JPH10265404A - ヒト成長ホルモンを含有する医薬製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、分子量約２００００のヒト成長ホ
ルモンを含有し、凍結乾燥再溶解後の水溶液中での溶解
性及び安定性を向上させた医薬製剤を提供する。 【解決手段】 分子量約２００００のヒト成長ホルモン
の水溶液にクレアチニン、アセチルトリプトファンナト
リウム及びニコチンアミドから選ばれる少なくとも１種
以上の水溶性複素環化合物、塩基性アミノ酸もしくはそ
の塩及び非イオン性界面活性剤を加え、凍結乾燥製剤を
製造する。 【効果】 本発明により、分子量約２００００のヒト成
長ホルモンを医薬品として適した濃度含有し、かつ凍結
乾燥再溶解後も安定に維持できる、注射剤として使用す
るに適した医薬製剤が提供可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、分子量約２０００
０のヒト成長ホルモン（以下２０ｋｈＧＨ）を含有する
医薬製剤に関するものであり、詳しくは２０ｋｈＧＨを
含有する溶液を凍結乾燥した後再溶解した場合不溶物が
なく、貯蔵安定性に優れた凍結乾燥製剤及びその製造法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヒト成長ホルモンは分子量が約２２００
０（２２ｋｈＧＨ）のものと約２００００（２０ｋｈＧ
Ｈ）のものがあることが知られている。２２ｋｈＧＨは
遺伝子組み換え技術により製造され、小児科領域におい
て下垂体性小人症の治療に用いられている。２０ｋｈＧ
Ｈはまだ工業的レベルで製造されたことがなく、医療用
として用いられたことがない。

【０００３】２０ｋｈＧＨは分子量約２００００の単鎖
のポリペプチドで、等電点を約５．５付近に有し、中性
のｐＨの水溶液中では安定しているが、酸性及びアルカ
リ性のｐＨ領域では不安定である。ｐＨ範囲が弱酸性か
ら弱アルカリ性での２０ｋｈＧＨの溶解性は約１ｍｇ／
ｍｌ以下であり、凍結保存後の再融解時には不溶物を生
じるなど、非常に溶解性の低い蛋白質といえる。さらに
弱酸性から弱アルカリ性のｐＨ範囲の水溶液中では、２
０ｋｈＧＨは非常に二量体を形成しやすく、既に報告さ
れているヒト下垂体由来の２０ｋｈＧＨにおいても２０
ｋｈＧＨ分子同士あるいは分子量約２２０００のヒト成
長ホルモンと二量体を形成しやすいことが報告されてい
る（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｏ．
Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２５６，ｐｐ．２３９５−２４０
１，１９８１）。これらのことから、２０ｋｈＧＨの溶
解性が低い原因は蛋白質の疎水性相互作用によるもので
あることが推察される。

【０００４】疎水性の高い蛋白質の溶解性を向上させる
一般的な方法としては、非常に強い界面活性作用をもつ
ドデシル硫酸ナトリウムや変性剤、例えば尿素、塩酸グ
アニジン等が用いられる。しかし、これらは蛋白質の構
造を破壊するものであり、蛋白質の本来の機能を喪失あ
るいは低減させる。すなわち、蛋白質を医薬製剤として
使用することを目的にした場合には、これらの一般的な
方法は決して好ましくない。

【０００５】一方、蛋白質の溶解性を向上させる為に溶
解助剤を使用する例として、正の電荷を有するヒスチジ
ン及びクレアチニンと負の電荷を有するクエン酸を等モ
ルずつ添加して組織プラスミノーゲンアクチベーター
（以下ｔＰＡ）改変体の溶解性を向上させる方法（ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ９０／０８５５７号）が知られている。ｔＰ
Ａ及びｔＰＡ改変体は、中性のｐＨでの溶解性は極端に
低いものの、酸性のｐＨでは優れた溶解性を示す蛋白質
である。すなわちｔＰＡ及びｔＰＡ改変体の溶解性の低
さは蛋白質の等電点沈澱によるものであり、この方法
は、正の電荷を有するヒスチジン及びクレアチニンと負
の電荷を有するクエン酸を添加することにより、等電点
沈澱を抑制するものである。

【０００６】現在市販されている分子量約２２０００の
ヒト成長ホルモンを含む医薬製剤の処方は下記表１（表
１）のとおりである。これらは通常皮下投与あるいは筋
肉内投与される。また、これら２２ｋｈＧＨの製剤は基
本的にはグリシンまたはマンニトールを含んでおり、５
℃保存で１年間安定である。

【０００７】

【表１】 表１ 市販されている２２ｋｈＧＨ凍結乾燥製剤の処方 ──────────────────────────────────── 製品名 添加物 再溶解液 ──────────────────────────────────── ジェノトロピン ４ＩＵ グリシン：２４ｍｇ 注射用水 １ｍｌ ノルジトロピン ４ＩＵ グリシン：２４ｍｇ Ｄ−マンニトール：２．４ｍｇ 注射用水 １ｍｌヒューマトローフ゜ ４ＩＵ グリシン：１．４８ｍｇ Ｄ−マンニトール：７．４ｍｇ 生理食塩水 ２ｍｌ サイゼン ４ＩＵ Ｄ−マンニトール：２０ｍｇ 生理食塩水 １ｍｌ グロウジェクト ４ＩＵ Ｄ−マンニトール：４０ｍｇ 生理食塩水 １ｍｌ ──────────────────────────────────── 本発明者らの検討によれば、このような処方で２０ｋｈ
ＧＨの凍結乾燥製剤を製造しても安定な製剤は得られな
かった。

【０００８】２０ｋｈＧＨをこれらと同様の投与方法・
処方で使用する場合に、十分な濃度を有する安定な水溶
液が得られないとすれば、それは投与容量の増大を招
く。このようなことは２０ｋｈＧＨの注射剤としての使
用に際し極めて不都合であると考えられる。

【０００９】ヒト成長ホルモンの溶液中の安定化方法と
してはこれまでにいくつかの技術が知られている。例え
ば、２２ｋｈＧＨ水溶液の安定化剤としてアルギニンと
ＥＤＴＡを含む製剤処方（特表平８−５０２０２１）、
２２ｋｈＧＨ溶液の不溶物の生成と溶解物の活性を維持
するために多価アルコールやアミノ酸を添加する処方
（ＥＰ３０３７４６）、２２ｋｈＧＨ水溶液の類縁物の
増加を抑制するために安定化剤としてヒスチジンを加え
る処方（特表平７−５０２５１６）が報告されている。
とは言え、これらの処方はいずれも溶液中での２２ｋｈ
ＧＨの安定化方法として検討されたものであり、２２ｋ
ｈＧＨ凍結乾燥品の安定化作用は記載されていない。ま
た２０ｋｈＧＨの凍結乾燥製剤の安定化に関しては何も
知られていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは２０ｋｈ
ＧＨの溶解性及び安定性について検討した。その結果、
以下表２（表２）に示すように、２０ｋｈＧＨは２２ｋ
ｈＧＨと比較すると、分子量が小さいだけでなく、生理
活性及び安定性、溶解性等の物理化学的性質が大きく異
なることが判明した。特に２０ｋｈＧＨの原体は凍結乾
燥しても不安定であり、５℃のような低温で凍結乾燥製
剤を保存しても２０ｋｈＧＨのＡｓｎが脱アミドされて
Ａｓｐとなった脱アミド体やＭｅｔがｏｘＭｅｔとなっ
たスルホキシド体のような類縁物質及び高分子量重合物
が経時的に増加する。類縁物質とは２０ｋｈＧＨの例え
ばＡｓｎ¹³⁴が脱アミドされてＡｓｐ¹³⁴となったモノ脱
アミド体、Ａｓｎ¹³⁴に加えＡｓｎ¹³⁷も脱アミドされた
ジ脱アミド体、Ｍｅｔ¹⁴がｏｘＭｅｔ¹⁴となったスルホ
キシド体を指している。また原体を溶解させた溶液中で
例えばヒペット操作のようなハンドリングで容易に蛋白
が会合し、不溶物が析出する。即ち水溶液中の安定性が
低い。後述するように２０ｋｈＧＨの溶液に塩基性アミ
ノ酸を添加しても不溶物や類縁物質の生成は抑制されな
い。前述したように２０ｋｈＧＨは疎水性が高く、その
ため２２ｋｈＧＨよりも不溶物が析出しやすいことが考
えられる。

【００１１】

【表２】 表２ ２０ｋｈＧＨと２２ｋｈＧＨとの物理化学的性質の違い ───────────────────────────── 物理化学的性質 ２０ｋｈＧＨ ２２ｋｈＧＨ ───────────────────────────── 等電点 ｐＨ５．５¹ ｐＨ５．１¹ 二量体形成 形成しやすい² 形成しにくい² 疎水性 強い³ 弱い³ 水に対する溶解度 低い³ 高い³ 凍結乾燥された原体の 低い³ 高い大³ の安定性 溶解した時の安定性 低い³ 高い 大³ ───────────────────────────── 1:Endocrine Reviews,(1991), vol.12, pp.314-324. 2:J Biol.Chem., (1981), vol.256, pp.2395-2401. 3:本発明データ

【００１２】以上述べたとおり、２０ｋｈＧＨの生理学
的活性を維持したままで優れた溶解性及び安定性を有す
る水溶液を得るためには、２２ｋｈＧＨの製剤処方を単
に踏襲するだけではその達成は非常に困難であり、注射
剤として適した濃度を維持しかつ安定である２０ｋｈＧ
Ｈの新たな処方の医薬製剤が強く望まれていた。また、
２０ｋｈＧＨを凍結乾燥しても類縁物質及び高分子量重
合物の生成は防止できないことから、類縁物質や高分子
量重合物の生成の少ない、安定な２０ｋｈＧＨを含有す
る凍結乾燥医薬製剤の提供が望まれていた。

【００１３】従って本発明の目的は、水に溶解した場合
２０ｋｈＧＨに由来する不溶物の析出がない２０ｋｈＧ
Ｈを含む医薬製剤を提供することであり、また他の目的
は再溶解後の類縁物質及び高分子量重合物の生成が抑制
された２０ｋｈＧＨを含む凍結乾燥製剤を提供すること
である。

【００１４】また、本発明の別の目的は、２０ｋｈＧＨ
を含む医薬製剤における２０ｋｈＧＨの不溶化を防止
し、安定性を向上させる方法、２０ｋｈＧＨを含む凍結
乾燥製剤の経時的な類縁物質や高分子量重合物の生成を
抑制する方法を提供することである。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題である２０ｋｈＧＨの溶解性及び安定性の向上と凍結
乾燥した時に安定な２０ｋｈＧＨの製剤処方を得ること
を目的に鋭意研究を進めた。その結果、優れた２０ｋｈ
ＧＨの溶解性と安定性を有する２０ｋｈＧＨを含む医薬
製剤の製造に成功した。また、２０ｋｈＧＨを含む凍結
乾燥製剤に塩基性アミノ酸と非イオン性界面活性化剤を
添加すると凍結乾燥製剤の類縁物質の生成が抑制され安
定性が向上し、該凍結乾燥製剤は水に再溶解した場合に
不溶物を生じないことを見出し、本発明を完成するに至
った。

【００１６】即ち本発明は、分子量約２００００のヒト
成長ホルモンまたはその類縁体と水溶性複素環化合物を
含む医薬製剤、分子量約２００００のヒト成長ホルモン
またはその類縁体を含む医薬製剤に水溶性複素環化合物
を添加することにより、該ヒト成長ホルモンまたはその
類縁体の不溶化を防止し、安定性を向上させる方法、１
種類または２種類の塩基性アミノ酸またはその塩及び非
イオン性界面活性剤を添加することにより、分子量約２
００００のヒト成長ホルモンまたはその類縁体を含有す
る凍結乾燥剤の経時的な類縁物質の生成を抑制する方法
である。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明に係る成長ホルモンは分子
量約２００００のヒト成長ホルモンであって、該ヒト成
長ホルモンは天然あるいは遺伝子組み換え技術で得られ
るいずれのものでもよい。本発明に係わる２０ｋｈＧＨ
の例としては、配列番号１及び配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列を含有するものが挙げられるが、配列番号１ま
たは配列番号２に記載のアミノ酸全配列の中の一つまた
は数個のアミノ酸が異なっていてもよく、２０ｋｈＧＨ
の生理学的特徴を保持している限り、本発明の範疇であ
る。

【００１８】本発明の２０ｋｈＧＨを含有する医薬製剤
に含まれる２０ｋｈＧＨの濃度は、凍結乾燥前の溶液状
態において０．５〜１０．０ｍｇ／ｍｌであり、好まし
くは１．０〜３．０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１．
５〜２．５ｍｇ／ｍｌである。また凍結乾燥された製剤
の再溶解後の２０ｋｈＧＨの濃度は１０ｍｇ／ｍｌ以下
が有効である。

【００１９】本発明の２０ｋｈＧＨを含有する医薬製剤
は、溶液状の製剤及び凍結乾燥された製剤の再溶解後の
２０ｋｈＧＨの溶解性を向上させるために水溶性複素環
化合物を含有する。本発明に用いられる水溶性複素環化
合物としては、クレアチニン、アセチルトリプトファン
ナトリウム等のアセチルトリプトファンの塩及びニコチ
ンアミドの中から少なくとも１種類以上が選ばれるが、
好ましくはクレアチニンである。該水溶性複素環化合物
濃度は溶液状の製剤及び凍結乾燥後の再溶解液において
０．１％〜１０％であり、好ましくは０．３％〜５％で
ある。

【００２０】本発明の２０ｋｈＧＨを含む医薬製剤のｐ
Ｈは５〜８の範囲であり、好ましくは６．０〜７．８、
より好ましくは６．５〜７．６である。特にｐＨを７．
６にすることにより通常の目視では判別しにくい、６０
００ルクス程度の光源の下で目視で確認できる、極微細
な不溶物までも減少ないし消失させることができる。ｐ
Ｈ調整を必要とする場合は、単にｐＨ調整剤、例えば塩
酸、リン酸及び硫酸等を用いるか、または緩衝液、例え
ばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リン酸、
マレイン酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、ヒスチジン又
はその塩を用いることが可能である。好ましくはリン酸
又はその塩である。該緩衝液濃度は０．１ｍＭ〜１００
ｍＭであり、好ましくは５ｍＭ〜５０ｍＭである。

【００２１】本発明の２０ｋｈＧＨを含む凍結乾燥製剤
に使用される塩基性アミノ酸としては、リジン、ヒスチ
ジン、アルギニンまたはその塩等が挙げられる。塩基性
アミノ酸の添加量は２０ｋｈＧＨ１重量部に対し１〜２
０重量部であり、好ましくは２〜１５重量部である。

【００２２】また本発明の２０ｋｈＧＨを含む凍結乾燥
製剤は、該凍結乾燥製剤の再溶解後の２０ｋｈＧＨの安
定性を向上させるために非イオン性界面活性剤を含有す
る。本発明に用いられる非イオン性界面活性剤はポリオ
キシエチレンポリオキシプロピレングリコール、或いは
ポリソルベートであり、例えばポリオキシエチレン（１
６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリ
ソルベート２０、ポリソルベート８０であり、好ましく
はポリソルベート２０またはポリソルベート８０もしく
はその両方である。さらに好ましくはポリソルベート８
０である。該非イオン性界面活性剤濃度は、凍結乾燥後
の再溶解液において０．０２％〜１％であり、好ましく
は０．０２％〜０．２％である。

【００２３】さらに本発明の２０ｋｈＧＨを含む凍結乾
燥製剤は、凍結乾燥したときの外観及び成形性向上のた
めに賦形剤を配合することができる。賦形剤のひとつと
しては糖アルコール、例えばマンニトールがあげられ
る。該賦形剤の濃度は、凍結乾燥後の再溶解液において
０．１％〜５％であり、好ましくは０．５％〜２％であ
る。本発明の医薬製剤は上述の水溶性複素環化合物を添
加した水溶液に２０ｋｈＧＨの希薄溶液を加えた後ｐＨ
を調整すればよい。

【００２４】また、本発明の医薬製剤は凍結乾燥品とす
ることが望ましく、凍結乾燥品の製造方法及び条件等に
ついて、特に限定されることはない。凍結乾燥は例え
ば、上記濃度範囲の水溶性複素環化合物、所定量の塩基
性アミノ酸、非イオン性界面活性化剤、必要により賦形
剤を添加した水溶液に２０ｋｈＧＨの希薄溶液を加えた
後ｐＨを調整された調製溶液を、−３０℃〜−８０℃で
凍結させ、常法により減圧乾燥を行なう。

【００２５】さらに本発明の医薬製剤を注射剤として使
用する場合には、凍結乾燥品を適切な注射用水、あるい
は浸透圧調節剤例えば塩化ナトリウム、ブドウ糖、マン
ニト−ルなどの糖アルコ−ルを含む水溶液にて再溶解す
ればよい。

【００２６】

【実施例】以下に本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例により何等限定されるもの
ではない。

【００２７】［実施例１］ クレアチニンの添加による
２０ｋｈＧＨの溶解性の検討 実施例１〜９で用いられる２０ｋｈＧＨは遺伝子操作に
より調製されたものであり、詳しくは、形質転換株ＭＴ
−１０７６５（本菌株は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５０
２０として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所にブダペスト条約に基づいて寄託されている）を用い
て特開平６−２６９２９２に記載された方法に従った。
すなわち、２０ｋｈＧＨをコードする遺伝子を有する発
現・分泌プラスミドを大腸菌に導入して得られた形質転
換株ＭＴ−１０７６５を、ポリペプトン、酵母エキス及
びグリセロール等で構成される培養液を用いて培養す
る。培養終了後、遠心分離操作により菌体を集菌し、浸
透圧ショック法により、菌体外膜を破裂させ、ペリプラ
ズム画分のみを回収する。ペリプラズム画分からの２０
ｋｈＧＨの分離・精製方法は、公知の方法及びそれに準
じた手法により実施した。

【００２８】上記より得られた約０．２ｍｇ／ｍｌ〜
０．４ｍｇ／ｍｌ濃度の２０ｋｈＧＨ水溶液に尿素を添
加し、約８ｍｇ／ｍｌまで濃縮した後、０％、０．３％
（２７．８ｍＭ）、０．６％（５５．５ｍＭ）、１．２
５％（１１１ｍＭ）、２．５％（２２１ｍＭ）、５％
（４４２ｍＭ）の各濃度のクレアチニンを含む２０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で満たされたゲ
ル濾過カラムの各々に上記濃縮液を添加した。ゲル濾過
により、尿素が除かれ、さらに上記各々の濃度のクレア
チニンを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に置換さ
れて溶出される精製画分を分取し、その得られた精製画
分中の蛋白濃度の測定及び溶液状態の変化を目視で評価
した。クレアチニンの添加による効果を表３（表３）に
示す。表３（表３）より、溶液中にクレアチニンが存在
することで２０ｋｈＧＨの溶解性を向上させることが可
能となり、さらにクレアチニン濃度の増加に伴いゲル濾
過法で得られる精製画分中の２０ｋｈＧＨの濃度が上昇
することも確認された。同様に、本発明において用いら
れる他の複素環化合物であるアセチルトリプトファンナ
トリウム、ニコチンアミドについても評価したところ、
クレアチニンにおける場合と同様の効果が認められた。

【００２９】また、形質転換株ＭＴ−１０７１２（本菌
株は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４３６１として通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所にブダペスト条約
に基づいて寄託されている）から上記と同様の操作によ
り得られた２０ｋｈＧＨを用いた実験を行ったところ、
上記と同様の結果を得た。

【００３０】これらの実験結果、クレアチニンの添加効
果の発現はクレアチニンと等モルの負の電荷を有する化
合物を必要としなかった。このことは２０ｋｈＧＨの溶
解性に及ぼすクレアチニンの作用は等電点沈澱の防止と
は異なった作用であることを示している。

【００３１】

【表３】 注：×；沈殿を生じる。 −；澄明

【００３２】［実施例２］ ポリソルベート８０の添加
による２０ｋｈＧＨ凍結溶解後の溶液状態の検討 表３（表３）に記載のクレアチニン濃度１．２５％（１
１１ｍＭ）を基本に０、０．００５、０．０１、０．０
２、０．０５、０．１、０．２％濃度のポリソルベート
８０（商品名；Ｔｗｅｅｎ８０）を各々添加したとき
の、凍結・融解前後の２０ｋｈＧＨ水溶液の溶液状態変
化を４面硝子容器に入れて、６０００ルクスの蛍光灯下
で目視で判定した。この時の２０ｋｈＧＨ濃度は約２ｍ
ｇ／ｍｌであった。ポリソルベート８０の添加による効
果を表４（表４）に示す。０．０２％以上のポリソルベ
ート８０を添加することにより、凍結・融解操作で生じ
る微量の２０ｋｈＧＨの不溶物の生成が防止され、安定
した溶液状態を維持することわかった。

【００３３】

【表４】 注：−；澄明 ＋；僅かな不溶物 ＋＋；はっきりした不溶物

【００３４】［実施例３］ マンニトールの添加による
２０ｋｈＧＨ凍結乾燥ケーキの外観、成形性及び再溶解
後の溶液状態の検討 表４（表４）に記載のポリソルべート８０濃度が０．０
５％及び０．２％であり、どちらもクレアチニン濃度が
１．２５％（１１１ｍＭ）である２０ｋｈＧＨ水溶液
に、賦形剤として０、１．０、５．０％濃度のマンニト
ールを各々加えてバイアル瓶に入れた。バイアル瓶を５
℃から−４０℃まで冷却し、−４０℃で５時間冷却し
た。−４０℃から−２５℃まで減圧下温度を上げ、−２
５℃で更に６０時間減圧乾燥した。減圧下に１５℃まで
昇温し、この温度で６時間乾燥した。凍結乾燥ケーキの
外観及び成形性を観察した後、さらに注射用蒸留水１ｍ
ｌを加えて再溶解したときの溶解性を６０００ルクスの
蛍光灯下で観察した。マンニトールの添加による効果を
表５（表５）に示す。凍結乾燥したケーキの外観及び成
形性はマンニトールを添加しないものに比べて、マンニ
トールを添加することでさらに向上することが可能とな
った。また、再溶解後の溶液状態も非常に良好であるこ
とが確認された。

【００３５】

【表５】 注：−；澄明 ＋；僅かな不溶物 ＋＋；はっきりした不溶物 △；やや不良 ○；良好 ◎；極めて良好

【００３６】［実施例４］２０ｋｈＧＨ凍結乾燥製剤の
再溶解後の不溶物の生成に対する塩基性アミノ酸とマン
ニトールの添加効果 所定量の塩基性アミノ酸またはその塩酸塩、１.２５％
（１１１ｍＭ）クレアチニン 、２.５％マンニトール、
０.０５％ポリソルベート８０を含み、リン酸二水素ナ
トリウムと水酸化ナトリウムでｐＨを７.６に調節した
２０ｋｈＧＨを２ｍｇ／ｍｌ含む水溶液１ｍｌをバイア
ル瓶に入れた。バイアル瓶を５℃から−４０℃まで冷却
し、−４０℃で５時間冷却した。−４０℃から−２５℃
まで減圧下温度を上げ、−２５℃で更に６０時間減圧乾
燥した。減圧下に１５℃まで昇温し、この温度で６時間
乾燥した。得られた凍結乾燥製剤を注射用蒸留水１ｍｌ
で復水（再溶解）し、５℃で７日間保存した。試験開始
時と７日後の溶状を６０００ルクスの蛍光灯下で観察し
た。結果を表６（表６）に示す。

【００３７】

【表６】 第６表 塩基性アミノ酸の溶液中の不溶物生成に対する効果 ────────────────────────────── 塩基性アミノ酸／マンニトール 溶液状態 ─────────── アミノ酸 添加量(mg) ｐＨ 開始時 ７日後 ────────────────────────────── − ０ ６．５ − ＋ − ０ ７．６ − − アルキ゛ニン塩酸塩 ４．２ ７．６ − ＋ アルキ゛ニン塩酸塩 ６．０ ７．６ − ＋ アルキ゛ニン塩酸塩 ４．２ ７．６ − − ＋マンニトール アルキ゛ニン塩酸塩 ６．０ ７．６ − − ＋マンニトール ヒスチシ゛ン ６．０ ７．６ − ＋ リシ゛ン塩酸塩 ６．０ ７．６ − ＋ ────────────────────────────── 注：−；澄明 ±；極僅かな不溶物 ＋；僅かな不溶物 ＋＋；はっきりした不溶物

【００３８】表６（表６）から明らかなように塩基性ア
ミノ酸は２０ｋｈＧＨ溶液の不溶物の生成を抑制せず、
むしろ増悪させる傾向があった。不溶物の生成はマンニ
トールを添加しｐＨを調整することで抑制されることが
わかった。

【００３９】［実施例５］２０ｋｈＧＨ凍結乾燥製剤の
再溶解後の溶液中の類縁物質の増加に対する塩基性アミ
ノ酸の添加効果 ２０ｋｈＧＨを含む水溶液のｐＨを７.６に調節した以
外は実施例４と同様の実験を行い、試験開始時と７日後
の類縁物質（脱アミド体とスルホキシド体）量を液体ク
ロマトグラフィーで定量した。結果を表７（表７）に示
す。

【００４０】

【表７】 表７ 塩基性アミノ酸の類縁物質生成に対する効果 ─────────────────────────────────── 塩基性アミノ酸添加 類縁物質量（％） ──────────────── アミノ酸 添加量(mg) ｐＨ 開始時 ７日後 増加分 ─────────────────────────────────── − ０ ７．６ ５．１ ５．４ ０．３アルキ゛ニン 塩酸塩 ４.２ ７．６ ５．１ ５．５ ０．４アルキ゛ニン 塩酸塩 ６.０ ７．６ ５．１ ５．５ ０．４ヒスチシ゛ン ６.０ ７．６ ５．２ ５．５ ０．３リシ゛ン 塩酸塩 ６.０ ７．６ ５．２ ５．６ ０．４ ─────────────────────────────────── 表７（表７）から明らかなように、塩基性アミノ酸の添
加は溶液中の類縁物質の増減には影響しなかった。

【００４１】［実施例６］ ２０ｋｈＧＨ凍結乾燥製剤
中の類縁物質の増加に対するアルギニン及び塩酸アルギ
ニンの添加効果 アルギニンまたは塩酸アルギニン所定量、１.２５％
（１１１ｍＭ）クレアチニン 、０.０５％ポリソルベー
ト８０を含みリン酸二水素ナトリウムと水酸化ナトリウ
ムでｐＨを７.６に調節した２０ｋｈＧＨを２ｍｇ／ｍ
ｌ含む水溶液１ｍｌをバイアル瓶に入れた。バイアル瓶
を５℃から−４０℃まで冷却し、−４０℃で５時間冷却
した。−４０℃から−２５℃まで減圧下温度を上げ、−
２５℃で更に６０時間減圧乾燥した。減圧下に１５℃ま
で昇温し、この温度で６時間乾燥した。得られた凍結乾
燥製剤を４０℃で２週間保存した。試験開始時と２週間
後の類縁物質の含量を液体クロマトグラフィーで測定し
た。結果を表８（表８）に示す。表８に示すようにアル
ギニンまたは塩酸アルギニンの添加により類縁物質の生
成が抑制されることが明らかになった。

【００４２】

【表８】 表８ 凍結乾燥製剤中の類縁物質の生成に対するアルギニンまたは塩酸アルギニ ンの添加効果 ───────────────────────────────── 塩基性アミノ酸 類縁物質量（％） ────────────────── アミノ酸 添加量(mg) 開始時 ２週間後 増加分 ───────────────────────────────── − ０ ３．９ １０．７ ６．８ 塩酸アルギニン １．０５ ３．７ ７．０ ３．３ 塩酸アルギニン ４．２０ ３．８ ５．６ ２．２ 塩酸アルギニン ６．００ ３．７ ５．５ １．８ 塩酸アルギニン ２６．７ ７．６ ８．２ ０．６ アルギニン ４．９６ ３．９ ７．０ ３．１ ─────────────────────────────────

【００４３】［実施例７］２０ｋｈＧＨ凍結乾燥製剤中
の類縁物質の増加に対するリジン塩酸塩及びヒスチジン
の添加効果 リジン塩酸塩またはヒスチジンを所定量、１.２５％ク
レアチニン 、０.０５％ポリソルベート８０を含みリン
酸二水素ナトリウムと水酸化ナトリウムでｐＨを７.６
に調節した２０ｋｈＧＨを２ｍｇ／ｍｌ含む水溶液１ｍ
ｌをバイアル瓶に入れた。バイアル瓶を５℃から−４０
℃まで冷却し、−４０℃で５時間冷却した。−４０℃か
ら−２５℃まで減圧下温度を上げ、−２５℃で更に６０
時間減圧乾燥した。減圧下に１５℃まで昇温し、この温
度で６時間乾燥した。得られた凍結乾燥製剤を４０℃で
２週間保存した。試験開始時と２週間後の類縁物質の含
量を液体クロマトグラフィーで測定した。結果を表９
（表９）に示す。表９に示すように塩基性アミノ酸及び
その塩であるヒスチジン及びリジン塩酸塩にも上記アル
ギニン及びアルギニン塩酸塩と同様に類縁物質の生成を
抑制する効果が認められた。

【００４４】

【表９】 表９ 凍結乾燥製剤中の類縁物質の生成に対する塩基性アミノ酸の添加効果 ───────────────────────────────── 塩基性アミノ酸 類縁物質量（％） ────────────────── アミノ酸 添加量(mg) 開始時 ２週間後 増加分 ───────────────────────────────── − ０ ３．９ １０．７ ６．８ ヒスチジン ４．４ ３．８ ５．８ ２．０ リジン塩酸塩 ５．２ ３．９ ５．６ １．８ ─────────────────────────────────

【００４５】［実施例８］ ２０ｋｈＧＨ凍結乾燥製剤
中の高分子量重合物の増加に対する塩基性アミノ酸の添
加効果 塩基性アミノ酸所定量、１.２５％（１１１ｍＭ）クレ
アチニン 、０.０５％ポリソルベート８０を含みリン酸
二水素ナトリウムと水酸化ナトリウムでｐＨを７.６に
調節した２０ｋｈＧＨを２ｍｇ／ｍｌ含む水溶液１ｍｌ
をバイアル瓶に入れた。バイアル瓶を５℃から−４０℃
まで冷却し、−４０℃で５時間冷却した。−４０℃から
−２５℃まで減圧下温度を上げ、−２５℃で更に６０時
間減圧乾燥した。減圧下に１５℃まで昇温し、この温度
で６時間乾燥した。得られた凍結乾燥製剤を４０℃で２
週間保存した。試験開始時と２週間後の高分子量重合物
の含量を電気泳動法（SDS-PAGE）にて分析した。すなわ
ち凍結乾燥製剤を注射用水で溶解し、還元剤（メルカプ
トエタノール）存在下あるいは非存在下で沸騰水浴中で
３分間加熱し、この試料溶液をポリアクリルアミドグラ
ジエントゲルに１ウェルあたり１０μｇ添加し定電流で
泳動後、銀染色した。結果を表１０（表１０）に示す。
表１０に示すように塩基性アミノ酸の添加により高分子
量重合物の生成が抑制されることが明らかになった。

【００４６】

【表１０】 表１０ 凍結乾燥製剤中の高分子量重合物の生成に対する塩基性アミノ酸の添加 効果 ───────────────────────────────── 塩基性アミノ酸 高分子量重合物（２週間後） ────────────────── アミノ酸 添加量(mg) 非還元 還元 ───────────────────────────────── 無添加 ０ ＋＋＋ ＋＋ 塩酸アルギニン ２.１ ＋＋ ＋ 塩酸アルギニン ４.２０ ＋ ± 塩酸アルギニン ６.００ ± − 塩酸アルギニン ２６.７ − − アルギニン ６.０ ＋ ± リジン塩酸塩 ５.２ ＋ ± ヒスチジン ４.４ ＋ ± ───────────────────────────────── SDS-PAGE上での高分子量分解物のバンドの濃さ。＋＋＋：濃く見える。＋＋：は っきり見える。 ＋：見える。 ±：極薄く見える。 −：見えない。

【００４７】［実施例９］２０ｋｈＧＨ凍結乾燥製剤 凍結して保存してあった２０ｋｈＧＨ（２ｍｇ／ｍ
ｌ）、クレアチニン（１.２５％（１１１ｍＭ））、ポ
リソルベート（０.０５％）含む溶液５６０ｍｌを流水
中にて静置したまま融解し、０.２２μｍのフィルター
にて濾過した。この濾液５１０ｍｌにＤ−マンニトール
１５ｇ及び塩酸アルギニン５.５２ｇを添加し、氷上に
て攪拌子を用いて溶解させた。さらに、氷上にてこの溶
液に０.５Ｎの水酸化ナトリウム溶液約１４ｍｌを添加
し、ｐＨを７.６に調整した後、新たに精製水を加え、
全量を正確に６００ｍｌとした。この溶液を注射用バイ
アル充填器を用い、２ｍｌのガラス製バイアル瓶に１ｍ
ｌ充填し、凍結乾燥に供した。凍結乾燥は棚温度５℃か
ら−４０℃まで急速冷凍し、−４０℃にて５時間予備凍
結させた。減圧下にて棚温度を−２５℃に制御し、約５
０時間乾燥させた後、減圧下にて棚温度を１５℃に制御
し、６時間乾燥させ、凍結乾燥製剤を得た。得られた凍
結乾燥製剤のケーキの性状は良好で、注射用蒸留水を加
え再溶解した時、溶液は澄明であった。この凍結乾燥製
剤を４０℃で２カ月間保存し、外観、復水した時の溶
状、及び類縁物質の量を測定した。結果を表１１（表１
１）に示す。その結果、この製剤は長期保存後も外観が
良好であり、水に再溶解した場合不溶物が生成せず、ま
た類縁物質の生成も抑制された、安定な２０ｋｈＧＨを
含有する凍結乾燥製剤であることが確認された。

【００４８】

【表１１】 表１１ 製剤の安定性試験 ─────────────────────────── 外観 再溶解後の溶状 類縁物質（％） ─────────────────────────── 試験開始時 良好 澄明 ３．９ ４週間経過後 良好 澄明 ５．６ ８週間経過後 良好 澄明 ６．２ ───────────────────────────

【００４９】

【発明の効果】本発明者らは、通常の生理活性物質に用
いられる緩衝液では薬剤として適当な濃度が得られない
２０ｋｈＧＨに、クレアチニン等の水溶性複素環化合物
を所定の濃度で加えることにより、２０ｋｈＧＨの溶解
性を向上させることを見出した。また、２０ｋｈＧＨの
水溶液のｐＨを調整することで極微量の不溶物の生成を
防止することが出来る。また、ポリソールベート８０等
の非イオン性界面活性剤を添加することにより、凍結溶
解における溶液での安定性を向上させることが可能とな
り、さらに、塩基性アミノ酸と糖アルコールであるマン
ニトールを添加することで、凍結乾燥時の安定性の向上
及び再溶解時の安定的溶解を可能とすることを見出し
た。これらより、２０ｋｈＧＨを含有し、凍結乾燥後、
再溶解した水溶液を注射剤として使用するに適した医薬
製剤が、容易かつ大量に提供可能となった。

【００５０】

【配列表】

【００５１】配列番号 ：１ 配列の長さ：１７６ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖型 配列の種類：タンパク質 配列 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu 1 10 15 Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu 20 25 30 Phe Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr 35 40 45 Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu 50 55 60 Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val 65 70 75 Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala 80 85 90 Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly 95 100 105 Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr 110 115 120 Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 125 130 135 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys 140 145 150 Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val 155 160 165 Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 170 175

【００５２】配列番号 ：２ 配列の長さ：１７６ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖型 配列の種類：タンパク質 配列 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Ser Leu 1 10 15 Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu 20 25 30 Phe Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr 35 40 45 Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu 50 55 60 Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val 65 70 75 Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala 80 85 90 Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly 95 100 105 Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr 110 115 120 Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 125 130 135 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys 140 145 150 Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val 155 160 165 Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 170 175

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 青木 美穂子 東京都千代田区霞が関三丁目２番５号 三 井東圧化学株式会社内 (72)発明者 深山 裕喜雄 千葉県茂原市東郷1900番地の１ 三井東圧 化学株式会社内 (72)発明者 内田 博司 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内 (72)発明者 伊藤 照夫 千葉県茂原市東郷1900番地の１ 三井東圧 化学株式会社内 (72)発明者 楠原 信海 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分子量約２００００のヒト成長ホルモン
   またはその類縁体と水溶性複素環化合物を含む医薬製
   剤。
2. 【請求項２】 水溶性複素環化合物がクレアチニン、ア
   セチルトリプトファンの塩、ニコチンアミドから選ばれ
   る少なくとも１種類のものであることを特徴とする請求
   項１に記載の医薬製剤。
3. 【請求項３】 水に溶解した場合のｐＨがｐＨ５〜８で
   ある請求項１あるいは２に記載の医薬製剤。
4. 【請求項４】 ｐＨがｐＨ調整剤あるいは緩衝液により
   調整されている請求項３に記載の医薬製剤。
5. 【請求項５】 １種類または２種類の塩基性アミノ酸も
   しくはその塩及び非イオン性界面活性剤を含み、凍結乾
   燥剤である請求項３に記載の医薬製剤。
6. 【請求項６】 分子量約２００００のヒト成長ホルモン
   １重量部に対して１〜２０重量部の塩基性アミノ酸また
   はその塩を含む請求項５に記載の医薬製剤。
7. 【請求項７】 非イオン性界面活性剤がポリソルベート
   ２０又はポリソルベート８０あるいはその両方である請
   求項６に記載の医薬製剤。
8. 【請求項８】 賦形剤を含むことを特徴とする請求項５
   に記載の医薬製剤。
9. 【請求項９】 賦形剤が糖アルコールである請求項８に
   記載の医薬製剤。
10. 【請求項１０】 分子量約２００００のヒト成長ホルモ
    ンまたはその類縁体を含む医薬製剤に水溶性複素環化合
    物を添加することにより、該ヒト成長ホルモンまたはそ
    の類縁体の不溶化を防止し、安定性を向上させる方法。
11. 【請求項１１】 水溶性複素環化合物がクレアチニン、
    アセチルトリプトファンの塩、ニコチンアミドから選ば
    れる少なくとも１種類以上のものであることを特徴とす
    る請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 水に溶解した場合のｐＨをｐＨ５〜８
    とすることを特徴とする請求項１０または１１に記載の
    方法。
13. 【請求項１３】 １種類または２種類の塩基性アミノ酸
    またはその塩及び非イオン性界面活性剤を添加すること
    により、分子量約２００００のヒト成長ホルモンまたは
    その類縁体を含有する凍結乾燥剤の経時的な類縁物質の
    生成を抑制する方法。
14. 【請求項１４】 賦形剤を含有することを特徴とする請
    求項１３に記載の方法。