JPH10263070A - 重合マトリックス上の大容量の細胞の移植方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】内分泌臓器を形成するために大容量の細胞を移
植する方法と手段を提供すること。 【解決手段】本発明により、外科手術法に使用するため
の手術用移植片を製造する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、概して臓器移植に
関するものであり、より詳しくは、重合マトリックス上
の大容量の細胞を患者に移植する方法である。

【０００２】

【従来の技術】これは、米国特許出願番号07/343,158と
して1989年4月25日にJoseph P. Vacanti, Robert S. La
nger、およびLynt Johnson、により出願された、タイト
ルが“重合マトリックス上の大容量の細胞の移植方法”
の一部継続出願である。それは、さらに、米国特許出願
番号 07/123,579 として1987年11月20日にJoseph P. Va
cantiおよびRobert S. Langer、により出願された、タ
イトルが“人工マトリックスを用いた、制御された細胞
の移植による臓器のキメラ新形態形成”の一部継続出願
であり、すでに、放棄され、そして再出願されている。
それは米国特許出願番号06/933,018として1986年11月20
日にJoseph P. Vacanti、により出願されたタイトルが
“人工マトリックスを用いた臓器のキメラ新形態形成”
の一部継続出願であり、すでに、放棄され、そして再出
願されている。

【０００３】本発明は、概して臓器移植に関するもので
あり、より詳しくは、重合マトリックス上の大容量の細
胞を患者に移植する方法である。

【０００４】肝臓の重大な機能障害を引きおこし、最後
には肝不全を引き起こす疾患は多くある。肝不全を支え
る人工的な方式がないため、移植がうまくいかないと、
肝不全はいつも患者に死をもたらす。合衆国では毎年3
0,000人が肝不全により死亡すると推定されており、社
会に対し毎年1400万ドルの損失となっている。これらの
疾患のうちのいくつかはタンパク質代謝の欠陥や、アミ
ノ酸代謝の欠陥、炭水化物代謝の欠陥、ピリミジンやプ
リン代謝の欠陥、脂質代謝の欠陥、ミネラル代謝の欠陥
をもたらす遺伝的欠陥を含有する。肝臓病にかかってい
る患者の別のグループは、アルコールによって引き起こ
される肝臓病の患者である。今日、これらの患者には選
択の余地はない。

【０００５】過去５年にわたって、臓器移植は臓器不全
を治療する方法として増々重要となってきている。不幸
にも、様々な臓器、特に肝臓の移植の今日の成功にもか
かわらず、提供される臓器の絶対的な不足のため、多く
の人々が死亡している。移植の選択の余地のあるこれら
の患者を治療するための唯一の方法は、肝臓が、移植で
きるようになるまで彼らを維持することである。

【０００６】全肝臓の移植は、1980年代、主に、Dr.Tho
mas Starzlの努力により、成功率が増加する外科手術と
なった。しかし、手術の技術的複雑さ、多大な出血、猛
烈な手術後の経過や、肝臓移植の多くの不知のため、移
植は大きな病院でしかできない高価な技術となってい
る。提供者の不足のため、移植は、それを求めている患
者の必要性にそぐわなくなってきている。今日、およそ
１年間に1500人の患者が肝臓移植を受けている。たと
え、その受容量が３倍になったとしても、末期の肝臓病
で死につつある30,000人の患者には及ばないであろう。

【０００７】臓器移植の非常事態と、免疫生物学の科学
とが腎臓、心臓、肝臓および他の臓器の置換を可能にし
た。しかし、これらの複雑な操作を行うための能力が向
上してきたので、その技術の限界がより明白なものとな
ってきた。手術は複雑であり、通常、多大な出血をとも
なう。保存期問が短いため、受領者と、遠くはなれた提
供者とが適合した場合、主に問題となる。これらの理由
のため、それを行うことは高価で、集約的な作業であ
り、第３の治療施設でのみ使用できる財源の出資を主に
必要とする。

【０００８】失われた機能の置換に必要な、それらの実
質組織の成分のみの選択的な細胞移植が、全体あるい
は、部分的な臓器移植にかわるものとして提案された。
これは、それに付随する出血や麻酔の困難さと合併症を
伴う主流となっている手術をさけることを含むいくつか
の魅力的な特色を有する。それは要求される機能を与え
るそれらの細胞のみを置換し、それゆえ、拒否作用を誘
発するかもしれない通過する白血球、抗原を提示する細
胞、そして他のタイプの細胞にともなう問題を回避する
ことができる。細胞培養の技術を加えることは、移植プ
ロセスにおいて助けとなる別の道具を与える。培養中
に、細胞の増殖を伴う細胞の数を広げる技量は、理論
上、自分自身の組織の自己移植を可能にする。

【０００９】近年、多くのグループが、生体内において
直接細胞を移植するのと同様に移植に用いるための試験
管での細胞の育成のための様々な方法の研究と開発に従
事している。このような努力のほとんどは、いったん移
植された細胞が、移植し、機能をもつことが出来ないと
いう問題に相応する限られた成功のみに遭遇してきた。

【００１０】Marrow-Tech IncorporatedによるW087/061
20では、間質細胞をまいたナイロンメッシュ上の骨髄細
胞のような試験管内の細胞の育成の成功について述べて
いる。

【００１１】A.A.Demetriouらは、Science 233,1190-11
92 (1986)で、腹膜腔に注入した、コラーゲンをコート
したマイクロキャリアービーズに付着させた肝細胞の移
植と機能について述べている。他は、膵臓組織を糖尿病
患者に、in vivoで直接移植している。長期にわたる効
果を達成できなかったより初期の試みは、分離した島細
胞のかたまりを肝臓の脈管床での移植を伴う門脈循環中
に注入することによる島細胞の移植であった。より最近
の実験的な方法は、宿主の免疫攻撃を回避するために、
膵臓べータ細胞をカプセル化したり、胎児のべータ細胞
を腎臓の莢膜内に入れ注入するという方法を包含してい
る。短期間の機能の実証があるにもかかわらず、長期間
の結果は、満足できるものではなかった（D.E.R.Suther
land, Diabetologia 20,161-185 (1981) ; D.E.R.Suthe
r1and,Diabetologia 20,435-500(1981))、そして膵臓全
体の移植が好ましい治療のままであった。

【００１２】米国特許出願番号123,579、そして、Josep
h P.VacantiおよびRobert S. Langer、により1987年11
月20日に出願された、タイトルが "Chimeric Neomorpho
genesis of Organs by Controlled Cellular Implantat
ion Using Artifical Matrices" と、米国特許出願番号
933,018としてJoseph P. Vacanti、により1986年11月2
0日に出願された、タイトルが“Chimeric Neomorphogen
esis of Organs UsingArtificial Matrices"において、
様々なタイプの細胞を生体内に移植し、脈管新生化する
前に、試験管内で、増殖させうる方法と、マトリックス
を開示している。両方の方法とマトリックスの主たる原
理は、まいた細胞間に脈管新生化がないために必要な栄
養の十分な分散と、培地のまわりからのガス交換のため
の十分な空間を与える３次元的な支持体構造である。

【００１３】しかし、この方法でさえ、まだ、特に合併
症を引きおこしうる傷を生ずる手術により、患者に、肝
細胞、膵臓、や他の内分泌細胞のような細胞の細胞塊の
移植が必要である。

【００１４】さらに、細胞を増殖させ機能させるために
は大容量の細胞を移植する必要がある。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】それゆえ、本発明の目
的は様々な臓器、特に、自然に生じる臓器に機能的に似
ている、肝臓、膵臓、副腎を含む内分泌臓器を形成する
ために大容量の細胞を移植する方法と手段を開示するこ
とである。

【００１６】本発明のさらなる目的は、機能的に臓器と
同等のものを形成するため生物的に分解可能で、毒性の
ないマトリックス上の大容量の細胞を、移植する方法を
提供することであり、それは従来の外科的方法と比べ
て、比較的非浸襲的で外傷性の方法を与えるものであ
る。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、（a）
高度に血管化された組織内に層として移植され、単一の
マトリックス構造体を形成し得る１つより多いマトリッ
クスを選択する工程、および（b）組織のひだの間に１
つより多いマトリックス構造体を移植する工程、を包含
する外科手術法に使用するための手術用移植片を製造す
る方法であって、該製造方法は、移植の時または移植の
前に該マトリックス上および該マトリックス内に生存し
ている細胞を植え付ける工程を包含し、ここで該マトリ
ックスは、該生存している細胞の生存度を維持するよう
に、多くの血管からの栄養物およびガスの交換を可能に
するための１００〜２００μｍの範囲の隙間空間を有す
る、多孔性または繊維状構造の生体適合性材料を含有す
る、手術用移植片の製造方法が提供される。

【００１８】１つの実施態様において、前記組織は腸管
膜、大網、または腹膜である。

【００１９】１つの実施態様において、前記材料は、ポ
リ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ
無水物、コラーゲンそしてコポリマー、それらの混合
物、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され
た生分解性ポリマーである。

【００２０】１つの実施態様において、前記材料は、ポ
リプロピレン、ポリエチレンテレフタレートおよび他の
ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、エチレン
ビニルアセテート、ナイロン、およびこれらの組み合わ
せからなる群から選択された非分解性あるいは非吸収性
材料である。

【００２１】１つの実施態様において、前記材料は、基
底膜成分、寒天、アガロース、ゼラチン、アラビアガ
ム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアル
ロン酸、グリコサミノグルカン、接着ペプチド、および
該物質の混合物からなる群から選択される付着因子でコ
ートされている。

【００２２】１つの実施態様において、前記マトリック
スは、脈管新生化合物、栄養物、成長因子、分化あるい
は脱分化の誘導物質、分泌生産物、免疫調節剤、炎症の
阻害物質、退化因子、リンパ系のネットワークあるいは
神経繊維の内部への成長を増大させる、あるいは可能に
する生物活性化合物、および該物質の混合物からなる群
から選択された化合物をさらに含有する。

【００２３】１つの実施態様において、前記細胞は、肝
細胞、膵臓細胞、副腎細胞、リンパ系の細胞、神経系の
細胞、線維芽細胞、内皮細胞、リンパ細胞、脾臓細胞、
および泌尿生殖器系の細胞からなる群から選択される。

【００２４】１つの実施態様において、前記マトリック
ス構造体は、繊維状メッシュ様形状である。

【００２５】１つの実施態様において、前記マトリック
ス構造体は、スポンジ様形状である。

【００２６】１つの実施態様において、前記マトリック
ス構造体は、シートである。

【００２７】１つの実施態様において、前記シートの厚
さは、２００μｍから２ｍｍの範囲にある。

【００２８】１つの実施態様において、前記マトリック
ス構造体は、第２のポリマーの溶液で生体適合性の繊維
状メッシュをコートすることによって形成され、そして
該繊維状メッシュの材料が該第２のポリマーの溶液には
溶解しない。

【００２９】１つの実施態様において、前記繊維状メッ
シュはポリグリコール酸から形成され、前記第２のポリ
マーは、ポリ乳酸およびポリ（乳酸−グリコール酸）の
コポリマーからなる群から選択される。

【００３０】１つの実施態様において、前記第２のポリ
マーは、前記繊維状メッシュを形成する繊維間で平坦な
表面を形成する。

【００３１】本発明によれば、（a）組織の層に移植さ
れ得る１つより多いマトリックスを選択する工程、およ
び（b）層構造を形成するように組織のひだの間に１つ
より多いマトリックス構造体を移植する工程、を包含す
る外科手術法において使用するためのマトリックスシー
ト構造体であって、１００〜２００μｍの範囲にある隙
間空間およびマトリックス上およびマトリックス内に付
着した生存している実質細胞を有する多孔性または繊維
形状の生体適合材料を含有し、該マトリックス構造体の
厚さが２００μｍ〜２ｍｍの範囲にある、マトリックス
シート構造体が提供される。

【００３２】１つの実施態様において、前記マトリック
ス構造体の厚さは、２００μｍ〜３００μｍの範囲にあ
る。

【００３３】１つの実施態様において、前記材料は、ポ
リ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ
無水物、コラーゲンおよびコポリマー、該物質の混合物
および組み合わせから選択された生分解性ポリマーであ
る。

【００３４】１つの実施態様において、前記材料は、ポ
リプロピレン、ポリエチレンテトラフタレートおよび他
のポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、エチレ
ンビニルアセテート、ナイロン、および該物質の組み合
わせからなる群より選択された非分解性あるいは非吸収
性材料である。

【００３５】１つの実施態様において、前記材料は、基
底膜成分、寒天、アガロース、ゼラチン、アラビアゴ
ム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアル
ロン酸、グリコサミノグリカン、接着ペプチドおよび該
物質の混合物からなる群より選択された付着因子でコー
トされている。

【００３６】１つの実施態様において、前記マトリック
スは、脈管新生化合物、栄養物、成長因子、分化あるい
は脱分化の誘導物質、分泌生産物、免疫調節剤、炎症の
阻害物質、退化因子、リンパ球ネットワークあるいは神
経繊維の内部への成長を増大させる、あるいは可能にす
る生物学的活性物質、および該物質の混合物からなる群
から選択された化合物をさらに含有する。

【００３７】１つの実施態様において、前記細胞は、肝
臓細胞、膵臓細胞、副腎細胞、リンパ系の細胞、神経系
の細胞、線維芽細胞、内皮細胞、リンパ球、脾臓細胞、
および泌尿生殖器系の細胞からなる群から選択される。

【００３８】本発明によれば、生体適合性があり、かつ
生分解性のある第２のポリマー溶液で生体適合性の繊維
状メッシュをコートすることによって形成される、上記
のマトリックスシート構造体であって、該繊維状メッシ
ュの材料が該第２のポリマー溶液には溶解しない、マト
リックスシート構造体が提供される。

【００３９】１つの実施態様において、前記繊維状メッ
シュはポリグリコール酸から形成され、前記第２のポリ
マーは、ポリ乳酸およびポリ（乳酸−グリコール酸）の
コポリマーからなる群から選択される。

【００４０】１つの実施態様において、前記第２のポリ
マーは、前記繊維状メッシュを形成する繊維間で平坦な
表面を形成する。

【００４１】本発明は、所望の機能を持った大容量の細
胞を、重合体の土台に付着させ、最小の傷と出血で、土
台上の細胞が、着床し生育し、機能することにより、機
能的に臓器と同等のものを形成するのに適した部位で、
患者に移植するための方法と手段を示したものである。
この方法は、多くの同等の、あるいは異なったマトリッ
クス上に細胞をまき、次いで組織間にin vivo の状態で
マトリックスを移植し、移植された細胞が脈管新生がな
されなくとも、しかし、要求される機能を与えるのに十
分多量の細胞状態で十分な栄養とガス交換が与えられる
ことを包含している。

【００４２】その方法は、肝臓、膵臓、および副腎を含
む内分泌組織体の生育に特によく適合しており、他のタ
イプの組織の生育と機能にも用いることが出来る。

【００４３】好ましい実施態様においては、種付けした
ポリマーシートを腸間膜のひだの間に設置する。移植
後、血管が内部へ成長することにより、移植した細胞の
可溶性産物を制御する通常のフィードバック機構が備わ
るまで、門脈循環よりのびる血管は、拡散により移植し
た細胞に、栄養や通常の代謝因子を供給する。マトリッ
クスあるいは支持構造体を形成するために好ましい材料
は生物的に分解され得る人工の重合体であり、それ単独
で、あるいは、非分解性の支持構造体と組み合わされて
制御された割合で加水分解により分解され、吸収され
る。分解可能の材料は分解性、操作性、大きさ、そして
形状の最大限の制御を備えている。さらに、細胞を移植
する前、あるいは、同時に、移植部位を下調べする際に
使用する目的に血管新生因子のような材料を、分解可能
なマトリックスに混合することが出来る。

【００４４】培養により細胞を最初生育させることによ
り、マトリックス細胞構造体の移植の後、有用となるで
あろう細胞に、取り扱い性と貫生増殖性を与えるが、も
し、種付けのために十分な細胞が、生検により得ること
が出来れば、その必要はない。

【００４５】腸間膜のひだの新しい組織の薄層と、フェ
ルト状のシートの重合体−肝細胞構築物を交互にしたも
のを用いた移植法の検討が200匹のラットになされた。
重合体上にのっている培養中の肝細胞はラット当り3000
万から６億個の細胞数であり、平均は、ラット当り6000
万から１億個の細胞数であった。150ｇのラットは、細
胞をのせた36cm²の重合体材料（１×３cm×２mm厚、50
0,000細胞／cm²で種付けした８枚のシートで、１×１×
３cmの移植組織を生ずる）を受け入れることができる。
融合は、事例の96％で達成された。５日から10ケ月にわ
たる組織学的分析により、新しい血管の着床と、肝細胞
の温床とかたまりが、組織学的に正常に生じていること
が明らかとなった。62日目にアルブミンに対する免疫蛍
光染色を用いて、肝臓特有の機能が、in situで示さ
れ、機能の部分的な入れ換えが、グルクロニルトランス
フェラーゼの欠員を基準とするGunnラットで観察され
た。

【００４６】

【発明の実施の形態】患者に、最小の傷で、大容量の脈
管組織の移植を可能にする方法は、多重に種付けした重
合マトリックスが、ある組織と近接でき、生育と増殖の
ための栄養とガスの十分な交換がなされうるという発見
にもとづいている。腸間膜や網のような、組織は、広い
表面積を有しており、血管も多くある。

【００４７】細胞マトリックス構造体の方法と移植部
位：腹膜は、腸腔と腸腔内の多くの臓器をおおっている
非常に希薄な膜である。"腸間膜”とは、通常、小腸の
腸間膜をさし、腹膜が二層におりたたまれたもので後部
腹壁から、小腸をつり上げている。腸間膜の付着してい
るへりは、たった約15cmの長さで、おおよそ第２腰椎骨
下方から右方向へ、十二指腸、大動脈、下大静脈の一部
を横切り右仙腸骨関節の方へのびている。自由な、ある
いは、付着していないヘリは、空腸、回腸をふくみ、ア
コーディオンのようにひだになっており、３〜６ｍの長
さに達する。自由なヘリと、付着しているヘリの距離は
15〜22cmの長さの範囲にある。

【００４８】腸間膜の２つの表面上の、腹膜の二層の間
には、上腸間膜動脈と、その支流、付随する静脈、リン
パ管、リンパ節、結合組織、そして、様々な量の脂肪組
織がある。図１Ａと図１Ｂに、腸間膜を断面からみたと
ころを示してある。図１Ａを参照すると、腸間膜10は、
上部12、下部14腸間膜動脈に結合しており、小陽16に血
液を供給している。図１Ｂを参照すると、腸間膜10は、
小腸16まで、外側にむかって扇のように広がっており、
上部腸間膜動脈12は上部腸間膜静脈に注ぎ込んでいる。
図２に示してあるように、下部腸間膜動脈20は、脾臓2
2、冠状および幽門静脈から血液を排出している。上部
腸間膜静脈18は、門脈静脈に注ぎ込んでおり、肝臓26に
つづいている。移植後、血管が内部に成長することによ
り、移植した細胞の可溶性産物を制御する通常のフィー
ドバック機構が備わるまで門脈循環から来る血管は、栄
養や、通常の代謝因子を拡散により移植した細胞に供給
している。

【００４９】網は、胃に付着した腹膜が二重におりたた
まれたもので、腸を含む他のいくつかの臓器と胃をつな
げている。腹膜の他の区域と、同様の特徴をもつ分離さ
れた組織もまた大容量の細胞を移植するための、本方法
に用いることが出来る。

【００５０】図３と図４に概略的に示してあるように、
細胞−重合体キメラ構造体は、生物的に分解可能で、生
物的に共存可能な、広い表面積をもつマトリックスに細
胞をつけることにより形成され、その細胞は、患者、あ
るいは近親者より生検で、あるいは細胞培養より得ら
れ、腸間膜16のひだ32の間に、細胞を植え付けたマトリ
ックスを移植する。腸間膜のひだ32は、キメラ構造体34
を形成するように、一緒に近づけられている。

【００５１】マトリックス材料の選択：マトリックスあ
るいは支持構造体を形成するのに好ましい材料は、生物
的に分解可能な人工の重合体で、例えば、ポリ乳酸、ポ
リグリコール酸、ポリオルソエステル、ポリ無水物、そ
れらの混合物あるいはコポリマーで、それ単独で、ある
いは、非分解性の材料と結合させた形で制御された割合
で加水分解され吸収されるものである。

【００５２】生物的に分解可能な材料は、分解性、操作
性、大きさ、そして形状の最大限の制御を備えている。
しかし、コラーゲンや生物的に分解出来ない材料を含
む、他の生物的に共存出来る重合材料を、構造体形成に
使うことが出来る。

【００５３】分解不可能な、あるいは、吸収不可能なも
のの例としては、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフ
タレート（Dacronポリエステル）や他のポリエステル、
テフロン、エチレンビニールアセテート、ナイロンやス
テンレスが材料として挙げられる。ナイロンは、一定に
水和し、分解するがゆっくり変化するため好ましくな
い。ステンレスのフィラメントは、製造するのがむづか
しい。ポリプロピレンおよびポリエステルは、FDAが構
造体材料や、他の移植体の成分として認可している。こ
れらは、モノフィラメントや、つむぎ糸、あるいは様々
な直径の繊維に加工しやすい。両材料とも、組織との反
応の程度はとても低い。

【００５４】いくつかの実例において、これらの材料
は、基底膜成分、アガロース、ゼラチン、アラビアゴ
ム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニングリコサ
ミノグリカン、これらの混合物、あるいは、細胞培養の
専門分野でよく知られている細胞付着性を増大させる生
物学的マトリックス分子と同様の特性をもった他の材料
の第二の材料に重層されている。これらの材料はまた、
アブレブミンの生産を含む肝臓に特異的ないくつかの機
能を長もちさせ、維持させることが出来る。細胞外ゲル
マトリックス（EHS）を用いた先に行われた研究ではこ
の材料をコートした重合体上で培養した肝細胞は、少な
くとも２つの代表的な肝臓に特異な遺伝子、アルブミン
とα−１−インヒビター３を高率で転写しつづけること
を示している。同じ状態下での細胞骨格の遺伝子の転写
は低い。

【００５５】核run-onアッセイにより決定された両方の
度合は、通常の肝臓に類似している。さらに、肝臓特異
的で、細胞骨格遺伝子に関するmRNAが多いという異常な
パターンはEHS上では否定されている。コラーゲンの、
縫合糸や移植体としての使用は、FDAより認可されてい
る。いくつかのコラーゲンはまた、ある場合には好都合
であろう血管新生と、線維形成を誘導する。

【００５６】細胞分化と生長は、付着部位の密集度を変
えることにより制御することが出来る。付着部位の密集
度は、重合支持材料の選択、あるいは化学修飾により、
あるいは、あらかじめ決めていた付着分子の数で基質を
コートすることによって変えることが出来る。たとえ
ば、高いpHの炭酸緩衝液が、ラミニンやフィブロネクチ
ンのような精製された細胞外マトリックス（ECM）を重
合体基質上に吸着させるのに用いられる。低密度の精製
されたECM（1〜50ng／cm²）に付着した肝細胞は、丸い
形態と、肝細胞特異的タンパク質（アルブミン、トラン
スフェリン、フィブリノーゲン）の高い分泌率と、低い
割合のDNA合成を有する。この制御は、用いたECM分子に
はほとんどよらないが、用いた特定のECM分子に依存し
て、分化に多少の影響をおよぼす。

【００５７】生物的に分解可能な材料の主たる利点は、
いったん、細胞の成長と、機能郡の形成が起こっても、
除去する必要がないということである。生物的に分解可
能な材料の別の利点は、マトリックスの分解の間にゆっ
くり放出されるため、マトリックス内へ化合物が取り込
まれるであろうということである。例えば、血管由来の
化合物、栄養、生長因子、分化あるいは脱分化の誘導物
質、免疫モジュレーター、炎症の阻害物質、退化因子、
リンパ系のネットワーク、あるいは、神経線維の内部へ
の成長を増大させる、あるいは、可能にする生物活性化
合物、および薬剤、を溶液中で、あるいは、第２の生物
的に分解可能な重合マトリックス中に取り込ました形で
マトリックス中に混入することが出来るし、あるいは、
マトリックスと結合させた形で与えることも出来る。

【００５８】マトリックスの形状：好ましい実施態様に
おいては、繊維からなるシートより構成されている、複
合重合マトリックスは、腸間膜中の新しいベッドあるい
はあらかじめ血管新生させたベッドヘ数ミクロンから数
センチの間の広がりを有する構造体を形成するように、
挿入されている。マトリックスは、移植と、機能臓器体
の形成に必要な細胞数を有するアタッチメントに対して
十分な表面積が必要であるということと、付着した細胞
それぞれに必要な栄養とガスがマトリックスの内部にま
で拡散するために、アタッチメントの表面間に十分な空
間が必要であるということを考慮して、様々な形で作ら
れうる。後の要求性は、米国特許出願番号123,579とし
て、Joseph P. VacantiおよびRobert S. Langerにより1
987年11月20日に出願された、タイトルが、"Chimeric N
eomorphogenesis of Organs by Controlled Cellular I
mplantation Using Artificial Matrices"と、米国特許
出願番号933,018としてJoseph P. Vacantiにより1986年
11月20日に出願された、タイトルが "Chimeric Neomorp
hogenesis of Organs Using Artificial Matrices" に
述べられているように、多くの比較的うすいマトリック
スを用意し、腸間膜のひだの間に、それぞれのシートを
移植することにより、あるいは、栄養物の同じ容量の細
胞への最大の拡散距離よりも大きい広がりを持つマトリ
ックスを用意することにより可能となる。この教示内容
はここでも取り込れられている。

【００５９】好ましい実施態様では、マトリックスは、
性状としては繊維状である。これは、波うっていないフ
ェルト状のメッシュから、重ねたあるいは、１本の繊維
をまいたスポンジ状の構造体の間で変動しうる。マトリ
ックス構成成分の、合成体、補強材（あるとすれば）そ
してコート剤の３つの主な変動に加え、繊維の直径、繊
維の密度、編まれた構造体、そして、繊維がクロスオー
バした融合体、あるいは、編みこまれたものを含む変動
を考慮しなければならない。乾いた、あるいは湿った状
態での圧縮性能吸収されやすい成分が取り除かれ（吸収
されやすいものと、吸収されにくい材料とが混合されて
いる場合）た後の圧縮性能、被破壊力、縫合糸のひっぱ
り強度、コラーゲンの配分、そして顕微鏡によってin v
itroでこれらのマトリックスの特性を明らかにすること
が出来る。

【００６０】繊維の材料は、縫合糸や波うっていないフ
ェルト状の材料として購入することが出来る。適したマ
トリックスはまた、専門分野で知られている溶剤投入、
回転投入、あるいは、押出し、あるいは同様の方法のよ
うな標準的な技術を用いて形成することが出来る。有効
なフェルト状の材料はDavis ＆ Geckより得られる。様
々な生物的に分解可能な重合体よりなる、これらのタイ
プの織物は、多くの医療に応用され、おおよそ１／３か
ら１／２mmの厚さにした場合、よい組織像と、血管の内
部への成長を示す。

【００６１】スポンジ状の繊維材料は、濾過可能な粒子
を含む重合体溶液を溶剤に投入することにより作られ
る。例えば、PLA/PLGA重合体は、濾過することにより、
大きさを75から150μmにしたNaCl粒子を含んだ状態で投
入されている。マトリックスは、塩化メチレン10wt％の
溶液から、ガラスのぺトリ皿に投入され、溶剤は、気化
させた塩化メチレンのもと、室温で蒸発させる。ポリ
（DL）乳酸、分子量50,000（Polysciences）とDupont M
edisorb 85:15 の50/50 w/wブレンドが、均一性と有孔
性という点で、良好な結果を与える。これらの材料は、
厚さは200〜300μmである。このタイプのマトリックス
の走査型電子顕微鏡写真の例が図５に示されている。ス
ポンジ状の構造体の孔サイズ、あるいは、織物のすき間
の空間は血管の内部への成長に最適であるためには100
〜200μmの間になることが必要である。

【００６２】スポンジ状のマトリックスはまた、Davis
& Geckのポリ（グリコール酸）メッシュを、ポリ（乳
酸）、あるいは、ポリ（乳酸）やポリ（グリコール酸）
のコポリマーのような重合体溶液中につけることにより
作ることが出来、第２の重合体、しかしポリ（グリコー
ル酸）ではない用には、塩化メチレンのような溶剤中に
重合体を溶解させる。第２の重合体は、ポリ（グリコー
ル酸）メッシュの圧縮強度をかなり上昇させ、細胞を付
着させるための平たんな表面をがん強にする繊維間に"
メニスカス"を形成する。好ましい具体例では、PGA織物
は、２から20重量パーセントのPLA:GA 85:15の塩化炭素
中の溶液に浸されており、余分な重合体溶液は吸い取ら
れ、マトリックスは、乾燥される。この方法は、どのよ
うな生物的に分解できる重合体、あるいは、第２の生物
的に共存でき、生物的に分解できる重合体溶液中で不溶
性の基質に応用出来る移植される細胞のタイプと同様に
移植されるマトリックスあるいは、マトリックスの表面
積は、レシピエントの大きさに基づいて決定される。ラ
ットに移植する細胞の平均は、１動物当り、６千万から
１億細胞の間である。これは、表面積がおおよそ36cm²
の重合体マトリックスを用いて移植される。70Kgの成人
に移植するのに用いることが出来る腸間膜の利用可能な
表面積は2.68m²と計算される。cm²当り700,000細胞の範
囲での細胞密度で用いることは、成人当り10⁹細胞、こ
れは、成人の肝臓の大きさの10％に当たる、の移植を理
論的に可能にする。

【００６３】細胞−マトリックス構造体の移植に先だつ
移植部位の下調べ：発明の別の実施態様では、１つある
いは、それ以上の、例えば、血管新生前の部位には血管
由来の化合物を用いているようにこれらの生物的に活性
な化合物を含むマトリックスを、移植部位の下調べを行
うために、細胞をまいたマトリックスの移植に先立っ
て、組織中へ移植している。

【００６４】細胞の選択とマトリックスヘの付着：様々
な分化した細胞を、マトリックス上に植え付けることが
出来る。好ましい実施態様では、肝細胞、膵臓細胞ある
いは副腎腺の細胞のような内分泌腺細胞が、マトリック
ス上で増殖している。視床下部や脳下垂体細胞を含む神
経系の細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、そしてリンパ細胞
のようなリンパ系の細胞、中胚葉細胞、そして泌尿生殖
器系の細胞、例えば、腎臓内分泌組織や、性に関係して
いる内分泌組織のような他の細胞もまたこの方法を用い
て移植することが出来る。

【００６５】内分泌細胞に関しては、細胞は腸間膜内の
多重マトリックス上に位置しており、本方法では、肝門
と組織系の間で、通常受けとっている臓器が供給する血
液に非常に近接した形で、これらの細胞を血流内におい
ている。このことは、細胞を通常の成長と増殖において
助けとなる、血液中に存在する多くの因子にさらしてい
る。

【００６６】一つあるいは、それ以上のタイプの細胞を
選択し、マトリックス上に成育させることが出来る。マ
トリックスの構造とin vitroで細胞が培養されるもとで
の時間の長さと状態は、細胞の付着（生きている細胞だ
けが重合体に付着した形で残っている）増殖の程度、そ
して、うまくいった植えつけの割合を測定することによ
って、それぞれの細胞のタイプに対する個々の原理に基
づいて決定される。上で討議したように、移植の前に、
十分な数の細胞が得られるならば、細胞をマトリックス
に付着させる目的以外に、in vitroで細胞を培養させる
必要はない。細胞は通常、数時間以内で付着する。メッ
シュに細胞を付着させるもっとも効率的な方法は、濃縮
した細胞懸濁液を疎水性で、細胞懸濁液を、約30分以上
かけて、織物内へしみ込ませるポリマーの表面上に置く
ことである。細胞は、ほとんどがばらばらで、あるい
は、また、２つか３つのグループで繊維に付着する。初
めの24時間以内に、細胞はかたまりに再構成し始め、こ
の時点で、単一の繊維をぐるっとつつみ込むことにより
繊維と、かなり接触している細胞もみられる。３日以内
に、細胞は、ほとんど完全に、大きなかたまりや細胞の
集団に組織化され、ほとんどがお互いに接触するように
なり、繊維支持体とは接触しなくなる。

【００６７】細胞は、生検や、トナーからの手術による
摘出、あるいは、確立された細胞系より得られる。細胞
の分離の方法は知られているが、細胞系や細胞源に対し
ては、最適化される必要がある。例えば、肝細胞は、コ
ラゲナーゼのような酵素を用いたり、機械的に分離し、
そして、あるいは、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）や
デトラフェニルホウ素のようなキレート剤で処理し分離
される。

【００６８】ある場合には、細胞−マトリックスルを移
植した後に、移植した細胞の生存能力を高める目的で、
シクロスポリンのような免疫抑制剤を投与することが有
効である。このことは、ラットの肝細胞をウサギに移植
した場合に示されたように、異種移植の場合には、必要
不可欠であり、肝細胞を、酵素的に欠損のあるGunnラッ
トに移植した場合に示されたように、同種間の移植でも
有効である。

【００６９】最初、培養により細胞を成長させること
は、続くマトリックス−細胞構造体の移植に適した細胞
操作を可能にする。現在利用可能な技術は、遺伝子を細
胞内に導入することを可能にし、脳胞性線維症のような
ために生ずる肝臓タンパク質の欠乏や代謝の欠損のため
にそうしないと存在しないであろうタンパク質の生産を
行わしている。遺伝子の発現を抑制することはまた、細
胞表面上に生じる抗原を変化させ、それにより、免疫応
答を変化させることにより、細胞は、異物とは認識され
ない。

【００７０】本発明は、次に続く、制限されない実施例
を参照することによりさらに理解されるであろう。

【００７１】

【実施例】

実施例１：腸間膜のマトリックスヘの移植のためのhepa
tocytesの単離。

【００７２】Seg1en, Methods in Ce11 Biology Vol.1
3, pp.29-83(San Diego, Ca, Academic 1976)に採用さ
れているBerry and Friend, J.Ce11 Bio1.43, 506-520
(1969)の方法を、生存性のみならず、hepatocytesの収
率を最適にするために以下のように改変した。 ポンプ、オートクレーブ可能なシラスチックチューブ、
ウォーターバス、及びエアートラップを用いて肝臓を分
散させた。分散用緩衝液の空気泡を取除くべく設置され
たエアートラップは当システムでは非常に重要な部分で
ある。肝臓は、イン シチューかあるいは体より摘出後
に分散させることができる。可能ならば、イン シチュ
ーでの分散が望ましい。イン シチューでは、肝臓が、
分散の両ステップで、腹腔中に残り、コラゲナーゼによ
る分散を引き続いて行うことだけが、初期細胞培養へと
分散させるために、外科的に取り除く。コラゲナーゼの
分散剤の再循環はない。

【００７３】初期の分散用に、Seglen HEPESべース初期
緩衝液、pH7.4を用い、次のコラゲナーゼによる分散に
は4.8mmol/L CaCl₂を含む同緩衝液を用いると、最適な
結果が得られる。緩衝液による分散で、肝臓に由来する
血液やカルシウムを洗い落とす。ラットの肝臓では、５
−６分間で充分である。第２ステップは、細胞に対して
過剰な損傷を与えない範囲で肝臓の良好な解離を与える
のに充分長く続けなければならない。一般的には、供与
者の年齢や体重及びコラゲナーゼ活性に応じて変化はあ
るが、ラットの肝臓を用いた時には、５−10分間が第２
ステップでは最適である。カニューラの出口温度が35−
36℃であるためにウォーターバスの最適温度は38−39℃
である。これらの条件では、一貫して、細胞生存率が85
−95％で、500−700×10⁵細胞／グラム肝臓の細胞を得
る。

【００７４】コラゲナーゼによる分散を用いてFischer3
4ラットとGunラットよりhepatocytesを得た。サイズが
１×３cm、厚さが２mmのポリグリコール酸の不編性の繊
維のシートに、500,000細胞／cm²となるように細胞を注
いだ。受容動物に無菌操作で開腹し、腸間膜葉の間にシ
ートを置いた。動物あたり８枚のシートを置き、膜葉を
接近させて、機能を有する移植組織１×１×３cmとな
る。

【００７５】組織移植後５日めに行った生体組成切片鏡
検で、新生脈管が生じ、適度な炎症反応と生存している
hepatocytesの存在していることが明らかになった。

【００７６】この実施例は、最小の外傷と血液の損失
で、多重のポリマー状のシートを幾重かの腸間膜に置く
ことにより、多量のhepatocytesの有効な組織移植を開
示している。当細胞はふつうは、ポリマー状の支持体が
なければ生存性を示さないものであり、機能を有する器
官に等価なものを形成するのに充分な数にイン ビボで
増殖するのは困難である。

【００７７】実施例２：吸着性のあるポリマーマトリッ
クス材と、接着因子の皮膜化の比較 移植を成功させる重要な因子のうちの１つは、移植用の
細胞を保持する骨格或いは装置の構築のために、適切な
材料を選択することである。材料は生体に適合できるも
のであるべきである。

【００７８】細胞接着のための有意な表面積を供するよ
うな表面積と体積の高い比率を持つ多孔性の３次元性の
装置へと仕上げられる特徴を持つべきである。結果とし
て生じた装置は、移植の際の崩壊をなくすべく充分な圧
縮強度を有していなけらればならない。材料は、移植す
る細胞に対して粘着できる基質でなければならないし、
また細胞による分化した機能を保持することについて、
そしてできれば細胞増殖についても同様に、理想的に考
慮しなければならない。

【００７９】合成ポリマーは再現性良く製造でき、良好
な機械特性を持つ。さらに、分解可能なポリマーを使用
することで、長期感染や外来性の肉体による反応を除外
すべきである。これらの感染や反応は、移植した細胞が
適切な組織の構成物へと成っていくことを阻害するであ
ろう。

【００８０】生体適合性、生分解性及び成型能の見通し
から、ポリラクチド（PLA）中のポリエステル、そして
ポリラクチド−グリコリド（PLGA）共族が多くの理想的
な特徴を持っている。興味のある相互作用のパラメータ
ーは、細胞接着、持続性及び分化した機能の保持性であ
る。接着性は望ましい。というのは、hepatocytesは足
場依存性であり、また非接着性細胞は移植部位に接した
ところにとどまりそうにはない、からであり、細胞は基
質に接触し、生存したままであることも望ましい。接触
期間に接触部位が分解されないことが望ましい。インビ
トロでの機能を持たせる素地はインビボで機能を有する
ための最適な素地である。細胞の機能性生命は、もし必
要であれば、細胞外マトリックスタンパク質でポリマー
状の素地を被うことにより、変えることができる。

【００８１】溶剤鋳型のフィルムの型で基質を作成し
た。そして２つの異なる成分より成るフィルムについて
調べた。１組のフィルムをモノマーで、ラクチド：グリ
コリド比85：15（DuPont, Medisorb 85:15、分子量平均
40−100,000）からなるポリ（DL−ラクチド−共存グリ
コリド）作成し、別の組のは、Medisorb 85：15とポリ
（Ｌ−ラクチド）（Polysciences, Mw 50,000）の混合
物（50／50 W/W）より作成した。

【００８２】塩化メチレン（Mallinkrodt、分析試薬品
質）中に、新しく調製した15％ポリマー溶液から、50mm
直径のガラス製ペトリシャーレ皿中でフィルムを成型し
た。各フィルムは0.4gmのポリマーを含んだ。フィルム
を含む血を、ペトリシャーレの蓋で覆い、溶剤を室温で
最小の５時間で蒸発させた。残存している溶剤を除去す
るために、24−48時間真空下にフィルムを置いた。フィ
ルムを殺菌の目的で、90分間、UV光にさらし、使用前に
乾燥状態で保存した。５mlのリン酸緩衝液−食塩水（PB
S，pH7.4）で１度洗浄し、続いて５mlの完全な培養用培
地で１度洗浄することにより、フィルムを培養用に調製
した。対照用ぺトリ皿（35mm細菌学用、Fa1con #1008）
を、50mM炭素緩衝液（pH9.4）中５μg／mlのVitrogen溶
液で、16−20時間、４℃で吸着させて、Type Ｉコラー
ゲン（Vitrogen,Collagen Corp.）で覆った。生じたコ
ラーゲンの表面濃度は１μg／cm²だった。

【００８３】細胞を、改変したSeglen, P.O.,Meth. Cel
l Bio1., 13,29-83（1976）の２段階コラゲナーゼ法を
用いて、180-250gmの雄性のFisherラットより単離し
た。肝臓を、Ca⁺⁺フリー分散緩衝液（143 mM NaCl, 7 m
M KCl, 10 Mm HEPES，pH7.4）で最初に内方向で分散さ
せ、続いて5mMCaCl₂と0.5mg／mlコラゲナーゼ（Worthin
gton, ClassII）を含む分散緩衝液で肝臓が柔らかくな
るまで分散した。完全に科学的に同定されている無血清
培地Wi11iam's E中に分散させた。 Wi11iam's E培地は1
0ng／mlのEGF(Co11aborative Research)、20mU/mlイン
シュリン(Gibco)、5nM デキサメタゾン(Sigma)、20mMピ
ルビン酸(Gibco)そして100U／mlペニシリン／ストレプ
トマイシン(Gibco)／(McGowan)を含む。分散後の細胞の
生存率は、トリパンブルー排除を用いて80-90％と決定
した。死細胞とデブリを等密度パーコール溶液(Kreame
r, B.L. et al., In Vitro Cel1, Dev. Bio1., 22(4)、
201-207(1986))中での遠視分離により除き、生じたペレ
ットを、細胞を移植する前に完全に培地で３度洗浄し
た、プレーティング時の生存率は88−98％だった。

【００８４】ルーチンな培養用に、細胞を30,000生細胞
／cm²培養表面積の濃度（300,000細胞／ディッシュ、コ
ントロール用ディッシュ、600,000細胞ディッシュ、50m
mポリマーフィルム；150,000細胞／ml）でプレートし
た、２〜４時間の接着時間（全ての基質への最大の接着
は90分以内に起こった）を経てから、末接着の細胞を除
去するために培地を変えた。そして細胞を、毎日培地を
変換することで無血清培地中に保持した。

【００８５】基質への細胞の接着は、直接計数か相対タ
ンパク質濃度を決定することに測定した。直接計算に
は、細胞を0.05％トリプシン／EDTA(Gibco)を用いて基
質よりはがした。コラーゲンで被った基質上にプレート
した細胞は、適当な細胞の分散を得るために、より長い
（30-45分)トリプシン処理を必要とした。そしてプレー
トを、全ての細胞が基質よりはずれたことを確かめるた
めに計数前に視覚的に調べた。多量のプレート上の細胞
数を同時に決定するために、要素フラビアン酸（NYS,Si
gma）の定量的結合と抽出を用いた（（Skehan, P.およ
びS. J. Friedman，In Vitro Cell. Devel. BIol., 21
(5),288-290(1985))。２つの異なる濃度（300,000及び6
00,000細胞／プレート）でプレートした細胞の反応と同
じ濃度で蒔いた同じプレートを計数することにより、細
胞数の計数を行って分析した。各点では３度繰り返して
測定した。

【００８６】細胞接着頻度を、300,000細胞／cm²表面積
でレプリカプレートに蒔いて計数した。各時間点で、３
つのプレートを、NYS色素結合分析による細胞の計数に
用いるために犠牲にした。

【００８７】高細胞濃度（500,000細胞／cm²）で細胞接
着上の死細胞から遊離する細胞外DNAの存在することに
よる影響を決定するために、0、10、100、及び1000U/ml
の濃度で接着培地にデオキシリボヌクレアーゼＩ（Unit
ed States Biochemical Corp.）を加えた。細胞をvitro
genでコートした標準型の35mmポリスチレンディッシュ
にプレートし、接着について２枚のプレートについて調
べた。

【００８８】接着用培地へと分泌したアルブミンを、ラ
ットアルビミン特異的抗体（Organon-Teknika-Capell)
を用いて、サンドウィッチELlSA技術（(Schwerer，B.,e
t al., Clin. Chim. Acta, 163, 237-244 (1987))を用
いて定量した。DNA合成は、20時間に渡り１μCi／ml ³H
-thymidineの取り込みにより生化学的に決定した。全DN
A分量と放射活性をMcGowan,J.A.およびN.L.R.Bucher，I
n Vitro，19(3),159-166(1983)により決定した。

【００８９】細胞培養をKarnovsky's定着液中で37℃、
１時間定着し、0.1Mカルジル酸緩衝液（pH7.4）で洗浄
し、１％オスミウムテトロキシド中で１時間再度定着さ
せ、徐々に濃度を変えたエタノール／水溶液中で脱水
し、超臨界のCO₂で臨界点乾燥機（Ladd)中で乾燥させ
た。サンプルを金で噴出被覆し、Hitachi走査型電子顕
微鏡で観察した。

【００９０】１つのセットの実験で、基質への細胞接着
の反応速度論を、細胞−細胞の相互作用の役割を最小に
するために、30,000細胞／cm²それ以下の細胞表面濃度
で研究した。（注意：２つの関連した細胞濃度、つまり
２次元の表面濃度と体積濃度がある。２次元の表面濃度
が適切である。なぜなら細胞は全体積に拘わらず表面に
極めて素早く沈澱するし、表面濃度は、接着界面で細胞
が相互作用をする程度と、その部位での相対的な拮抗作
用を反映している。即ち、直径20-25μmの細胞では球体
での全表面範囲は160,000-250,000細胞／cm²に相当する
であろうし、だから30,000細胞／cm²は少なくとも20％
の表面範囲を表すであろう。体積濃度は重要である。な
ぜなら、接着が、細胞分泌性のタンパク質により阻害さ
れるからである。）ポリマーフィルムの両タイプヘの接
着率は、同様であり、最大の接着は60分以内に達成され
るが、コラーゲンでコートした対照ディッシュへの最大
の接着は約120分間必要である。hepatocytesは単一細胞
として初期には接触して観察できるが、コラーゲンでコ
ートしたディッシュへの接着の反応速度論における違い
は、４倍に稀釈した細胞濃度（7500細胞／cm²）では観
察できなかった。

【００９１】100,000細胞／cm²細胞濃度では、細胞−細
胞の相互作用が基質に接着している細胞の数に顕著に影
響を与える。hepatocytesの接着のパターンはポリマー
の基質と対照について全く異なるものである。高細胞濃
度では、細胞が２−10細胞の集合体を形成することが観
察される。これらの集合体はコラーゲンでコートした基
質に接着するようにみえるであろうが、ポリマーフィル
ムと相互作用するようにはみえなかった。もし死細胞よ
りDNAがもれることが非特異的な会合を起こしているな
ら期待されるであろうような細胞集合体の形成はDNase
（10-1000U/ml）の存在によっては影響を受けなかっ
た。たとえ非常に多数の細胞が、高細胞濃度でポリマー
フィルムによりもコラーゲンでコートした基質に接着し
ていても、細胞−細胞相互作用も、200,000/cm²細胞濃
度での接着パターンにも影響を与えるだろう。洗浄ステ
ップ中で、細胞のパッチが表面より現れ、部分で表面が
むき出しになるであろう。表面での細胞の分布はNKS分
析中に容易に視覚化し、そのようなパッチ形成は200,00
0細胞／cm²かそれ以下の細胞濃度では観察できない。

【００９２】培養に用いたポリマーの基質は不透明であ
るので、走査型電子顕微鏡を細胞の形態を観察するのに
用いることができる。コラーゲンでコートしたポリスチ
レンディッシュ上に保持された細胞は、一般的には高度
に広がり、そして平板状であった。表面の微絨毛が主に
細胞の中心に観察できた。比較して、ポリマーの基質上
の細胞の形態はヘテロである。高度に球状化し、しかも
広がった細胞が観察された。ポリマーフィルム状では、
球状で広がった細胞は幾多の表面の微絨毛を有してい
た。

【００９３】PLAとPLGAの混合物のポリマーフィルムの
成型物上に保持されたhepatocytesの成長パターンは、
コラーゲンの対照基質上に保持されたhepatocytesのそ
れと同様である。DNA合成速度は同様である。細胞の自
然減は、培養３日後に始まる。純粋なPLGA85：15を用い
たフィルム成型物は、調べた細胞濃度（20,000細胞／cm
²)での、細胞の寿命に対して、よい基質であることを示
せなかった。３−４日後、大きな断片或いは、ひもとな
って基質よりはがれた。細胞をフィブロネクチンでコー
トしたポリスチレンディッシュ（10μg/cm² 10,000-30,
000細胞／cm²で培養すると、基質からのhepatocytesの
脱離が観察できた。素地からの細胞のシートあるいはひ
も状のものの脱離もまた、他のシステムで観察され、細
胞−素地間の張力を克服する細胞−細胞間の張力に寄与
していた。

【００９４】ポリマーブレンドフィルム上でhepatocyte
sの機能を保持することを、アルブンミンの分泌速度を
測定することにより評価した。ポリマーブレンドフィル
ム上に保持された細胞によるアルブミンの分泌速度（μ
g／10⁶細胞／日）は培養５日後にはほぼ２倍に増加し
た。比較して、コラーゲンの対照ディッシュ上の細胞の
アルブミンの分泌は60％以上減少した。

【００９５】コラーゲン上に保持された細胞でのアルブ
ミン合成が減少したことは、コラーゲンの表面濃度が１
及び10μg/cm²でも同じだった。

【００９６】ポリマーブレンドフィルム上の細胞による
アルブミンの分泌速度は、ラットについて報告されてい
るインビボの速度〔17.3-19.4mg/gm肝臓/24時間〕の範
囲である。（Peters, T. Jr., and J.C. Peters, J. Bi
ol. Chem., 247(12). 3858-3863(1972)）。このラット
の速度は、120×110⁶hepatocytes／gm肝臓をもとにし
て、144-162μg／10⁶細胞／24時間に相当する。

【００９７】ポリマーの表面にある最大の細胞濃度は5
0,000細胞／cm²だった。もし表面にプレートした細胞の
数は100,000細胞／cm²を超えると、基質に接着している
細胞の数は減少した。50,000細胞／cm²という最大の細
胞接着は、細胞増殖が望ましい移植状況において充分な
細胞の数ではある、しかし、もし、過剰な細胞−細胞の
接触が移植した細胞による機能の保存に必要ならば、あ
るいはもしポリマーの表面領域をもっと有効に使えるこ
とが必要であるならば、より高い細胞接着密度が要求さ
れる。充分な数の細胞がコラーゲンの対照に接着してい
るので、ng−μg／cm²量のコラーゲンのような細胞外マ
トリックスタンパク質でポリマー基質をコートすること
は、もし高細胞表面密度が要求されるならば、移植マト
リックスヘの細胞の接着を促するのに用いることができ
る。

【００９８】インビボでのhepatocytesの機能を保持す
るために、細胞を高度に機能を有する状態で移植する必
要があること、及びこのことを確認するための最良の方
法は、細胞の機能を保持させるのにも最適であるような
接着用の基質を用いることが望まれている。PLGA85：15
とPLLAとの混合物から作成されたフィルムは、１つのhe
patocytesの機能（アルブミンα分泌）を確実に保持さ
せるように見える。しかし、この保持の機構は明らかで
はない。なぜなら、ポリマーを細胞間に生体特異的な相
互作用がないからである。分化した機能を保持すること
が観察されたが、その考えられるメカニズムの１つは、
細胞の形の調整を通じてである。多くの細胞のタイプで
の遺伝子発現のコントロールが細胞の形状に依存してい
ることが示されている。

【００９９】実施例３：細胞を植えたマトリックスの第
２次移植を行う部位での前導脈化（Prevascularizatio
n） 移植後最初の24-48時間にhepatocytesの生存率の大きな
減少がある。この減少は移植に用いられている細胞密度
には全く依存していない。しかしながら、適用が高密度
であれば、植付けを長く生かす生存細胞の数がそれだけ
多くなる。植え付けた細胞の数を増加させることによっ
て前導脈化が助けているように見える。図６ａは、移植
部位の低倍率見取図を描している。右及び左の余白はも
ともとの腸間膜皺壁であり、細胞のポリマー構築物は葉
の間に見ることができる。ポリマー材料はそれぞれのフ
ァイバーのまわりに巨大細胞の異物反応を示す。すき間
には、適当に炎症した細胞の浸潤物がある。生存してい
るhepatocyteｓの小さな集まりとクラスターが移植物の
中に見られる。新しい血管新生も存在する。図６ｂは、
hepatocytesの集まりが、腸間膜皺壁や関連している血
液供給に最も近接している移植体の端をはっきりと好む
ことを示しているより高倍率の見取図である。hepatocy
tesもまたポリマーファイバーに接着していない。細胞
が敷かれたマトリックスについて、と同様にお互いにつ
いても選択的な接着性が起こることを示している。コラ
ーゲンを置くことに伴う起こるフィブロブラスト反応が
ある。

【０１００】前導脈化は、トリペプチドのグリシン−ヒ
スチジン−リジン（GHL）とともに負荷したポリマーの
移植によって成し終えた。GHLは肝栄養剤であると同様
に既知の脈管新生剤であり得るものである。図７ａは、
腸間膜へ移植したGHLを含むポリマー状のマトリックス
の写真である。図７ｂは、腸間膜へ移植したGHLを含ま
ないポリマー状のマトリックスの写真である。マトリッ
クスは細胞を含んでいなかった。ポリマーは上段左側の
角にある。図７ａ中の矢印は、大きくて、密な脈管のネ
ットワークを示している。このネットワークはポリマー
状のマトリックスを含むGHLの移植５日間を経て生じた
ものである。

【０１０１】当該発明の修飾や改変、インビボにおいて
ポリマー状のマトリックス上での機能を有する多量の細
胞を移植する方法、およびそれぞれの産物は、上記本発
明の説明から当業者には明らかであろう。これらの修飾
や改変は添付の請求の範囲内に入る。

【０１０２】

【発明の効果】本発明により、内分泌臓器を形成するた
めに大容量の細胞を移植する方法と手段が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは、成人の側断面図であり、小腸と腸間
膜を含む上部および下部胃腸管の様々な構成成分を示し
ている。図１Ｂは、小腸の腸間膜の、前からみた予想図
である。

【図２】腸間膜に伴う循環系の静脈の図である。

【図３】図３Ａと図３Ｂは、腸間膜のひだの間に置かれ
た、細胞を植えつけたポリマーシートの移植を示してい
る本発明の方法の図解であり、図３Ａは予想図であり、
図３Ｂは断面図である。

【図４】ポリマーシートの挿入の結果生じるキメラ構造
体の図であり、図３に示したように、本発明による細胞
マトリックスキメラ構造体を形成するように、ゆるく、
合わさって接近している。

【図５】200〜500μm厚の範囲の厚さをもつ、スポンジ
状のマトリックスの断面のフリーズフラクチャー図であ
る。

【図６】図６Ａは、移植部位の低倍率図を示している。
右と左の端はもともとの腸間膜のひだであり、細胞重合
体構造物は、ひだの間に見ることが出来る。重合体材料
は、それぞれの繊維のまわりに巨細胞による異物反応を
示す。間質にもぐり込んでいる軽い炎症性の細胞があ
る。生育し得る肝細胞の、小さな巣とかたまりが、移植
体のいたるところにみられ、新しい血管の新生が、いた
るところで存在している。図６Ｂは、肝細胞の巣が、明
らかに、腸間膜のひだにぴったりとくっついた移植体の
ふちの部分に選択的にみられ、血液の供給をともなって
いることを示している高倍率図である、肝細胞は、ま
た、重合体繊維には付着しておらず、設置されたマトリ
ックスだけでなく、細胞それぞれに付して、選択的な接
着性が生じていることを示している。コラーゲンの堆積
に関与する付随性の線維芽細胞反応がみられる。

【図７】図７Ａは、腸間膜に移植された、ＧＨＬを含む
重合マトリックスの写真である。図７Ｂは、腸間膜に移
植された、ＧＨＬを含まない重合マトリックスの写真で
ある。

フロントページの続き (71)出願人 596096696 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉ ｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139，ケンブリッジ，マサチューセッツ アベニュー 77 77 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ａｖｅ ｎｕｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ 02139 ＵＳＡ (72)発明者 ジョゼフ ピー． バカンティ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01890 ウィンチェスター，フェルズ ロ ード 51 (72)発明者 ロバート エス． ランガー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02158 ニュートン，ロンバード ストリ ート 77 (72)発明者 リント ジョンソン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02368 ランドルフ，パール ストリート 17 (72)発明者 リンダ グリフィス−シーマ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02173 レキシントン，バーリントン ス トリート 28

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （a）高度に血管化された組織内に層と
   して移植され、単一のマトリックス構造体を形成し得る
   １つより多いマトリックスを選択する工程、および
   （b）組織のひだの間に１つより多いマトリックス構造
   体を移植する工程、を包含する外科手術法に使用するた
   めの手術用移植片を製造する方法であって、該製造方法
   は、移植の時または移植の前に該マトリックス上および
   該マトリックス内に生存している細胞を植え付ける工程
   を包含し、ここで該マトリックスは、該生存している細
   胞の生存度を維持するように、多くの血管からの栄養物
   およびガスの交換を可能にするための１００〜２００μ
   ｍの範囲の隙間空間を有する、多孔性または繊維状構造
   の生体適合性材料を含有する、手術用移植片の製造方
   法。