JPH10262651A - シアン化合物分解菌 - Google Patents

シアン化合物分解菌

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JPH10262651A
JPH10262651A JP9078620A JP7862097A JPH10262651A JP H10262651 A JPH10262651 A JP H10262651A JP 9078620 A JP9078620 A JP 9078620A JP 7862097 A JP7862097 A JP 7862097A JP H10262651 A JPH10262651 A JP H10262651A
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英司 簗瀬
Yoshiyuki Sato
義幸 佐藤
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 シアン化合物に対して分解活性を有する
新菌株フザリウム オキシスポルム(Fusarium oxyspor
um) N-10株、及び該菌株を用いたシアン化合物の処理方
法。 【効果】 シアン錯体等のシアン化合物の微生物による
効率的な分解除去が可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、フザリウム属に属
する糸状菌で、シアン化合物、特にニッケルシアン錯体
に対して顕著な分解活性を有する、新規な微生物及びそ
の用途に関する。
【0002】
【従来の技術】近年、シアンをはじめカドミウム、鉛等
の重金属による土壌・水質汚染が問題となっている。従
来から、このような土壌・水質汚染を微生物により分解
除去しようとするバイオレメディエーションの多数の試
みがなされている。しかしながら、シアン化合物は土壌
および水中で金属イオンと安定なシアン錯体を形成して
存在していることが多く、かかるシアン錯体を効率的に
分解できる微生物は未だ見出されていない。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、シア
ン化合物、とりわけシアン錯体に対して顕著な分解活性
を有する微生物を提供することにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、シアン錯体を分解できる微生物を日本各
地の土壌を対象としてスクリーニングした結果、ニッケ
ルシアン錯体をはじめ、遊離シアン、ニトリル類を含む
シアン化合物に優れた分解性を発揮する新規糸状菌、フ
ザリウム オキシスポルム N-10 株を分離することに成
功し、本発明を完成した。
【0005】即ち、本発明は、シアン化合物に対して分
解活性を有する新菌株フザリウムオキシスポルムN-10株
である。また、本発明は、上記の菌株を用いてシアン化
合物を分解することを特徴とするシアン化合物の処理方
法である。本発明者らは、シアン化合物に対して分解活
性を有する新菌株フザリウム オキシスポルム N-10株
を次のようにして分離した。
【0006】まず、日本各地の土壌100 点を試料対象と
し、0.5mM のニッケルシアン錯体を窒素源とし、0.25%
のグルコースを炭素源とした合成無機培地(表1)を用
い、その5ml を含むガラス試験管に土壌試料を懸濁して
綿栓を施し、30℃で振盪培養を行った。約5日間の培養
後、その一部を同組成の培養液に植菌してさらに5日間
培養を行った。このような集積培養を5回程度繰り返し
た後、平板培地上でコロニーを形成させ、コロニーより
目的とする菌を純粋単離した。
【0007】単離した菌のニッケルシアン錯体の分解活
性は、培養終了物中に残存する同錯体濃度を測定し、比
較した。この分解率の比較により、最も分解率の高いフ
ザリウム オキシスポルム N-10 株を選出した。
【0008】
【表1】金属シアン錯体分解菌の分離用培地テトラシアノニッケルカリウム (ニッケルシアン 錯体) 0.5 mM グルコース 0.25% Na2HPO4 0.35% KH2PO4 0.15% MgSO4 ・7H2O 0.001% FeCl3 ・6H2O 0.001% ビタミン混液 0.1 %pH 7.2 フザリウム オキシスポルム N-10 株の菌学的性質は以
下の通りである。 〔1〕 培養的・形態的性質 (1) 生育速度(ポテトデキストロース寒天平板培地, 2
5℃, 4 日間) : コロニーの直径 44 〜46 mm (2) 集落表面の色調(ポテトデキストロース寒天平板
培地):白色〜赤色がかった白色 (3) 集落裏面の色調(ポテトデキストロース寒天平板
培地):赤色がかった灰色 集落裏面の色調(カーネーションリーフ寒天平板培
地):オレンジがかった白色〜白色 以下、(4) 〜(9) はカーネーションリーフ寒天平板培地
上での性状を示す。
【0009】(4) 集落裏面の形状、組織:集落形状は
円形、表面は羊毛状、束状、周囲は全縁 (5) スポロドキア : 形成する (6) 分生子形成細胞 : アンプル形のフィアライド 10
〜32×2 〜3 μm (7) 大型分生子 : 湾曲した流線形, 隔壁3〜5個,2
1〜35×3 〜4 μm (8) 小型分生子 : 豊富に形成, 楕円形〜円筒形, 直
線状, 湾曲, 隔壁0〜1個,集塊状に形成,6〜12×2
〜4 μm (9) 厚膜胞子 : 形成する(頂生、間生) 分生子形成細胞、および分生子の顕微鏡観察結果を図1
に示す。 〔2〕 生理学的性質 (1) 最適生育条件 温度20〜30℃ pH6.5〜7.5 (2) 生育の範囲 温度15〜35℃ pH 5 〜8 以上の菌学的諸性質から、本菌株は、楕円形の小型分生
子を形成し、厚膜胞子をよく形成するという点におい
て、フザリウム オキシスポルムと同定した。また、ニ
ッケルシアン錯体を窒素源として生育するものはいまま
でに知られていないことから、本菌株を、フザリウム
オキシスポルムの新菌株として、フザリウム オキシス
ポルム N-10 株と命名した。
【0010】本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託番号FERM P-16160として寄託されている(寄
託日平成9年3月27日)。本菌株の培養には、通常の微
生物の培養に使用される炭素源、窒素源、無機物を含む
各種培地を使用することができる。炭素源としては、例
えばグルコース、フラクトース、デンプン等の各種糖
類、窒素源としては、酵母エキス、肉エキス、ペプト
ン、各種アミノ酸等の有機窒素類、また硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム等の各種無機窒素である。炭素
源、窒素源とも、単独または組合わせて用いられる。そ
の他の無機物として、リン、ナトリウム、カリウム、カ
ルシウム、微量金属類等、必要に応じて添加する。
【0011】本菌株は、シアン化合物による汚染土壌、
工場廃液などの処理に使用することができる。上記処理
は、本菌株の菌体、菌体処理物、またそれらの固定化物
で用いて行うことができる。菌体とは、本菌株を培地に
培養し、その培養物の中から回収した菌体自体をいい、
生細胞、凍結物、または凍結乾燥物のいずれでも良い。
また、菌体処理物とは、菌体破砕物、または培養物(菌
体、培養上清を含む)からの抽出物をいう。また、固定
化物とは、該菌体または菌体処理物を担体等に固定化し
たものをいう。
【0012】以下、実施例により本発明を説明する。
【0013】
【実施例】
〔実施例1〕 フザリウム オキシスポルムN-10株によ
るシアン化合物の分解 (1) 高濃度ニッケルシアン錯体の分解 フザリウム オキシスポルムN-10株(以下、N-10株とい
う)による高濃度ニッケルシアン錯体の分解を検討し
た。
【0014】唯一の窒素源としてニッケルシアン錯体を
0 から50mMの範囲で添加する以外は表1と同組成の合成
無機培地でN-10株を30℃で振盪培養し、N-10株の菌体の
生育と培養液中の残存基質量を経時的に測定した。生育
は培養液の濁度の増加を610nm の吸光度の上昇として測
定した。基質の分解は表2に示す条件下で高速液体クロ
マトグラフィーを用いて測定した。結果を図2および3
に示す。 N-10 株は20mM (約5000ppm)の高濃度において
も速やかに生育し、10mMのニッケルシアン錯体を1週間
の培養で分解した。
【0015】
【表2】 HPLCを用いるニッケルシアン錯体分析条件 使用機種 PKD−5D カラム ODS-II (内径4.6mm ×長さ15cm) 溶出液 10mM NaH2PO4・2H2O 5mM 水酸化テトラブチルアンモニウムハイドロオキサイド pH7.1 に調整後、アセトニトリルを7:3で混合 流速 1ml/min 検出 紫外部, 265nm (2) 遊離シアンを窒素源とした生育 N-10株が遊離シアンを窒素源として生育できるか否かに
ついて検討した。
【0016】ニッケルシアン錯体の代わりに、窒素源と
してシアン化カリウムを初発濃度を1mM で添加した合成
無機培地(表1)にてN-10株を30℃で振盪培養し、48時
間毎に1mM のシアン化カリウムを添加して菌体の生育を
観察した。結果を図4に示す。N-10株は最終的に250ppm
のシアン化カリウムの添加に同調して生育したことか
ら、本菌が遊離シアンを窒素源として旺盛に生育でき、
遊離シアン分解活性を有することが確認された。
【0017】(3) ニトリル化合物を窒素源とした生育 N-10 株がニトリル化合物を窒素源として生育できるか
否かについて検討した。ニッケルシアン錯体の代わり
に、窒素源としてニトリル化合物を0.2%になるように添
加した合成無機培地(表1)にてN-10株を30℃で振盪培
養し、菌株の生育を観察した。結果を図5に示す。N-10
株はアセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリ
ル、サクシニトリルなどの脂肪族ニトリル、ベンゾニト
リルなどの芳香族ニトリルを窒素源として生育できるこ
とが明らかとなった。
【0018】また、遊離シアン(KCN)、ニッケルシ
アン錯体を窒素源とした結果も併せて図5に示す。 〔実施例2〕 N-10 株による金属シアン錯体分解代謝物
の分析 (1) N-10 株の休止菌体を用いたニッケルシアン錯体と
遊離シアンの分解1mM のニッケルシアン錯体を含む合成
無機培地(表1)で48時間生育させたN-10株を集菌した
後、100mM のリン酸カリウム緩衝液(pH7.0) で洗菌し
た。休止菌体反応(1.0ml) は、10mMニッケルシアン錯体
またはシアン化カリウム、100mM リン酸緩衝液(pH7.0)
、N-10株休止菌体(湿重量:0.26mg) からなる反応液
中で30℃で攪拌した。経時的に試料を採取し、反応生成
物として推定されるホルムアミドはGC分析(表3)に
より、アンモニアはアンモニアテストワコーによる比色
定量により、ギ酸はベーリンガー・マンハイム社のF−
キットを用いた定量により、それぞれ測定した。
【0019】
【表3】 GCを用いるホルムアミド分析条件 使用機種 GC-8A カラム Porapack Q (内径2.6mm ×長さ2m) キャリアガス 窒素ガス 流速 40ml/min 注入温度 240 ℃ 検出 FID 10mM(2500ppm)のニッケルシアン錯体の分解に伴い、ホ
ルムアミド、ギ酸、およびアンモニアが生成された(図
6)。N-10株休止菌体は、24時間で1200ppm のニッケル
シアン錯体を分解する高性能分解菌であった。一方、N-
10株の10mM(600ppm)のシアン化カリウムからのホルミア
ミドへの分解活性は極めて高く、菌体との反応によりシ
アン化カリウムは瞬時に変換された。変換されたホルム
アミドの減少に伴い、ギ酸およびアンモニアが生成され
た(図7)。以上のように、高い毒性を有する遊離型シ
アンに対してもN-10株休止菌体は、24時間で600ppmのシ
アンを完全にギ酸とアンモニアに分解する高性能菌であ
った。
【0020】(2) N-10 株細胞から調製した無細胞抽出
液を用いたニッケルシアン錯体と遊離シアンの分解 1mM のニッケルシアン錯体を含む合成無機培地(表1)
で48時間生育させたN-10株を集菌し、菌体を100mM のリ
ン酸カリウム緩衝液(pH7.0) で洗菌した。1gの洗浄菌体
に対し、1.5gの海砂と2ml の100mM リン酸カリウム緩衝
液(pH7.0, 1mM2-メルカプトエタノールを含む) を添加
して、氷冷しつつ乳鉢中で破砕した。得られた破砕液の
1000rpm 遠心分離上清を無細胞抽出液とした。酵素反応
(1.0ml)は、10mMニッケルシアン錯体またはシアン化カ
リウム、100mM リン酸緩衝液(pH7.0)、無細胞抽出液
(1.4mg protein) からなる反応液中で30℃で行った。
経時的に試料を採取し、反応生成物として推定されるホ
ルムアミド、アンモニア、ギ酸をそれぞれ(1) と同様に
して定量分析した。
【0021】10mM(2500ppm) のニッケルシアン錯体の分
解に伴い、ホルムアミド、ギ酸、およびアンモニアが生
成された(図8)。シアン化カリウムの場合では、10mM
(600ppm) のシアン化カリウムからのホルムアミドへの
分解活性は極めて高く、シアン化カリウムは瞬時に変換
された。変換されたホルムアミドの減少に伴い、ギ酸お
よびアンモニアが生成された(図9)。
【0022】
【発明の効果】本発明によって提供される微生物は、シ
アン化合物に対して顕著な分解活性を有するため、この
微生物を種々の方法で培養し、種々の形態で利用するこ
とにより、シアン化合物がもたらす土壌・水質汚染の微
生物による効率的な分解除去が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 N-10株の分生子形成細胞(写真1)、および
分生子(写真2)の顕微鏡写真である。
【図2】 高濃度ニッケルシアン錯体を窒素源としたN-
10株の生育を示す図である。
【図3】 N-10株による高濃度ニッケルシアン錯体の分
解を示す図である。
【図4】 シアン化カリウムを窒素源としたN-10株の生
育を示す図である。
【図5】 各種ニトリル化合物を窒素源としたN-10株の
生育を示す図である。
【図6】 N-10株の休止菌体による10mMニッケルシアン
錯体の分解を示す図である。
【図7】 N-10株の休止菌体による10mMシアン化カリウ
ムの分解を示す図である。
【図8】 N-10株の無細胞抽出液による10mMニッケルシ
アン錯体の分解を示す図である。
【図9】 N-10株の無細胞抽出液による10mMシアン化カ
リウムの分解を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成9年4月15日
【手続補正1】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図1
【補正方法】変更
【補正内容】
【図1】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12R 1:77)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 シアン化合物に対して分解活性を有する
    新菌株フザリウムオキシスポルム(Fusarium oxysporu
    m) N-10株。
  2. 【請求項2】 請求項1記載の菌株を用いてシアン化合
    物を分解することを特徴とするシアン化合物の処理方
    法。
  3. 【請求項3】 菌株の菌体、菌体処理物、またはそれら
    の固定化物を用いることを特徴とする請求項2記載のシ
    アン化合物の処理方法。
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