JPH10262645A - α−アミラーゼ酵素活性測定用酵素センサー及びα−アミラーゼ酵素活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は酵素センサー、特に、血液等の生体液
中のα−アミラーゼ酵素の活性を測定するための酵素セ
ンサー及びこれを使用して生体液中のα−アミラーゼ酵
素の活性を測定する方法に関する。 【解決手段】本発明の生体液のα−アミラーゼ酵素活性
測定用酵素センサーは、過酸化水素電極上に固定化グル
コースオキシダーゼ酵素膜、第１の制限膜、固定化α−
グルコシダーゼ酵素膜及び第２の制限膜を順次、積層し
てなる電極構成体からなることを特徴とするものであ
る。また、本発明の生体液のα−アミラーゼ酵素活性の
測定方法は、上記した酵素センサーを使用して、生体試
料とデンプン又はデンプン構成成分との反応により生成
するマルトース及びそのオリゴ糖の生成量を電流変化と
して検出することによりα−アミラーゼ酵素活性を測定
することを特徴とするものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は酵素センサー、特
に、血液等の生体液中のα−アミラーゼ酵素の活性を測
定するための酵素センサー及びこれを使用して生体液中
のα−アミラーゼ酵素の活性を測定する方法に関する。
特に本発明は、過酸化水素電極と特定の固定化酵素膜と
を組合せた電極構成体からなる生体液中のα−アミラー
ゼ酵素活性測定用の酵素センサー及びこれを使用するα
−アミラーゼ酵素活性の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び解決すべき課題】α−アミラーゼは、
周知の通り、消化酵素の１種であるが、このα−アミラ
ーゼ酵素の活性の定量的測定は医療の分野では膵臓の疾
患の診断及び治療における重要な検査項目の一つとなっ
ており、特に、急性膵炎の診断に欠くことのできないも
のである。

【０００３】α−アミラーゼ酵素の活性の測定法として
は、アミロクラスチック法、サッカロゲニック法、クロ
モゲニック法、共役酵素法、電極法等が知られている
が、アミロクラスチック法、サッカロゲニック法、クロ
モゲニック法は反応時間が長いこと、選択性が不十分で
あること、操作が煩雑であること等の欠点を有する。共
役酵素法はマルトオリゴ糖又はその誘導体を基質として
おり、デンプンに比べて基質の構造が明確であり、カイ
ネテイック定量が可能であり、自動分析装置への適応が
容易であるが、比色測定法による測定であるため、光学
的な測定系を必要としており、測定操作が繁雑であるか
又は高価な測定機を必要とする。一方、電極法は固定化
酵素膜又は固定化酵素カラムと電極、例えば過酸化水素
電極とを組合せた酵素センサーを使用するα−アミラー
ゼ酵素等の活性の測定方法であり、この方法は酵素の有
する基質特異性、電気化学的分析の迅速性、簡便性等を
利用しているため、医療の分野でα−アミラーゼの活性
を測定するのに非常に適した方法である。更に、全血を
血清、血漿に分離する操作を必要とせずに直接測定する
こともできる。

【０００４】酵素センサーとこれを使用する酵素、例え
ば、α−アミラーゼの活性の測定法は、例えば、「蛋白
質 核酸 酵素」、第30巻、第４号（昭和60年発行）、
第20頁〜第32頁に記載されている。

【０００５】上記文献の記載から明らかな通り、アミラ
ーゼ酵素等の活性を測定するための酵素センサーは白金
陽極と銀陰極とからなる過酸化水素電極と、固定化酵素
膜、例えばグルコースオキシダーゼを固定化した高分子
膜とから構成されている。この酵素センサーを使用して
α−アミラーゼの活性を測定するにあたっては、反応セ
ル内にpH7.0のリン酸塩緩衝液を充填し、過酸化水素電
極表面に固定化酵素膜を密着させ、白金陽極には銀/塩
化銀陰極に対して、例えば+0.6Vの電圧を印加する。生
体液中のα−アミラーゼの作用を特異的に受けるソジウ
ムスターチグリコレート(SSG)と分解補助酵素としての
グルコアミラーゼ(GA)を試薬として使用してα−アミラ
ーゼの活性を測定した場合、SSGはα−アミラーゼとGA
の作用により単糖のグルコースに加水分解される。生成
したグルコースを固定化グルコースオキシダーゼ酵素膜
−過酸化水素電極で検出する。即ち、反応電流はグルコ
ースの生成量に比例するので、この反応電流を測定する
ことにより、この電流値からα−アミラーゼ活性値を算
出し得る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記したご
とき形式の酵素センサーについて、種々、検討した結
果、過酸化水素電極上に特定の４種の膜を積層すること
により、α−アミラーゼの酵素活性の測定結果を信頼性
の高いものにし得ることを知見して、本発明を完成した
ものである。

【０００７】従って、本発明によれば、過酸化水素電極
上に固定化グルコースオキシダーゼ酵素膜、第１の制限
膜、固定化α−グルコシダーゼ酵素膜及び第２の制限膜
を順次、積層してなる電極構成体からなることを特徴と
する、生体液のα−アミラーゼ酵素活性測定用酵素セン
サーが提供される。

【０００８】本発明によれば、更に、上記酵素センサー
を使用して、生体試料とデンプン又はデンプン構成成分
との反応により生成するマルトース及びそのオリゴ糖の
生成量を電流変化として検出することによりα−アミラ
ーゼ酵素活性を測定することを特徴とする、生体液のα
−アミラーゼ酵素活性の測定方法が提供される。

【０００９】上記したごとき本発明の方法は、特に、血
液、尿のごとき生体液試料のα−アミラーゼ酵素活性を
測定するのに使用される。

【００１０】本発明の酵素センサーの特徴は、過酸化水
素電極上に固定化グルコースオキシダーゼ酵素膜の他
に、第２の固定化酵素膜として、固定化α−グルコシダ
ーゼ酵素膜を設けたことにある。

【００１１】α−アミラーゼ酵素活性の測定において、
従来、補助分解酵素として使用されているグルコアミラ
ーゼはアミラーゼ反応時に基質に対しても応答するのに
対し、本発明の酵素センサーの第２の固定化酵素膜であ
る固定化α−グルコシダーゼ酵素膜中のα−グルコシダ
ーゼはアミラーゼ反応時に基質に対して応答することが
ない。更に、固定化膜は試料中に最初から存在するグル
コースの透過を制限する。従って、本発明の酵素センサ
ーにおいては、信頼性の高い測定結果が得られる。

【００１２】以下においては、図面を参照しながら本発
明の酵素センサー及びこれを使用するアミラーゼ酵素活
性の測定法をより詳細に説明する。

【００１３】図１は、本発明の酵素センサー８の構成を
示すものである。即ち、図１において、ガラス又はエポ
キシ樹脂１で固定した白金アノード３の表面に４枚の膜
がO-リングのごとき固定部材で固定されている。この４
枚の膜は、固定化グルコースオキシダーゼ酵素膜４、第
１の制限膜a ５、固定化α−グルコシダーゼ酵素膜６及
び第２の制限膜b ７からなる。２は銅ワイヤーリード線
である。

【００１４】本発明の酵素センサー８において上記制限
膜a及びbを、それぞれ、固定化グルコースオキシダーゼ
酵素膜４と固定化α−グルコシダーゼ酵素膜６との間及
び固定化α−グルコシダーゼ酵素膜６の表面に積層する
理由は、生体液試料中に存在するグルコースの拡散を制
限し、グルコース測定における測定範囲を広くすること
及び酵素固定化膜の電極表面への固定を行いまた生体試
料成分からの汚れに対して保護することにある。

【００１５】上記したごとき構成を有する酵素センサー
８を使用して、図２に示すごとくAg/AgCl参照電極13と
共にバイオセンサー15を構成する。図２に示すバイオセ
ンサー15中の酵素センサー８の白金アノード３にはAg/A
gCl参照電極13に対して常に+0.45〜+0.70Vの範囲の一定
電圧を印加する。また、電極ブロック10内には中性(pH
7.0)のリン酸塩緩衝液11を充填し、酵素センサー８と参
照電極13には電解質溶液により電流を導通させる。12は
参照電極用銅ワイヤーリード線であり、14は検体試料の
流路である。

【００１６】本発明の酵素センサー８の上記２種の固定
化酵素膜は公知の酵素センサーで使用されている固定化
酵素膜と同様、多孔性高分子担体膜と前記したごとき特
定の酵素とから構成される。多孔性高分子担体として
は、塩化ビニル樹脂、ポリビニルアルコール、アセチル
セルロース、ポリカーボネート樹脂、ナイロン、ポリプ
ロピレン、ポリエチレン、テフロン等の高分子材料を使
用することができる。制限膜a及びbとしては、グルコー
スの拡散を制限できる材料、生体試料成分からの汚れに
対する保護を行うことのできる材料又は酵素膜を固定保
持できる機械的強度を有する材料からなるものであれば
いかなるものでも使用できるが、かかる材料としては例
えばポリカーボネート、セルロース混合エステル、ポリ
テトラフルオロエチレン、ガラス繊維等を挙げることが
できる。

【００１７】上記したごときバイオセンサー15を使用し
て生体試料のアミラーゼ活性を測定する場合の系統図を
図３に示す。

【００１８】アミラーゼ活性を測定するにあたっては、
まず、定量シリンジ18とこれに連結しているノズルで検
体試料20を吸引し、また、定量シリンジ17で基質（例え
ば水溶性デンプン）19を吸引する。ついで、両液を一定
の速度で混合ジョイント部16に供給して完全に混合す
る。ついで、液送用ローラーポンプ25により、バイオセ
ンサー15の流路14に通液し、ここで、α−アミラーゼ酵
素活性の測定を行う。なお、図３において符号21〜24
は、それぞれ、電流−電圧転換器、A/Dコンバーター、
コンピューター及びプリンターであり、26は廃液タンク
である。

【００１９】上記の測定は下記の原理に従って行われ
る。まず、検体試料中のα−アミラーゼと、添加した水
溶性デンプンの作用により次の反応(1)が進行する： α-アミラーゼ 水溶性デンプン ――→ グルコース＋マルトース＋マルトオリゴ糖 (1) ここで生成したマルトース及びオリゴ糖(n=3〜6)は制限
膜b ７を通過して、加水分解酵素のα−グルコシダーゼ
が固定された酵素膜６中に拡散し、この酵素の作用によ
り下記の反応(2) が進行する： α-グルコシダーゼ マルトース,マルトオリゴ糖 ―――――→ グルコース (2)

【００２０】反応(1)及び(2)で生成したグルコースは、
更に、α−グルコシダーゼ固定膜６と制限膜a ５とを通
過して、固定化グルコースオキシダーゼ酵素膜４に到達
し、ここで下記の酸化反応(3)が行われる： グルコースオキシダーゼ グルコース + O₂ + H₂O ―――――→ グルコン酸 ＋ H₂O₂ (3) かくしてグルコースの酸化で生成した過酸化水素は白金
電極３の表面で酸化され、下記の反応(4) に従って、測
定回路に電流が発生する： 印加電圧(+0.45〜0.70V) H₂O₂ ――――――――――→ 2H⁺ + O₂ + 2e^- (4)

【００２１】上記式(1)〜(4)の反応によって流れる電流
は、適当な条件下では、検体試料のアミラーゼ活性と比
例する。従って、上記の操作時に流れる電流を測定し、
これを予め作成しておいた検量線によりアミラーゼ活性
に換算することにより、試料のアミラーゼ活性を定量す
ることができる。

【００２２】上記したごときバイオセンサー15及びこれ
を含む装置系（図３）を使用して測定用試料中のアミラ
ーゼ活性を定量する方法を下記の実施例に示す。

【００２３】

【実施例】実施例 基質溶液として１％の水溶性デンプンを含有するリン酸
塩緩衝溶液(0.2M,pH7.0)を使用した。定量シリンジ17と
18により、それぞれ、基質溶液700μlと測定サンプル
（アミラーゼ水溶液）100μlを吸引し、混合ジョイント
16を通過させて完全に混合した。ついで、混合溶液を液
送用ローラーポンプ25で吸引して、センサー15の流路14
に導入した。試料は８倍に稀釈してから測定したことに
なる。アミラーゼ活性は、一定時間の出力電流量の変化
に基づく応答曲線より算出するため、ローラーポンプ25
の吸引速度をそれに合わせて設定し、液を流しながらセ
ンサーの出力電流を計測した。上記の測定を行うに当た
っては、過酸化水素電極に0.6Vの電圧を印加した。測定
結果を図４及び図５に示す。

【００２４】図４において、横軸はセンサー15における
測定時間（分）であり、左側の縦軸は出力電流(nA)の測
定値である。図４中に示されているグルコース濃度(mM)
は測定溶液中のグルコースの濃度であり、また、右の縦
軸に示されている数値(IU/l)は単位体積中のアミラーゼ
活性値である。

【００２５】前記した測定原理から明らかな通り、セン
サーの最終検出物質はグルコースであるため、試料中に
共存するグルコースの影響が存在する。図４において
は、応答電流は検体試料のグルコース濃度に比例し、こ
れは共存するグルコースの応答を示している。即ち、グ
ルコース濃度８mMと16mMとでは、その応答電流はほぼ２
倍である。グルコース濃度を一定にして（例えば８mMの
場合）、アミラーゼ活性を変えた場合、対応する応答曲
線のスロープ（２〜３分）は比例的に変化する。このス
ロープ（△nA/分）をアミラーゼ活性（IU/l)に対してプ
ロットした結果は図５に示す通りであり、広範囲の直線
性が得られた。更に、図４にはグルコース濃度を変えた
場合（例えば０〜16mM)のアミラーゼ応答曲線も示され
ているが、そのスロープに変化はない。

【００２６】前記の装置系を使用して、アスコルビン
酸、尿酸、アルブミン、ビリルビン、ヘモグロビン、溶
血、シュウ酸塩、クエン酸、EDTA及びヘパリン酸のごと
き共存物質がアミラーゼの活性測定に与える影響につい
て測定した結果が図６〜図１５に示されている。アミラ
ーゼの活性測定は260UI/lのアミラーゼ水溶液に上記の
共存物質をそれぞれの図の横軸に示す量を添加して行っ
た。ビリルビンの濃度が30mg/dl以上の場合及びEDTAが
存在する場合以外、これらの共存物質の存在によりアミ
ラーゼの活性測定に影響は認められなかった。

【００２７】検体試料として血清及び尿を使用して測定
した場合に得られた結果が表１に示されている。表１に
示す結果は、これらの検体についての同時再現性の結果
である。尿及び血清のサンプル１及び２は、異なる提供
者から採取した試料である。なお、表１中のnは測定回
数であり、SDは標準偏差であり、CV％は変動係数であ
る。

【００２８】

【００２９】図16及び図17は、それぞれ、尿及び血清検
体について本発明の方法による測定と従来法（分光光度
法）による測定を行った場合の本発明の方法と従来法と
の相関を示すものである。図中、Y＝aX + bは相関の回
帰式であり、Ｒは相関係数であり、nは測定サンプル数
である。

【００３０】これらの結果から本発明の方法は臨床上必
要でかつ十分な同時再現性を有しており更に従来法との
相関も良好であることが認められる。

【００３１】以下に示す比較例は、本発明の酵素センサ
ーとこれを使用したアミラーゼ酵素活性の測定法の効果
を明らかにするためのものである。

【００３２】比較例１ 本発明による酵素センサー中の固定化α−グルコシダー
ゼ酵素膜の代わりに、固定化グルコアミラーゼ酵素膜を
積層した酵素センサー使用して前記実施例と同様の操作
を行ってアミラーゼ酵素活性の測定を行った。アミラー
ゼ酵素活性の測定はリン酸塩緩衝液(0.2モル/l,pH7.0）
に基質溶液（１％水溶性デンプン溶液）とアミラーゼ溶
液（100IU/l)を３分間隔で添加して、経時的な電流応答
を記録することにより行った。

【００３３】固定化グルコアミラーゼ酵素膜を積層した
酵素センサー（比較例１）を使用した場合の測定結果は
図18に示されている。固定化α−グルコシダーゼ酵素膜
を積層した酵素センサー（本発明）を使用した場合の測
定結果は、図19に示されている。図18及び19における記
号S及びAは、それぞれ、リン酸塩緩衝液に水溶性デンプ
ン溶液及びアミラーゼ溶液を添加したことを示す。

【００３４】グルコアミラーゼ酵素膜を使用した場合
に、基質である水溶性デンプンの添加により電流の増加
が確認された。これはデンプンがグルコアミラーゼによ
り水解されたためと考えられる。即ち、グルコアミラー
ゼによる水解反応はアミラーゼの水解反応との競争反応
になり、グルコアミラーゼによる水解反応により生成し
た電流の増加は、アミラーゼ活性の測定の誤差になると
考えられる。

【００３５】比較例２ 固定化グルコースオキシダーゼ酵素膜と固定化α−グル
コシダーゼ酵素膜とを積層した本発明の酵素センサーを
使用する代わりに、酸化還元酵素であるグルコースオキ
シダーゼと水解酵素であるα−グルコシダーゼとを固定
化した一枚の酵素膜を積層した酵素センサーを使用して
前記実施例と同様の操作を行ってアミラーゼ酵素活性の
測定を行った。アミラーゼ酵素活性の測定はグルコース
(0〜5ミリモル/l）とアミラーゼ(200IU/l）の混合溶液
に対する電流応答を測定することにより行った。固定化
グルコースオキシダーゼ酵素膜と固定化α−グルコシダ
ーゼ酵素膜とを積層した酵素センサーを使用した場合の
結果は、図20に示されており、グルコースオキシダーゼ
とα−グルコシダーゼとを固定化した一枚の酵素膜を積
層した酵素センサーを使用した場合の結果は図21に示さ
れている。

【００３６】本発明による酵素センサーを使用した場合
には、図20から明らかな通り、共存グルコース濃度が0
〜5ミリモル/lの範囲でアミラーゼ応答(200IU/l）に影
響しなかったのに対し、グルコースオキシダーゼとα−
グルコシダーゼとを固定化した一枚の酵素膜を積層した
酵素センサーを使用した場合（比較例２）の場合には、
図21から明らかな通り、グルコース濃度が2ミリモル/l
以上のとき、アミラーゼの応答出力が低下することが認
められた。これは２種の酵素を一枚の膜に固定した場
合、電極のグルコース濃度に対する出力電流値の直線性
範囲が狭いことを表す。

【００３７】

【発明の効果】上記したごとく、過酸化水素電極上に固
定化グルコースオキシダーゼ酵素膜、第１の制限膜、固
定化α−グルコシダーゼ酵素膜及び第２の制限膜を順
次、積層してなる電極構成体からなる本発明による生体
液のα−アミラーゼ酵素活性測定用酵素センサーは、ア
ミラーゼ酵素活性の測定を迅速にかつ容易に行うことを
可能にし、従って、かかる本発明のα−アミラーゼ酵素
活性測定用酵素センサーを使用する方法は医療の分野で
アミラーゼ酵素活性を測定するのに非常に適した方法で
ある。また、生体試料とデンプン又はデンプン構成成分
の反応により生成するマルトース及びそのオリゴ糖の生
成量を電流変化として検出するため、反応試薬を容易に
かつ廉価に入手することができ、従って、測定を簡便に
かつ低コストで実施できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の酵素センサーの略図である。

【図２】図２は、酵素センサー、参照電極、電極流路を
含むバイオセンサーの略図である。

【図３】図３はアミラーゼ活性測定の系統図である。

【図４】図４は図２のバイオセンサーを使用したα−ア
ミラーゼ酵素活性の測定結果であり、グルコースが共存
する場合の応答曲線である。

【図５】図５は図２のバイオセンサーを使用したα−ア
ミラーゼ酵素活性の測定結果であり、図４からプロット
したα−アミラーゼの検量線である。

【図６】図６は共存物質としてアスコルビン酸が存在す
る場合の影響を示すグラフである。

【図７】図７は共存物質として尿酸が存在する場合の影
響を示すグラフである。

【図８】図８は共存物質としてアルブミンが存在する場
合の影響を示すグラフである。

【図９】図９は共存物質としてビリルビンが存在する場
合の影響を示すグラフである。

【図１０】図１０は共存物質としてヘモグロビンが存在
する場合の影響を示すグラフである。

【図１１】図１１は共存物質として溶血が存在する場合
の影響を示すグラフである。

【図１２】図１２は共存物質として、シュウ酸塩が存在
する場合の影響を示すグラフである。

【図１３】図１３は共存物質としてクエン酸が存在する
場合の影響を示すグラフである。

【図１４】図１４は共存物質としてEDTAが存在する場合
の影響を示すグラフである。

【図１５】図１５は、共存物質としてヘパリン酸が存在
する場合の影響を示すグラフである。

【図１６】図１６は尿検体での本発明の方法と従来法と
の相関を示すグラフである。

【図１７】図１７は血清検体での本発明の方法と従来法
との相関を示すグラフである。

【図１８】図１８は、固定化グルコースオキシダーゼ酵
素膜と固定化α−グルコアミラーゼ酵素膜とを積層した
酵素センサーの基質及びアミラーゼに対する応答曲線で
ある。

【図１９】図１８は、固定化グルコースオキシダーゼ酵
素膜と固定化α−グルコシダーゼ酵素膜とを積層した本
発明の酵素センサーの基質及びアミラーゼに対する応答
曲線である。

【図２０】図２０は固定化グルコースオキシダーゼ酵素
膜と固定化α−グルコシダーゼ酵素膜とを積層した本発
明の酵素センサーの、グルコース−アミラーゼ混合溶液
に対する応答曲線である。

【図２１】図２１はグルコースオキシダーゼとα−グル
コシダーゼとを固定化した一枚の酵素膜を積層した酵素
センサーのグルコース−アミラーゼ混合溶液に対する応
答曲線である。

【符号の説明】

１．白金電極固定用樹脂；２．及び12．銅ワイヤーリー
ド線；３．白金電極；４．固定化グルコースオキシダー
ゼ酵素膜；５、７．制限膜a及び制限膜b;６．α−グル
コシダーゼ酵素膜；９．参照電極固定用樹脂；10．セン
サーブロック；11．リン酸塩緩衝液；13．Ag/AgCl参照
電極；14．試料検体流路；15．センサー；16．混合ジョ
イント部；17及び18．定量シリンジ；19．基質溶液；2
0．検体試料溶液；21．電流−電圧転換器；22．A/Dコン
バーター；23．コンピューター；24．プリンター；25．
液送用ローラーポンプ；26．廃液タンク

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 過酸化水素電極上に固定化グルコースオ
   キシダーゼ酵素膜、第１の制限膜、固定化α−グルコシ
   ダーゼ酵素膜及び第２の制限膜を順次、積層してなる電
   極構成体からなることを特徴とする、生体液のα−アミ
   ラーゼ酵素活性測定用酵素センサー。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の酵素センサーを使用し
   て、生体試料とデンプン又はデンプン構成成分との反応
   により生成するマルトース及びそのオリゴ糖の生成量を
   電流変化として検出することによりα−アミラーゼ酵素
   活性を測定することを特徴とする、生体液のα−アミラ
   ーゼ酵素活性の測定方法。