JPH10262686A - ポリペプチド - Google Patents

ポリペプチド

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JPH10262686A
JPH10262686A JP9329715A JP32971597A JPH10262686A JP H10262686 A JPH10262686 A JP H10262686A JP 9329715 A JP9329715 A JP 9329715A JP 32971597 A JP32971597 A JP 32971597A JP H10262686 A JPH10262686 A JP H10262686A
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岩夫 岡本
Masashi Kurimoto
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を
誘導する安定なポリペプチドの提供を課題とする。 【解決手段】特定のアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞
においてインターフェロン−γの産生を誘導するポリペ
プチド、そのポリペプチドをコードするＤＮＡと、適宜
宿主内に当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入し
てなる形質転換体を培養する工程と、生成したポリペプ
チドを培養物から採取する工程を含んでなるポリペプチ
ドの製造方法及び有効成分として当該ポリペプチドを含
んでなる感受性疾患剤により解決する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は新規な生理活性ポ
リペプチドに関するものであり、詳細には、免疫担当細
胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−
γ」と略記する。）の産生を誘導する人為的に創製され
たポリペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】本発明者らは、免疫担当細胞においてＩ
ＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチド（以下、「野生
型ポリペプチド」と言う。）の単離と、その野生型ポリ
ペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングに成功
し、関連する発明を特開平８−２７１８９号公報、特開
平８−１９３０９８号公報及び特願平８−６７４３４号
明細書に開示した。この野生型ポリペプチドは、通常、
部分アミノ酸配列として配列表における配列番号１乃至
３に示すアミノ酸配列を共通して含有し、有用な生理活
性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キ
ラー細胞による細胞障害性を増強したり、キラー細胞の
生成を誘導する性質を兼備している。上記の生理活性故
に、野生型ポリペプチドは、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗
腫瘍剤、免疫疾患剤などとして広範な用途が期待されて
いる。
【０００３】ところが、同じ特許出願人による特願平８
−６７４３４号明細書にも記載されているように、天然
の細胞は一般に野生型ポリペプチドの産生量が少ないと
いう問題がある。本発明者らが鋭意研究したところ、そ
の原因の一つは、天然の細胞において、野生型ポリペプ
チドが生理活性を有しない前駆体として存在しているこ
とが判明した。本発明者らは、この前駆体が、例えば、
インターロイキン−１β変換酵素などの変換酵素を作用
させると活性型に変換されることを見出し、特願平８−
２０７６９１号明細書及び特願平８−２１３２６７号明
細書に開示した。
【０００４】天然の細胞において野生型ポリペプチドの
産生量が少ない別の原因として、野生型ポリペプチドが
不安定である可能性がある。組換えＤＮＡ技術の進歩に
より、昨今では、生理活性蛋白質を構成するアミノ酸の
１個又は２個以上を欠失せしめたり、あるいは、他のア
ミノ酸で置換する改変ポリペプチドの開発が盛んであ
る。しかしながら、組換えＤＮＡ技術が進歩した今日で
も、個々の生理活性蛋白質においては、元の生理活性を
実質的に変えることなく安定性を高めるには、依然とし
て試行錯誤を繰返さなければならない状況にある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の第一の課題は、野生型ポリペプチドの生理活性
を実質的に変えることなく、安定性を有意に高めたポリ
ペプチドを提供することにある。
【０００６】さらに、この発明の第二の課題は、斯かる
ポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【０００７】加えて、この発明の第三の課題は、斯かる
ポリペプチドの医薬品としての用途を提供することにあ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者がこれらの課題
を解決すべく鋭意研究したところ、部分アミノ酸配列と
して、配列表における配列番号１乃至３に示すアミノ酸
配列を含有する野生型ポリペプチドにおけるシステイン
の１若しくは複数が他のアミノ酸により置換されたアミ
ノ酸配列、又は、その置換されたアミノ酸配列におい
て、前記置換部位以外の部位で、１若しくは複数のアミ
ノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を含
有するポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較し
て、安定性が有意に高く、置換する他のアミノ酸の種類
によっては、免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γ誘導能も
有意に高いことが判明した。そして、斯かるポリペプチ
ドは組換えＤＮＡ技術を応用することによって所望量を
容易に製造することができ、また、毒性が低いことか
ら、ＩＦＮ−γ誘導剤としてのみならず、医薬品として
も極めて有利に用い得ることを確認した。
【０００９】すなわち、この発明は、前記第一の課題
を、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号
１乃至３に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドに
おいて、そのポリペプチドにおけるシステインの１若し
くは複数が他のアミノ酸により置換されたアミノ酸配
列、又は、その置換されたアミノ酸配列において、前記
置換部位以外の部位で、１若しくは複数のアミノ酸が付
加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を含有し、免
疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導
するポリペプチドにより解決するものである。
【００１０】さらに、この発明は、前記第二の課題を、
斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡを適宜宿主内に
導入してなる形質転換体を培養する工程と、生成したポ
リペプチドを培養物から採取する工程を含んでなるポリ
ペプチドの製造方法により解決するものである。
【００１１】加えて、この発明は、前記第三の課題を、
有効成分として斯かるポリペプチドを含んでなる感受性
疾患剤により解決するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】この発明でいうポリペプチドと
は、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号
１乃至３に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドに
おいて、そのポリペプチドにおけるシステインの１若し
くは複数が他のアミノ酸により置換されたアミノ酸配
列、又は、その置換されたアミノ酸配列において、前記
置換部位以外の部位で、１若しくは複数のアミノ酸が付
加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を含有し、免
疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導
する性質を有するすべてのポリペプチドを包含する。シ
ステインを置換する他のアミノ酸としては、そのアミノ
酸によって置換されたアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドが、部分アミノ酸配列として配列表における配列番
号１乃至３に示すアミノ酸配列を含有する野生型ポリペ
プチドと同様、単独又は適宜補因子の存在下において、
免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導し且つ野
生型ポリペプチドと比較して有意に高い安定性を示すか
ぎりにおいて、その種類は問わない。システインを置換
する他のアミノ酸の具体例としては、例えば、セリン、
トレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ
ン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプ
トファン及びメチオニンが挙げられ、このうちで最も望
ましいアミノ酸はセリン及びアラニンである。配列表に
おける配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列を含有する
ポリペプチドの具体例としては、例えば、配列表におけ
る配列番号４又は５に示すアミノ酸配列を含有する野生
型ポリペプチドを挙げることができる。因みに、配列番
号４に示すアミノ酸配列は、そのＮ末端から第３８番
目、第６８番目、第７６番目及び第１２７番目にシステ
インを有し、配列番号５に示すアミノ酸配列は、そのＮ
末端から第７番目、第７５番目及び第１２５番目にシス
テインを有している。
【００１３】この発明のポリペプチドの具体例として
は、例えば、配列表における配列番号４に示すアミノ酸
配列を含有する野生型ポリペプチドにおけるシステイン
を他のアミノ酸で置換した配列表における配列番号６乃
至１２に示すアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配
列表における配列番号５に示すアミノ酸配列を含有する
野生型ポリペプチドにおけるシステインを他のアミノ酸
で置換した配列表における配列番号１３及び１４に示す
アミノ酸配列を含有するポリペプチド、さらには、所期
の生理活性と安定性が失われない範囲で、それらのアミ
ノ酸配列において、前記特定の置換部位以外の部位で、
１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換さ
れたアミノ酸配列を含有するポリペプチドが挙げられ
る。なお、アミノ酸の付加、欠失若しくは置換に関し、
１若しくは複数のアミノ酸とは、部位特定変異誘発法な
どの公知の手法によって付加、欠失若しくは置換できる
程度の数のアミノ酸を意味する。配列番号６乃至１４に
示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドは、野生型ポ
リペプチドと比較して、いずれも安定性と生理活性が有
意に高い。
【００１４】この発明のポリペプチドは、通常、組換え
ＤＮＡ技術を応用して製造される。すなわち、当該ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを適宜宿主内に導入して形
質転換し、得られた形質転換体を培養し、生成した当該
ポリペプチドを培養物から採取する。この発明は、組換
えＤＮＡ技術を用いる当該ポリペプチドの製造方法を提
供するものでもあり、この発明の製造方法によるときに
は、所望量の当該ポリペプチドを容易に得ることができ
る。
【００１５】この発明の製造方法で用いるＤＮＡとして
は、それが当該ポリペプチドをコードするかぎり、天然
の給源から得られたＤＮＡを人為的に改変したものであ
っても、化学合成したものであってもよい。前者の方法
の具体例としては、例えば、天然の細胞を給源にして、
配列表における配列番号４又は５に示すアミノ酸配列を
コードする、配列番号２５又は２８に示す塩基配列のＤ
ＮＡを調製し、このＤＮＡに対して、ロバート・エム・
ホートンらが『メソッズ・イン・エンザイモロジー』、
第２１７巻、２７０乃至２７９頁（１９９３年）に報告
している『オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ
法』を適用し、配列番号４又は５に示すアミノ酸配列に
おけるシステインに相当するコドンを他のアミノ酸のコ
ドンにより置換した塩基配列のＤＮＡを調製する。斯か
るＤＮＡの具体例としては、例えば、配列番号２５に示
す塩基配列有におけるコドンが置換された配列番号１５
乃至２１に示す塩基配列、配列番号２８におけるコドン
が置換された配列番号２２及び２３に示す塩基配列及
び、それらの塩基配列に相補的な塩基配列、さらには、
その配列表における配列番号１５乃至２３に示す塩基配
列及びそれらの塩基配列に相補的な塩基配列において、
それらの塩基配列がコードするアミノ酸配列を変更する
ことなく、塩基の１若しくは複数を他の塩基で置換した
塩基配列を含んでなるものが挙げられる。後者の方法の
具体例としては、例えば、化学合成が挙げられ、配列表
における配列番号１５乃至２３に示す塩基配列に基づ
き、常法にしたがって、前者の方法の場合と同様の塩基
配列を含有するＤＮＡを得ることができる。いずれにし
ても、一旦ＤＮＡが入手されれば、これにＰＣＲ法を適
用することによって、所望のレベルに容易に増幅するこ
とができる。
【００１６】ところで、斯界においては、一般に、ある
ポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主中で発現させる
に際し、そのＤＮＡの発現効率を改善したり、あるい
は、ポリペプチドそのものの生理活性を改善する目的
で、ＤＮＡにおける塩基の１個又は２個以上を他の塩基
で置換したり、ＤＮＡに適宜のプロモーターやエンハン
サーを連結することがある。この発明のＤＮＡにおいて
も斯かる変更は当然可能であり、具体的には、最終的に
得られるポリペプチドが所期の生理活性と安定性を失わ
ない範囲で、例えば、配列表における配列番号１５乃至
２３に示す塩基配列の５´末端及び／又は３´末端に適
宜の制限酵素による認識部位、開始コドン、終止コド
ン、さらには、例えば、配列表における配列番号２４に
示すヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２
ｂのシグナルペプチドに代表されるような、適宜のシグ
ナルペプチドをコードする塩基配列を連結し得ることは
言うまでもない。
【００１７】斯かるＤＮＡは微生物及び動植物由来の適
宜の宿主、とりわけ、哺乳類由来の宿主細胞に導入する
と、安定性と生理活性の高いポリペプチドを発現する。
この発明のＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主
に導入される。組換えＤＮＡはこの発明のＤＮＡと自律
複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡさえ入手でき
れば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に
調製することができる。この発明のＤＮＡを挿入し得る
ベクターとしては、例えば、ｐｃＤ、ｐｃＤＬ−ＳＲ
α、ｐＫＹ４、ｐＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓ
などのプラスミドベクターが挙げられる。自律複製可能
なベクターは、通常、プロモーター、エンハンサー、複
製起点、転写終結部位、スプライシング配列及び／又は
選択配列などの、この発明のＤＮＡが個々の宿主におい
て発現するための適宜塩基配列を含んでなる。なお、プ
ロモーターとして、例えば、熱ショック蛋白質プロモー
ターや、あるいは、同じ特許出願人が特開平７−１６３
３６８号公報に開示したインターフェロン−αプロモー
ターを用いるときには、形質転換体における当該ＤＮＡ
の発現を外部刺激により人為的に制御できることとな
る。
【００１８】斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入
するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体
的には、先ず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自律複
製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により
切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片を連
結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特
異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＡｃｃＩ、Ｂａｍ
ＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、Ｓ
ｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれ
ば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易とな
る。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に
応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外
でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られ
る組換えＤＮＡは、微生物や動物由来の宿主において無
限に複製可能である。
【００１９】斯かる組換えＤＮＡは、適宜宿主内に導入
して当該ポリペプチドの製造に用いられる。宿主として
は、斯界において慣用される微生物及び動植物由来のも
のを用いることができるが、ポリペプチドの最終用途が
医薬品である場合には、酵母や哺乳類由来の宿主が望ま
しい。哺乳類由来の宿主細胞の具体例としては、例え
ば、３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１
細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＯＰ細胞及びそれ
らの変異株を始めとする、ヒト、サル、マウス及びハム
スター由来の上皮系細胞、間質系細胞及び造血系細胞が
挙げられる。斯かる宿主にこの発明のＤＮＡを導入する
には、例えば、公知のＤＥＡＥ−デキストラン法、燐酸
カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェク
ション法、マイクロインジェクション法、さらには、レ
トロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワ
クシニアウイルスなどによるウイルス感染法などを用い
ればよい。形質転換体から当該ポリペプチドを産生する
クローンを選択するには、形質転換体を培養培地で培養
し、当該ポリペプチドの産生が観察されたクローンを選
択すればよい。なお、哺乳類由来の宿主細胞を用いる組
換えＤＮＡ技術については、例えば、黒木登志夫、谷口
克、押村光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブッ
ク』、１９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編
集、『実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ３ 遺伝
子クローニング実験法』、１９９３年、羊土社発行など
にも詳述されている。
【００２０】斯くして得られる形質転換体は、培養培地
で培養すると、宿主内外に当該ポリペプチドを産生す
る。培養培地として、形質転換体を培養するための慣用
の培養培地を用いればよく、斯かる培養培地は、通常、
緩衝水を基材とし、これにナトリウムイオン、カリウム
イオン、カルシウムイオン、燐イオン、塩素イオンなど
の無機イオンと、宿主の代謝能力に応じた微量元素、炭
素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを加え、必要に
応じて、さらに血清、ホルモン、細胞成長因子、細胞接
着因子などを含有せしめて構成される。個々の培養培地
としては、例えば、１９９培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａ
ｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＭＣＤＢ１０４培
地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＥＭ培地、ＲＤ培地、ＲＩ
ＴＣ８０−７培地、ＲＰＭＩ−１６３０培地、ＲＰＭＩ
−１６４０培地、ＷＡＪＣ４０４培地などが挙げられ
る。斯かる培養培地に形質転換体を約１×１０4乃至１
×１０7個／ｍｌ、望ましくは、約１×１０5乃至１×１
０6個／ｍｌ接種し、必要に応じて新鮮な培養培地と取
替えながら、温度３７℃前後で１日乃至１週間、望まし
くは、２乃至４日間浮遊培養又は単層培養すると、当該
ポリペプチドを含む培養物が得られる。形質転換体の種
類や培養条件にもよるが、斯くして得られる培養物は、
通常、１ｌ当り、当該ポリペプチドを約１μｇ乃至１ｍ
ｇ含む。
【００２１】このようにして得られた培養物はＩＦＮ−
γ誘導剤としてそのまま用いられることもあるが、通常
は使用に先立ち、必要に応じて、超音波、細胞溶解酵素
及び／又は界面活性剤により菌体又は細胞を破砕した
後、濾過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを菌体
若しくは細胞又はそれらの破砕物から分離し、精製す
る。精製には菌体若しくは細胞又はそれらの破砕物を除
去した培養物に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分
別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性蛋白質を
精製するための斯界における慣用の方法が適用され、必
要に応じて、これらは適宜組合せて適用される。そし
て、最終使用形態に応じて、精製ポリペプチドを濃縮・
凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。なお、同じ特
許出願人による特開平８−２３１５９８号公報に開示さ
れたモノクローナル抗体は当該ポリペプチドの精製に極
めて有用であり、このモノクローナル抗体を用いるイム
ノアフィニティークロマトグラフィーによるときには、
高純度の当該ポリペプチドが最少のコストと労力で得ら
れる。
【００２２】この発明のポリペプチドは、通常、免疫担
当細胞を培養してＩＦＮ−γを製造するための培養培地
に共存させるか、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防の
ためにヒトを含む哺乳動物に投与される。すなわち、前
者の用途においては、哺乳類の末梢血から分離される白
血球や、例えば、ＨＢＬ−３８細胞、Ｍｏ細胞（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ８０６６）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ８１６３）、ＨｕＴ７８細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ
１６１）、ＥＬ４細胞（ＡＴＣＣ ＴＵＢ３９）、Ｌ１
２−Ｒ４細胞などの培養株化した免疫担当細胞又はその
変異株をこの発明のポリペプチドを１ｍｌ当り約０．１
ｎｇ乃至１μｇ、望ましくは、約１乃至１００ｎｇ含む
適宜の培養培地に浮遊させる。必要に応じて、培養培地
にマイトジェンやインターロイキン２、抗ＣＤ３抗体な
どのＴ細胞刺激物質を加え、培養培地を適宜新鮮なもの
と取換えながら、通常一般の方法により約１乃至１００
時間培養する。斯くして得られる培養物にＩＦＮ−γを
精製するための慣用の方法、すなわち、塩析、透析、濾
過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲル電気泳
動、等電点電気泳動などを適宜組合せて適用することに
より、ＩＦＮ−γを採取することができる。
【００２３】さらに、この発明のポリペプチドは免疫担
当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導することから、
有効成分として当該ポリペプチドを含んでなる感受性疾
患剤は、ヒトを含む哺乳動物に投与すると、体内の免疫
担当細胞においてＩＦＮ−γの産生が促され、ＩＦＮ−
γ感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。また、後
記実施例に例示する本発明のポリペプチドのように、ポ
リペプチドが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を
誘導する性質に加えて、ＮＫ細胞やＬＡＫ細胞（リンホ
カイン活性化キラー細胞）、細胞障害性Ｔ細胞などのキ
ラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成
を誘導する性質を兼備するときには、キラー細胞も感受
性疾患の治療・予防に関与することとなる。したがっ
て、この発明でいう感受性疾患とは、ＩＦＮ−γ感受性
疾患を含む、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞が直接又
は間接に関与して治療及び／又は予防し得る疾患全般を
意味するものであり、具体的には、例えば、肝炎、ヘル
ペス症、尖圭コンジロム、ＡＩＤＳなどのウイルス性疾
患、カンジダ症、マラリア症、クリプトコックス症、エ
ルシニア症、結核などの感染症、悪性腎腫瘍、菌状息肉
症、慢性肉芽腫などの固形悪性腫瘍、成人Ｔ細胞白血
病、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ種などの血球系悪性
腫瘍、さらには、アレルギー症、リウマチ、膠原病など
の免疫疾患や骨粗鬆症を挙げることができる。また、イ
ンターロイキン３と併用するときには、白血病、骨髄
腫、さらには、悪性腫瘍を治療する際の放射線照射や化
学療法剤の投与に伴う白血球減少症や血小板減少症の完
治又は緩解にも効果を発揮する。
【００２４】斯くして、この発明の感受性疾患剤は、上
記のごとき感受性疾患を治療・予防するための抗腫瘍
剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、免疫疾患剤、血小板増多
剤、白血球増多剤などとして多種多様な用途を含有する
こととなる。剤型並びに感受性疾患の種類及び症状にも
よるが、この発明の感受性疾患剤は、通常、液状、ペー
スト状又は固状に調製され、当該ポリペプチドを０．０
００００１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．
０００１乃至０．１％（ｗ／ｗ）含んでなる。
【００２５】この発明の感受性疾患剤は当該ポリペプチ
ド単独の形態はもとより、当該ポリペプチドとそれ以外
の生理的に許容される、例えば、担体、賦形剤、希釈
剤、免疫助成剤、安定剤、さらには、必要に応じて、他
の生理活性物質の１種又は２種以上との組成物としての
形態をも包含する。安定剤としては、例えば、血清アル
ブミン、ゼラチンなどの蛋白質や、グルコース、果糖、
蔗糖、マルトース、ラクトース、トレハロース、ソルビ
トール、マンニトール、マルチトール、ラクチトールな
どの糖質、さらには、燐酸、クエン酸を主体とする緩衝
剤が、また、併用し得る他の生理活性物質としては、例
えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、
インターフェロン−γ、インターロイキン２、インター
ロイキン３、インターロイキン１２、ＴＮＦ−α、ＴＮ
Ｆ−β、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファー
ジ刺激因子、カルボコン、シクロホスファミド、アクラ
ルビシン、チオテパ、ブスルファン、アンシタビン、シ
タラビン、フルオロウラシル、テトラヒドロフリルフル
オロウラシル、メトトレキセート、アクチノマイシン
Ｄ、クロモマイシンＡ3 、ダウノルビシン、ドキソルビ
シン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ビンクリス
チン、ビンブラスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、金コロ
イド、クレスチン、ピシバニール、レンチナン及び丸山
ワクチンなどが挙げられる。このうち、インターロイキ
ン２との併用は、インターロイキン２がこの発明のポリ
ペプチドが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘
導する際の補因子として機能するので特に有利である。
天然型又は組換え型インターロイキン２を併用すること
により、当該ポリペプチド単独ではＩＦＮ−γを産生し
難い免疫担当細胞においても所期のＩＦＮ−γ産生を誘
導することができる。また、インターロイキン１２と併
用するときには、当該ポリペプチド又はインターロイキ
ン１２単独では容易に達成し得ない、極めて高レベルの
ＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。しかも、当該
ポリペプチドは体内におけるインターロイキン１２によ
るイムノグロブリンＥ抗体の産生阻害を高めるので、イ
ムノグロブリンＥ抗体の産生を主因とする、例えば、ア
トピー性喘息、アトピー性気管支喘息、枯草熱、アレル
ギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、血管性浮腫、アトピー
性消化器異常を始めとするアトピー性疾患を治療するた
めの免疫疾患剤においても極めて有用である。なお、ヒ
トを含む哺乳動物の体内においては、微量ではあるが、
インターロイキン１２が存在することがあるので、斯か
る場合には、当該ポリペプチドのみを投与すれば所期の
治療効果が達成できる。
【００２６】さらに、この発明の感受性疾患剤は、投薬
単位形態の薬剤をも包含し、その投与単位形態の薬剤と
は、当該ポリペプチドを、例えば、１回当りの用量又は
その整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０ま
で）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に
一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位
形態の薬剤としては、注射剤、液剤、散剤、顆粒剤、錠
剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤などが
挙げられる。
【００２７】この発明の感受性疾患剤は経口的に投与し
ても非経口的に投与しても、また、以下に述べるように
抗腫瘍細胞を体外で活性化させる場合に用いてもよく、
いずれの場合にも、感受性疾患の治療・予防に効果を発
揮する。感受性疾患の種類や症状にもよるが、具体的に
は、患者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人当
り約０．１μｇ乃至５０ｍｇ／回、望ましくは、約１μ
ｇ乃至１ｍｇ／回のポリペプチドを１乃至４回／日又は
１乃至５回／週の用量で１日乃至１年間に亙って経口投
与するか、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内に非経口投与
すればよい。
【００２８】この発明の感受性疾患剤は、インターロイ
キン２を用いる、いわゆる「抗腫瘍免疫療法」にも有用
である。抗腫瘍免疫療法は、一般に、（ｉ）悪性腫瘍患
者の体内に直接インターロイキン２を投与する方法と、
（ｉｉ）インターロイキン２により生体外で活性化させ
た抗腫瘍細胞を患者の体内に移入する方法（養子免疫療
法）に大別されるが、当該ポリペプチドを併用するとき
には、その効果を有意に高めることができる。具体的に
は、前記（ｉ）の方法の場合、患者にインターロイキン
２を投与するのと同時又は事前に当該ポリペプチドを成
人当り約０．１μｇ乃至１ｍｇ／回の用量で１乃至１０
回投与する。インターロイキン２の投与量は、悪性腫瘍
の種類、患者の症状及びポリペプチドの用量にもよる
が、通常、成人当り約１０，０００乃至１，０００，０
００単位／回とする。一方、前記（ｉｉ）の方法の場合
には、悪性腫瘍患者から採取した単核球又はリンパ球を
インターロイキン２の存在下で培養するに当り、それら
血球１×１０6 個当り当該ポリペプチドを約０．１ｎｇ
乃至１μｇ共存させておく。そして、一定時間培養した
後、培養物からＮＫ細胞又はＬＡＫ細胞を採取し、これ
を元の患者に移入するのである。この発明による抗腫瘍
免疫療法の対象となり得る疾患としては、例えば、結腸
癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、甲状腺癌、舌癌、膀胱癌、
絨毛癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、喉頭癌、肺癌、乳
癌、悪性黒色腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、神経芽細胞腫、
卵巣腫瘍、睾丸腫瘍、骨肉腫、膵臓癌、悪性腎腫瘍、副
腎腫、血管内皮腫などの固形悪性腫瘍や白血病、悪性リ
ンパ腫などの血球系悪性腫瘍が挙げられる。
【００２９】ところで、当該ポリペプチドをコードする
この発明のＤＮＡは、いわゆる、「遺伝子療法」にも有
用である。すなわち、通常の遺伝子療法においては、こ
の発明のＤＮＡを、例えば、レトロウイルス、アデノウ
イルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス由来のベク
ターに挿入するか、カチオニックポリマーや膜融合型リ
ポソームなどのリポソームに包埋し、この状態でＩＦＮ
−γ及び／又はキラー細胞に感受性を含有する疾患に罹
患した患者に直接注入するか、あるいは、患者からリン
パ球を採取し、生体外で導入した後、患者に自家移植す
るのである。また、養子免疫遺伝子療法においては、効
果細胞にこの発明のＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と
同様にして導入すると、腫瘍細胞に対する効果細胞の細
胞障害性が高まり、養子免疫療法を強化することができ
る。さらに、腫瘍ワクチン遺伝子療法においては、患者
から摘出した腫瘍細胞にこの発明のＤＮＡを通常の遺伝
子療法の場合と同様にして導入し、生体外で一定数に達
するまで増殖させた後、患者に自家移植するのである。
移植された腫瘍細胞は患者体内においてワクチンとして
作用し、強力且つ抗原特異的な抗腫瘍免疫を発揮する。
斯くして、この発明のＤＮＡは、ウイルス疾患、感染
症、悪性腫瘍及び免疫疾患を始めとする各種疾患の遺伝
子療法に著効を発揮することとなる。なお、これらの遺
伝子療法を実施するための一般的手順は、例えば、島田
隆、斎藤泉、小澤敏也編集、『実験医学別冊バイオマニ
ュアルＵＰシリーズ 遺伝子治療の基礎技術』、１９９
６年、羊土社発行に詳述されている。
【００３０】以下、この発明の実施の形態につき、実施
例を挙げて説明する。実施例Ａ−１乃至Ａ−９にはこの
発明によるポリペプチドの製造方法の実施例が、また、
実施例Ｂ−１乃至Ｂ−５にはこの発明の感受性疾患剤の
実施例がそれぞれ例示されている。なお、実施例Ａ−１
乃至Ａ−９において用いられる手法は斯界において慣用
のものであり、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄
編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１９９
２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験医学
別冊バイオマニュアルシリーズ３ 遺伝子クローニング
実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述されて
いる。
【００３１】
【実施例Ａ−１】 〈ポリペプチドの製造〉
【００３２】
【実施例Ａ−１（ａ）】 〈組換えＤＮＡの構築〉ヒト急性リンパ性白血病に由来
する株化細胞の一種であるＢＡＬＬ−１細胞（ＲＣＢ０
２５６）から常法にしたがって染色体ＤＮＡを採取する
一方、カーステン・ヘンコらが『ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー』、第１８５巻、２２７乃至
２６０頁（１９８５年）に報告しているヒトインターフ
ェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチ
ドをコードする配列表における配列番号２４に示す塩基
配列に基づき、センスプライマー１及びアンチセンスプ
ライマー１として５´−ＡＣＡＣＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣ
ＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＡＡＣ−
３´及び５´−ＴＴＧＣＣＡＡＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡ
ＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧ−３´で表される塩基配列のオリ
ゴヌクレオチドをそれぞれ化学合成した。次いで、０．
５ｍｌ容反応管に染色体ＤＮＡを１μｇ、１０×ＰＣＲ
緩衝液を１０μｌ、そして、２５ｍＭ ｄＮＴＰミック
スを１μｌそれぞれとり、さらに、センスプライマー１
及びアンチセンスプライマー１をそれぞれ適量加え、滅
菌蒸留水を加えて全量を９９μｌとし、２．５単位／μ
ｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加えた後、９
４℃、６０℃及び７２℃の順序でそれぞれ１分間インキ
ュベートするサイクルを３０回繰返してＰＣＲ反応させ
たところ、配列表における配列番号２４に示す塩基配列
と、その塩基配列の５´末端に連結された制限酵素Ｘｈ
ｏＩによる認識部位及び３´末端に連結された配列番号
２５に示す塩基配列の第１乃至１１番目の塩基配列をそ
れぞれ含んでなるＤＮＡ断片１を得た。
【００３３】別途、同じ特許出願人による特開平８−１
９３０９８号公報に記載された方法にしたがって、配列
表における配列番号４に示すアミノ酸配列を有する野生
型ポリペプチドをコードする、配列表における配列番号
２５に示す塩基配列を含む組換えＤＮＡ『ｐＨＩＧＩ
Ｆ』を調製した。配列表における配列番号４のアミノ酸
配列の野生型ポリペプチドは、その第１６乃至２１番
目、第３０乃至３５番目及び、第５１乃至５５番目のア
ミノ酸よりなる部分に、それぞれ、部分アミノ酸配列と
しての、配列番号１、２及び３に示すアミノ酸配列を含
んでいる。一方、配列表における配列番号２５及び２６
に示す塩基配列に基づき、常法にしたがって、センスプ
ライマー２及びアンチセンスプライマー２として５´−
ＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧ
ＣＴＴＧＡＡＴＣ−３´及び５´−ＡＣＡＣＧＣＧＧＣ
ＣＧＣＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧ−３
´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ
化学合成した。０．５ｍｌ容反応管に組換えＤＮＡ『ｐ
ＨＩＧＩＦ』を１ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μ
ｌ、そして、２５ｍＭ ｄＮＴＰミックスを１μｌをと
り、さらに、センスプライマー２及びアンチセンスプラ
イマー２をそれぞれ適量加え、滅菌蒸留水を加えて全量
を９９μｌとし、２．５単位／μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポ
リメラーゼを１μｌ加えた後、９４℃、６０℃及び７２
℃の順序でそれぞれ１分間インキュベートするサイクル
を３０回繰返してＰＣＲ反応させたところ、配列表にお
ける配列番号２５に示す塩基配列と、その塩基配列の３
´末端に連結された終止コドンＴＡＧ及び制限酵素Ｎｏ
ｔＩによる認識部位並びに５´末端に連結された配列番
号２４に示す塩基配列の第５７乃至６９番目の塩基配列
をそれぞれ含んでなるＤＮＡ断片２を得た。
【００３４】０．５ｍｌ容反応管にこのようにして得た
ＤＮＡ断片１及び２をそれぞれ１ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩
衝液を１０μｌ、さらに、２５ｍＭ ｄＮＴＰミックス
を１μｌとり、滅菌蒸留水で９９μｌとし、９４℃で３
分間インキュベートし、３７℃まで徐々に冷却し、１５
分間インキュベートした後、２．５単位／μｌ Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加え、７２℃まで徐々に
昇温し、２分間インキュベートし、センスプライマー１
及びアンチセンスプライマー２をそれぞれ適量加え、９
４℃で１分間、６０℃で１分間及び７２℃で１分３０秒
間の順序でインキュベートするサイクルを３０回繰返し
てさらにＰＣＲ反応させたところ、配列表における配列
番号２６に示す塩基配列を含んでなるＤＮＡ断片３が得
られた。
【００３５】次に、常法にしたがって、配列表における
配列番号２６に示す塩基配列の第２８７番目のグアニン
をシトシンに置換するための変異センスプライマーとし
ての５´−ＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＡＡＡＡ
ＴＴＴＣＡＡＣＴＣ−３´で表される塩基配列のオリゴ
ヌクレオチドを化学合成した。そして、ＤＮＡ断片３を
鋳型とし、センスプライマー２に代えてこの変異センス
プライマーを用いた以外はＤＮＡ断片２の場合と同様に
ＰＣＲ反応させたところ、配列表における配列番号２６
に示す塩基配列の第２８７番目の塩基がシトシンである
こと以外は配列番号２６の塩基配列における第２７６乃
至５７０番目と同一の塩基配列を含有するＤＮＡ断片４
が得られた。
【００３６】別途、常法にしたがって、配列表における
配列番号２６に示す塩基配列の第２８７番目のグアニン
をシトシンに置換するための変異アンチセンスプライマ
ーとしての５´−ＧＡＧＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＣＴＣＡ
ＧＡＣＴＴＣＡＣＡＧＡＧ−３´で表される塩基配列の
オリゴヌクレオチドを化学合成した。そして、ＤＮＡ断
片３を鋳型とし、アンチセンスプライマー１に代えてこ
の変異アンチセンスプライマーを用いた以外はＤＮＡ断
片１の場合と同様にＰＣＲ反応させたところ、配列表に
おける配列番号２６に示す塩基配列の第２８７番目の塩
基がシトシンであること以外は配列番号２６の塩基配列
における第１乃至３０４番目と同一の塩基配列を含有す
るＤＮＡ断片５が得られた。
【００３７】このようにして得たＤＮＡ断片４及び５を
鋳型にした以外は、ＤＮＡ断片３の場合と同様にＰＣＲ
反応させたところ、配列表における配列番号６に示すア
ミノ酸をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片６を得
た。このＤＮＡ断片６は、配列表における配列番号１５
に示す塩基配列と、その塩基配列の５´末端に連結され
た配列番号２４に示す塩基配列及び制限酵素ＸｈｏＩに
よる認識部位と、３´末端に連結された終止コドンＴＡ
Ｇ及び制限酵素ＮｏｔＩによる認識部位からなってい
た。
【００３８】その後、常法にしたがって、このＤＮＡ断
片６を制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩにより切断し、得
られた５５５塩基対からなるＤＮＡ断片を２５ｎｇと
り、予め制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩにより同様に切
断しておいたインビトロジェン製プラスミドベクター
『ｐＣＤＭ８』を１０ｎｇ加え、宝酒造製ライゲーショ
ン・キット『ライゲーション・キット・バージョン２』
を用いて１６℃で３０分間インキュベートした後、クロ
ーニングしたところ、４，４９４塩基対からなる自律複
製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１
２』が得られた。図１に示したように、この組換えＤＮ
Ａにおいては、配列表における配列番号１５に示す塩基
配列を含むｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』がヒトイ
ンターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナ
ルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連
結されていた。配列表における配列番号１５に示す塩基
配列は、そこに併記したアミノ酸配列に見られるよう
に、配列番号４に示すアミノ酸配列の野生型ポリペプチ
ドにおける第６８番目のシステインがセリンに置換され
た、配列番号６に示すアミノ酸配列をコードするもので
ある。
【００３９】対照として、ＤＮＡ断片６に代えてＤＮＡ
断片３を用いた以外は上記と同様に処置して、４，４９
４塩基対からなる自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳ
ＨＩＧＩＦ／ＷＴ』を得た。図２に見られるように、こ
の組換えＤＮＡにおいては、野生型ポリペプチドをコー
ドする配列表における配列番号２５に示す塩基配列を有
するｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＷＴ』がヒトインターフェロ
ン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドを
コードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されてい
た。
【００４０】
【実施例Ａ−１（ｂ）】 〈形質転換体によるポリペプチドの製造〉実施例Ａ−１
（ａ）の方法により得た組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩ
Ｆ／ＭＵＴ１２』を通常のコンピテントセル法によりイ
ンビトロジェン製大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３株に導入
し、得られた形質転換体を２０μｇ／ｍｌアンピシリン
及び１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンをそれぞれ含むＬ
培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培
養した。培養物を遠心分離して菌体を分離し、これに通
常のアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡを抽出
した。
【００４１】６ウェルマイクロプレートに１０％（ｖ／
ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭＥ培地（ｐＨ７．４）
を２．５ｍｌ／ウェルずつ分注し、アフリカミドリザル
の腎臓に由来する株化細胞の一種であるＣＯＳ−１細胞
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）を１．８×１０5個／ウ
ェルの割合で接種した後、５％ＣＯ2インキュベーター
中、３７℃で２４時間培養した。培養物から上清を除
き、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）により
平衡化したＤＭＥ培地により洗浄した後、２．８μｇ／
ｍｌの上記で抽出した組換えＤＮＡ、５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．４ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン及び０．１ｍＭクロロキンをそれぞれ
含むＤＭＥ培地を１．８ｍｌ／ウェルずつ分注し、５％
ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で４時間培養した。
上清を除き、１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルフォキシド
及び１４０ｍＭ ＮａＣｌをそれぞれ含む１０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．４）を２．５ｍｌ／ウェルずつ加え、
室温下で２分間静置し、再度上清を除き、５０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を含むＤＭＥ培地により
細胞を洗浄した後、コスモバイオ製培養培地『ＣＯＳ培
地』を２．５ｍｌ／ウェル加え、５％ＣＯ2 インキュベ
ーター中、３７℃で３日間培養した。培養物を同じ特許
出願人による特開平８−２３１５９８号公報に記載され
たモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロッティン
グ法により分析したところ、配列表における配列番号４
に示すアミノ酸配列の第６８番目のシステインがセリン
に置換されたアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞におい
てＩＦＮ−γの産生を誘導するこの発明のポリペプチド
が培養物１ｍｌ当り約２０ｎｇ産生していた。
【００４２】対照として、実施例Ａ−１（ａ）の方法に
より得た組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＷＴ』を組
換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』と同様に
処置したところ、培養物１ｍｌ当り、免疫担当細胞にお
いてＩＦＮ−γの産生を誘導する野生型ポリペプチドが
約１ｎｇ産生していた。このポリペプチド産生量は、組
換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』を用いた
場合の約５％に過ぎないものである。このことは、本実
施例で得たこの発明のポリペプチドが、野生型ポリペプ
チドと比較して、安定性及び生理活性が高いことを示し
ている。
【００４３】
【実施例Ａ−１（ｃ）】 〈ポリペプチドの精製〉実施例Ａ−１（ｂ）の方法によ
り得たこの発明のポリペプチドを含む培養物を遠心分離
し、上清を採取した。別途、同じ特許出願人による特開
平８−２３１５９８号公報に記載された方法にしたがっ
てモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティーク
ロマトグラフィー用ゲルを調製し、プラスチック製円筒
管にカラム状に充填し、燐酸緩衝生理食塩水（以下、
「ＰＢＳ」と言う。）で洗浄した後、上記上清を負荷し
た。カラムを新鮮なＰＢＳで洗浄した後、１Ｍ塩化ナト
リウムを含む０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．
５）を通液し、溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦ
Ｎ−γの産生を誘導するポリペプチドを含む画分を採取
し、ＰＢＳに対して４℃で１８時間透析し、膜濾過によ
り濃縮した後、凍結乾燥して、純度約９５％のポリペプ
チド固状物を得た。収量は原料培養物当り約５０％であ
った。並行して、組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／Ｗ
Ｔ』を用いて得た野生型ポリペプチドを含む培養物を同
様にして精製し、後記理化学的性質の解明において対照
として用いた。
【００４４】
【実施例Ａ−１（ｄ）】 〈分子量〉実施例Ａ−１（ｃ）の方法により得たこの発
明のポリペプチドをユー・ケー・レムリが『ネイチャ
ー』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）
に報告している方法に準じ、還元剤として２％（ｗ／
ｖ）ジチオトレイトールの存在下でＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動したところ、分子量１８，０００
乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ
誘導能あるポリペプチドの主バンドが観察された。な
お、このときの分子量マーカーは、ウシ血清アルブミン
（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０
００ダルトン）、カーボニックアンヒドロラーゼ（３
０，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター
（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン
（１４，４００ダルトン）であった。
【００４５】
【実施例Ａ−１（ｅ）】 〈Ｎ末端アミノ酸配列〉パーキン・エルマー製プロテイ
ン・シーケンサー『４７３Ａ型』を使用し、常法にした
がって分析したところ、実施例Ａ−１（ｃ）の方法によ
り得たこの発明のポリペプチドは、Ｎ末端に配列表にお
ける配列番号２７に示すアミノ酸配列を有していた。
【００４６】
【実施例Ａ−１（ｆ）】 〈安定性〉実施例Ａ−１（ｃ）の方法により得たこの発
明のポリペプチド及び野生型ポリペプチドをＣＯＳ培地
にポリペプチド固形物として約１０ｎｇ／ｍｌになるよ
うにそれぞれ別々に溶解し、溶液を４０℃で２４時間イ
ンキュベートした。インキュベート開始から０時間、
０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時
間、１２時間及び２４時間後にそれぞれの溶液からサン
プリングし、そのＩＦＮ−γ誘導能を後記実施例Ａ−１
（ｇ）の方法により測定することにより活性経時変化を
調べた。そして、インキュベート開始から０時間後のＩ
ＦＮ−γ誘導能を基準にして、各個のインキュベーショ
ン時間における残存活性の百分率（％）を計算した。結
果を図３に示す。
【００４７】図３の結果に見られるように、本実施例の
ポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較して安定性が
有意に高く、生理活性がより長時間持続した。このこと
は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生型ポリペ
プチドの生理活性を損なうことなく安定性を高めるのに
有効であることを物語っている。
【００４８】
【実施例Ａ−１（ｇ）】 〈免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生〉ヒト急性骨
髄性白血病に由来する株化細胞の一種であるＫＧ−１細
胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４６）を血清無含有のＲＰＭＩ
−１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度３×１０5個
／ｍｌになるように接種し、１０％ＣＯ2インキュベー
ター中、３７℃で４日間培養した後、細胞を採取し、１
０％仔牛血清アルブミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０
培地（ｐＨ７．４）に細胞密度３×１０6 個／ｍｌにな
るように浮遊させた。この浮遊液を９６ウェルマイクロ
プレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注し、実施例Ａ−
１（ｃ）の方法により得たこの発明のポリペプチドか野
生型ポリペプチドのいずれかを適宜希釈して０．１ｍｌ
／ウェル加えた後、１０％ＣＯ2 インキュベーター中、
３７℃で２４時間培養した後、各ウェルから培養上清を
０．１ｍｌずつ採取し、通常の酵素免疫測定法によりＩ
ＦＮ−γを測定した。並行して、ポリペプチドを一切省
略した系を設け、上記と同様に処置して対照とした。結
果を表１に示す。なお、表１中のＩＦＮ−γ含量は、米
国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手したＩＦＮ−γ標
品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づき国際単位（Ｉ
Ｕ）に換算している。
【００４９】
【表１】
【００５０】表１の結果は、この発明のポリペプチドを
作用させると、免疫担当細胞としてのＫＧ−１細胞にお
いてＩＦＮ−γの産生が誘導されたことを示している。
そして、このときのＩＦＮ−γ産生は野生型ポリペプチ
ドの場合と同等以上であった。
【００５１】
【実施例Ａ−１（ｈ）】 〈ＮＫ細胞による細胞障害性の増強〉ヘパリン加注射器
により健常者から血液を採取し、ＰＢＳにより２倍希釈
した後、フィコール上に重層し、遠心分離して高密度リ
ンパ球を得た。このリンパ球を細胞密度１×１０6 個／
ｍｌになるように１０μｇ／ｍｌカナマイシン、５×１
０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール及び１０％（ｖ／
ｖ）ウシ胎児血清をそれぞれ含むＲＰＭＩ−１６４０培
地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、１２ウェルマイクロプレ
ートに０．５ｍｌ／ウェルずつ分注した。そして、実施
例Ａ−１（ｃ）の方法により得たこの発明のポリペプチ
ドか野生型ポリペプチドのいずれかを上記と同一の新鮮
な培地に適宜希釈してマイクロプレートに１．５ｍｌ／
ウェルずつ加え、さらに、５０単位／ｍｌ組換え型ヒト
インターロイキン２を含むか含まない上記と同一の新鮮
な培地を０．５ｍｌ／ウェル加えた後、５％ＣＯ2 イン
キュベーター中、３７℃で２４時間培養し、ＰＢＳで洗
浄して効果細胞としてのＮＫ細胞を含む培養リンパ球を
得た。
【００５２】次いで、常法により51Ｃｒ標識したＮＫ細
胞感受性標的細胞としてのヒト慢性骨髄性白血病に由来
する株化細胞の一種であるＫ−５６２細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２４３）を９６ウェルマイクロプレートに１×１
０4 個／ウェルずつとり、上記で調製した培養リンパ球
を効果細胞／標的細胞比で２．５：１、５：１又は１
０：１の割合となるように加え、５％ＣＯ2 インキュベ
ーター中、３７℃で４時間培養した後、常法にしたがっ
て培養上清の放射能を測定して死滅標的細胞数を求め
た。そして、各々の系につき、細胞障害性の目安とすべ
く、試験に供した標的細胞数に対する死滅標的細胞数の
百分率（％）を計算した。結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
【００５４】表２の結果は、この発明のポリペプチドに
ＮＫ細胞による細胞障害性を増強する性質があり、しか
も、この性質は野生型ポリペプチドと同等以上であるこ
とを示している。表２の結果に見られるように、この細
胞障害性の増強は、インターロイキン２が共存すると、
一段と増強される。
【００５５】
【実施例Ａ−１（ｉ）】 〈ＬＡＫ細胞の生成誘導〉常法により51Ｃｒ標識したＮ
Ｋ細胞非感受性標的細胞としてのヒトバーキットリンパ
腫に由来する株化細胞の一種であるＲａｊｉ細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ８６）を９６ウェルマイクロプレートに１
×１０4 個／ウェルずつとり、７２時間培養した以外は
実施例Ａ−１（ｇ）と同様にして調製した効果細胞とし
てのＬＡＫ細胞を含む培養リンパ球を効果細胞／標的細
胞比で５：１、１０：１又は２０：１の割合で加え、５
％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で４時間培養した
後、常法にしたがって培養上清の放射能を測定し、実施
例Ａ−１（ｈ）と同様にして細胞障害性（％）を計算し
た。結果を表３に示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】表３の結果は、この発明のポリペプチドに
ＬＡＫ細胞の生成を誘導する性質があり、しかも、この
性質は野生型ポリペプチドと同等以上であることを示し
ている。表３の結果に見られるように、この誘導は、イ
ンターロイキン２が共存すると、一段と増強される。
【００５８】
【実施例Ａ−１（ｊ）】 〈急性毒性試験〉常法にしたがって、８週齢のマウスに
実施例Ａ−１（ｃ）の方法により得たこの発明のポリペ
プチドを経皮、経口又は腹腔内に注射投与した。その結
果、この発明のポリペプチドのＬＤ５０は、いずれの投
与経路によっても約１ｍｇ／ｋｇマウス体重以上である
ことが判明した。このことは、この発明のポリペプチド
がヒトに対する医薬品に配合して安全であることを裏付
けている。
【００５９】
【実施例Ａ−２】 〈ポリペプチドの製造〉実施例Ａ−１（ａ）の方法によ
り得たＤＮＡ断片６を鋳型に用い、配列表における配列
番号４に示すアミノ酸配列の第３８番目のシステインを
セリンに置換するための変異センスプライマー及び変異
アンチセンスプライマーとして、それぞれ５´−ＣＴＧ
ＡＴＴＣＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＡＡＴＧＣ−３´及び
５´−ＧＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＡＧＡＡＴ
ＣＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチド
を用いた以外は実施例Ａ−１（ａ）と同様にして、配列
表における配列番号１６に示す塩基配列を含む自律複製
可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』
を得た。図４に示すように、この組換えＤＮＡにおいて
は、配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列をコ
ードするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』がヒトイン
ターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナル
ペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結
されていた。
【００６０】この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と
同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換
体を培養したところ、配列表における配列番号７に示す
アミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍｌ
当り約５０ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ−
１の方法により精製し、理化学的性質を調べたところ、
本実施例のポリペプチドは実施例Ａ−１の方法により得
たこの発明のポリペプチドと同様の分子量とＮ末端アミ
ノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、実施
例Ａ−１（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、図
３に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生型
ポリペプチドと比較して安定性が有意に高かった。これ
らの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生
型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を高
めるのに有効であることを物語っている。
【００６１】
【実施例Ａ−３】 〈ポリペプチドの製造〉実施例Ａ−１（ａ）の方法によ
り得たＤＮＡ断片６を鋳型に用い、配列表における配列
番号４に示すアミノ酸配列の第１２７番目のシステイン
をセリンに置換するための変異センスプライマー及び変
異アンチセンスプライマーとして、それぞれ５´−ＣＴ
ＴＴＣＴＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧ−
３´及び５´−ＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＧ
ＣＴＡＧＡＡＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌ
クレオチドを用いた以外は実施例Ａ−１（ａ）と同様に
して、配列表における配列番号１７に示す塩基配列を含
む自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／Ｍ
ＵＴ２５』を得た。図５に示すように、この組換えＤＮ
Ａにおいては、配列表における配列番号８に示すアミノ
酸配列をコードするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ２５』
がヒトインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂ
のシグナルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの
下流に連結されていた。
【００６２】この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と
同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換
体を培養したところ、配列表における配列番号８に示す
アミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍｌ
当り約３０ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ−
１の方法により精製し、理化学的性質を調べたところ、
本実施例のポリペプチドは実施例Ａ−１の方法により得
たこの発明のポリペプチドと同様の分子量とＮ末端アミ
ノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、実施
例Ａ−１（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、図
３に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生型
ポリペプチドと比較して安定性が有意に高かった。これ
らの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生
型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を高
めるのに有効であることを物語っている。
【００６３】
【実施例Ａ−４】 〈ポリペプチドの製造〉実施例Ａ−２の方法により得た
組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』におけ
る配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列をコードする
ｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』を鋳型に用い、配列
表における配列番号４に示すアミノ酸配列の第１２７番
目のシステインをセリンに置換するための変異センスプ
ライマー及び変異アンチセンスプライマーとして、それ
ぞれ５´−ＣＴＴＴＣＴＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧ
ＡＧＡＧＡＧ−３´及び５´−ＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴ
ＴＣＡＧＡＡＧＣＴＡＧＡＡＡＧ−３´で表される塩基
配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例Ａ−１
（ａ）と同様にして、配列表における配列番号１８に示
す塩基配列を含む自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳ
ＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ３２』を得た。図６に示すように、
この組換えＤＮＡにおいては、配列表における配列番号
９に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ
／ＭＵＴ３２』がヒトインターフェロン−αにおけるサ
ブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配
列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。
【００６４】この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と
同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換
体を培養したところ、配列表における配列番号９に示す
アミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍｌ
当り約８０ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ−
１の方法により精製し、理化学的性質を調べたところ、
本実施例のポリペプチドは実施例Ａ−１の方法により得
たこの発明のポリペプチドと同様の分子量とＮ末端アミ
ノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、実施
例Ａ−１（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、図
３に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生型
ポリペプチドと比較して安定性が有意に高かった。これ
らの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生
型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を高
めるのに有効であることを物語っている。
【００６５】
【実施例Ａ−５】 〈ポリペプチドの製造〉実施例Ａ−４の方法により得た
組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ３２』におけ
る配列表の配列番号１８に示す塩基配列のｃＤＮＡ『Ｉ
ＧＩＦ／ＭＵＴ３２』を鋳型に用い、配列表における配
列番号４に示すアミノ酸配列の第７６番目のシステイン
をセリンに置換するための変異センスプライマー及び変
異アンチセンスプライマーとして、それぞれ５´−ＣＡ
ＡＣＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡ−３´及び
５´−ＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧ
−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを用い
た以外は実施例Ａ−１（ａ）と同様にして、配列表にお
ける配列番号１９に示す塩基配列を含む自律複製可能な
組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ４１』を得
た。図７に示すように、この組換えＤＮＡにおいては、
配列表における配列番号１０に示すアミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ４１』がヒトインタ
ーフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシグナルペ
プチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結さ
れていた。
【００６６】この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と
同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換
体を培養したところ、配列表における配列番号１０に示
すアミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍ
ｌ当り約６ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ−
１の方法により精製し、理化学的性質を調べたところ、
本実施例のポリペプチドは実施例Ａ−１の方法により得
たポリペプチドと同様の分子量とＮ末端アミノ酸配列を
有し、同様に毒性が低かった。さらに、実施例Ａ−１
（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、図３に見ら
れるように、本実施例のポリペプチドは野生型ポリペプ
チドと比較して安定性が著しく高かった。これらの事実
は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生型ポリペ
プチドの生理活性を損なうことなく安定性を高めるのに
極めて有効であることを物語っている。
【００６７】
【実施例Ａ−６】 〈ポリペプチドの製造〉実施例Ａ−２の方法により得た
組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』におけ
る配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列をコードする
ｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』を鋳型に用い、配列
表における配列番号４に示すアミノ酸配列における第７
６番目のシステインをアラニンに変換するための変異セ
ンスプライマー及び変異アンチセンスプライマーとし
て、それぞれ、５´−ＣＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＡＡＣ
ＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＣ−３´及び５´−ＴＴＴＧＴ
ＴＣＴＣＡＧＣＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧ−３´で表され
る塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例
Ａ−１（ａ）と同様にして、配列表における配列番号２
０に示す塩基配列を含む自律複製可能な組換えＤＮＡ
『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ３５』を得た。図８に示す
ように、この組換えＤＮＡにおいては、配列表における
配列番号１１に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ
『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ３５』がヒトインターフェロン−α
におけるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコード
する塩基配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。
【００６８】この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と
同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換
体を培養したところ、配列表における配列番号１１に示
すアミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍ
ｌ当り約６０ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ
−１の方法により精製し、理化学的性質を調べたとこ
ろ、本実施例ポリペプチドは実施例Ａ−１の方法により
得たこの発明のポリペプチドと同様の分子量とＮ末端ア
ミノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、実
施例Ａ−１（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、
図３に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生
型ポリペプチドと比較して安定性が著しく高かった。こ
れらの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野
生型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を
高めるのに極めて有効であることを物語っている。
【００６９】
【実施例Ａ−７】 〈ポリペプチドの製造〉実施例Ａ−４の方法により得た
組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ３２』におけ
る配列表の配列番号１８に示すアミノ酸配列をコードす
るｃＤＮＡ『ＩＧＩＦ／ＭＵＴ３２』を鋳型に用い、配
列表における配列番号４に示すアミノ酸配列の第７６番
目のシステインをアラニンに置換するための変異センス
プライマー及びアンチセンスプライマーとして、それぞ
れ、５´−ＣＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴ
ＴＡＴＴＴＣＣ−３´及び５´−ＴＴＴＧＴＴＣＴＣＡ
ＧＣＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧ−３´で表される塩基配列
のオリゴヌクレオチドを用いた以外は実施例Ａ−１
（ａ）と同様にして、配列表における配列番号２１に示
す塩基配列を含む自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳ
ＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ４２』を得た。図９に示すように、
この組換えＤＮＡにおいては、配列表における配列番号
１２に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ＩＧＩ
Ｆ／ＭＵＴ４２』がヒトインターフェロン−αにおける
サブタイプα２ｂをシグナルペプチドをコードする塩基
配列ＩＦＮｓｓの下流に連結されていた。
【００７０】この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と
同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換
体を培養したところ、配列表における配列番号１２に示
すアミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍ
ｌ当り約３０ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ
−１の方法により精製し、理化学的性質を調べたとこ
ろ、本実施例ポリペプチドは実施例Ａ−１の方法により
得たこの発明のポリペプチドと同様の分子量とＮ末端ア
ミノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、実
施例Ａ−１（ｆ）の方法により安定性を調べたところ、
図３に見られるように、本実施例のポリペプチドは野生
型ポリペプチドと比較して安定性が著しく高かった。こ
れらの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野
生型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定性を
高めるのに極めて有効であることを物語っている。
【００７１】
【実施例Ａ−８】 〈ポリペプチドの製造〉
【００７２】
【実施例Ａ−８（ａ）】 〈組換えＤＮＡの構築〉実施例Ａ−１（ａ）に記載のＤ
ＮＡ断片１を得るためのＰＣＲ反応において、アンチセ
ンスプライマー１に代えて、５′−ＣＧＧＣＣＡＡＡＧ
ＴＴＧＣＣＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧ−３′で表さ
れる塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いた以外は同様
にしてＰＣＲ反応を行った。その結果、配列表における
配列番号２４に示す塩基配列と、その塩基配列の５´末
端に連結された制限酵素ＸｈｏＩによる認識部位及び３
´末端に連結された配列番号２８に示す塩基配列の第１
乃至１１番目の塩基配列をそれぞれ含んでなるＤＮＡ断
片７を得た。
【００７３】同じ特許出願人による特開平８−２７１８
９号公報に記載された方法にしたがって、配列表におけ
る配列番号５に示すアミノ酸配列を有する野生型ポリペ
プチドをコードする配列表における配列番号２８に示す
塩基配列を含む組換えＤＮＡ『ｐＭＧＴＧ−１』を調製
した。配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列の
野生型ポリペプチドは、その第１６乃至２１番目、第２
９乃至３４番目及び、第５０乃至５４番目のアミノ酸よ
りなる部分に、それぞれ、部分アミノ酸配列として、配
列表における配列番号１、２及び３に示すアミノ酸配列
を含んでいる。一方、センスプライマー３及びアンチセ
ンスプライマー３として、５′−ＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧ
ＧＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＴＧ−
３′及び５′−ＡＣＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＣＴ
ＴＴＧＡＴＧＴＡＡＧＴＴＡＧ−３′で表されるオリゴ
ヌクレオチドを化学合成した。実施例Ａ−１（ａ）に記
載のＤＮＡ断片２を得るためのＰＣＲ反応において、組
換えＤＮＡ『ｐＨＩＧＩＦ』、センスプライマー２及び
アンチセンスプライマー２に代えて、ここで得た組換え
ＤＮＡ『ｐＭＧＴＧ−１』、センスプライマー３及びア
ンチセンスプライマー３をそれぞれ用いた以外は同様に
してＰＣＲ反応を行った。その結果、配列表における配
列番号２８に示す塩基配列と、その塩基配列の３´末端
に連結された終止コドンＴＡＧ及び制限酵素ＮｏｔＩに
よる認識部位並びに５´末端に連結された配列番号２４
に示す塩基配列の第５７乃至６９番目の塩基配列をそれ
ぞれ含んでなるＤＮＡ断片８を得た。
【００７４】実施例Ａ−１（ａ）に記載のＤＮＡ断片３
を得るためのＰＣＲにおいて、ＤＮＡ断片１、ＤＮＡ断
片２及びアンチセンスプライマー２に代えて、上記で得
たＤＮＡ断片７、ＤＮＡ断片８及びアンチセンスプライ
マー３をそれぞれ用いたこと以外は同様にしてＰＣＲ反
応を行った。その結果、配列表における配列番号２９に
示す塩基配列を含んでなるＤＮＡ断片９を得た。
【００７５】実施例Ａ−１（ａ）に記載のＤＮＡ断片４
を得るためのＰＣＲ反応において、ＤＮＡ断片３に代え
て上記で得たＤＮＡ断片９を用いるとともに、変異セン
スプライマーとして配列表における配列番号２９に示す
塩基配列の第１０３番目のチミンをグアニンに、第１０
４番目のグアニンをシトシンに置換するための５′−Ｇ
ＧＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＧＣＴＡＣＡＡＣＣ−３′で表
されるオリゴヌクレオチドを化学合成して用い、そして
アンチセンスプライマー２に代えて上記のアンチセンス
プライマー３を用いたこと以外は同様にしてＰＣＲ反応
を行った。その結果、配列表における配列番号２９に示
す塩基配列の第１０３番目及び第１０４番目の塩基がそ
れぞれグアニン及びシトシンであること以外は配列番号
２９の塩基配列における第９１乃至５７０番目の塩基か
らなる配列と同一の塩基配列を含有するＤＮＡ断片１０
を得た。
【００７６】実施例Ａ−１（ａ）に記載のＤＮＡ断片５
を得るためのＰＣＲ反応において、ＤＮＡ断片３に代え
て上記で得たＤＮＡ断片９を用いるとともに、変異アン
チセンスプライマーとして配列表における配列番号２９
に示す塩基配列の第１０３番目のチミンをグアニンに、
第１０４番目のグアニンをシトシンに置換するための
５′−ＧＧＴＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＣＣ−
３′で表されるオリゴヌクレオチドを化学合成して用い
たこと以外は同様にしてＰＣＲ反応を行った。その結
果、配列表における配列番号２９に示す塩基配列の第１
０３番目及び第１０４番目の塩基がそれぞれグアニン及
びシトシンであること以外は配列番号２９の塩基配列に
おける第１乃至１１１番目の塩基からなる配列と同一の
塩基配列を含有するＤＮＡ断片１１を得た。
【００７７】実施例Ａ−１（ａ）に記載のＤＮＡ断片３
を得るためのＰＣＲ反応において、ＤＮＡ断片１、ＤＮ
Ａ断片２及びアンチセンスプライマー２に代えて、上記
で得たＤＮＡ断片１０、ＤＮＡ断片１１及びアンチセン
スプライマー３をそれぞれ用いた以外はすべて同様にし
てＰＣＲ反応を行った。その結果、配列表における配列
番号１３に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を含
むＤＮＡ断片１２を得た。このＤＮＡ断片１２は、配列
表における配列番号２２に示す塩基配列と、その塩基配
列の５′末端に連結された配列番号２４に示す塩基配列
及び制限酵素ＸｈｏＩによる認識部位と、３′末端に連
結された終止コドンＴＡＧ及び制限酵素ＮｏｔＩによる
認識部位からなっていた。
【００７８】実施例Ａ−１（ａ）に記載の組換えＤＮＡ
『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』を得るための一連の
処理において、ＤＮＡ断片６に代えて上記で得たＤＮＡ
断片１２を用いた以外は同様にして処理したところ、自
律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＭＵＴ
１１』が得られた。図１０に示すように、この組換えＤ
ＮＡにおいては、配列表における配列番号２２に示す塩
基配列を含むｃＤＮＡ『ｍＩＧＩＦ／ＭＵＴ１１』がヒ
トインターフェロン−αにおけるサブタイプα２ｂのシ
グナルペプチドをコードする塩基配列ＩＦＮｓｓの下流
に連結されていた。配列表における配列番号２２に示す
塩基配列は、そこに併記したアミノ酸配列に見られるよ
うに、配列番号５に示すアミノ酸配列の野生型ポリペプ
チドにおける第７番目のシステインがアラニンに置換さ
れたアミノ酸配列をコードするものである。
【００７９】対照として、実施例（ａ）に記載の組換え
ＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』を得た一連の
処理において、ＤＮＡ断片６に代えて上記で得たＤＮＡ
断片９を用いた以外は同様にして処理したところ、自律
複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＷＴ』が
得られた。図１１に示すようにこの組換えＤＮＡにおい
ては、野生型ポリペプチドをコードする配列表における
配列番号２８に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡ『ｍＩ
ＧＩＦ／ＷＴ』がヒトインターフェロン−αにおけるサ
ブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配
列『ＩＦＮｓｓ』の下流に連結されていた。
【００８０】
【実施例Ａ−８（ｂ）】 〈形質転換体によるポリペプチドの製造〉実施例Ａ−１
（ｂ）に記載のポリペプチドの製造において、組換えＤ
ＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』に代えて実施例
Ａ−８（ａ）で得た組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／
ＭＵＴ１１』を用いた以外は同様にして、組換えＤＮＡ
を抽出し、組換えＤＮＡをＣＯＳ−１細胞に導入し、組
換えＤＮＡの導入されたＣＯＳ−１細胞を培養して培養
物を得た。培養物を、同じ特許出願人による特開平８−
２１７７９８号公報に記載されたモノクローナル抗体を
用いるウェスタンブロッティング法により分析したとこ
ろ、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列の第
７番目のシステインがアラニンに置換されたアミノ酸配
列を有し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘
導するこの発明のポリペプチドが培養物１ｍｌ当り約２
０ｎｇ産生していた。
【００８１】対照として、実施例Ａ−８（ａ）の方法に
より得た組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＭＩＧＩＦ／ＷＴ』
を、組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＭＵＴ１１』と
同様に処理したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−
γの産生を誘導するポリペプチドが産生された。このポ
リペプチド産生量は、『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＭＵＴ１
１』を用いた場合と比較して有意に低かった。このこと
は、本実施例で得たこの発明のポリペプチドが、野生型
ポリペプチドと比較して、安定性及び生理活性が高いこ
とを示している。
【００８２】
【実施例Ａ−８（ｃ）】 〈ポリペプチドの精製〉実施例Ａ−８（ｂ）の方法によ
り得たこの発明のポリペプチドを含む培養液を遠心分離
し、上清を採取した。別途、同じ特許出願人による特開
平８−２１７７９８号公報に記載された方法にしたがっ
てモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティーク
ロマトグラフィー用ゲルを調製し、プラスチック製円筒
管にカラム状に充填し、ＰＢＳで洗浄した後、上記上清
を負荷した。カラムを新鮮なＰＢＳで洗浄した後、３５
ｍＭエチルアミン水溶液（ｐＨ１０．８）を通液し、溶
出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘
導するポリペプチドを含む画分を採取し、ＰＢＳに対し
て透析し、膜濾過により濃縮し、凍結乾燥して純度約９
５％のポリペプチド固状物を得た。並行して、組換えＤ
ＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＷＴ』を用いて得た野生型ポ
リペプチドを含む培養物を同様にして精製し、後記理化
学的性質の解明における対照として用いた。
【００８３】
【実施例Ａ−８（ｄ）】 〈分子量〉実施例Ａ−８（ｃ）での方法により得たこの
発明のポリペプチドを、実施例Ａ−１（ｄ）に準じてＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したとこ
ろ、分子量１８，５００乃至１９，５００ダルトンに相
当する位置にＩＦＮ−γ産生能あるポリペプチドの主バ
ンドが観察された。
【００８４】
【実施例Ａ−８（ｅ）】 〈Ｎ末端アミノ酸配列〉実施例Ａ−１（ｅ）に準じて分
析したところ、実施例Ａ−８（ｃ）の方法により得たこ
の発明のポリペプチドは、Ｎ末端に配列表における配列
番号３０に示すアミノ酸配列を有していた。
【００８５】
【実施例Ａ−８（ｆ）】 〈安定性〉実施例Ａ−８（ｃ）の方法により得たこの発
明のポリペプチド及び野生型ポリペプチドを、０．２ｇ
／ｍｌマルトースを含むＰＢＳにポリペプチド固形物と
して約１００ｎｇ／ｍｌになるようにそれぞれ別々に溶
解し、溶液を４０℃で２４時間インキュベートした。イ
ンキュベート開始から０時間、３時間、９時間及び２４
時間にそれぞれの溶液から一部をサンプリングしてその
ＩＦＮ−γ産生の誘導能の経時変化を調べた。ＩＦＮ−
γ産生の誘導能は、後記実施例Ａ−８（ｇ）に詳述した
方法により求め、インキュベート開始後０時間の値を基
準にして、各インキュベーション時間における残存活性
の百分率（％）を計算した。結果を図１２に示す。
【００８６】図１２の結果に見られるように、本発明の
ポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較して安定性が
有意に高く、生理活性がより長時間持続した。このこと
は、本実施例におけるアミノ酸の置換が、野生型ポリペ
プチドの生理活性を損なうことなく安定性を高めるのに
有効であることを物語っている。
【００８７】
【実施例Ａ−８（ｇ）】 〈免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生〉Ｃ３Ｈ／Ｈ
ｅＪマウスより免疫担当細胞として脾細胞を採取し、細
胞を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ−
１６４０培地に浮遊させ、細胞浮遊液に実施例Ａ−８
（ａ）の方法で得たこの発明のポリペプチド又は野生型
ポリペプチドを、コンカナバリンＡ又はインターロイキ
ン２の存在するか又はしない条件下で添加し、培養した
後、産生したＩＦＮ−γを酵素免疫測定法により測定す
ることにより、ＩＦＮ−γの産生の誘導能を調べた。そ
の結果、この発明のポリペプチドは、免疫担当細胞とし
てのマウス脾細胞におけるＩＦＮ−γの産生を誘導し、
その誘導能は、野生型ポリペプチドの場合と同等以上で
あることが確認された。
【００８８】
【実施例Ａ−８（ｈ）】 〈急性毒性試験〉実施例Ａ−１（ｊ）に記載の方法にし
たがって、実施例Ａ−８（ａ）の方法で得たこの発明の
ポリペプチドの急性毒性試験を実施した。その結果、当
該ポリペプチドのＬＤ５０は、いずれの投与経路によっ
ても約１ｍｇ／ｋｇマウス体重以上であり、哺乳動物に
対する医薬品に配合して安全であることが確認された。
【００８９】
【実施例Ａ−９】 〈ポリペプチドの製造〉実施例Ａ−８（ａ）の方法によ
り得たＤＮＡ断片９を鋳型に用い、配列表における配列
番号５に示すアミノ酸配列の１２５番目のシステインを
セリンに置換するための変異センスプライマー及び変異
アンチセンスプライマーとして、それぞれ、５′−ＧＧ
ＡＣＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴＡＧＣＣＡＡＡＡＧＧ−
３′及び５′−ＣＣＴＴＴＴＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＡ
ＡＧＴＧＴＣＣ−３′で表される塩基配列のオリゴヌク
レオチドを用いた以外は実施例Ａ−８（ａ）と同様にし
て処理し、配列表における配列番号２３に示す塩基配列
を含む自律複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ
／ＭＵＴ１２』を得た。図１３に示すように、この組換
えＤＮＡにおいては、配列表における配列番号１４に示
すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ『ｍＩＧＩＦ／Ｍ
ＵＴ１２』がヒトインターフェロン−αにおけるサブタ
イプα２ｂのシグナルペプチドをコードする塩基配列Ｉ
ＦＮｓｓの下流に連結されていた。
【００９０】この組換えＤＮＡを実施例Ａ−１（ｂ）と
同様にしてＣＯＳ−１細胞に導入し、得られた形質転換
体を培養したところ、配列表における配列番号１４に示
すアミノ酸配列を含有するポリペプチドが培養培地１ｍ
ｌ当り約５０ｎｇ産生していた。この培養物を実施例Ａ
−８の方法により精製し、理化学的性質を調べたとこ
ろ、本実施例のポリペプチドは実施例Ａ−８の方法によ
り得たこの発明のポリペプチドと同様の分子量とＮ末端
アミノ酸配列を有し、同様に毒性が低かった。さらに、
実施例Ａ−８（ｆ）の方法により安定性を調べたとこ
ろ、図１２に見られるように、本実施例のポリペプチド
は野生型ポリペプチドと比較して安定性が有意に高かっ
た。これらの事実は、本実施例におけるアミノ酸の置換
が野生型ポリペプチドの生理活性を損なうことなく安定
性を高めるのに有効であることを物語っている。
【００９１】
【実施例Ｂ−１】 〈液剤〉安定剤として１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミ
ンを含む生理食塩水に実施例Ａ−１乃至Ａ−９の方法に
より得たこの発明の精製ポリペプチドのいずれかを１ｍ
ｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾
過により滅菌して７種類の液剤を得た。
【００９２】安定性に優れた本品は、ヒトを含む哺乳動
物の、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、感染症及び免疫疾患
を含む感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼
剤及び点鼻剤として有用である。
【００９３】
【実施例Ｂ−２】 〈乾燥注射剤〉安定剤として１％（ｗ／ｖ）精製ゼラチ
ンを含む生理食塩水１００ｍｌに実施例Ａ−１乃至Ａ−
９の方法により得たこの発明の精製ポリペプチドのいず
れかを１００ｍｇ溶解し、常法にしたがって精密濾過に
より除菌し、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥
した後、密栓して７種類の乾燥製剤を得た。
【００９４】安定性に優れた本品は、ヒトを含む哺乳動
物の、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、感染症及び免疫疾患
を含む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤と
して有用である。
【００９５】
【実施例Ｂ−３】 〈軟膏剤〉滅菌蒸留水に和光純薬工業製カルボキシビニ
ルポリマー『ハイビスワコー１０４』と林原製結晶トレ
ハロース粉末『トレハロース』をそれぞれ濃度１．４％
（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解
し、実施例Ａ−１乃至Ａ−９の方法により得たこの発明
の精製ポリペプチドのいずれかを均一に混合した後、ｐ
Ｈ７．２に調整して、１ｇ当り精製ポリペプチドを約１
ｍｇ含む７種類のペースト状物を得た。
【００９６】延展性と安定性に優れた本品は、ヒトを含
む哺乳動物の、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、感染症及び
免疫疾患を含む感受性疾患の治療・予防するための軟膏
剤として有用である。
【００９７】
【実施例Ｂ−４】 〈錠剤〉林原製無水結晶α−マルトース粉末『ファイン
トース』に実施例Ａ−１乃至Ａ−９の方法により得たこ
の発明の精製ポリペプチドのいずれかと細胞賦活剤とし
てのルミンを均一に混合し、得られる混合物を常法によ
り打錠して製品１錠（約２００ｍｇ）当り精製ポリペプ
チド及びルミンをそれぞれ約１ｍｇ含む７種類の錠剤を
得た。
【００９８】摂取性、安定性に優れ、細胞賦活作用も含
有する本品は、ヒトを含む哺乳動物の、悪性腫瘍、ウイ
ルス性疾患、感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治
療・予防するための錠剤として有用である。
【００９９】
【実施例Ｂ−５】 〈養子免疫療法剤〉悪性リンパ腫患者の末梢血から単核
球を単離し、３７℃に予温した１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡ
Ｂ血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．
２）に細胞密度約１×１０6 個／ｍｌになるように浮遊
させ、養子免疫療法剤として実施例Ａ−１乃至Ａ−７の
方法により得たこの発明の精製ポリペプチドのいずれか
を約１０ｎｇ／ｍｌと組換え型ヒトインターロイキン２
を約１００単位／ｍｌ加え、５％ＣＯ2 インキュベータ
ー中、３７℃で１週間培養した後、遠心分離したＬＡＫ
細胞を採取した。
【０１００】このＬＡＫ細胞は、元の悪性リンパ腫患者
の体内に移入すると、リンパ腫細胞に顕著な細胞障害性
を示し、インターロイキン２のみ用いる養子免疫療法と
比較して有意に高い治療効果を発揮する。なお、ヒト単
核球に代えて腫瘍組織浸潤リンパ球を同様に処置して得
られる細胞障害性Ｔ細胞も、元の患者の体内に移入する
と、ＬＡＫ細胞と同様の効果を発揮する。本実施例の養
子免疫療法剤は、悪性リンパ腫以外に、例えば、悪性腎
腫瘍、悪性黒色腫、大腸癌、肺癌などの固形悪性腫瘍に
も有利に適用できる。
【０１０１】ＩＦＮ−γはウイルス、細菌などに対する
感染防御、悪性腫瘍の増殖抑制、免疫機能の調節作用を
通じてヒトの生体防御、さらには、イムノグロブリンＥ
抗体の産生阻害に多大の関与をすることが知られてい
る。しかも、前述のとおり、ＩＦＮ−γはヒトの感受性
疾患剤としてすでに実用化されており、その対象疾患、
用量、用法及び安全性はほぼ確立した状況にある。一
方、フランセス・アール・バークウィル著、渡部好彦
訳、『サイトカインとがん治療』、１９９１年、東京化
学同人発行などにも記載されているように、ＮＫ細胞及
びＬＡＫ細胞などのキラー細胞を利用する療法は、抗腫
瘍免疫療法を始めとして、多種多様のヒト疾患に対して
試みられ、総じて良好な成果が報告されている。最近で
は、サイトカインを用いるキラー細胞による細胞障害性
の増強又はキラー細胞の精製の誘導と治療効果との関連
性が注目されており、例えば、ティー・フジオカら『ブ
リティッシュ・ジャーナル・オブ・ユーロロジー』、第
７３巻、第１号、２３乃至３１頁（１９９４年）には、
ＬＡＫ細胞とインターロイキン２を併用する抗腫瘍免疫
療法において、インターロイキン２がＬＡＫ細胞の生成
を顕著に誘導し、重篤な毒性や副作用を惹起することな
く、ヒトの転移癌に格別の効果を発揮したことが報告さ
れている。
【０１０２】このように、多種多様のヒト疾患の治療・
予防にＩＦＮ−γやキラー細胞が深く係わり、その完治
又は緩解への多大の寄与が明らかになっている。斯かる
状況において、実施例Ａ−１乃至Ａ−９の結果に見られ
るように、当該ポリペプチドが顕著な毒性を示すことな
く、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する
とともに、ＮＫ細胞による細胞障害性の増強又はＬＡＫ
細胞の生成を誘導したことは、この発明の感受性疾患剤
が重篤な副作用を惹起することなくヒトを含む哺乳動物
に長期間連用でき、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞が
関与する疾患の治療・予防に効果を発揮することを示し
ている。
【０１０３】
【発明の効果】以上説明したごとく、この発明は免疫担
当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する安定なポリ
ペプチドの創製に基づくものである。この発明のポリペ
プチドはアミノ酸配列までが解明された物質であり、し
かも、野生型ポリペプチドと比較して安定性が高いの
で、実用に際して生理活性がより長時間持続する特徴が
ある。これにより、この発明のポリペプチドは細胞培養
によりＩＦＮ−γを製造するためのＩＦＮ−γ誘導剤と
して、さらには、ヒトを含む哺乳動物における、ＩＦＮ
−γ感受性を有するウイルス疾患、感染症、悪性腫瘍、
免疫疾患一般に対する治療剤・予防剤として多種多様の
用途を有することとなる。また、キラー細胞による細胞
障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を兼
備するこの発明のポリペプチドを有効成分とする感受性
疾患剤は、悪性腫瘍などの難治性疾患の治療に格別の効
果を発揮する。
【０１０４】さらに、この発明のポリペプチドは強力な
ＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期
のＩＦＮ−γ産生を誘導でき、また、毒性が極めて低い
ことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起すること
がない。したがって、この発明のポリペプチドは、使用
に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−
γを迅速に誘導できる利点がある。斯くも有用なるポリ
ペプチドは、組換えＤＮＡ技術を利用するこの発明の製
造方法により、所望量を容易に製造することができる。
【０１０５】この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する
ものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある
発明であると言える。
【０１０６】
【配列表】
配列番号：1 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Asp Gln Val Leu Phe 1 5
【０１０７】配列番号：2 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Glu Asp Met Thr Asp 1 5
【０１０８】配列番号：3 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Tyr Lys Asp Ser 1 5
【０１０９】配列番号：4 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１１０】配列番号：5 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155
【０１１１】配列番号：6 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１１２】配列番号：7 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１１３】配列番号：8 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１１４】配列番号：9 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１１５】配列番号：10 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１１６】配列番号：11 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ala Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１１７】配列番号：12 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ala Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１１８】配列番号：13 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Asn Phe Gly Arg Leu His Ala Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155
【０１１９】配列番号：14 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Ser Gln Lys Glu 115 120 125 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155
【０１２０】配列番号：15 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT 48 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC 192 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 TCT GTG AAG TCT GAG AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT 240 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA 288 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG 336 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TGT GAA 384 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG 432 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC 471 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１２１】配列番号：16 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT 48 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TCT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144 Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC 192 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 TCT GTG AAG TCT GAG AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT 240 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA 288 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG 336 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TGT GAA 384 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG 432 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC 471 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１２２】配列番号：17 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT 48 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC 192 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 TCT GTG AAG TCT GAG AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT 240 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA 288 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG 336 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TCT GAA 384 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu 115 120 125 AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG 432 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC 471 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１２３】配列番号：18 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT 48 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TCT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144 Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC 192 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 TCT GTG AAG TCT GAG AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT 240 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA 288 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG 336 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TCT GAA 384 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu 115 120 125 AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG 432 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC 471 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１２４】配列番号：19 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT 48 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TCT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144 Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC 192 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 TCT GTG AAG TCT GAG AAA ATT TCA ACT CTC TCC TCT GAG AAC AAA ATT 240 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA 288 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG 336 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TCT GAA 384 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu 115 120 125 AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG 432 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC 471 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１２５】配列番号：20 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT 48 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TCT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144 Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC 192 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 TCT GTG AAG TCT GAG AAA ATT TCA ACT CTC TCC GCT GAG AAC AAA ATT 240 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ala Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA 288 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG 336 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TGT GAA 384 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG 432 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC 471 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１２６】配列番号：21 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT 48 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TCT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144 Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC 192 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 TCT GTG AAG TCT GAG AAA ATT TCA ACT CTC TCC GCT GAG AAC AAA ATT 240 Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ala Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA 288 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG 336 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TCT GAA 384 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu 115 120 125 AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG 432 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC 471 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１２７】配列番号：22 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 AAC TTT GGC CGA CTT CAC GCT ACA ACC GCA GTA ATA CGG AAT ATA AAT 48 Asn Phe Gly Arg Leu His Ala Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC GTT GAC AAA AGA CAG CCT GTG TTC GAG GAT ATG 96 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 ACT GAT ATT GAT CAA AGT GCC AGT GAA CCC CAG ACC AGA CTG ATA ATA 144 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 TAC ATG TAC AAA GAC AGT GAA GTA AGA GGA CTG GCT GTG ACC CTC TCT 192 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 GTG AAG GAT AGT AAA ATG TCT ACC CTC TCC TGT AAG AAC AAG ATC ATT 240 Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 TCC TTT GAG GAA ATG GAT CCA CCT GAA AAT ATT GAT GAT ATA CAA AGT 288 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 GAT CTC ATA TTC TTT CAG AAA CGT GTT CCA GGA CAC AAC AAG ATG GAG 33 6 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 TTT GAA TCT TCA CTG TAT GAA GGA CAC TTT CTT GCT TGC CAA AAG GAA 384 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 GAT GAT GCT TTC AAA CTC ATT CTG AAA AAA AAG GAT GAA AAT GGG GAT 432 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 AAA TCT GTA ATG TTC ACT CTC ACT AAC TTA CAT CAA AGT 471 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155
【０１２８】配列番号：23 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 AAC TTT GGC CGA CTT CAC TGT ACA ACC GCA GTA ATA CGG AAT ATA AAT 48 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC GTT GAC AAA AGA CAG CCT GTG TTC GAG GAT ATG 96 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 ACT GAT ATT GAT CAA AGT GCC AGT GAA CCC CAG ACC AGA CTG ATA ATA 144 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 TAC ATG TAC AAA GAC AGT GAA GTA AGA GGA CTG GCT GTG ACC CTC TCT 192 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 GTG AAG GAT AGT AAA ATG TCT ACC CTC TCC TGT AAG AAC AAG ATC ATT 240 Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 TCC TTT GAG GAA ATG GAT CCA CCT GAA AAT ATT GAT GAT ATA CAA AGT 288 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 GAT CTC ATA TTC TTT CAG AAA CGT GTT CCA GGA CAC AAC AAG ATG GAG 336 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 TTT GAA TCT TCA CTG TAT GAA GGA CAC TTT CTT GCT AGC CAA AAG GAA 384 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Ser Gln Lys Glu 115 120 125 GAT GAT GCT TTC AAA CTC ATT CTG AAA AAA AAG GAT GAA AAT GGG GAT 432 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 AAA TCT GTA ATG TTC ACT CTC ACT AAC TTA CAT CAA AGT 471 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155
【０１２９】配列番号：24 配列の長さ：69 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..69 特徴を決定した方法：S 配列 ATGGCCTTGA CCTTTGCTTT ACTGGTGGCC CTCCTGGTGC TCAGCTGCAA GTCAAGCTGC 60 TCTGTGGGC 69
【０１３０】配列番号：25 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ヒト 組織：肝臓 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：E 配列 TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT 48 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC 192 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 TCT GTG AAG TGT GAG AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT 240 Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA 288 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG 336 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TGT GAA 384 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG 432 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC 471 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155
【０１３１】配列番号：26 配列の長さ：570 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：5´UTR 存在位置：1..15 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：16..84 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：85..555 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：3´UTR 存在位置：556..570 特徴を決定した方法：S 配列 ACACCTCGAG CCACC ATG GCC TTG ACC TTT GCT TTA CTG GTG GCC CTC CTG 51 Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu -20 -15 GTG CTC AGC TGC AAG TCA AGC TGC TCT GTG GGC TAC TTT GGC AAG CTT 99 Val Leu Ser Cys Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Tyr Phe Gly Lys Leu -10 -5 1 5 GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC 147 Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe 10 15 20 ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC 195 Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp 25 30 35 TGT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA 243 Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys 40 45 50 GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAG 291 Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu 55 60 65 AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTT AAG GAA 339 Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu 70 75 80 85 ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA AGT GAC ATC ATA TTC 387 Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe 90 95 100 TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG ATG CAA TTT GAA TCT 435 Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser 105 110 115 TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT 483 Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu 120 125 130 TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA 531 Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile 135 140 145 ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC TAGGCGGCCG CGTGT 570 Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 150 155
【０１３２】配列番号：27 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：N末端フラグメント 配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser 1 5 10
【０１３３】配列番号：28 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：マウス 組織：肝臓 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：E 配列 AAC TTT GGC CGA CTT CAC TGT ACA ACC GCA GTA ATA CGG AAT ATA AAT 48 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC GTT GAC AAA AGA CAG CCT GTG TTC GAG GAT ATG 96 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 ACT GAT ATT GAT CAA AGT GCC AGT GAA CCC CAG ACC AGA CTG ATA ATA 144 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 TAC ATG TAC AAA GAC AGT GAA GTA AGA GGA CTG GCT GTG ACC CTC TCT 192 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 GTG AAG GAT AGT AAA ATG TCT ACC CTC TCC TGT AAG AAC AAG ATC ATT 240 Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 TCC TTT GAG GAA ATG GAT CCA CCT GAA AAT ATT GAT GAT ATA CAA AGT 288 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 GAT CTC ATA TTC TTT CAG AAA CGT GTT CCA GGA CAC AAC AAG ATG GAG 33 6 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 TTT GAA TCT TCA CTG TAT GAA GGA CAC TTT CTT GCT TGC CAA AAG GAA 384 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 GAT GAT GCT TTC AAA CTC ATT CTG AAA AAA AAG GAT GAA AAT GGG GAT 432 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 AAA TCT GTA ATG TTC ACT CTC ACT AAC TTA CAT CAA AGT 471 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155
【０１３４】配列番号：29 配列の長さ：570 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：5´UTR 存在位置：1..15 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：16..84 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：85..555 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：3´UTR 存在位置：556..570 特徴を決定した方法：S 配列 ACACCTCGAG CCACC ATG GCC TTG ACC TTT GCT TTA CTG GTG GCC CTC CTG 51 Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu -20 -15 GTG CTC AGC TGC AAG TCA AGC TGC TCT GTG GGC AAC TTT GGC CGA CTT 99 Val Leu Ser Cys Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Asn Phe Gly Arg Leu -10 -5 1 5 CAC TGT ACA ACC GCA GTA ATA CGG AAT ATA AAT GAC CAA GTT CTC TTC 147 His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn Asp Gln Val Leu Phe 10 15 20 GTT GAC AAA AGA CAG CCT GTG TTC GAG GAT ATG ACT GAT ATT GAT CAA 195 Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln 25 30 35 AGT GCC AGT GAA CCC CAG ACC AGA CTG ATA ATA TAC ATG TAC AAA GAC 243 Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile Tyr Met Tyr Lys Asp 40 45 50 AGT GAA GTA AGA GGA CTG GCT GTG ACC CTC TCT GTG AAG GAT AGT AAA 291 Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser Val Lys Asp Ser Lys 55 60 65 ATG TCT ACC CTC TCC TGT AAG AAC AAG ATC ATT TCC TTT GAG GAA ATG 339 Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met 70 75 80 85 GAT CCA CCT GAA AAT ATT GAT GAT ATA CAA AGT GAT CTC ATA TTC TTT 387 Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser Asp Leu Ile Phe Phe 90 95 100 CAG AAA CGT GTT CCA GGA CAC AAC AAG ATG GAG TTT GAA TCT TCA CTG 435 Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu Phe Glu Ser Ser Leu 105 110 115 TAT GAA GGA CAC TTT CTT GCT TGC CAA AAG GAA GAT GAT GCT TTC AAA 483 Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu Asp Asp Ala Phe Lys 120 125 130 CTC ATT CTG AAA AAA AAG GAT GAA AAT GGG GAT AAA TCT GTA ATG TTC 531 Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp Lys Ser Val Met Phe 135 140 145 ACT CTC ACT AAC TTA CAT CAA AGT TAGGCGGCCG CGTGT 570 Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 150 155
【０１３５】配列番号：30 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：N末端フラグメント 配列 Asn Phe Gly Arg Leu His 1 5
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のポリペプチドをコードする組換えＤ
ＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』の構造を示す図
である。
【図２】野生型ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ
『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＷＴ』の構造を示す図である。
【図３】この発明のポリペプチド及び野生型ポリペプチ
ドの活性経時変化を示す図である。
【図４】この発明のポリペプチドをコードするさらに別
の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ２１』の構
造を示す図である。
【図５】この発明のポリペプチドをコードするさらに別
の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ２５』の構
造を示す図である。
【図６】この発明のポリペプチドをコードするさらに別
の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ３２』の構
造を示す図である。
【図７】この発明のポリペプチドをコードするさらに別
の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ４１』の構
造を示す図である。
【図８】この発明のポリペプチドをコードするさらに別
の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ３５』の構
造を示す図である。
【図９】この発明のポリペプチドをコードするさらに別
の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＨＩＧＩＦ／ＭＵＴ４２』の構
造を示す図である。
【図１０】この発明のポリペプチドをコードするさらに
別の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＭＵＴ１１』の
構造を示す図である。
【図１１】野生型ポリペプチドをコードする別の組換え
ＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＷＴ』の構造を示す図であ
る。
【図１２】この発明のポリペプチド及び野生型ポリペプ
チドの活性経時変化を示す図である。
【図１３】この発明のポリペプチドをコードするさらに
別の組換えＤＮＡ『ｐＣＳＭＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２』の
構造を示す図である。
【符合の説明】
ＣＭＶ サイトメガロウイルス・プロモ
ーター ＩＦＮｓｓ ヒトインターフェロン−αにお
けるサブタイプα２ｂのシグナルペプチドをコードする
配列 ＩＧＩＦ／ＷＴ 野生型ポリペプチドをコードす
るｃＤＮＡ ＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２乃至ＩＧＩＦ／ＭＵＴ４２この発
明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ ｍＩＧＩＦ／ＷＴ 別の野生型ポリペプチドをコー
ドするｃＤＮＡ ｍＩＧＩＦ／ＭＵＴ１１及びｍＩＧＩＦ／ＭＵＴ１２こ
の発明の別のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ＡＤＹ Ａ６１Ｋ 35/76 ＡＤＺ 48/00 ＡＥＤ 38/17 ＡＤＵ 37/02 ＡＢＡ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＡＤＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＹ // Ａ６１Ｋ 35/76 ＡＤＺ 48/00 ＡＥＤ 37/12 ＡＤＵ

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 部分アミノ酸配列として、配列表におけ
    る配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列を含有するポリ
    ペプチドにおいて、そのポリペプチドにおけるシステイ
    ンの１若しくは複数が他のアミノ酸により置換されたア
    ミノ酸配列、又は、その置換されたアミノ酸配列におい
    て、前記置換部位以外の部位で、１若しくは複数のアミ
    ノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を含
    有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産
    生を誘導するポリペプチド。
  2. 【請求項２】 他のアミノ酸がセリン、トレオニン、ア
    ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジ
    ン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン又は
    メチオニンである請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】 部分アミノ酸配列として配列表における
    配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列を含有するポリペ
    プチドが、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配
    列を含有する請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】 部分アミノ酸配列として配列表における
    配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列を含有するポリペ
    プチドが、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配
    列を含有する請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】 配列表における配列番号６乃至１２に示
    すアミノ酸配列から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を
    含有する請求項１、２又は３に記載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 配列表における配列番号１３又は１４に
    示すアミノ酸配列を含有する請求項１、２又は４に記載
    のポリペプチド。
  7. 【請求項７】 キラー細胞の細胞障害性を増強する性質
    及び／又はキラー細胞の生成を誘導する性質を有する請
    求項１、２、３、４、５又は６に記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 請求項１乃至７のいずれかに記載のポリ
    ペプチドをコードするＤＮＡ。
  9. 【請求項９】 配列表における配列番号１５乃至２３の
    いずれかに示す塩基配列若しくはそれらの塩基配列に相
    補的な塩基配列、又は、配列番号１５乃至２３のいずれ
    かに示す塩基配列若しくはそれらの塩基配列に相補的な
    塩基配列において、それらの塩基配列がコードするアミ
    ノ酸配列を変更することなく、塩基の１若しくは複数が
    他の塩基で置換された塩基配列を含有する請求項８に記
    載のＤＮＡ。
  10. 【請求項１０】５´末端に配列表における配列番号２４
    に示す塩基配列を含有する請求項８又は９に記載のＤＮ
    Ａ。
  11. 【請求項１１】自律複製可能なベクター内に挿入された
    請求項８、９又は１０に記載のＤＮＡ。
  12. 【請求項１２】適宜の宿主内に導入された請求項８、
    ９、１０又は１１に記載のＤＮＡ。
  13. 【請求項１３】宿主が哺乳類由来の上皮系細胞、間質系
    細胞又は造血系細胞である請求項１２に記載のＤＮＡ。
  14. 【請求項１４】請求項１乃至７のいずれかに記載のポリ
    ペプチドをコードするＤＮＡを適宜宿主内に導入してな
    る形質転換体を培養する工程と、生成したポリペプチド
    を培養物から採取する工程を含んでなるポリペプチドの
    製造方法。
  15. 【請求項１５】宿主が哺乳類由来の上皮系細胞、間質系
    細胞又は造血系細胞である請求項１４に記載のポリペプ
    チドの製造方法。
  16. 【請求項１６】生成したポリペプチドを透析、塩析、濾
    過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、
    ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
    ー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフ
    ィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
    トグラフィー、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動
    により採取する請求項１４又は１５に記載のポリペプチ
    ドの製造方法。
  17. 【請求項１７】ポリペプチドを採取する工程において、
    モノクローナル抗体によるイムノアフィニティークロマ
    トグラフィーを用いる請求項１４、１５又は１６に記載
    のポリペプチドの製造方法。
  18. 【請求項１８】有効成分として請求項１乃至７のいずれ
    かに記載のポリペプチドを含んでなる感受性疾患剤。
  19. 【請求項１９】インターロイキン２をさらに含んでなる
    請求項１８に記載の感受性疾患剤。
  20. 【請求項２０】安定剤として血清アルブミン、ゼラチ
    ン、糖質又は緩衝剤を含んでなる請求項１８又は１９に
    記載の感受性疾患剤。
  21. 【請求項２１】抗腫瘍剤としての請求項１８、１９又は
    ２０に記載の感受性疾患剤。
  22. 【請求項２２】抗腫瘍免疫療法剤としての請求項２１に
    記載の感受性疾患剤。
  23. 【請求項２３】抗ウイルス剤としての請求項１８、１９
    又は２０に記載の感受性疾患剤。
  24. 【請求項２４】抗菌剤としての請求項１８、１９又は２
    ０に記載の感受性疾患剤。
  25. 【請求項２５】免疫疾患剤としての請求項１８、１９又
    は２０に記載の感受性疾患剤。
  26. 【請求項２６】インターロイキン１２をさらに含んでな
    る請求項２５に記載の感受性疾患剤。
  27. 【請求項２７】アトピー性疾患を治療するための請求項
    ２５又は２６に記載の感受性疾患剤。
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