JPH10262694A - B細胞性リンパ腫の骨髄転移検査法 - Google Patents

B細胞性リンパ腫の骨髄転移検査法

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JPH10262694A
JPH10262694A JP7772497A JP7772497A JPH10262694A JP H10262694 A JPH10262694 A JP H10262694A JP 7772497 A JP7772497 A JP 7772497A JP 7772497 A JP7772497 A JP 7772497A JP H10262694 A JPH10262694 A JP H10262694A
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JP
Japan
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cells
bone marrow
cell lymphoma
interleukin
lymphoma
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JP7772497A
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English (en)
Inventor
Yoshiaki Fujimiya
芳章 藤宮
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Sumitomo Forestry Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Forestry Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 B細胞性リンパ腫の骨髄転移検査法を提供す
ることを目的とする。 【解決手段】 B細胞性リンパ腫が骨髄に転移している
ことが疑われる患者から採取した骨髄細胞をインターロ
イキン−2を添加した培養液中で培養することによっ
て、B細胞性リンパ腫細胞を高頻度に増殖させることが
できる。かくして増殖したB細胞性リンパ腫細胞を検出
することによって、簡便にB細胞性リンパ腫の骨髄転移
を判定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明はB細胞性リンパ腫の
骨髄転移検査法に関する。更に詳細には、B細胞性リン
パ腫の骨髄への転移が疑われる患者から採取した骨髄細
胞を、インターロイキン−2を添加した培養液中で培養
してB細胞性リンパ腫細胞を増殖させてB細胞性リンパ
腫細胞を検出することによって、B細胞性リンパ腫の骨
髄への転移を判定する骨髄転移検査法に関する。また本
発明は、B細胞性リンパ腫細胞を増殖させるための培養
液に関する。
【0002】
【従来の技術】悪性リンパ腫は臨床的に言えば主として
リンパ組織が腫瘤大に腫大する疾患であり、病理組織像
はリンパ球系の細胞が腫瘍増殖するのが特徴である。悪
性リンパ腫は、リンパ球の由来によりT細胞性リンパ腫
とB細胞性リンパ腫に分類され、B細胞性リンパ腫とし
ては、濾胞性リンパ腫、Burkittリンパ腫、慢性
リンパ性白血病、免疫芽細胞腫などが知られている。悪
性リンパ腫の診断には、リンパ節、胸水、腹水などを穿
刺して検査する穿刺細胞診、Rappaport分類、
T/Bリンパ球の形態的特徴をとり入れたLukes分
類などによる病理診断、更には腫瘍細胞上の表面マーカ
ーや遺伝子解析による診断などがある。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】悪性リンパ腫の患者に
おいて、悪性リンパ腫が造血器官である骨髄に腫瘍細胞
が浸潤しているかどうかを診断する方法としては、従来
確定的な結果を見出せる診断法がなく、簡便な診断法の
開発が望まれていた。特にB細胞性リンパ腫の症例は極
めて少ないことから、B細胞性リンパ腫の骨髄への転移
を診断する方法の開発は極めて困難であった。このよう
な状況下において、本発明の目的は、B細胞性リンパ腫
の骨髄への転移を簡便に検査する方法を提供することに
ある。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者は、B細胞性リ
ンパ腫の骨髄への転移を簡便に検査できる方法を見出す
ことを目的として鋭意研究した結果、B細胞性リンパ腫
の患者から採取した骨髄細胞を、インターロイキン−2
を添加した培養液中で培養することによって、B細胞性
リンパ腫細胞を増殖させることができ、従って増殖して
きたB細胞性リンパ腫細胞を検出することによってB細
胞性リンパ腫の骨髄への転移が判定できることを見出し
本発明を完成させた。
【0005】従って本発明は、B細胞性リンパ腫が骨髄
に転移しているかどうかを判定する方法であって、 (a) B細胞性リンパ腫が骨髄に転移していることが疑わ
れる患者から採取した骨髄液から骨髄細胞を集め; (b) 該骨髄細胞を、インターロイキン−2を添加した培
養液中で培養して、B細胞性リンパ腫細胞を選択的に増
殖させ; (c) 次いで増殖したB細胞性リンパ腫細胞を検出する;
ことによってB細胞性リンパ腫が骨髄に転移しているか
どうかを判定することを特徴とするB細胞性リンパ腫の
骨髄転移検査法に関する。更に本発明は、インターロイ
キン−2を添加した培養液であって、B細胞性リンパ腫
細胞を選択的に増殖させるための培養液に関する。
【0006】
【発明の実施の形態】本発明の検査法では、先ずB細胞
性リンパ腫が骨髄に転移していることが疑われる患者か
ら採集した骨髄液から骨髄細胞を集める。本発明では、
Burkittリンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽細胞
腫、慢性リンパ性白血病、小細胞性リンパ腫などのB細
胞性リンパ腫の患者が対象となる。骨髄液の採取は、胸
骨穿刺吸引法、針生検、Jamshidi針などの通常
の方法によって行うことができる。骨髄液には、骨髄細
胞の他に骨髄内の細血管系に由来する末梢血が含まれて
いるので予め末梢血を除去する。末梢血の除去は、例え
ば骨髄液に、ヘパリンなどの抗凝固剤を添加したRPM
I1640等の通常用いられる培養液を加え、得られる
混合液を例えばFicoll−paque(ファルマシ
ア社製、スウェーデン)に重層して遠心し、遠心後に上
層部の白色の細胞層を除去することによって実施でき
る。末梢血が除去された細胞を集め、適当に遠心分離・
洗浄を行うことによって骨髄細胞が採取される。
【0007】次いで、採取された骨髄細胞を、インター
ロイキン−2を添加した培養液中で培養する。インター
ロイキン−2はTリンパ球が分泌するサイトカインの1
種であり、抗原特異的キラーT細胞の増殖・分化の促
進、ナチュラルキラー細胞活性の増強、B細胞の増殖の
誘導などの作用を有することが知られている。しかしな
がら、インターロイキン−2がB細胞性リンパ腫細胞に
対して増殖作用を有することについては従来知られてい
ない。
【0008】本発明によれば、インターロイキン−2は
B細胞性リンパ腫細胞の増殖作用を有し、従ってB細胞
性リンパ腫の患者から採集された骨髄細胞を、インター
ロイキン−2を添加した培養液中で培養することによっ
て、B細胞性リンパ腫細胞を増殖させることができ、増
殖してきたB細胞性リンパ腫細胞を検出することによっ
て、簡便にB細胞性リンパ腫細胞の存在を判定できるこ
とが見出された。本発明で用いるインターロイキン−2
は、組換えDNA法によって製造されたものを通常用い
ることができる。骨髄細胞の培養には、HS−RPM1
などの通常の培地に例えば約10%になるようにヒト血
清を添加したものが用いられる。インターロイキン−2
の添加量は、通常700JRU/ml〜1,000JR
U/mlであり、培養液は、37℃の温度でpH約7の
条件下で、5%CO2 インキュベータ中で行うのが好ま
しい。培養は毎日培養液の一部を交換しながら約10〜
14日間培養を継続することにより、細胞が増殖してく
る。次いで適宜大きな培養器へ移して更に約3〜4週間
培養を継続することによりB細胞性リンパ腫細胞が存在
する場合には、B細胞性リンパ腫細胞が高頻度に選択的
に増殖してくる。
【0009】増殖してくるB細胞性リンパ腫細胞は、例
えばB細胞性リンパ腫細胞の表面マーカーに対するモノ
クローナル抗体を用いて通常の方法によって検出するこ
とができる。このようなモノクローナル抗体としては、
表面マーカーCD19、CD20、Iaなどに対する市
販のモノクローナル抗体OKB19、Leu−12、N
U−B2などが挙げられる。
【0010】あるいは次のような方法によってもB細胞
性リンパ腫細胞を検出することができる。即ち、上記の
培養方法によって増殖してきた細胞を、次いでインター
ロイキン−2を添加しない例えば牛胎児血清10%加培
養液にて1〜10代継代培養を行い、継代培養後におい
ても増殖し続ける細胞がB細胞であるか否かを判定する
ことによって、B細胞性リンパ腫細胞を検出することが
できる。つまり、1〜10代継代培養後に増殖し続ける
のは通常腫瘍細胞であり、増殖し続ける細胞がB細胞で
あれば、それはB細胞性リンパ腫細胞と判定できるため
である。更にインターロイキン−2は正常B細胞の増殖
を誘導する作用を有するもののインターロイキン−2単
独では正常B細胞は増殖し続ける事はないので増殖した
細胞は腫瘍化したB細胞と判定できる。
【0011】
【発明の効果】以上に詳細に説明した通り、本発明によ
れば極めて簡便な方法によって、B細胞性リンパ腫の患
者において、骨髄への転移を容易に検出することができ
る。また、インターロイキン−2を添加した培養液、例
えばインターロイキン−2及びヒト血清10%を添加し
た培養液は、B細胞性リンパ腫細胞を増殖させるために
極めて好適な培養液である。
【0012】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
する。 実施例 1)骨髄細胞の採取 リンパ節の検査などでB細胞性リンパ腫であると診断さ
れた悪性リンパ腫の患者の骨髄から、胸骨穿刺吸引法に
より、骨髄液を採取する。吸引骨髄液には骨髄細胞の他
にかなりの末梢血が含まれているため、次の方法でその
末梢血を予め除去する。 骨髄液に37℃に加温したRPMI1640培養液
(100U/mlのヘパリン加)を加え全体の溶液が骨
髄液と培養液が容量比1:1あるいは1:2の割合にな
る様にする。温和に懸濁した後次のステップへ進む。 赤血球を除くためにこの混合液を例えばFicol
l−paque(ファルマシア社製スウェーデン)に静
かに重層し、350Gで25分間室温にて遠心する。 遠心後、Ficoll−paqueの上層部の白色
の細胞層を採取し10%ヒト血清加RPMI1640培
養液(HS−RPMI)に懸濁する。 細胞を集めた後、室温にて350G10分間遠心
し、HS−RPMIで2回洗浄する。かくして骨髄細胞
を集める。
【0013】2)B細胞性リンパ腫細胞の増殖 集めた骨髄細胞を、700JRU/ml〜1000JR
U/mlになる様に組換えインターロイキン−2(IL
−2)を加えた5mlのHS−RPMIに懸濁し、25
cm2 の培養フラスコにて培養液のpHが約7になるよ
うに5%CO2インキュベータで、37℃の温度で培養
を開始する。10%健常ヒト血清+組換えIL−2+R
PMI1640培養液を増殖培地と称する。その後、毎
日増殖培地1mlずつ加え10〜14日めに十分に増殖
した場合には適宜大きなフラスコへ移し約3〜4週間培
養すると高頻度にB細胞性リンパ腫細胞が選択的に増殖
してくる。
【0014】3)継代培養後の検査 十分に増殖した細胞を組換えIL−2を加えないHS−
RPMIで培養する事ができる。25cm2 に10ml
の増殖培地中で細胞を培養した時以下の手順で組換えI
L−2を除去して培養を続ける事ができる。 上記のフラスコで増殖培地の半分を吸引して棄て新
しく10%牛胎児血清(胎児牛血清FBS)加RPMI
1640の培養液を加える。 3日後、10%FBS−RPMI1640 1ml
を加え7日間加え続ける。7日後すべて古い培養液を棄
て、新鮮10%FBS−RPMI1640に懸濁する。
増殖後、適宜細胞を分けて継代する。細胞増殖後の免疫
学的検査により、B細胞性リンパ腫と同定した。増殖
後、組換えIL−2をすべて除去した10%FBS−R
PMIにて1〜10代継代し、その細胞の表面マーカー
をフローサイトメトリーにて検出した。得られた結果を
表1に示す。
【0015】
【表1】
【0016】表1の結果を示した当該細胞(HSJ)
は、上記の結果からB細胞に特有なCD19抗原を発現
しかつT細胞に特有なCD3、CD4及びCD8抗原を
発現していないことが判る。またNK細胞に特有なCD
16抗原を発現していないことが判る。更にマクロファ
ージに特異的に発現するCD14抗原も発現していない
ことが判る。以上の事実と、B細胞は骨髄の幹細胞より
分化、成熟するが当該細胞は幹細胞に特有なCD34抗
原も発現していないことからある程度分化が進んでお
り、かつClassII抗原を発現していることから、こ
の細胞は免疫学的に腫瘍化した細胞、すなわちB細胞性
リンパ腫細胞であると判定できる。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 B細胞性リンパ腫が骨髄に転移している
    かどうかを判定する方法であって、 (a) B細胞性リンパ腫が骨髄に転移していることが疑わ
    れる患者から採取した骨髄液から骨髄細胞を集め; (b) 該骨髄細胞を、インターロイキン−2を添加した培
    養液中で培養して、B細胞性リンパ腫細胞を増殖させ; (c) 次いで増殖したB細胞性リンパ腫細胞を検出する;
    ことによってB細胞性リンパ腫が骨髄に転移しているか
    どうかを判定することを特徴とするB細胞性リンパ腫の
    骨髄転移検査法。
  2. 【請求項2】 工程(b) によってB細胞性リンパ腫を選
    択的に増殖させた後、インターロイキン−2を除去した
    培養液中で継代培養し、増殖する骨髄細胞がB細胞であ
    るかどうかを判定することによってB細胞性リンパ腫を
    検出する、請求項1の検査法。
  3. 【請求項3】 インターロイキン−2を添加した培養液
    であってB細胞性リンパ腫細胞を増殖させるための培養
    液。
JP7772497A 1997-03-28 1997-03-28 B細胞性リンパ腫の骨髄転移検査法 Pending JPH10262694A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7652069B2 (en) 2002-03-04 2010-01-26 Merck Hdac Research, Llc Polymorphs of suberoylanilide hydroxamic acid
US7732490B2 (en) 2002-03-04 2010-06-08 Merck Hdac Research, Llc Methods of treating cancer

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