JPH10253633A - 免疫分析装置 - Google Patents
免疫分析装置Info
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- JPH10253633A JPH10253633A JP5587497A JP5587497A JPH10253633A JP H10253633 A JPH10253633 A JP H10253633A JP 5587497 A JP5587497 A JP 5587497A JP 5587497 A JP5587497 A JP 5587497A JP H10253633 A JPH10253633 A JP H10253633A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- metal complex
- bpy
- light
- concentration
- substance
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- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】試料中の微量生体物質の測定感度の向上、およ
び測定セルの長寿命化をはかる。 【解決手段】Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+等の光励起する金属錯体
を標識物質として測定対象物質と結合させ、その結合成
分と非結合成分を磁性ビーズ法により分離した後、光照
射により測定対象物質を含むサンプル液中に添加された
Ｆｅ3+をＦｅ2+へと変化させ、不可逆的に生じたＦｅ2+
を吸光光度法により定量する。
び測定セルの長寿命化をはかる。 【解決手段】Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+等の光励起する金属錯体
を標識物質として測定対象物質と結合させ、その結合成
分と非結合成分を磁性ビーズ法により分離した後、光照
射により測定対象物質を含むサンプル液中に添加された
Ｆｅ3+をＦｅ2+へと変化させ、不可逆的に生じたＦｅ2+
を吸光光度法により定量する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は光励起を生じる金属
錯イオンを標識物質に用いて測定対象物質を定量する装
置に係り、特に金属錯イオンで標識した測定対象物質濃
度を測定する免疫分析装置に関するものである。
錯イオンを標識物質に用いて測定対象物質を定量する装
置に係り、特に金属錯イオンで標識した測定対象物質濃
度を測定する免疫分析装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】免疫分析(immunoassay）の分野では、測
定対象分析物の存在及び濃度を同定するための技術とし
て、吸光光度法，蛍光法，化学発光法及び電気化学発光
法が用いられてきた。蛍光法は発熱以外の機構による光
放射を取扱い、電気化学発光法は化学発光法に電気化学
を融合した方法である。原理的には吸光光度法，蛍光
法，（電気）化学発光法の順に高感度と言われている。
辻 章夫，菅野 剛史編著の化学発光イムノアッセイ、
ライフ・サイエンス（１９９２）参照。
定対象分析物の存在及び濃度を同定するための技術とし
て、吸光光度法，蛍光法，化学発光法及び電気化学発光
法が用いられてきた。蛍光法は発熱以外の機構による光
放射を取扱い、電気化学発光法は化学発光法に電気化学
を融合した方法である。原理的には吸光光度法，蛍光
法，（電気）化学発光法の順に高感度と言われている。
辻 章夫，菅野 剛史編著の化学発光イムノアッセイ、
ライフ・サイエンス（１９９２）参照。
【０００３】化学発光法では、ルミノール，イソルミノ
ール等に過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を作用させて生じる発光
を計測する方法が古くから採用されている。化学発光法
は高感度かつダイナミックレンジが長いなどの利点を有
しているが、発光の減衰が急速であり、精度が悪く、試
薬が不安定であり、バックグランドが高いなどの欠点が
あった。この欠点は試薬の高純度化、装置の改良による
精度の向上などで解消されつつあるが、原理的には解決
されていない。この主要因はルミノール，イソルミノー
ル等の従来利用されてきた標識物質が一端励起してから
発光して基底状態に戻るまでの寿命が平均数１０ナノ秒
と短い点である。
ール等に過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を作用させて生じる発光
を計測する方法が古くから採用されている。化学発光法
は高感度かつダイナミックレンジが長いなどの利点を有
しているが、発光の減衰が急速であり、精度が悪く、試
薬が不安定であり、バックグランドが高いなどの欠点が
あった。この欠点は試薬の高純度化、装置の改良による
精度の向上などで解消されつつあるが、原理的には解決
されていない。この主要因はルミノール，イソルミノー
ル等の従来利用されてきた標識物質が一端励起してから
発光して基底状態に戻るまでの寿命が平均数１０ナノ秒
と短い点である。
【０００４】電気化学発光法では、電極反応を用いるこ
とで発光の同期をとることができ、精度の向上を図れ
る。この電気化学発光法を結合分析法（binding assay
methodology)に適用することで低濃度のホルモン，薬
物、その他の生物学的に有用な物質の定量が行われてい
る。例えば結合分析法では、未知量の決定すべき対象分
析物と、電気化学発光用標識分子を結合させた既知量の
作用物質を含むサンプル混合物が形成される。この混合
物は、標識分子を対象分析物に結合させるためにインキ
ュベート（incubate）される。インキュベートの後、こ
の混合サンプル混合物は結合成分(Ｂ成分；binding com
ponent）と非結合成分(Ｆ成分；freecomponent)とに分
離される。この結合成分は標識化された作用物質が分析
物に結合したものであり、非結合成分は分析物に結合し
ていない標識化された作用物質である。
とで発光の同期をとることができ、精度の向上を図れ
る。この電気化学発光法を結合分析法（binding assay
methodology)に適用することで低濃度のホルモン，薬
物、その他の生物学的に有用な物質の定量が行われてい
る。例えば結合分析法では、未知量の決定すべき対象分
析物と、電気化学発光用標識分子を結合させた既知量の
作用物質を含むサンプル混合物が形成される。この混合
物は、標識分子を対象分析物に結合させるためにインキ
ュベート（incubate）される。インキュベートの後、こ
の混合サンプル混合物は結合成分(Ｂ成分；binding com
ponent）と非結合成分(Ｆ成分；freecomponent)とに分
離される。この結合成分は標識化された作用物質が分析
物に結合したものであり、非結合成分は分析物に結合し
ていない標識化された作用物質である。
【０００５】近年、ルテニウム二価イオンを錯体中心に
持つ、ルテニウム（II）トリスビピリジル錯体Ｒｕ（ｂ
ｐｙ)3 2+を標識物質に用いた電気化学発光法が開発され
ている。Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+は、電気化学発光法で現在唯
一実用化されている標識分子である。電気化学的方法
で、Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+を励起させ、Ｒｕ(ｂｐｙ)3 2+*を
得る。このＲｕ(ｂｐｙ)3 2+*は、早い系間交差を経てリ
ン光を発する(Ｒｕ(ｂｐｙ)3 2+*→Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2＋ｈ
ν）。この発光量を光電子増倍管等で計測している。
持つ、ルテニウム（II）トリスビピリジル錯体Ｒｕ（ｂ
ｐｙ)3 2+を標識物質に用いた電気化学発光法が開発され
ている。Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+は、電気化学発光法で現在唯
一実用化されている標識分子である。電気化学的方法
で、Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+を励起させ、Ｒｕ(ｂｐｙ)3 2+*を
得る。このＲｕ(ｂｐｙ)3 2+*は、早い系間交差を経てリ
ン光を発する(Ｒｕ(ｂｐｙ)3 2+*→Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2＋ｈ
ν）。この発光量を光電子増倍管等で計測している。
【０００６】また光化学の分野でも、上記電気化学発光
法で用いられるようになった、Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+を光励
起物質に用いた研究が多く行われている。ケミストリー
・レビュー９３（１９９３）光化学特集参照。Ｒｕ（ｂ
ｐｙ)3 2+は、（１）励起効率及び発光効率が高く、かつ
（２）励起状態の平均寿命が０.６ マイクロ秒と長いと
いう利点がある（インオーガニック・アンド・オーガノ
メタリック・フォトケミストリ１６８，１（１９７８）
参照）。
法で用いられるようになった、Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+を光励
起物質に用いた研究が多く行われている。ケミストリー
・レビュー９３（１９９３）光化学特集参照。Ｒｕ（ｂ
ｐｙ)3 2+は、（１）励起効率及び発光効率が高く、かつ
（２）励起状態の平均寿命が０.６ マイクロ秒と長いと
いう利点がある（インオーガニック・アンド・オーガノ
メタリック・フォトケミストリ１６８，１（１９７８）
参照）。
【０００７】この０.６ マイクロ秒は、溶液中の化学反
応のタイムスケール（数ナノセカンド以上）と比較して
十分に長いため、溶液中に含まれる他の化学物質と反応
させることができる。そこでＲｕ（ｂｐｙ)3 2+をＲｕ
(ｂｐｙ)3 2+*に光励起して、Ｒｕ(ｂｐｙ)3 2+*を液相ま
たは固相中でメチルビオロゲン（methylviologen，ＭＶ
2+）と反応させる（Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+*＋ＭＶ2+→Ｒｕ
(ｂｐｙ)3 3+＋ＭＶ+)ことで、光エネルギーを化学エネ
ルギー（電子伝達）に変換させる研究がなされている
（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ
ィー１０２，5119(１９８０)，ジャーナル・オブ・フィ
ジカル・ケミストリ９４，８７４（1990），ジャーナル
・オブ・フィジカル・ケミストリ９６，２８７９（１９
９２)参照)。
応のタイムスケール（数ナノセカンド以上）と比較して
十分に長いため、溶液中に含まれる他の化学物質と反応
させることができる。そこでＲｕ（ｂｐｙ)3 2+をＲｕ
(ｂｐｙ)3 2+*に光励起して、Ｒｕ(ｂｐｙ)3 2+*を液相ま
たは固相中でメチルビオロゲン（methylviologen，ＭＶ
2+）と反応させる（Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+*＋ＭＶ2+→Ｒｕ
(ｂｐｙ)3 3+＋ＭＶ+)ことで、光エネルギーを化学エネ
ルギー（電子伝達）に変換させる研究がなされている
（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ
ィー１０２，5119(１９８０)，ジャーナル・オブ・フィ
ジカル・ケミストリ９４，８７４（1990），ジャーナル
・オブ・フィジカル・ケミストリ９６，２８７９（１９
９２)参照)。
【０００８】更に上記反応の結果生じたＲｕ（ｂｐｙ)3
3+にＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を還元剤とし
て作用させてＲｕ（ｂｐｙ)3 2+に戻すと、光照射を続け
ることでＲｕ(ｂｐｙ)3 2+*＋ＭＶ2+の反応を繰り返し行
うことができる（フォトインデュースト・エレクトロン
・トランスファー・パートＡ・コンセプシャル・ベーシ
ス，アムステルダム エルセビア（Elsevier）社発行
（１９８８）の４０９ページ参照）。
3+にＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を還元剤とし
て作用させてＲｕ（ｂｐｙ)3 2+に戻すと、光照射を続け
ることでＲｕ(ｂｐｙ)3 2+*＋ＭＶ2+の反応を繰り返し行
うことができる（フォトインデュースト・エレクトロン
・トランスファー・パートＡ・コンセプシャル・ベーシ
ス，アムステルダム エルセビア（Elsevier）社発行
（１９８８）の４０９ページ参照）。
【０００９】また、磁性ビーズを用いて、標識物質と測
定対象物質との結合部分と非結合部分とを分離する方法
が、免疫分析法として広く用いられている。この磁性ビ
ーズ法により低濃度の標識物質と測定対象物質との結合
部分を効率良く、非結合部分から分離することができ
る。
定対象物質との結合部分と非結合部分とを分離する方法
が、免疫分析法として広く用いられている。この磁性ビ
ーズ法により低濃度の標識物質と測定対象物質との結合
部分を効率良く、非結合部分から分離することができ
る。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】蛍光法で測定可能な試
料濃度Ｃ1(mol／dm3）は、検出可能な蛍光強度をＦ、蛍
光量子収率をφ、入射光の強さをＩ0 、モル吸光度を
ε、セル長さをｌ、四方に放出される蛍光の総量に対し
て実際に検出器の受光部に入る割合をＫとすると、化１
で表すことができる。
料濃度Ｃ1(mol／dm3）は、検出可能な蛍光強度をＦ、蛍
光量子収率をφ、入射光の強さをＩ0 、モル吸光度を
ε、セル長さをｌ、四方に放出される蛍光の総量に対し
て実際に検出器の受光部に入る割合をＫとすると、化１
で表すことができる。
【００１１】
【化１】 Ｃ1＝Ｆ／（φ・Ｉ0・ε・ｌ・Ｋ） （１） 一般的なＣ1 は、光電子増倍管の検出光量を１００フォ
トン／秒としてＦに代入し、φ＝０.５，Ｉ0＝１ｍＷ
（＝２×１０15フォトン／秒），ε＝１０3 ，ｌ＝１c
m，Ｋ＝０.０１とするとＣ1＝１０-14mol／dm3となる。
化１よりＩ0やＫを増大させることで検出感度を向上す
ることができる。
トン／秒としてＦに代入し、φ＝０.５，Ｉ0＝１ｍＷ
（＝２×１０15フォトン／秒），ε＝１０3 ，ｌ＝１c
m，Ｋ＝０.０１とするとＣ1＝１０-14mol／dm3となる。
化１よりＩ0やＫを増大させることで検出感度を向上す
ることができる。
【００１２】一方、化学発光法で測定可能な試料濃度Ｃ
2(mol／dm3）は、検出可能な化学発光強度をＥ、蛍光量
子収率をφ、分子１個から１個のフォトンを生じると仮
定してＮ0 をアボガドロ数とし、化学発光の総量に対し
て検出器の受光部に入る割合をＫとして化２で表すこと
ができる。
2(mol／dm3）は、検出可能な化学発光強度をＥ、蛍光量
子収率をφ、分子１個から１個のフォトンを生じると仮
定してＮ0 をアボガドロ数とし、化学発光の総量に対し
て検出器の受光部に入る割合をＫとして化２で表すこと
ができる。
【００１３】
【化２】 Ｃ2＝Ｅ／（φ・Ｎ0・Ｋ） （２） 一般的なＣ2 は、光電子増倍管の検出光量を１００フォ
トン／秒としてＥに代入し、φ＝０.０１，Ｋ＝０.０１
とするとＣ2＝１０-18mol／dm3となる。化２より化学発
光法の利点は溶液中に化学発光を誘導する物質を多数加
えておくことで、アボガドロ数を化２中のＮ0 として使
用できる点にあることが分かる。しかし、蛍光法と比較
して一般にφの値が小さい。
トン／秒としてＥに代入し、φ＝０.０１，Ｋ＝０.０１
とするとＣ2＝１０-18mol／dm3となる。化２より化学発
光法の利点は溶液中に化学発光を誘導する物質を多数加
えておくことで、アボガドロ数を化２中のＮ0 として使
用できる点にあることが分かる。しかし、蛍光法と比較
して一般にφの値が小さい。
【００１４】電気化学発光法も基本的には上記化２と同
一の式で定義できる。但し、電気化学発光法では発光の
同期をとることで精度の向上を図れる。しかし従来の電
気化学発光法による測定では、電極を有するという原理
上の制約、並びに電極表面の電位分布を均一に保つとい
う要請により、平板構造の電極が多用されている。その
ため発光量を測定する際の立体角を大きくするために最
適な円筒形状、あるいは球形状の測定セル形状を得るこ
とが難しかった。
一の式で定義できる。但し、電気化学発光法では発光の
同期をとることで精度の向上を図れる。しかし従来の電
気化学発光法による測定では、電極を有するという原理
上の制約、並びに電極表面の電位分布を均一に保つとい
う要請により、平板構造の電極が多用されている。その
ため発光量を測定する際の立体角を大きくするために最
適な円筒形状、あるいは球形状の測定セル形状を得るこ
とが難しかった。
【００１５】またＲｕ（ｂｐｙ)3 2+及びトリプロピルア
ミン等のアミン誘導還元剤を利用した電気化学発光法で
は、トリプロピルアミン濃度を過剰にしておくことで、
バックグランド発光を一定に保つようにしているが、こ
のトリプロピルアミンそのものが発光してしまう。この
トリプロピルアミンは、電気化学発光法では、発光を生
じるための引き金となる物質であり不可欠であるが、バ
ックグランド発光の元となっていた。そして電場を印加
するために溶液サンプルでの熱の発生や、電極表面での
化学反応による構造材の劣化により、測定セルの寿命を
長くすることが困難であった。
ミン等のアミン誘導還元剤を利用した電気化学発光法で
は、トリプロピルアミン濃度を過剰にしておくことで、
バックグランド発光を一定に保つようにしているが、こ
のトリプロピルアミンそのものが発光してしまう。この
トリプロピルアミンは、電気化学発光法では、発光を生
じるための引き金となる物質であり不可欠であるが、バ
ックグランド発光の元となっていた。そして電場を印加
するために溶液サンプルでの熱の発生や、電極表面での
化学反応による構造材の劣化により、測定セルの寿命を
長くすることが困難であった。
【００１６】本発明では、蛍光法，化学発光法及び電気
化学発光と同等或いはそれ以上の測定感度を有する測定
法を開発し、かつ電気化学発光法の持つ上記３つの課題
を解決することで、（１）測定感度の向上、および
（２）測定セルの寿命の延長を行う。また、装置構成を
簡単にすることで、装置の小型化を可能とする。
化学発光と同等或いはそれ以上の測定感度を有する測定
法を開発し、かつ電気化学発光法の持つ上記３つの課題
を解決することで、（１）測定感度の向上、および
（２）測定セルの寿命の延長を行う。また、装置構成を
簡単にすることで、装置の小型化を可能とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本測定方法で測定可能な
試料濃度Ｃ3(mol／dm3）は、吸光光度法等で検出可能な
Ｆｅ2+濃度をＧ、蛍光量子収率をφ、入射光の強さをＩ
0 、入射光の照射時間をτ、モル吸光度をε、セル長さ
をｌ、Ｆｅ3+の中で実際にＲｕ（ｂｐｙ)3 2+と反応する
モル数をＮ（＝ａＮ0 ，但しαは係数、Ｎ0 はアボガド
ロ数）、光励起したＲｕ（ｂｐｙ)3 2+が光放出をしない
でＦｅ3+と反応する確率をβとすると化３で表すことが
できる。
試料濃度Ｃ3(mol／dm3）は、吸光光度法等で検出可能な
Ｆｅ2+濃度をＧ、蛍光量子収率をφ、入射光の強さをＩ
0 、入射光の照射時間をτ、モル吸光度をε、セル長さ
をｌ、Ｆｅ3+の中で実際にＲｕ（ｂｐｙ)3 2+と反応する
モル数をＮ（＝ａＮ0 ，但しαは係数、Ｎ0 はアボガド
ロ数）、光励起したＲｕ（ｂｐｙ)3 2+が光放出をしない
でＦｅ3+と反応する確率をβとすると化３で表すことが
できる。
【００１８】
【化３】 Ｃ3＝Ｇ／（φ・Ｉ0 ・τ・ε・ｌ・Ｎ・β） （３） 吸光光度法を用いた場合のＧは、１ｎmol／ｌ（１０-9m
ol／ｌ）程度である。本手法では、（１）入射光の強さ
Ｉ0 や照射時間τを大きくでき、（２）溶液中のＦｅ3+
の濃度を大きくすることでＮやβを大きくできるので原
理的にＣ3 を小さくすることができる。
ol／ｌ）程度である。本手法では、（１）入射光の強さ
Ｉ0 や照射時間τを大きくでき、（２）溶液中のＦｅ3+
の濃度を大きくすることでＮやβを大きくできるので原
理的にＣ3 を小さくすることができる。
【００１９】前記のＲｕ（ｂｐｙ)3 2+は自然光領域（４
５２ｎｍ）に光吸収極大をもち、光励起によってＲｕ
（ｂｐｙ)3 2+*となる。このＲｕ（ｂｐｙ)3 2+*は化学的
に酸化及び還元の両方とも受けやすい。特に、Ｆｅ3+と
Ｒｕ(ｂｐｙ)3 2+*は以下に示すように拡散律速（反応速
度＝２.７×１０9Ｍ-1ｓ-1）で反応し、Ｆｅ2+となる。
以下に反応の化学式を化４ないし化８に示す。
５２ｎｍ）に光吸収極大をもち、光励起によってＲｕ
（ｂｐｙ)3 2+*となる。このＲｕ（ｂｐｙ)3 2+*は化学的
に酸化及び還元の両方とも受けやすい。特に、Ｆｅ3+と
Ｒｕ(ｂｐｙ)3 2+*は以下に示すように拡散律速（反応速
度＝２.７×１０9Ｍ-1ｓ-1）で反応し、Ｆｅ2+となる。
以下に反応の化学式を化４ないし化８に示す。
【００２０】
【化４】 Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+＋ｈν→Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+* （４）
【００２１】
【化５】 Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+*＋Ｆｅ3+→Ｒｕ（ｂｐｙ)3 3+＋Ｆｅ2+ （５） （ｋ＝２.７×１０9Ｍ-1ｓ-1）
【００２２】
【化６】 Ｒｕ（ｂｐｙ)3 3+＋Ｆｅ2+→Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+＋Ｆｅ3+ （６） （ｋ〜５×１０6Ｍ-1ｓ-1）（化５と比較してほとんど
生じない）
生じない）
【００２３】
【化７】 Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+*＋Ｆｅ2+→Ｒｕ（ｂｐｙ)3 +＋Ｆｅ3+ （７） （ｋ2／ｋ4〜１０5）（化５と比較してほとんど生じな
い）
い）
【００２４】
【化８】 Ｒｕ（ｂｐｙ)3 3+＋Ｒｅｄ→Ｒｅｄ+＋Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+ （８） 上記の反応化８のＲｅｄはトリエタノールアミン，トリ
フェニルアミン，ジメチルアニリン，テトラメチルフェ
ニレンジアミン，ジメトキシベンゼン，トリメトキシベ
ンゼン，ジメトキシナフタレン等の還元剤物質を指す。
なお上記の反応化５と化６の反応速度定数は、ジャーナ
ル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー９
８，６５３６（１９７６）を参照することができる。ま
た化７の反応についてはインオーガニック・アンド・オ
ーガノメタリック・フォトケミストリ１６８，１（１９
７８）を参照することができる。上記の一連の反応化
４，化５，化８を繰り返すことにより、ほぼ不可逆的に
Ｆｅ3+がＦｅ2+へと変化していく。この変化量は、Ｆｅ
2+濃度を１、１０フェナントロリン法，ビピリジル法，
ニトロソＲ塩法等の吸光光度法で求めることにより定量
することができる。またキレート滴定法，ポーラログラ
フィー等を用いて求めることも可能である（日本化学会
編，第４版実験化学講座１５「分析」，丸善（１９９
１）参照）。
フェニルアミン，ジメチルアニリン，テトラメチルフェ
ニレンジアミン，ジメトキシベンゼン，トリメトキシベ
ンゼン，ジメトキシナフタレン等の還元剤物質を指す。
なお上記の反応化５と化６の反応速度定数は、ジャーナ
ル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー９
８，６５３６（１９７６）を参照することができる。ま
た化７の反応についてはインオーガニック・アンド・オ
ーガノメタリック・フォトケミストリ１６８，１（１９
７８）を参照することができる。上記の一連の反応化
４，化５，化８を繰り返すことにより、ほぼ不可逆的に
Ｆｅ3+がＦｅ2+へと変化していく。この変化量は、Ｆｅ
2+濃度を１、１０フェナントロリン法，ビピリジル法，
ニトロソＲ塩法等の吸光光度法で求めることにより定量
することができる。またキレート滴定法，ポーラログラ
フィー等を用いて求めることも可能である（日本化学会
編，第４版実験化学講座１５「分析」，丸善（１９９
１）参照）。
【００２５】一方、前記のＦｅ3+とＲｕ(ｂｐｙ)3 2+*の
反応は、溶液の酸素含有量に大きく影響される。これは
化９によりＲｕ(ｂｐｙ)3 2+*が酸化されてしまうためで
ある。
反応は、溶液の酸素含有量に大きく影響される。これは
化９によりＲｕ(ｂｐｙ)3 2+*が酸化されてしまうためで
ある。
【００２６】
【化９】 Ｒｕ(ｂｐｙ)3 2+*＋Ｏ2→Ｒｕ(ｂｐｙ)3 3+＋Ｏ2 -(ｋ＝３.３×１０9Ｍ-1ｓ-1) （９） この反応速度定数については、Ｃ−Ｔ．リン（Ｌｉｎ）
他のジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソ
サエティー９８，６５３６（１９７６）を参照。しか
し、Ｆｅ3+濃度を予め過剰とすることで酸素の影響を十
分小さくすることが可能である。
他のジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソ
サエティー９８，６５３６（１９７６）を参照。しか
し、Ｆｅ3+濃度を予め過剰とすることで酸素の影響を十
分小さくすることが可能である。
【００２７】なおペルオキソ二硫化イオン(Ｓ2Ｏ8 2-)に
よる酸化反応に対してRu(bpy)3 2+を光触媒として用いた
場合、前記反応化４にしたＲｕ（ｂｐｙ)3 2+の光励起反
応により生じたＲｕ（ｂｐｙ)3 2+*が、以下の化１０の
ようにＳ2Ｏ8 2- に作用する。
よる酸化反応に対してRu(bpy)3 2+を光触媒として用いた
場合、前記反応化４にしたＲｕ（ｂｐｙ)3 2+の光励起反
応により生じたＲｕ（ｂｐｙ)3 2+*が、以下の化１０の
ようにＳ2Ｏ8 2- に作用する。
【００２８】
【化１０】 Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+*＋Ｓ2Ｏ8 2-→ＳＯ2 -＋ＳＯ4 2- （１０） この反応の反応速度は吸収光強度および照射光強度に比
例して早くなることが知られている（ジャーナル・オブ
・ザ・ケミカル・ソサエティー・ダルトン・トランザク
ション３５５(１９８５)参照）。従って、本測定装置に
用いるＦｅ3+との反応化５も照射光強度に比例すると期
待される。
例して早くなることが知られている（ジャーナル・オブ
・ザ・ケミカル・ソサエティー・ダルトン・トランザク
ション３５５(１９８５)参照）。従って、本測定装置に
用いるＦｅ3+との反応化５も照射光強度に比例すると期
待される。
【００２９】本発明では前記課題を解決するために、Ｒ
ｕ（ｂｐｙ)3 2+等の光励起する金属錯体を標識物質とし
て測定対象物質と結合させ、その結合成分と非結合成分
を磁性ビーズ法により分離した後、光照射により測定対
象物質を含むサンプル液中に添加されたＦｅ3+をＦｅ2+
へと変化させる。その結果不可逆的に生じたＦｅ2+を吸
光光度法により定量することでサンプル液中の測定対象
物質の定量を行う。
ｕ（ｂｐｙ)3 2+等の光励起する金属錯体を標識物質とし
て測定対象物質と結合させ、その結合成分と非結合成分
を磁性ビーズ法により分離した後、光照射により測定対
象物質を含むサンプル液中に添加されたＦｅ3+をＦｅ2+
へと変化させる。その結果不可逆的に生じたＦｅ2+を吸
光光度法により定量することでサンプル液中の測定対象
物質の定量を行う。
【００３０】
【発明の実施の形態】図１に本測定で用いる化学反応サ
イクル図を示す。Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+が光励起によりＲｕ
(ｂｐｙ)3 2+*となった後、拡散律速の反応速度でＦｅ3+
と不可逆的に反応しＲｕ(ｂｐｙ)3 3+となる。このＲｕ
(ｂｐｙ)3 3+を還元剤物質で還元することによりＲｕ
（ｂｐｙ)3 2+に戻すことで、上記光励起反応を繰り返し
行う。この化学反応サイクルを反復することによりＦｅ
2+濃度が増大するが、このＦｅ2+濃度を吸光光度法によ
り定量する。
イクル図を示す。Ｒｕ（ｂｐｙ)3 2+が光励起によりＲｕ
(ｂｐｙ)3 2+*となった後、拡散律速の反応速度でＦｅ3+
と不可逆的に反応しＲｕ(ｂｐｙ)3 3+となる。このＲｕ
(ｂｐｙ)3 3+を還元剤物質で還元することによりＲｕ
（ｂｐｙ)3 2+に戻すことで、上記光励起反応を繰り返し
行う。この化学反応サイクルを反復することによりＦｅ
2+濃度が増大するが、このＦｅ2+濃度を吸光光度法によ
り定量する。
【００３１】図２に本測定装置の基本構造図を示す。図
２の１は吸光光度分析用光源、２はレンズ、３はフィル
タ、４はシャッタである。この１から４により、測定セ
ル８に光照射する。図２の５と６は磁気ビーズ捕捉用電
磁石であり、磁気ビーズ法により、Ｂ／Ｆ分離を行う。
また７は光励起用光源であり、金属錯イオンにより標識
したサンプル液が入る測定セル８内で、図１に示したＦ
ｅ3+→Ｆｅ2+の反応を進行させる。１，１０フェナント
ロリン法であれば５１０ナノメートルの波長を光源１と
する。また図２の９はモノクロメータ、１０は光電子増
倍管、１１はコントローラ・Ａ／Ｄコンバータ、１２は
パーソナルコンピュータであり、これらは分析のための
測定回路を構成する。
２の１は吸光光度分析用光源、２はレンズ、３はフィル
タ、４はシャッタである。この１から４により、測定セ
ル８に光照射する。図２の５と６は磁気ビーズ捕捉用電
磁石であり、磁気ビーズ法により、Ｂ／Ｆ分離を行う。
また７は光励起用光源であり、金属錯イオンにより標識
したサンプル液が入る測定セル８内で、図１に示したＦ
ｅ3+→Ｆｅ2+の反応を進行させる。１，１０フェナント
ロリン法であれば５１０ナノメートルの波長を光源１と
する。また図２の９はモノクロメータ、１０は光電子増
倍管、１１はコントローラ・Ａ／Ｄコンバータ、１２は
パーソナルコンピュータであり、これらは分析のための
測定回路を構成する。
【００３２】図３に連続測定する場合の測定手順例を示
す。測定対象物質は本図の垂直手前方向から測定セル８
内に注入され、本図の垂直奥方向から測定セル８外へ排
出される。図３（ａ）では磁気ビーズ捕捉用電磁石と光
励起用光源１５がスイッチオンになっており、測定セル
８内では、Ｆｅ3+→Ｆｅ2+の反応が進行する。この光照
射時間を長くすることで、Ｆｅ2+が蓄積され、測定感度
が向上する。磁気ビーズ１３は壁面に沿って分布するた
め、光励起用光源１５が磁気ビーズ１３を一様に照射す
ることができる。
す。測定対象物質は本図の垂直手前方向から測定セル８
内に注入され、本図の垂直奥方向から測定セル８外へ排
出される。図３（ａ）では磁気ビーズ捕捉用電磁石と光
励起用光源１５がスイッチオンになっており、測定セル
８内では、Ｆｅ3+→Ｆｅ2+の反応が進行する。この光照
射時間を長くすることで、Ｆｅ2+が蓄積され、測定感度
が向上する。磁気ビーズ１３は壁面に沿って分布するた
め、光励起用光源１５が磁気ビーズ１３を一様に照射す
ることができる。
【００３３】図３（ａ）では、吸光分析を行わないので
吸光分析用光源１４はスイッチオフされ、かつモノクロ
メータ９，光電子増倍管１０に至るまでのシャッター１
６も閉じている。
吸光分析用光源１４はスイッチオフされ、かつモノクロ
メータ９，光電子増倍管１０に至るまでのシャッター１
６も閉じている。
【００３４】図３（ｂ）では、同図（ａ）により生じた
Ｆｅ2+イオンを吸光光度法により計測する様子を示して
いる。生じたＦｅ2+イオンは磁性ビーズ１３と結合して
いる標識分子近傍に多く存在するので、磁性ビーズ捕捉
用電磁石１８のスイッチを切り、測定セル８を９０度回
転することにより、吸光光度法用光源１７の光路上にＦ
ｅ2+が分布するようにし、吸光光度法用試薬を加えて、
撹拌等の操作を行った後、吸光光度法用光源１４のスイ
ッチを入れ、Ｆｅ2+の分光を９から１０の検出回路によ
り信号として出力させる。
Ｆｅ2+イオンを吸光光度法により計測する様子を示して
いる。生じたＦｅ2+イオンは磁性ビーズ１３と結合して
いる標識分子近傍に多く存在するので、磁性ビーズ捕捉
用電磁石１８のスイッチを切り、測定セル８を９０度回
転することにより、吸光光度法用光源１７の光路上にＦ
ｅ2+が分布するようにし、吸光光度法用試薬を加えて、
撹拌等の操作を行った後、吸光光度法用光源１４のスイ
ッチを入れ、Ｆｅ2+の分光を９から１０の検出回路によ
り信号として出力させる。
【００３５】図４に連続測定する場合の本測定装置の立
体構造図を示す。本図の手前に吸光光度法用の測定回路
を配置する（本図では省略）。測定セル８の上方向よ
り、金属錯イオンにより標識したサンプル液２１が注入
され、下方向より排出される。なおＤＮＡ等の生体高分
子ではＦｅ2+，Ｆｅ3+イオンによる損傷が生じる可能性
があるので、Ｆｅ3+イオンのサンプル液への添加は光照
射直前に行う等の配慮を行うことが望ましい。
体構造図を示す。本図の手前に吸光光度法用の測定回路
を配置する（本図では省略）。測定セル８の上方向よ
り、金属錯イオンにより標識したサンプル液２１が注入
され、下方向より排出される。なおＤＮＡ等の生体高分
子ではＦｅ2+，Ｆｅ3+イオンによる損傷が生じる可能性
があるので、Ｆｅ3+イオンのサンプル液への添加は光照
射直前に行う等の配慮を行うことが望ましい。
【００３６】本発明の実施の形態の一つは、低濃度のホ
ルモン，薬物、その他の生物学的に有用な物質を正確に
かつ再現性良く測定することである。
ルモン，薬物、その他の生物学的に有用な物質を正確に
かつ再現性良く測定することである。
【００３７】更に、光吸収により励起した金属錯イオン
等の標識物質が基底状態に戻る際の発光を速やかに酸化
消光することにより、電気エネルギーを化学エネルギー
に変換し、溶液中に予め含まれていた金属イオン等を変
化させ、その金属イオン濃度変化を吸光光度法、或いは
キレート滴定法，ポーラログラフィー等により測定する
ことで金属錯イオンで標識した測定対象物質濃度を測定
する方法は、その対象を問わず本発明に含まれる。この
標識物が本発明に従ういずれかの実施例中で使用された
場合には、他の分子、例えば、分析対象物及びその類似
物、上に述べた結合相手と結合することのできる反応性
成分、にリンクされることも本発明の範囲に含まれる。
等の標識物質が基底状態に戻る際の発光を速やかに酸化
消光することにより、電気エネルギーを化学エネルギー
に変換し、溶液中に予め含まれていた金属イオン等を変
化させ、その金属イオン濃度変化を吸光光度法、或いは
キレート滴定法，ポーラログラフィー等により測定する
ことで金属錯イオンで標識した測定対象物質濃度を測定
する方法は、その対象を問わず本発明に含まれる。この
標識物が本発明に従ういずれかの実施例中で使用された
場合には、他の分子、例えば、分析対象物及びその類似
物、上に述べた結合相手と結合することのできる反応性
成分、にリンクされることも本発明の範囲に含まれる。
【００３８】本発明の実施例としては光励起用光源が可
視光であることは有利な特長となるが、これが赤外光や
紫外光，Ｘ線，マイクロ波等の可視光以外の電磁波であ
っても本発明に含まれる。
視光であることは有利な特長となるが、これが赤外光や
紫外光，Ｘ線，マイクロ波等の可視光以外の電磁波であ
っても本発明に含まれる。
【００３９】
【発明の効果】本発明の効果は、図１に示した反応サイ
クルを複数回反復させることにより、微量の標識物質を
高感度かつ再現性良く定量することが可能となる点であ
る。本発明では酵素・免疫分析に取り入れられている磁
気ビーズ法によるＢ／Ｆ分離と、分光光度法とを組み合
わせることで、生体試料中のホルモン，腫瘍マーカー，
血中薬物，血中酵素，サイトカイン等の微量生体物質を
再現性良く測定することができる。
クルを複数回反復させることにより、微量の標識物質を
高感度かつ再現性良く定量することが可能となる点であ
る。本発明では酵素・免疫分析に取り入れられている磁
気ビーズ法によるＢ／Ｆ分離と、分光光度法とを組み合
わせることで、生体試料中のホルモン，腫瘍マーカー，
血中薬物，血中酵素，サイトカイン等の微量生体物質を
再現性良く測定することができる。
【図１】本発明の測定で用いる化学反応サイクルの説明
図。
図。
【図２】本発明の一実施例の測定装置の基本構造を示す
ブロック図。
ブロック図。
【図３】本発明の一実施例の連続測定方式の場合の測定
手順の説明図。
手順の説明図。
【図４】本発明の一実施例の連続測定の場合の測定装置
の要部斜視図。
の要部斜視図。
１…吸光光度分析用光源、２…レンズ、３…シャッタ
ー、４…フィルタ、５…磁性ビーズ捕捉用電磁石（縦方
向から図示）、６…磁性ビーズ捕捉用電磁石（横方向か
ら図示）、７…光励起用光源、８…測定セル、９…モノ
クロメータ、１０…光電子増倍管、１１…コントローラ
・Ａ／Ｄコンバータ、１２…パーソナルコンピュータ、
１３…磁性ビーズ、１４…吸光光度分析用光源、１５…
光励起用光源及び、磁性ビーズ捕捉用電磁石、１６…シ
ャッター、２０…Ｆｅ2+の呈色光、２１…測定対象サン
プル液。
ー、４…フィルタ、５…磁性ビーズ捕捉用電磁石（縦方
向から図示）、６…磁性ビーズ捕捉用電磁石（横方向か
ら図示）、７…光励起用光源、８…測定セル、９…モノ
クロメータ、１０…光電子増倍管、１１…コントローラ
・Ａ／Ｄコンバータ、１２…パーソナルコンピュータ、
１３…磁性ビーズ、１４…吸光光度分析用光源、１５…
光励起用光源及び、磁性ビーズ捕捉用電磁石、１６…シ
ャッター、２０…Ｆｅ2+の呈色光、２１…測定対象サン
プル液。
Claims (5)
- 【請求項１】少なくとも１個の光源，光励起する金属錯
体，前記金属錯体を酸化する酸化剤、及び前記金属錯体
を還元する還元剤を備え、金属錯体，金属錯体を酸化す
る酸化剤及び金属錯体を還元する還元剤の混合体に上記
光源から光を照射し、光励起した金属錯体と酸化剤と
の、酸化還元反応を定量する手段を設けたことを特徴と
する免疫分析装置。 - 【請求項２】請求項１の光励起する金属錯体には、トリ
ス２，２′−ビピリジル−ルテニウム（II）錯体（Ｒｕ
（ｂｐｙ)3 2+）またはＲｕ，Ｏｓ，Ｅｕ等の錯体を用
い、前記金属錯体を酸化する酸化剤にはＦｅ3+等の金属
イオンを、前記金属錯体を還元する還元剤にはトリエタ
ノールアミン，トリフェニルアミン，ジメチルアニリ
ン，テトラメチルフェニレンジアミン，ジメトキシベン
ゼン，トリメトキシベンゼン，ジメトキシナフタレン等
の還元剤を用いる免疫分析装置。 - 【請求項３】請求項１の光励起する金属錯体に抗原認識
能力を有する分子を結合し、請求項２の酸化剤の濃度変
化を測定することにより、抗原物質の濃度測定を行う免
疫分析装置。 - 【請求項４】免疫分析におけるサンドイッチ法と磁気ビ
ーズ法等の固相法を用いて、抗原物質の濃度測定を行う
請求項３の免疫分析装置。 - 【請求項５】請求項１に記載の酸化還元反応を定量する
手段は、溶液中に予め含まれていたＦｅ3+等のｎ価イオ
ンをＦｅ2+等の（ｎ−１）価イオンに還元させる結果生
じるＦｅ2+等の（ｎ−１）価イオン濃度を吸光光度法ま
たは原子吸光法により測定する手段であることを特徴と
する免疫分析装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05587497A JP3881415B2 (ja) | 1997-03-11 | 1997-03-11 | 免疫分析装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05587497A JP3881415B2 (ja) | 1997-03-11 | 1997-03-11 | 免疫分析装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10253633A true JPH10253633A (ja) | 1998-09-25 |
| JP3881415B2 JP3881415B2 (ja) | 2007-02-14 |
Family
ID=13011250
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05587497A Expired - Fee Related JP3881415B2 (ja) | 1997-03-11 | 1997-03-11 | 免疫分析装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3881415B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7550273B2 (en) | 2001-12-28 | 2009-06-23 | Arkray, Inc. | Colorimetric method and reagent used for the same |
-
1997
- 1997-03-11 JP JP05587497A patent/JP3881415B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7550273B2 (en) | 2001-12-28 | 2009-06-23 | Arkray, Inc. | Colorimetric method and reagent used for the same |
| US8574896B2 (en) | 2001-12-28 | 2013-11-05 | Arkray, Inc. | Colorimetric method and reagent used for the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3881415B2 (ja) | 2007-02-14 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040302 |
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|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20060621 |
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