を有する 12merから 16mer以上、さ
らに望ましくは 20mer以上の核酸、及びその誘導体、を
コードするＤＮＡを用いれば、実施例４に示したように
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８ ｍＲＮ
Ａの検出が可能である。たとえば、診断を目的としてこ
れらの遺伝子の発現を調べる方法として、配列表配列番
号３の一部の遺伝子配列を有する 12merから 16mer以
上、さらに望ましくは 20mer以上の相補し得る核酸、つ
まりアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらがメチル
化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、またはチオ
フォスフェート化された誘導体すなわちアンチセンス核
酸を用い、ハイブリダイゼーション、プライマーエクス
テンション、ヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイ
等の手法によって行うことが出来る。また、本発明の７
回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の更に詳細な機能を
明らかにすることを目的として、細胞や生体へのアンチ
センス核酸の投与も考えられる利用法である。本発明の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の過剰な反応が病
態となっている疾患については、これらアンチセンス核
酸により遺伝子の発現を押さえることによって、治療を
行うことも可能である。また、アンチセンス核酸を適当
なベクターに組み込み、そのベクターを用いることも可
能である。これらアンチセンス核酸の作成例・使用例に
ついては Murray, J. A. H. 編、ANTISENSE RNA AND DN
A 、Wiley-Liss, Inc., 1992年、に詳しい。

【００３２】以上のように、配列表配列番号２の遺伝子
配列の少なくとも一部の遺伝子配列を有する 12merから
16mer以上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及び
その誘導体、及び配列表配列番号３の遺伝子配列の少な
くとも一部の遺伝子配列を有する 12merから 16mer以
上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及びその誘導
体、は診断などに有用であり、配列表配列番号３の遺伝
子配列の少なくとも一部の遺伝子配列を有する 12merか
ら 16mer以上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及
びその誘導体は診断、治療などに有用である。

【００３３】本発明の核酸を含有するベクターとして
は、例えば大腸菌由来の pBR322, pUC18, pUC19, pUC11
8, pUC119(いずれも日本国宝酒造社製）などが挙げられ
るが、その他のものであっても宿主内で複製増殖できる
ものであればいずれも用いることができる。実施例５に
ベクターとしてｐｃＤＮＡ３を、宿主として大腸菌を用
いた例を示した。また本発明のＤＮＡを含有するファー
ジベクターとしては、例えばλｇｔ10、λｇｔ11 (米国
Stratagene社製) などが挙げられるが、その他のもので
あっても宿主内で増殖できるものであれば用いることが
できる。このようにして、得られたベクターは適当な宿
主、例えばエシェリヒア(Escherichia) 属菌、バチルス
(Bacillus)属菌、などにカルシウムクロライド法等を用
いて導入し、本発明のＤＮＡを含有するベクターを保持
する形質転換体を作成することができる上記エシェリヒ
ア属菌の例としては、のエシェリヒア コリＫ12ＨＢ10
1 、ＭＣ1061、ＬＥ392 、ＪＭ109 などが挙げられる。
上記バチルス属菌の例としてはバチルス サチリスＭＩ
114 等が挙げられる。また、ファージベクターは、例え
ば増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法 (Pr
oc. Natl. Acad. Sci., 71:2442-, 1978) を用いて導入
することができる。尚、本発明の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＪＥＧ１８の全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ
を含むプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＪＥＧ１８を大腸菌Ｄ
Ｈ５に遺伝子導入した形質転換細胞（実施例５）E.col
i：DH5-pJEG18は、日本国通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所に平成９年３月11日に受託番号：ＦＥ
ＲＭＢＰ−５８６５として寄託されている。

【００３４】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
１８をコードする塩基配列を有する核酸を含有するベク
ターは、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８
をコードする塩基配列を有する核酸を製造する上で、ま
た、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の核
酸を保持する形質転換体を作成する上で有用である。上
記の方法にて作成した本発明の核酸を用いた７回膜貫通
型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の発現には、成書によって知
られている(Kriegler, Gene Transfer and Expression-
A Laboratory Manual Stockton Pres, 1990. および横
田ら、バイオマニュアルシリーズ４, 遺伝子導入と発現
・解析法, 羊土社、1994) 多数の方法が用いられる。す
なわち、分離した７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８
のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベク
ターにつなぎ、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞、バ
クテリアなどの原核細胞を宿主として生産させることが
できる。

【００３５】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
１８を発現させる際に、本発明のポリペプチドをコード
する核酸はその5'末端に翻訳開始コドンを有し、また、
3'末端には翻訳終止コドンを有していてもよい。これら
の翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当な合成核酸ア
ダプターを用いて付加することもできる。更に該ＤＮＡ
を発現させるには上流にプロモーターを接続する。ベク
ターとしては上記の大腸菌由来プラスミド、枯草菌由来
プラスミド、酵母由来プラスミド、あるいはλファージ
などのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワク
シニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。

【００３６】本発明に用いられるプロモーターとして
は、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー
ターであればいかなるものでもよい。形質転換する際の
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔａｃプロモー
ター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが
好ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１
プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、
宿主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰ
プロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿
主が原核細胞である場合には、プロモーターとともにリ
ボゾーム結合部位をもつことが好ましい。宿主が動物細
胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レト
ロウィルスのプロモーター、メタルチオネインプロモー
ター、ヒートショックプロモーターなどが利用できる。

【００３７】本発明のポリペプチドを発現させる時、配
列表配列番号１のアミノ酸配列と実質的に同等な蛋白質
をコードする核酸のみでもよいが、膜表面への発現を保
証する必要のある場合には、既知シグナルペプチドをコ
ードする核酸をＮ末に付加したり、産生されたポリペプ
チドの検出を容易にするための既知抗原エピトープをコ
ードする核酸を付加することで、特別の機能を付加した
蛋白質を生産させることもできる。このような技術の一
つの例として、Choe, H.ら、Cell, 85, 1135-1148, 199
6 年を挙げることができる。

【００３８】本発明者らは、実施例５に示したごとく、
７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を発現する発現ベ
クターとして配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３(Invitro
gen 社）につなぎ、本発明のＤＮＡを含む発現ベクター
を作製した。このようにして構築された７回膜貫通型受
容体蛋白質ＪＥＧ１８をコードするＤＮＡを含有する発
現ベクターを用いて、本発明のＤＮＡを含むベクターを
保持する形質転換体を製造する。宿主としては例えばエ
シェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが
挙げられる。動物細胞としては、例えばサル細胞である
ＣＯＳ−７、Vero細胞、チャイニーズハムスター細胞Ｃ
ＨＯ、カイコ細胞ＳＦ９などが挙げられる。

【００３９】このようにして得られる本発明の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８をコードする塩基配列を有
する核酸を含有するベクターは、本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ１８を産生する上で有用である。実
施例６，７に示したごとく、上記の発現ベクターを遺伝
子導入し、７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８をＣＨ
Ｏ細胞、２９３細胞などで発現させ、これら発現プラス
ミドで形質転換された形質転換体が得られる。これらの
形質転換体は本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
１８を産生する上で有用である。本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ１８と実質的に同等な蛋白質をコー
ドする塩基配列を有する核酸を含有するベクターを保持
した形質転換体を作成し、それぞれ公知の方法により、
適当な培地中で適当な培養条件により培養することによ
って、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８ま
たはその塩を製造することができる。例えば実施例６の
ようにWestern blottingを用いたり、また、ＦＡＣＳに
よって検査することにより、７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ１８の生産を確認することができる。

【００４０】このようにして作成した、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８またはその塩を用いて、
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のリガン
ドを決定することができる。そのためには、まず、リガ
ンド候補である試験化合物を、純化したまたは、未精製
の、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８と接
触させ、試験化合物の本発明の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８に対する結合もしくはその結合により引き
起こされる反応を測定する。試験化合物の本発明の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８に対する結合を測定す
る場合には、純化した、または、未精製の本発明の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８と試験化合物を接触さ
せ、複合体量および／または未結合の試験化合物量を測
定する。複合体量および／または未結合の試験化合物量
を測定する方法としては、例えば、放射性化合物や色素
などを用いて試験化合物を標識し、複合体と未結合の試
験化合物を分離し、標識を用いて複合体量および／また
は未結合の試験化合物量を測定する。この一つの例を実
施例７に示した。

【００４１】受容体と結合する化合物が知られている場
合には、その化合物を標識し、試験化合物が標識化合物
と競合するかどうかをもって、試験化合物の結合を測定
することもできる。これらの方法の例として、浅沼幹人
ら、実験医学 11, 22-29,1993 年に挙げられている方法
がある。そのほかにも、ＳＰＡ(Scintillation Proximi
ty Assay) のように複合体と未結合の試験化合物を分離
せずに測定する方法もある。

【００４２】一方、試験化合物と本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ１８の結合によりひき起こされる反
応を測定する場合には、本発明の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＪＥＧ１８の共役しているシグナル伝達系によって
様々な方法が考えられる。このような方法として、例え
ば唐木英明ら編、実験医学 7, pp26-109, 1989年のよう
に細胞内カルシウムを測定する方法、Samson, M.ら、Bi
ochem. 35, pp3362-3367, 1996年のようにマイクロフィ
ジオメーターを用いる方法、細胞内ｃＡＭＰの量を測定
する方法、などがある。リガンドとの結合によって引き
起こされる反応を測定する１つの例を実施例８に示し
た。これらＪＥＧ１８蛋白質もしくはその塩、または、
その部分ペプチドまたはその塩と試験化合物を接触させ
るＪＥＧ１８蛋白質に対するリガンドを決定する方法は
７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８に結合して白血球
細胞の反応を制御する、疾患の治療を行う物質を検索す
る上で有用である。

【００４３】さらに上記のようにして、リガンド、すな
わち、７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８に作用する
ものを発見した場合には、その作用の変化、すなわち、
その活性化を行ったり、活性化を阻害したりする物質を
検索することが可能である。そのことは、(i) ７回膜貫
通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８もしくはその塩またはその
部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドを接触させた
場合と(ii)７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８もしく
はその塩またはその部分ペプチドもしくはその塩に、リ
ガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行
うことによって行うことができる。その一つの例を実施
例９に示した。この方法は、７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ１８に作用して白血球細胞の反応を制御する、疾
患の治療を行う物質を検索する上で有用である。

【００４４】７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を特
異的に認識する抗体は実施例１０に示したようにして作
製することができる。抗体を作製するためのペプチドの
長さは特に限定されないが、ＪＥＧ18蛋白質を特徴づけ
られる長さがあればよく、好ましくは６アミノ酸以上、
特に好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いれぱよ
い。このペプチドをそのまま、またはＫＬＨ(keyhole-l
impet hemocyanin) やＢＳＡ(bovine serum albumin)と
いったキャリア蛋白質と架橋した後に必要に応じてアジ
ュバントと共に動物へ接種せしめ、その血清を回収する
ことでＪＥＧ18蛋白質を認識する抗体 (ポリクローナル
抗体) を含む抗血清を得ることができる。また、抗血清
より抗体を精製して使用することも可能である。接種す
る動物としては、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウ
ス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製には
ヒツジ、ウサギが好ましい。また、ハイブリドーマ細胞
を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得る
ことも可能であるが、この場合にはマウスが好ましい。
また、配列番号１に示したアミノ酸の全長または６残基
以上、望ましくは８残基以上のアミノ酸配列をＧＳＴ
（グルタチオン Ｓ―トランスフェラーゼ）などと融合
させたものを精製して、または未精製のまま、抗原とし
て用いることもできる。成書(Antibodies a laboratory
manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Labo
ratory) に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニ
ング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を
用いて、細胞に発現させた遺伝子組換え体抗体によって
も作製することができる。このように作製された抗体は
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の精製に
利用できる。

【００４５】また、実施例１０に示したこれらの７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を特異的に認識する抗体
を用いれば、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
１８の検出、測定が可能であり、細胞の分化異常を伴う
疾患、例えば悪性腫瘍、ウイルス感染などの疾患の診断
薬として使用でき得る。また、実施例６に示すように、
この検出、測定には、Western Blotting, FACS (Fluore
scence Activated Cell Sorter) などを用いることがで
きる。ＦＡＣＳを用いた臨床診断の例は、例えば、天神
美夫ら編、フローサイトメトリーハンドブック、サイエ
ンスフォーラム社、1984年、の第４部 フローサイトメ
トリーの臨床医学への応用、に示されている。これら検
出、測定については、Western Blotting (Immunoblotti
ng) に関してはAntibodies laboratory manual, E.Harl
ow et al., Cold Spring HarborLaboratory, pp471-510
にその方法の詳細が、免疫沈降、免疫測定などに関し
ては、同書pp421-470, pp553-612にそれぞれ詳細が記さ
れている。ＦＡＣＳの際の細胞の染色については、高津
聖志、瀧伸介、免疫研究の基礎技術、羊土社、1995年、
pp16-61 に、ＦＡＣＳの操作については、天神美夫ら
編、フローサイトメトリーハンドブック、サイエンスフ
ォーラム社、1984年に詳細が示されている。

【００４６】以上のように、配列表配列番号１で表され
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
ることを特徴とする７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１
８またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはその
塩に対する抗体は本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ１８を発現している細胞を同定する上で有用であ
る。

【００４７】

【発明の実施の形態】以下に発明を実施する形態につい
て例を示すが、必ずしもこれらに限定されるものではな
い。

【実施例１】新規７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８断片の取得 白血球細胞Jurkat E6-1 (ATCC TIB-152)はＡＴＣＣ(Ame
rican Type Cell Culture Collection) より入手し、Ｉ
Ｌ−２（インターロイキン２) 産生能の高い亜株をさら
に選択し、Jurkat Z18株と命名した。この細胞株は、前
述のように日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６６として
寄託されている。これを拡大培養して保存し実験に用い
た。細胞はセルバンカー（十慈化学工業（株))に１mlあ
たり約10⁷ の濃度で懸濁し、液体窒素液漕にて凍結保存
した。通常の培養の際には、培地はＲＰＭＩ1640 (GIBC
OBRL Cat.No.22400-071) を用い、最終濃度10％のＦＢ
Ｓ (Fetal Bovine Serum;GIBCO BRL Cat.No.10099-141;
56℃20分間熱処理して非働化した）、100 分の１量の
Penicillin-Streptomycin溶液（大日本製薬（株)Cat.N
o.16-70D-49DN)を加えた。10⁴ 細胞／mlから10⁵ 細胞／
mlになるように細胞を加え、37℃、５％二酸化炭素、湿
度 100％で培養し、10⁶ 細胞／ml前後になった時点でピ
ペットでよく混合した後に新しい培地に植え替えた。

【００４８】全体で約５×10⁷ 個の細胞を培養し、1000
rpm で15分の遠心(KS-8300型、久保田製作所、RS3000/6
型ローター）後、上清を吸引・廃棄し、ＰＢＳ (Phosph
ateBuffered Salts；大日本製薬（株) 製 Cat.No. 28-1
03-05) を30ml加え懸濁後、再度同じ条件で遠心した。
以下、Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia
Biotech 製) を用い、製造者のプロトコル (Rev.4. XY-
025-00-07)11〜14頁に従って(second column purificat
ion は行わなかった）、ｍＲＮＡを抽出した。エタノー
ル沈殿後、Molecular Cloning, A laborartory manual,
1989, Eds.,Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,
T.,Cold Spring Harbor Loboratory Press のE5、Spect
rophotometric Determination of the Amount of DNA o
rRNA に従って定量した。１μg の mＲＮＡを用い、Sup
erScript Choice System for cDNASynthesis(Life Tech
nologies製) を用いてｃＤＮＡ合成を行った。プロトコ
ル11〜17頁(Protocol １および２）に従い、oligo(dT)
プライマーを用いて２重鎖（ds）ＤＮＡを合成した。そ
の後、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈
殿後、40μl の滅菌水に溶解した（これをｃＤＮＡサン
プルと呼ぶ）。

【００４９】このｃＤＮＡサンプルのうち４μl を用い
てＰＣＲ (polymerase chain reaction)を行った。ＰＣ
ＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードR001A)を
用いた。酵素に添付のバッファーを５μl 、酵素に添付
の dNTP mixture 4μl と合成オリゴヌクレオチド A:
5'ATC TTA AGC TTG AAC CTI GCC ITI GC(GTA) GAC 、お
よび、合成オリゴヌクレオチド B: 5' CCC AAC GAA TTC
(AG)TA GAT (GC)A(AGCT) IGG (AG)TT IA(AGC) (AG)CA
、（かっこ内はその位置に複数の残基の混合物を反応
させたことを示し、Ｉはイノシンヌクレオチドを示す）
をそれぞれ 200 pmol を加え、最終容量50μl とした。

【００５０】この混合物を、TaKaRa PCR thermal Cycle
r 480 を用いて、95℃１分, 40℃２分, 72℃３分を５サ
イクル行ったのち、95℃１分, 50℃２分, 72℃３分を25
サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を1.5 ％アガロ
ース・ゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド
（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約
700bp のｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。こ
のバンドをゲルから切り出してSuprec01 (宝酒造社製)
で精製後、ＴＡ cloningキット (Invitorogen社製) を
用いてクローニングした。

【００５１】すなわち、ベクターとして pCRII Vector
(Invitorogen 社製、以下pCRII という）を用い、ベク
ターと先のＤＮＡとをそのモル比が１：３となるように
混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(Invitorogen社
製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み
込まれたベクター pCRIIを大腸菌One Shot Competent C
ells (Invitrogen社製）に遺伝子導入し、アンピシリン
(Sigma社製）を50μg/ml含むＬ−Broth(宝酒造社製）半
固型培地のプレートに蒔き、12時間程度37℃に放置し、
現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシ
リンを含むＬ−Broth 液体培地２mlに植え付け、18時間
程度37℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニ
プレップ(Promega社製）を用いて添付の説明書に従って
プラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素 EcoRI
にて消化して、約 700bpのＤＮＡが切り出されてくるこ
とで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確
認されたクローンについて、組み込まれているｃＤＮＡ
の塩基配列決定を行った。

【００５２】挿入ｃＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ap
plied Biosystems社製の蛍光シークエンサーを用いて実
施した。シークエンスサンプルの調製はPRISM 、Ready
Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Appli
ed Biosystems 社製）を用いて行なった。0.5 ml容のマ
イクロチューブに9.5 μl の反応ストック液、4.0 μl
の0.8pmol/μl のＴ７プロモータープライマー(GIBCO B
RL社製）および 6.5μl の0.16μg/μl のシークエンス
用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、100 μl のミネラルオイ
ルを重層後、96℃30秒、55℃15秒および60℃４分を１サ
イクルとするＰＣＲ増幅反応を25サイクル行ない、４℃
で５分間保温した。反応後、80μl の滅菌精製水を加え
て撹拌し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・
クロロホルム抽出を行なった。 100μl の水層に10μl
の３Ｍ酢酸ナトリウム (pH5.2)および 300μl のエタノ
ールを加えて撹拌後、室温、14,000rpm にて15分間の遠
心を行ない沈殿を回収した。沈殿を75％エタノールで洗
浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス
用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μl の
10mMのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して90℃、２
分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。

【００５３】116 のクローンについてＤＮＡ配列決定を
行ったところ、２個のクローンが配列表配列番号２のＤ
ＮＡ配列の 303番目から1025番目に対応する配列を有し
ていた（両端のプライマーの配列を含む）。GenBank リ
リース97.0、October,1996のサーチの結果、この配列は
７回膜貫通型受容体群と類似していることが判明した
（以下、この断片をＪＥＧ(Jurkat Expressed G-protei
n coupled Receptor) 18断片とよぶ）。

【００５４】

【実施例２】新規７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８Ｃ末端断片の
取得 Jurkat由来のｃＤＮＡライブラリー（CLONTECH社、コー
ドHL5 0086) からプラークハイブリダイゼーションにて
全長ｃＤＮＡを持ったクローンの検索を行った。10⁶ 個
相当のプラークをMolecular Cloning,A laborartory ma
nual,1989, Eds., Sambrook,J., Fritsch,E.F.,and Man
iatis,T., Cold Spring Harbor Loboratory Press の
2. 109-111 、Immobilization of bacteriophage λ pl
aques onnitrocellulose filters に従ってプレート
し、出現したプラークをナイロンフィルター(Hybond N
⁺ ; Amersham社製）に転写し、転写したナイロンフィル
ターをアルカリ処理（1.5M NaCl,0.5M NaOHを染み込ま
せた濾紙上に５分間放置）し、次いで中和処理 (0.5M N
aCl, 0.5MTris-HCl (pH7.5) を染み込ませた濾紙上に５
分間放置）を２回行い、次に２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳ
Ｃ溶液は 0.15M NaCl、15mMクエン酸 pH7.0) 中で５分
間、２度振とう洗浄し風乾した。その後、ＵＶクロスリ
ンカー（フナコシ社製、モデルＣＬー1000) を用いて、
このフィルターの紫外線照射を1200×160 マイクロジュ
ール/cm²で行った。このフィルターを用いて放射性同位
元素P³² にて標識されたヒト７回膜貫通型受容体蛋白質
遺伝子ＪＥＧ１８断片をプローブにしてハイブリダイゼ
ーションを行った。

【００５５】放射性同位元素P³² にて標識されたＪＥＧ
１８断片プローブは以下のように作製した。すなわち、
ＪＥＧ１８断片が組み込まれたベクターpCRII より、制
限酵素EcoRI にてベクターより切り出し、0.8 ％アガロ
ース・ゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド
（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、こ
のバンドをゲルから切り出して Suprec 01（宝酒造社
製）を用いて精製した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラ
ベリングキット(Megaprime DNA labeling system：Amer
sham社製コードＲＰＮ1607）を用いて標識した。すなわ
ち、ＤＮＡ50ngにプライマー液５μl 、５×反応緩衝溶
液10μl 及び脱イオン水を加えて全量を43μl として沸
騰水浴を５分間行い、その後、α-P³²-dCTP(アマーシャ
ム社製、コード AA 0005) ５μl 、及び Klenow 酵素溶
液２μl を加えて、37℃で10分間水浴し、放射標識した
ＪＥＧ１８断片を合成した。更にその後、セファデック
スカラム(Quick Spin Column Sephadex G-50: 独逸国ベ
ーリンガーマンハイム社製）で精製し、５分間沸騰水浴
をしたのち、２分間氷冷後使用した。

【００５６】前述の方法にて作成したフィルターを、各
々の成分の最終濃度が６倍濃度のＳＳＣ溶液、５倍濃度
のデンハルト液（和光純薬社製）、0.5 ％ＳＤＳ（ドデ
シル硫酸ナトリウム、和光純薬社製）、及び 100μl/ml
の沸騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡ(Sigma社製）
を含むハイブリダイゼーション液中に浸し、65℃にて２
時間振とうしたのち、前述の方法でP³² 標識されたプロ
ーブをハイブリダイゼーション液に添加し、65℃にて16
時間振盪し、ハイブリダイゼーションを行った。

【００５７】次に、フィルターを0.1 ％ＳＤＳを含む、
各々の成分の最終濃度が２倍濃度のＳＳＣ溶液に浸し、
室温で３回洗浄後、さらに同溶液で室温15分洗浄した。
洗浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用し
て、−85℃でオートラジオグラフィーを行った。その結
果、強く露光された部分のクローンを拾い、再度プラー
クを蒔き直し前述の方法にてスクリーニングを行い、完
全に単独のクローンを分離した。

【００５８】単離されたファージクローンのうち３クロ
ーンを以降の遺伝子配列決定に供した。Molecular Clon
ing, A laborartory manual,1989,Eds., Sambrook,J.,
Fritsch,E.F., and Maniatis,T., Cold Spring Harbor
Loboratory Pressの2.70、の方法に従い、これらのすべ
てのクローンのファージを約10⁹ pfu(plaque formingun
it)調製し、Wizard lambda preps (Promega) を用いて
ファージＤＮＡを精製し、制限酵素 NotI にて消化し、
同様に制限酵素 NotI で消化したプラスミド pBluescri
ptII SK(−) (Stratagene 社製）に組み込んだ。これら
のクローンの両端のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサー
により解析し、配列表配列番号２にあるＤＮＡ配列で 2
81番目のＧまで、アミノ酸配列で49番目のＬｙｓまで決
定した。

【００５９】

【実施例３】ヒト７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８ｃＤＮＡの5'
RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 実施例１に示したようにして、白血球細胞JurkatのｍＲ
ＮＡを調製した。5'RACE system for Rapid Amplificat
ion of cDNA Ends, Version 2.0 (Gibco社製、コード:
18374-058)を用い、添付のプロトコール pp10-15に従っ
た。ＧＳＰ１には 5' GGT AGA AAC AGA ACA TGC AG 3'
(配列表配列番号３の 758番目のＧから 779番目のＧま
での20mer)、また GSP2 には 5' GTA AGT CAG CAA TGG
CTA AG 3'(配列表配列番号３の 848番目のＧから 867番
目のＧまでの20mer)の配列をもつ、化学合成ＤＮＡをプ
ライマーとして用いた。ＧＳＰ１プライマーを用い逆転
写酵素によりJurkat mRNA から１本鎖ｃＤＮＡを合成し
た後、ターミナルデオキシトランスフェラーゼによりポ
リＣを5'末端に付加したものを (以下、dC-tailedcDNA
とよぶ）以降のＰＣＲ (Polymerase chain Reaction)反
応に用いた。第１回目のＰＣＲ反応は脱イオン水 31.5
μl 、ＰＣＲ反応緩衝溶液（ベーリンガマンハイム社
製）５μl 、2.5mM ｄＮＴＰ溶液（宝酒造社製）４μl
、10μmol ＧＳＰ１プライマー２μl 、10μmol abrid
ged Anchorプライマー（ベーリンガマンハイム社製）
２μl 、dC-tailed cDNA 5μl 、High Fedelity Taq ポ
リメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を 0.5μl
加え、94℃で２分処理した後、94℃１分、55℃１分、72
℃２分を１サイクルとした反応を35サイクルを行った。
ＰＣＲ反応は、TaKaRa PCR thermal Cycler 480 を用い
て行った。

【００６０】この反応溶液５μl を用い、第２回目のＰ
ＣＲ反応は脱イオン水 31.5 μl 、ＰＣＲ反応緩衝溶液
（ベーリンガーマンハイム社製）５μl 、2.5mM mMｄＮ
ＴＰ溶液（宝酒造社製）４μl 、10μmol ＧＳＰ２プラ
イマー２μl 、10μmol ＡＵＡＰ プライマー（ベーリ
ンガーマンハイム社製）２μl 、High Fedelity Taqポ
リメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製)0.5μl を加
え、同様に94℃で２分処理した後、94℃１分、50℃１
分、72℃１分を１サイクルとした反応を34サイクルを行
い、最後に94℃１分、50℃１分、72℃７分の反応を行っ
た。ＰＣＲ反応により生成したＤＮＡを0.7 ％低融点ア
ガロース上の電気泳動で分離した後、ＤＮＡのバンドを
切り出し、GENE CleanII (バイオ101 社製、コード GL-
1131-05))のプロトコールに従いＤＮＡを精製した。こ
の精製ＤＮＡをＴＡクローニングｋｉｔ（米国、インビ
トロージェン社製、コード K2000-01)を用い、添付のプ
ロトコールに従って、ｐＣＲ2.1 ベクターに組み込ん
だ。これらのクローンの両端のＤＮＡ配列をＤＮＡシー
クエンサーにより解析してヒト７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８とその遺伝子の全構造を決定した（配列表
配列番号１, 2, 3) 。

【００６１】

【実施例４】Northern 解析 実施例１, 2, 3で得られた白血球細胞 Jurkat E6-1細胞
株由来ヒト７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の各臓
器における遺伝子発現を Northern で解析した。Multip
le Tissue Northern (MTN) Blots フィルター(CLONTEC
H 社製、コード＃ 7759-1 及び＃7760-1) を用い、５倍
濃度のＳＳＰＥ溶液（１倍濃度のＳＳＰＥ溶液は 0.15M
NaCl、10mM NaH2PO4、1mM EDTA、pH7.4)、10倍濃度の
デンハルト液（和光純薬社製）、２％ＳＤＳ（ドデシル
硫酸ナトリウム、和光純薬社製）、終濃度50％ホルムア
ミド（和光純薬社製）、及び 100μg/mlの沸騰水浴によ
り変性したサケ精子ＤＮＡ(Sigma社製）を含むハイブリ
ダイゼーション液中に浸し、42℃にて２時間振とうした
のち、実施例２と同様の方法でP³² 標識されたＪＥＧ１
８遺伝子断片プローブをハイブリダイゼーション液に添
加し、42℃にて16時間振盪し、ハイブリダイゼーション
を行った。

【００６２】次に、フィルターを 0.1％ＳＤＳを含む、
各々の成分の最終濃度が２倍濃度のＳＳＣ溶液に浸し、
室温で３回洗浄後、さらに同溶液で室温15分洗浄した。
さらに、0.1 ％ＳＤＳを含む、各々の成分の最終濃度が
0.2倍濃度のＳＳＣ溶液で室温15分間洗浄を行った。洗
浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用して、
−85℃でオートラジオグラフィーを行った。図１に示す
ように、ＪＥＧ１８は、胸腺、脾臓に約 5-6kbのバンド
が認められた。小腸、末梢血でも弱いバンドが認められ
た。

【００６３】

【実施例５】７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８発現ベクターの作
製 白血球細胞Jurkat Z18株のｍＲＮＡ、１μg を用い、Su
perScript Choice System for ｃＤＮＡ Synthesis (Li
fe Technologies 、コード8090RT) を用いてｃＤＮＡ合
成を行った。製造者のプロトコル11ページから17ページ
(Protocol１および２）に従い、5'GCA TTT CAG GTC AC
A TTC AG3' (配列表配列番号３の11番目のＧから30番目
Ｇまでの20mer である) の配列を持つブライマーを用い
て１本鎖(ss)DNA を合成した。その後フェノール・クロ
ロフォルム抽出、エタノール沈殿後、40μl の滅菌水に
溶解した (これをｃＤＮＡサンプルと呼ぶ) 。このｃＤ
ＮＡサンプルのうち４μl を用いてＰＣＲ(polymerase
chain reaction) を行った。ＰＣＲはHigh Fidelity Ta
q ポリメラーゼ (ベーリンガーマンハイム社製）を用い
た。酵素に添付のバッファーを５μl 、2.5mM ｄＮＴＰ
mixture (宝酒造社製) ４μl と、オリゴヌクレオチド
Ａ：5' CGC GGA TCC CAT GCC TGC TAA TTA CAC GTG TA
C C3'(配列表配列番号２の137 番目のＣから161 番目の
Ｃの25残基の5'末端にスペーサー配列CGC と制限酵素Ba
mHI の酵素配列GGA TCCを加えたもの) 、およびオリゴ
ヌクレオチドＢ：5'TGC TCT AGA GCA TTA GCA TAA TTC
AGG TGT CAT G3'(配列表配列番号３の45番目のＧから66
番目のＣの22残基の5'末端にスペーサー配列TGC と制限
酵素XbaIの認識配列TCT AGA およびスペーサー配列GCA
を加えたもの）を、それぞれ20ピコモルを加え、最終容
量50μl とした。

【００６４】この混合物を、TaKaRa PCR thermal Cycle
r 480 を用いて、95℃３分、55℃１分、72℃２分を１サ
イクル行ったのち、95℃１分、55℃１分、72℃２分を２
サイクル、94℃１分、65℃１分、72℃２分を24サイクル
行って、最後に94℃１分、65℃１分、72℃７分の反応を
行った。このＰＣＲ産物の一部を0.8 ％アガロース・ゲ
ル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド (日本ジ
ーン社製) にて染色後、紫外線下で観察し、約1000bpの
ｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。

【００６５】残りのＰＣＲ反応溶液を0.8 ％アガロース
ゲル上で分離し、目的とする遺伝子産物をゲルから切り
出し、GENE CleanIIを用いて、ＤＮＡの精製を行った。
この精製ＤＮＡをＴＡクローニングkit を用い、添付の
プロトコールに従って、ｐＣＲ2.1 ベクターに組み込ん
だ。これらのクローンを制限酵素BamHI 、XbaIで消化
し、電気泳動で約1000bpの断片と、ｐＣＲ2.1 ベクター
である約3.9kb の断片を生ずるクローンを選択した。こ
のクローンを制限酵素XbaI、及び制限酵素BamHIで消化
し、その反応液全量を0.8 ％低融点アガロース・ゲル中
で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド (日本ジーン
社製) にて染色後、紫外線下で観察し、約1000bpのＤＮ
Ａのバンドをゲルから切り出してGENE CleanIIで精製
後、ベクターpcＤＮＡ３にXbaI、BamHI サイトを用いて
クローニングした。ベクターpcＤＮＡ３は以下のように
調製した。５μg のベクターpcＤＮＡ３、５μl 、脱イ
オン水36μl 、制限酵素緩衝液 (NEB 社製）５μl 、制
限酵素XbaI、及び制限酵素BamHI 各々２μl を加え全量
を50μl として、37℃で１時間水浴した。この反応液全
量を0.8 ％低融点アガロース・ゲル中で電気泳動を行
い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色
液、紫外線下で観察し、約5.4kbpのＤＮＡのバンドをゲ
ルから切り出してGENE CleapIIで精製した。ベクターと
先のＤＮＡのモル比が１：３となるように混ぜ合わせ
て、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社製）にてベクター
にＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたpcＤＮＡ
３を大腸菌ＤＨ５ Competont Cells (東洋紡社製、コー
ドＤＮＡ-901) に遺伝子導入し、アンピシリン(Sigma社
製) を50μg/ml含むＬ−Broth(宝酒造社製) 半固型培地
のブレートに蒔き、12時間程度37℃に放置し、現れてき
たコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含
むＬ−Broth 液体培地２mlに植え付け、18時間程度37℃
で振盪培養し、菌体を回収し、ウイザードミニブレップ
(Promega社製) を用いて添付の説明書に従ってプラスミ
ドを分離し、このプラスミドを制限酵素XbaI、BamHI に
て消化して、約1000bpのＤＮＡが切り出されたクローン
について、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行
った。

【００６６】ＤＮＡ塩基配列決定は、Applied Biosyete
ms社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シーク
エンスサンプルの精製は、PRISM 、Ready Reaction Dye
Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosyete
ms社製) を用いて行なった。0.5ml 容のマイクロチュー
ブに 9.5μl の反応ストック液、4.0 μl の0.8pmol/μ
l のＴ７プロモータープライマー（GIBCO BRL 社製) お
よび6.5 μl の0.16μg/μl シークエンス用鋳型ＤＮＡ
を加えて混合し、100 μl のミネラルオイルを重層後、
96℃30秒、55℃15秒および60℃４分を１サイクルとする
ＰＣＲ増幅反応を25サイクル行ない、４℃で５分間保温
した。反応後、80μl の滅菌精製水を加えて攪拌し、遠
心分離後の水層を３回のフェノール・クロホルム抽出を
行なった。100 μl の水層に10μl の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（pH5.2)および300 μl エタノールを加えて攪拌後、
室温、14,000rpm にて15分間の遠心を行ない沈殿を回収
した。沈殿を75％エタノールで洗浄後、真空下に２分間
静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シ
ークエンスサンプルは、４μｌの10mMのＥＤＴＡを含む
ホルムアミドに溶解して90℃、２分間で変性後、氷中で
冷却してシークエンスに供した。これによって得られた
発現プラスミドをｐＪＥＧ18と命名した。なお、発現プ
ラスミドpJEG18を大腸菌ＤＨ５株に導入した菌株E.col
i：DH5-pJEG18は日本国通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６５
として寄託されている。

【００６７】

【実施例６】発現ベクターの細胞への遺伝子導入と発現 実施例５で作製した発現ベクターを２９３細胞（大日本
製薬（株）から入手可能、原ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ-1573)
に遺伝子導入した。遺伝子導入前の細胞の継代は、MEM
with Earles Salts (MEMアール液体培地、大日本製薬
（株) Cat. No.12-102-54GN)を用い、１０％馬血清（56
℃20分間熱処理して非働化した；ICN Biomedicals,Inc.
Cat.No.2921149) 、100 分の１量の Penicillin-Strept
omycin溶液（大日本製薬（株) Cat.No.16-70D-49DN) を
加えた。細胞は、 5×10⁴ 個／mlから 5×10⁵ 個／mlの
濃度で培地中に植え付け、37℃、５％二酸化炭素、湿度
100％で培養し、コンフルエントになるまで培養した。
培地を吸引・廃棄し、ＥＤＴＡトリプシン液(Cosmo Bio
Co.,Ltd.)処理により、細胞をプレート底面よりはがし
た。前記の培地（血清を含む）を加えて反応を停止させ
た。その後、ピペッティングによって細胞を均一に懸濁
し、遠心して(1000rpm 15分； KS-8300型、久保田製作
所、RS3000/6型ローター）回収し、新しい培地に再度懸
濁し継代した。遺伝子導入は、 Invitrogen 社のキット
(Cat.No.IV2780-1) を用いリン酸カルシウム共沈法にて
行い（添付のプロトコル６ページ）、本発明の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８をコードするＤＮＡを保持
する形質転換体を作成した。ＤＮＡは３５mmプレートあ
たり５μg を用いた。

【００６８】膜画分の調製は、以下のように行った。遺
伝子導入した細胞およびｐｃＤＮＡ３プラスミドを導入
した細胞を24〜48時間培養した。その後、培地はアスピ
レータで吸引し廃棄し、ＰＢＳ (大日本製薬（株）Cat.
No. 28-103-05)を用いて細胞を洗浄し、その後１ml／プ
レートのＰＢＳを加え、Cell Scraper-L (住友ベークラ
イト、Cat.No.MS-93300)を用いてプレートからはがし
た。その後、１ml／３プレートのＰＢＳを加え、プレー
トを洗浄し、回収した細胞に加えた。この細胞懸濁液を
Polytron (KINEMATIKA 社製、PT10-SK)で破砕し、マイ
クロチューブ用遠心機（トミー精工、MRX-150 型）で４
℃、13000xg で１５分間遠心した。上清を捨て、さらに
２度ＰＢＳを加え懸濁後、同じ条件で遠心した。バイオ
・ラッド社のプロテインアッセイキットを用いて蛋白質
を定量し、蛋白質量が、１mg／mlになるようＰＢＳを加
えて調製した。この懸濁液を膜画分調製液とした。

【００６９】こうして得られた膜画分調製液を用いてウ
ェスタンブロッティング法にて７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８の発現を確認した。すなわち、膜画分をＡ
ＣＩジャパン社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用電気泳動槽及び
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラジエ
ントゲル５〜15％）を用い、添付の取扱い説明書に従っ
てＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった。サンプルは２−メル
カプトエタノール（２−ＭＥ）を加えて５分間の沸騰水
浴加熱処理により還元処理を行った。マーカーとしては
Amersham 社製レインボーマーカー（高分子量用）を用
い、サンプルバッファー、泳動バッファーについては添
付の取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
終了後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブランフィ
ルター (BioRad社製）に同社製ミニトランスブロットセ
ルにより転写した。

【００７０】このように作製されたフィルターをブロッ
クエース（大日本製薬社製）、ＴＢＳ−Ｔ(20mM Tris、
137mM NaCl(pH7.6) 、0.1 ％ Tween 20)に４℃で一晩振
盪してブロッキングした。ＥＣＬウェスタンブロッティ
ング検出システム（Amersham社）に添付の説明書に従
い、一次抗体として実施例１０に記載した抗ＪＥＧ１８
抗血清を用い、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗
マウスＩｇ羊抗体（Amersham社製）を反応させた。。

【００７１】抗体の反応時間は各々室温で一時間反応さ
せ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて10分間室温で振盪洗浄す
る操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィルタ
ーをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム(Ame
rsham 社製）の反応液に５分間浸し、ポリ塩化ビニリデ
ンラップに包んでＸ線フィルムに感光させた。分子量マ
ーカーとの比較の結果、約38〜42kDのバンドが遺伝子導
入をしたものについてのみ得られ、遺伝子導入をしてい
ない細胞には観察されなかった。

【００７２】

【実施例７】リガンドのスクリーニング 遺伝子導入を行わない２９３細胞とＪＥＧ１８形質転換
体 293細胞の膜画分を実施例６と同様にして調製した。
膜画分調製液50μl もしくはＰＢＳ（大日本製薬（株)C
at.No. 28-103-05) と放射性標識された候補化合物 CGS
21680 (DupontNEN社、カタログ番号 NET-1021) 50μl
(終濃度100nM)、 PBS 50μl を加え、全量を 150μl と
した。混合して候補化合物と７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ１８を接触させ、37℃で30分間保温した後、マイ
クロチューブ用遠心機（トミー精工、MRX-150 型）で室
温、15000xg で15分間遠心し、ＪＥＧ１８蛋白質と結合
した候補化合物と結合していないものを分離した。その
上清を１μl とり、10mlの液体シンチレーター用カクテ
ル (Dupont NEN、ECONOFLU OR-2)に加え、混合した。そ
の後、Beckman LS6000LL型シンチレーションカウンター
を使用して放射活性をカウントし、ＪＥＧ１８遺伝子導
入の有無で得られた放射活性を比較した。その結果、得
られた放射活性はＪＥＧ１８遺伝子導入の有無で差がな
かった。

【００７３】

【実施例８】リガンドのスクリーニング 実施例５で作製した発現ベクターをＣＨＯ細胞（大日本
製薬（株）から入手可能、原ＡＴＣＣ番号CCL-61) に遺
伝子導入した。遺伝子導入前の細胞の継代は、F-12 Nut
rient Mixture(ＨＡＭ培地、GIBCO BRL カタログ番号 1
1765-047) を用い、最終濃度10％のＦＢＳ(Fetal Bovin
e Serum; GIBCO BRL Cat.No.10099-141; 56 ℃20分間熱
処理して非働化した) 、100 分の１量の Penicillin-St
reptomycin溶液（大日本製薬（株）Cat.No.16-70D-49D
N) を加えた。細胞は、 5×10⁴ 個／mlから 5×10⁵ 個
／mlの濃度で培地中に植え付け、37℃５％２酸化炭素、
湿度 100％で培養し、コンフルエントになるまで培養し
た。培地は吸引・廃棄し、ＥＤＴＡトリプシン液(Cosmo
Bio Co.,Ltd.)処理により、細胞をプレート底面よりは
がした。前記の培地（血清を含む）を加えて反応を停止
させた。その後、ピペッティングによって細胞を均一に
懸濁し、遠心して(1000rpm 15 分； KS-8300型、久保田
製作所、RS3000/6型ローター) 回収した。新しい培地に
再度懸濁し、継代した。

【００７４】遺伝子導入は、 Invitrogen 社のキット(C
at.No.IV2780-1) を用いリン酸カルシウム共沈法にて行
った（添付のプロトコル６ページ）。ＤＮＡは35mmプレ
ートあたり５μg 用いた。遺伝子導入後、約６時間後に
培地を新しいものと交換しさらに約４８時間培養した。
さらに培養上清を、種種の細胞濃度で 400μg/mlの濃度
のネオマイシン(Geneticin、 GIBCO BRL 11811-023)を含
む培地に植え替えた。その後、２週間前後培養し増殖し
た細胞を発現細胞とした。

【００７５】以上のように作成した７回膜貫通型受容体
蛋白質ＪＥＧ１８発現細胞を用いて、化学遊走の測定を
行った。リガンド候補物質としては、ＬＰＳ（リポポリ
サッカライド）投与ラット血清を用いた。７週令の Wis
tar ラットを (株) 日本生物材料より購入した。サルモ
ネラミネソタＲＥ595 由来ＬＰＳ(Sigma社製) を日本薬
局方生理食塩水に最終濃度１mg／mlになるように懸濁し
た。懸濁液をソニケーター(Branson) でソニケートし、
透明な液とした。これを日本薬局方生理食塩水で10倍に
希釈し、 400μl 、尾静脈より投与した。投与後約２２
時間後のラットをエーテル麻酔し開腹して心臓より採血
した。マイクロチューブ用遠心機（トミー精工、MRX-15
0 型）で４℃、13000xg で15分間遠心し、その上清を−
20℃で保存した。これを被検物質溶液とした。

【００７６】96穴マイクロプレートチャンバー（フナコ
シ（株）カタログ番号ＦＥ−2292-96)に96穴マイクロプ
レート（フナコシ（株）カタログ番号ＦＥ−2300-02)お
よび15μg/mlのフィブロネクチン(Sigma、ＰＢＳ（大日
本製薬（株）カタログ番号28-103-05)中に溶解した）で
処理した８μm のポアサイズのフレームフィルター（フ
ナコシ（株）カタログ番号ＦＥ-2340-08) を据え付け
た。下室には0.15％ＢＳＡ(Sigma社製) を含む RPMI 16
40 (GIBCO BRL カタログ番号 22400-071) で被検物質溶
液を10倍希釈して加えた。上室には0.15％ＢＳＡを含む
RPMI 1640に懸濁した７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
１８発現細胞を加え，被検物質とＪＥＧ１８蛋白質を接
触させた。この状態の96穴マイクロプレートチャンバー
を５％二酸化炭素、37℃で５時間保温した。フィルター
を固定・染色して顕微鏡下で観察した。その結果、化学
遊走している細胞が観察された。

【００７７】

【実施例９】リガンドと拮抗する物質のスクリーニング ＪＥＧ１８形質転換ＣＨＯ細胞を用い形質転換体の化学
遊走試験を行った。(i)実施例５で作製したＪＥＧ１８
形質転換ＣＨＯ細胞に発現する７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８とリガンドと実施例８に示したＬＰＳ投与
ラット血清をリガンドとして用いて実施例８と同様に化
学遊走している細胞を観察した。さらに、(ii)実施例８
の実験の際に上室および下室に含まれる溶液に最終濃度
100μmolのＮＥＣＡを加えて実施例８と同様に化学遊
走している細胞を観察した。そののち、(i)(ii) を比較
したが、両者に差はなかった。

【００７８】

【実施例１０】ＪＥＧ１８蛋白質を認識する抗体の作成 配列表配列番号１の１番目から19番目のペプチドを合成
し、免疫原としてウサギに免疫して、抗体価の測定後、
全血の採血を行い、血清を採取して、米国 BioRad 社製
のエコノパック血清ＩｇＧ精製キットを用いて、添付の
取扱い説明書に従って、抗ヒトＪＥＧ１８蛋白質ウサギ
ポリクローナル抗体を精製して作製した。ペプチド合成
は、Fmoc固相合成法 (新生化学実験講座１・タンパク質
ＶＩ合成及び発現、東京化学同人発行）にて行ない、そ
の２mgの合成ペプチドを等量のキャリア蛋白質ＫＬＨ(k
eyhole-limpet hemocyanin) とマレイミド法にてコンジ
ュゲートしたものを抗原として使用した。約2.5 kgのウ
サギ１羽に 0.5mgの抗原を背部皮下投与し、その21日
後、42日後および63日後にもそれぞれ等量の抗原を同様
に投与した。最初の投与から73日目にウサギより血液を
麻酔下頸動脈採血により採取後、血清を分離し抗血清と
した。

【００７９】

【発明の効果】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥ
Ｇ１８は、白血球の機能を制御する医薬品を検索するこ
とに使用が可能である。

【００８０】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：333 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Pro Ala Asn Tyr Thr Cys Thr Arg Pro Asp Gly Asp Asn Thr 5 10 15 Asp Phe Arg Tyr Phe Ile Tyr Ala Val Thr Tyr Thr Val Ile Leu 20 25 30 Val Pro Gly Leu Ile Gly Asn Ile Leu Ala Leu Trp Val Phe Tyr 35 40 45 Gly Tyr Met Lys Glu Thr Lys Arg Ala Val Ile Phe Met Ile Asn 50 55 60 Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Arg 65 70 75 Ile Phe Tyr Tyr Leu Asn His Asp Trp Pro Phe Gly Pro Gly Leu 80 85 90 Cys Met Phe Cys Phe Tyr Leu Lys Tyr Val Asn Met Tyr Ala Ser 95 100 105 Ile Tyr Phe Leu Val Cys Ile Ser Val Arg Arg Phe Trp Phe Leu 110 115 120 Met Tyr Pro Phe Arg Phe His Asp Cys Lys Gln Lys Tyr Asp Leu 125 130 135 Tyr Ile Ser Ile Ala Gly Trp Leu Ile Ile Arg Leu Ala Cys Val 140 145 150 Leu Phe Pro Leu Leu Arg Thr Ser Asp Asp Thr Ser Gly Asn Arg 155 160 165 Thr Lys Cys Phe Val Asp Leu Pro Thr Arg Asn Val Asn Leu Ala 170 175 180 Gln Ser Val Val Met Met Thr Ile Gly Glu Leu Ile Gly Phe Val 185 190 195 Thr Pro Leu Leu Ile Val Leu Tyr Cys Thr Trp Lys Thr Val Leu 200 205 210 Ser Leu Gln Asp Lys Tyr Pro Met Ala Gln Asp Leu Gly Glu Lys 215 220 225 Gln Lys Ala Leu Lys Met Ile Leu Thr Cys Ala Gly Val Phe Leu 230 235 240 Ile Cys Phe Ala Pro Tyr His Phe Ser Phe Pro Leu Asp Phe Leu 245 250 255 Val Lys Ser Asn Glu Ile Lys Ser Cys Leu Ala Arg Arg Val Ile 260 265 270 Leu Ile Phe His Ser Val Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Asn Ser 275 280 285 Cys Leu Asp Pro Val Ile Tyr Tyr Phe Ser Thr Asn Glu Phe Arg 290 295 300 Arg Arg Leu Ser Arg Gln Asp Leu His Asp Ser Ile Gln Leu His 305 310 315 Ala Lys Ser Phe Val Ser Asn His Thr Ala Ser Thr Met Thr Pro 320 325 330 Glu Leu Cys

【００８１】配列番号：2 配列の長さ：1183 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GTGGTAAAAA GAAGAAGGTT ATTTTATACT TCGTATCTCC AACCCACTGG CAATCAATCT 60 TTTGGAAGGA ACAGCAGTTG ATTGTGAATT TAGTTTTGAA CCACCATTAG GCAAAGATAG 120 TTTCTCTAGA GAGAATC 137 ATG CCT GCT AAT TAC ACG TGT ACC AGG CCA GAT GGA GAC AAT ACA 182 Met Pro Ala Asn Tyr Thr Cys Thr Arg Pro Asp Gly Asp Asn Thr 5 10 15 GAT TTT CGA TAC TTT ATT TAT GCA GTG ACA TAC ACT GTC ATT CTT 227 Asp Phe Arg Tyr Phe Ile Tyr Ala Val Thr Tyr Thr Val Ile Leu 20 25 30 GTG CCA GGT CTC ATA GGG AAT ATA TTA GCC CTG TGG GTA TTC TAT 272 Val Pro Gly Leu Ile Gly Asn Ile Leu Ala Leu Trp Val Phe Tyr 35 40 45 GGT TAT ATG AAA GAA ACA AAA CGA GCT GTG ATA TTT ATG ATA AAC 317 Gly Tyr Met Lys Glu Thr Lys Arg Ala Val Ile Phe Met Ile Asn 50 55 60 TTA GCC ATT GCT GAC TTA CTA CAA GTT CTT TCC TTG CCA CTG AGG 362 Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Arg 65 70 75 ATC TTC TAC TAC TTG AAT CAT GAC TGG CCA TTT GGG CCT GGT CTC 407 Ile Phe Tyr Tyr Leu Asn His Asp Trp Pro Phe Gly Pro Gly Leu 80 85 90 TGC ATG TTC TGT TTC TAC CTG AAG TAT GTC AAC ATG TAT GCA AGC 452 Cys Met Phe Cys Phe Tyr Leu Lys Tyr Val Asn Met Tyr Ala Ser 95 100 105 ATC TAC TTC TTG GTC TGC ATC AGT GTG CGA CGA TTT TGG TTT CTC 497 Ile Tyr Phe Leu Val Cys Ile Ser Val Arg Arg Phe Trp Phe Leu 110 115 120 ATG TAC CCC TTT CGC TTC CAT GAC TGC AAA CAG AAA TAT GAC CTG 542 Met Tyr Pro Phe Arg Phe His Asp Cys Lys Gln Lys Tyr Asp Leu 125 130 135 TAC ATC AGC ATT GCT GGC TGG CTG ATC ATC CGC CTT GCC TGT GTA 587 Tyr Ile Ser Ile Ala Gly Trp Leu Ile Ile Arg Leu Ala Cys Val 140 145 150 CTC TTT CCA CTC CTC AGA ACC AGT GAT GAT ACC TCT GGC AAT AGG 632 Leu Phe Pro Leu Leu Arg Thr Ser Asp Asp Thr Ser Gly Asn Arg 155 160 165 ACC AAA TGC TTT GTG GAT CTT CCT ACC AGG AAT GTC AAC CTG GCC 677 Thr Lys Cys Phe Val Asp Leu Pro Thr Arg Asn Val Asn Leu Ala 170 175 180 CAG TCC GTT GTT ATG ATG ACC ATT GGC GAG TTG ATT GGG TTT GTA 722 Gln Ser Val Val Met Met Thr Ile Gly Glu Leu Ile Gly Phe Val 185 190 195 ACT CCG CTT CTG ATT GTC CTA TAT TGT ACC TGG AAG ACG GTT TTA 767 Thr Pro Leu Leu Ile Val Leu Tyr Cys Thr Trp Lys Thr Val Leu 200 205 210 TCA CTG CAA GAT AAA TAT CCC ATG GCC CAA GAT CTT GGA GAG AAA 812 Ser Leu Gln Asp Lys Tyr Pro Met Ala Gln Asp Leu Gly Glu Lys 215 220 225 CAG AAA GCC TTG AAG ATG ATT CTA ACC TGT GCA GGG GTA TTC CTA 857 Gln Lys Ala Leu Lys Met Ile Leu Thr Cys Ala Gly Val Phe Leu 230 235 240 ATT TGC TTT GCA CCT TAT CAT TTC AGT TTT CCT TTA GAT TTC CTG 902 Ile Cys Phe Ala Pro Tyr His Phe Ser Phe Pro Leu Asp Phe Leu 245 250 255 GTG AAG TCC AAT GAA ATT AAA AGC TGC CTA GCC AGA AGG GTG ATT 947 Val Lys Ser Asn Glu Ile Lys Ser Cys Leu Ala Arg Arg Val Ile 260 265 270 CTA ATA TTT CAT TCT GTG GCA TTG TGT CTT GCT AGT CTG AAT TCA 992 Leu Ile Phe His Ser Val Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Asn Ser 275 280 285 TGT CTT GAC CCA GTC ATA TAC TAC TTT TCC ACT AAT GAG TTC CGA 1037 Cys Leu Asp Pro Val Ile Tyr Tyr Phe Ser Thr Asn Glu Phe Arg 290 295 300 AGA CGG CTT TCA AGA CAA GAT TTG CAT GAC AGC ATC CAA CTC CAT 1082 Arg Arg Leu Ser Arg Gln Asp Leu His Asp Ser Ile Gln Leu His 305 310 315 GCA AAA TCC TTT GTG AGT AAC CAT ACA GCT TCC ACC ATG ACA CCT 1127 Ala Lys Ser Phe Val Ser Asn His Thr Ala Ser Thr Met Thr Pro 320 325 330 GAA TTA TGC 1136 Glu Leu Cys TAAAACAAAA AACCAAACTG AATGTGACCT GAAATGCAAG TACATCA 1183

【００８２】配列番号：3 配列の長さ：1183 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA アンチセンス：YES 配列 TGATGTACTT GCATTTCAGG TCACATTCAG TTTGGTTTTT TGTTTTAGCA TAATTCAGGT 60 GTCATGGTGG AAGCTGTATG GTTACTCACA AAGGATTTTG CATGGAGTTG GATGCTGTCA 120 TGCAAATCTT GTCTTGAAAG CCGTCTTCGG AACTCATTAG TGGAAAAGTA GTATATGACT 180 GGGTCAAGAC ATGAATTCAG ACTAGCAAGA CACAATGCCA CAGAATGAAA TATTAGAATC 240 ACCCTTCTGG CTAGGCAGCT TTTAATTTCA TTGGACTTCA CCAGGAAATC TAAAGGAAAA 300 CTGAAATGAT AAGGTGCAAA GCAAATTAGG AATACCCCTG CACAGGTTAG AATCATCTTC 360 AAGGCTTTCT GTTTCTCTCC AAGATCTTGG GCCATGGGAT ATTTATCTTG CAGTGATAAA 420 ACCGTCTTCC AGGTACAATA TAGGACAATC AGAAGCGGAG TTACAAACCC AATCAACTCG 480 CCAATGGTCA TCATAACAAC GGACTGGGCC AGGTTGACAT TCCTGGTAGG AAGATCCACA 540 AAGCATTTGG TCCTATTGCC AGAGGTATCA TCACTGGTTC TGAGGAGTGG AAAGAGTACA 600 CAGGCAAGGC GGATGATCAG CCAGCCAGCA ATGCTGATGT ACAGGTCATA TTTCTGTTTG 660 CAGTCATGGA AGCGAAAGGG GTACATGAGA AACCAAAATC GTCGCACACT GATGCAGACC 720 AAGAAGTAGA TGCTTGCATA CATGTTGACA TACTTCAGGT AGAAACAGAA CATGCAGAGA 780 CCAGGCCCAA ATGGCCAGTC ATGATTCAAG TAGTAGAAGA TCCTCAGTGG CAAGGAAAGA 840 ACTTGTAGTA AGTCAGCAAT GGCTAAGTTT ATCATAAATA TCACAGCTCG TTTTGTTTCT 900 TTCATATAAC CATAGAATAC CCACAGGGCT AATATATTCC CTATGAGACC TGGCACAAGA 960 ATGACAGTGT ATGTCACTGC ATAAATAAAG TATCGAAAAT CTGTATTGTC TCCATCTGGC 1020 CTGGTACACG TGTAATTAGC AGGCATGATT CTCTCTAGAG AAACTATCTT TGCCTAATGG 1080 TGGTTCAAAA CTAAATTCAC AATCAACTGC TGTTCCTTCC AAAAGATTGA TTGCCAGTGG 1140 GTTGGAGATA CGAAGTATAA AATAACCTTC TTCTTTTTAC CAC 1183

【図面の簡単な説明】

【図１】臓器中の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８
のNorthern解析結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表配列番号１で表されるアミノ酸配
   列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する７回膜貫通
   型受容体蛋白質ＪＥＧ１８またはその塩。
2. 【請求項２】 請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白
   質ＪＥＧ１８の部分ペプチドまたはその塩。
3. 【請求項３】 ７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の
   部分ペプチドが配列表配列番号１のアミノ酸配列で１番
   目のMet から１９番目のTyr までのペプチドである請求
   項２記載の部分ペプチドまたはその塩。
4. 【請求項４】 請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白
   質ＪＥＧ１８をコードする塩基配列を有する核酸を含有
   する核酸。
5. 【請求項５】 配列表配列番号２で表される塩基配列を
   有する請求項６記載の核酸。
6. 【請求項６】 配列表配列番号２で表される塩基配列の
   うち少なくとも一部の遺伝子配列を有する 12merから 1
   6mer以上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及びそ
   の誘導体。
7. 【請求項７】 配列表配列番号２で表される塩基配列の
   うち少なくとも一部の遺伝子配列を有する核酸が 138番
   目のＡから1139番目のＡまでの核酸である請求項６記載
   の核酸、及びその誘導体。
8. 【請求項８】 配列表配列番号３で表される塩基配列の
   うち少なくとも一部の遺伝子配列を有する 12merから 1
   6mer以上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及びそ
   の誘導体。
9. 【請求項９】 請求項６記載の核酸を含有するベクタ
   ー。
10. 【請求項１０】 請求項６記載のベクターを保持する７
    回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８発現形質転換体。
11. 【請求項１１】 請求項１０記載の形質転換体を培養
    し、形質転換体の細胞膜に７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
    ＥＧ１８を生成せしめることを特徴とする７回膜貫通型
    受容体蛋白質ＪＥＧ１８またはその塩の製造方法。
12. 【請求項１２】 請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋
    白質ＪＥＧ１８もしくはその塩または請求項２記載の部
    分ペプチドもしくはその塩と、試験化合物とを接触させ
    ることを特徴とする７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１
    ８に対するリガンドの決定方法。
13. 【請求項１３】 (i)請求項１記載の７回膜貫通型受容
    体蛋白質ＪＥＧ１８もしくはその塩または請求項２記載
    の部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドを接触させ
    た場合と(ii)請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白質
    ＪＥＧ１８もしくはその塩または請求項２記載の部分ペ
    プチドもしくはその塩に、リガンドおよび試験化合物を
    接触させた場合との比較を行うことを特徴とするリガン
    ドと請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１
    ８との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニ
    ング方法。
14. 【請求項１４】 請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋
    白質ＪＥＧ１８もしくはその塩または請求項２記載の部
    分ペプチドもしくはその塩に対する抗体。