JPH10271998A - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 免疫担当細胞においてインターフェロン−
γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体から活性型の
ポリペプチドを製造する方法を提供することを課題とす
る。 【解決手段】免疫担当細胞においてインターフェロン−
γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体にインターロ
イキン−１β変換酵素を作用させることを特徴とする免
疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導
する活性型のポリペプチドの製造方法により解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は生理活性ポリペプ
チドの製造方法に関するものであり、詳細には、免疫担
当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ
−γ」と略記する。）の産生を誘導するポリペプチドの
製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】本発明者らは、免疫担当細胞においてＩ
ＦＮ−γの産生を誘導する新規なポリペプチドの単離
と、そのポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニ
ングに成功し、特開平８−２７１８９号公報及び特開平
８−１９３０９８号公報に開示した。このポリペプチド
は有用な生理活性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導
する性質と、キラー細胞による細胞障害性を増強した
り、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備しているの
で、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、抗免疫疾患剤な
どとして広範な用途が期待されている。

【０００３】ところで、ヒト細胞においては、遺伝子の
発現により生成したポリペプチドは細胞内酵素によるプ
ロセッシングを受け、ポリペプチドの一部が切断された
り、糖鎖が付加したりすると言われている。医薬品に配
合するポリペプチドとしては、ヒト細胞におけると同様
のプロセッシングを受けたものが望ましいところ、特願
平８−２６９１０５号明細書に記載されているように、
ヒト細胞は一般に当該ポリペプチドの産生量が少ないと
いう問題がある。本発明者がその原因について鋭意研究
したところ、ヒト細胞において、当該ポリペプチドは、
通常、生理活性を有しない、分子量約２４，０００ダル
トンの前駆体として存在していることが判明した。当該
ポリペプチドにかぎらず、多くのサイトカインは、通
常、まず、生理活性を有しない前駆体として産生され、
その後、細胞内酵素によるプロセッシングを受けて活性
型のポリペプチドに変換されることが知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の課題は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産
生を誘導するポリペプチドの前駆体から活性型のポリペ
プチドを製造する方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者が上記課題を解
決すべく鋭意研究したところ、インターロイキン−１β
変換酵素（以下、「ＩＣＥ」と略記する。）が当該ポリ
ペプチドの前駆体に作用し、免疫担当細胞においてＩＦ
Ｎ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドを生成す
ることが判明した。

【０００６】すなわち、この発明は、免疫担当細胞にお
いてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体
にＩＣＥを作用させることを特徴とする免疫担当細胞に
おいてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチ
ドの製造方法を要旨とするものである。

【０００７】ＩＣＥは、例えば、ナンシー・エー・ソー
ンベリーらが『ネイチャー』、第３５６巻、７６８乃至
７７４頁（１９９２年）に報告しているように、分子量
約２０，０００ダルトンのサブユニットと分子量約１
０，０００ダルトンのサブユニットからなるヘテロダイ
マー構造を有するシステイン・プロテアーゼの一種であ
り、通常、このヘテロダイマー同士が会合した状態で活
性を発現する。ＩＣＥは公知の酵素であり、インターロ
イキン−１βの前駆体における第１１６番目のアスパラ
ギン酸と第１１７番目のアラニンの間のペプチド結合、
さらには、第２７番目のアスパラギン酸と第２８番目の
グリシンの間のペプチド結合をそれぞれ切断することが
知られている。しかしながら、ＩＣＥが免疫担当細胞に
おいてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆
体に作用し、そのアミノ酸配列における特定の部位、と
りわけ、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列におけ
る第３６番目のアスパラギン酸と第３７番目のチロシン
の間のペプチド結合を切断し、免疫担当細胞においてＩ
ＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドを生成
することは知られていない。ＩＣＥのこの新規な作用を
利用する当該ポリペプチドの製造方法は、この発明をも
って嚆矢とするものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】前述のとおり、この発明は、ＩＣ
Ｅが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する
ポリペプチドの前駆体から活性型のポリペプチドを生成
するという独自の知見に基づくものである。この発明で
いう前駆体は、通常、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動において分子量約２４，０００
ダルトンを示し、例えば、当該ポリペプチドを本来的に
産生する細胞内、あるいは、当該ポリペプチドをコード
する領域を含むＤＮＡ（例えば、配列表における配列番
号５に示す塩基配列のＤＮＡ）を導入することによって
形質転換した哺乳類由来の宿主細胞内に存在する。斯か
る前駆体は、通常、Ｎ末端には配列表における配列番号
１に示すアミノ酸配列の一部又は全部を、また、全体と
しては、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列
の全部、又はそのＮ末端の一部が欠失したアミノ酸配列
を有し、そのままでは免疫担当細胞においてＩＦＮ−γ
の産生を誘導しない。

【０００９】しかしながら、斯かる前駆体はこの発明に
したがってＩＣＥを作用させると、前駆体の配列番号１
に示すアミノ酸配列における第３６番目のアスパラギン
酸と第３７番目のチロシンの間のペプチド結合が切断さ
れ、Ｎ末端に配列表における配列番号３に示すアミノ配
列を有する活性型のポリペプチドに変換され、この活性
型のポリペプチドは、単独又は適宜補因子の存在下、免
疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。な
お、活性型のポリペプチドは、通常、Ｎ末端に配列表に
おける配列番号３に示すアミノ酸配列を、また、全体と
しては、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列
を有し、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動において分子量１８，０００乃至１９，５０
０ダルトンを示す。

【００１０】ＩＣＥとしては、それが当該ポリペプチド
の前駆体に作用し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの
産生を誘導する活性型のポリペプチドを生成するかぎ
り、天然のものであっても人工的に創成したものであっ
てもよく、その構造や出所・由来は問わない。また、エ
マド・エス・アルネムリらが『ザ・ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー』、第２７０巻、第９
号、４，３１２乃至４，３１７頁（１９９５年）に報告
しているように、同一給源に由来するＩＣＥであって
も、給源によっては、いくつかのアイソフォームの含ま
れることが知られている。これらのアイソフォームは生
理作用において若干違いがあると言われているけれど
も、それらが当該ポリペプチドの前駆体に作用し、活性
型のポリペプチドを生成するかぎり、この発明において
使用可能である。

【００１１】ＩＣＥは、通常、ＩＣＥを本来的に産生す
る細胞、あるいは、組換えＤＮＡ技術を適用することに
よってＩＣＥの産生能を有するに至った形質転換体から
得ることができる。ＩＣＥを本来的に産生する細胞とし
ては、ヒトを含む哺乳類由来の、例えば、上皮細胞、内
皮細胞、間質細胞、軟骨細胞、単球、顆粒球、リンパ
球、神経細胞及びそれらを培養株化して得られる細胞株
が挙げられる。また、形質転換体としては、ＩＣＥをコ
ードするＤＮＡを微生物又は動物由来の適宜宿主に導入
することによって得られる形質転換微生物及び形質転換
細胞が挙げられる。これらの細胞又は形質転換体を斯界
において慣用される培養培地を用いて培養し、得られる
培養物から増殖した形質転換体を一旦分離するか培養上
清とともに超音波を印加するか、低張媒体中に浸漬する
などして破砕し、得られる破砕物又は破砕物と培養上清
との混合物に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別
沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲ
ル電気泳動、等電点電気泳動などの酵素を精製するため
の斯界における慣用の方法を適宜組合せて適用してＩＣ
Ｅを採取する。なお、ＩＣＥをコードするＤＮＡ及びＩ
ＣＥの産生能を有する形質転換体は、例えば、ナンシー
・エー・ソーンベリーら『ネイチャー』、第３５６巻、
７６８乃至７７４頁（１９９２年）やエマド・エス・ア
ルネムリら『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー』、第２７０巻、第９号、４，３１２乃至
４，３１７頁（１９９５年）などにも記載されている。

【００１２】当該ポリペプチドの前駆体にＩＣＥを作用
させるこの発明の実施態様としては、例えば、当該ポリ
ペプチドの前駆体に上記の方法により調製したＩＣＥを
接触させるか、あるいは、ＩＣＥをコードするＤＮＡと
当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとを哺乳
類由来の適宜宿主細胞に導入し、そこで両ＤＮＡを共発
現させればよい。前者の場合には、当該ポリペプチドの
前駆体の産生能を有する細胞、もしくは、形質転換によ
って当該ポリペプチドの前駆体の産生能を有するに至っ
た細胞を培養する。その培養物に上記の方法により調製
したＩＣＥを共存せしめるか、あるいは、培養物から細
胞を分離するか分離することなく、必要に応じて細胞を
破砕した後、培養物又は細胞破砕物にＩＣＥを添加すれ
ばよい。共存又は添加せしめるＩＣＥの量としては、通
常、前駆体と等モル以下で事足り、また、温度及びｐＨ
としては、ＩＣＥが作用し得るレベル、通常、温度約４
乃至４０℃、ｐＨ約６乃至９で原料の前駆体から活性型
のポリペプチドが所望量生成するまで反応させればよ
く、斯くして、活性型のポリペプチドを含む反応物を得
る。なお、後述するＴＨＰ−１細胞やＡ−２５３細胞な
どのように、同一の細胞が当該ポリペプチドの前駆体と
ＩＣＥをそれぞれ産生する場合には、当然のことなが
ら、必ずしもＩＣＥを添加する必要はなく、必要に応じ
て細胞を破砕した後、上記と同様、ＩＣＥが前駆体に作
用して活性型のポリペプチドを生成し得る温度及びｐＨ
で細胞又は細胞破砕物を含む培養物をインキュベートす
れば良い。このような場合には、より効率的な生成反応
を得るため、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチ
オトレイトール、還元型グルタチオンを始めとする還元
剤の適量を加えるのが望ましい。

【００１３】後者の場合には、ＩＣＥをコードするＤＮ
Ａと当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとを
哺乳類由来の適宜宿主細胞にそれぞれ導入して形質転換
すればよい。この場合には、ＤＮＡの発現により生成し
たＩＣＥが、同じ形質転換体内で、ＤＮＡの発現により
生成した当該ポリペプチドの前駆体に作用し、活性型の
ポリペプチドを生成する。宿主細胞としては、例えば、
３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細
胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＯＰ細胞及びそれら
の変異株を始めとする、斯界において宿主として慣用さ
れるヒト、サル、マウス及びハムスター由来の上皮系細
胞株、間質系細胞株、神経芽細胞株及び造血系細胞が用
いられる。斯かる宿主細胞にＩＣＥをコードするＤＮＡ
と当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡを導入
するには、例えば、公知のＤＥＡＥ−デキストラン法、
燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフ
ェクション法、マイクロインジェクション法、さらに、
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、
ワクシニアウイルスなどによるウイルス感染法などを用
いればよい。その際、必要に応じて、適宜のプロモータ
ー、エンハンサー、複製起点、転写終結部位、スプライ
シング配列、ポリアデニル化配列及び／又は選択マーカ
ーを含む、例えば、ｐＣＤ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、ｐＫＹ
４、ｐＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＳＶ２
−ｇｐｔなどのベクターを用いてもよい。形質転換細胞
から目的とするクローンを選別するには、コロニーハイ
ブリダイゼーション法を適用するか、形質転換細胞を培
養培地で培養し、活性型ポリペプチドの産生が観察され
たクローンを選別すればよい。このクローンを形質転換
細胞を培養するための斯界における慣用の培養培地を用
いて培養すれば、活性型のポリペプチドを含む培養物が
得られる。当該ポリペプチドの前駆体を本来的に産生す
る細胞を用いる場合も、形質転換により当該ポリペプチ
ドの産生能を有するに至った細胞を用いる場合も、細胞
や培養条件によっては、当該ポリペプチドの前駆体とと
もに、活性型ポリペプチドを分解して不活性化する、例
えば、ＣＰＰ３２やＭｃｈ−３などの分解酵素が生成す
ることがある。このような場合、培養培地又は細胞若し
くは細胞破砕物を含む培養物に斯かる分解酵素の活性を
阻害する、例えば、アセチル−Ｌ−アスパラチル−Ｌ−
グルタミル−Ｌ−バリル−Ｌ−アスパルト−１−アール
などの物質を適量共存させると、活性型ポリペプチドの
分解が抑制され、収量が増加する。なお、哺乳類由来の
宿主細胞を用いる組換えＤＮＡ技術については、例え
ば、黒木登志夫、谷口克、押村光雄編集、『実験医学別
冊細胞工学ハンドブック』、１９９２年、羊土社発行や
横田崇、新井賢一編集、『実験医学別冊バイオマニュア
ルシリーズ３ 遺伝子クローニング実験法』、１９９３
年、羊土社発行などにも詳述されている。

【００１４】なお、この発明において、ＩＣＥの活性
は、ダグラス・ケー・ミラーらが『ザ・ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２６８巻、第
２４号、１８，０６２乃至１８，０６９頁（１９９３
年）に報告している方法にしたがって測定し、活性値
（単位）で表示している。すなわち、１０％（ｗ／ｖ）
スクロース、０．１％（ｗ／ｖ）３−［（３−コラミド
プロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホ
ネート（以下、「ＣＨＡＰＳ」と略記する。）及び２ｍ
Ｍジチオトレイトールをそれぞれ含む２５ｍＭヘペス緩
衝液（ｐＨ７．５）を３９５μｌとり、これにＮ−（Ｎ
−アセチル−チロシニル）−バリニル−アラニル−アス
パラギン酸−７−アミノ−４−メチルクマリンアミドの
１０ｍＭジチルスルホキシド溶液５μｌと被検ＩＣＥ溶
液１００μｌをそれぞれ加え、３０℃で１時間反応させ
る。反応中、反応の進行に伴って遊離する７−アミノ−
４−メチルクマリンの量を、蛍光光度計により、波長３
８０ｎｍで励起して放出される波長４６０ｎｍの蛍光の
強度に基づき経時的にモニターする。ＩＣＥの１単位と
は、斯かる条件で反応させたときに、１分間に７−アミ
ノ−４−メチルクマリンを１ピコモル遊離する酵素の量
と定義する。

【００１５】斯くして得られた活性型のポリペプチドを
含む反応物及び培養物は、ＩＦＮ−γ誘導剤としてその
まま用いられることもあるが、通常は使用に先立ち、必
要に応じて、超音波、細胞溶解酵素及び／又は界面活性
剤により細胞を破砕した後、濾過、遠心分離などにより
当該ポリペプチドを細胞又は細胞破砕物から分離し、精
製する。精製には細胞又は細胞破砕物を除去した培養物
に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィ
ー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳
動、等電点電気泳動などの生理活性ポリペプチドを精製
するための斯界における慣用の方法が用いられ、必要に
応じて、これらは適宜組合せて適用される。そして、最
終使用形態に応じて、精製ポリペプチドを濃縮・凍結乾
燥して液状又は固状にすればよい。なお、同じ特許出願
人による特開平８−２３１５９８号公報に開示されたモ
ノクローナル抗体は当該ポリペプチドの精製に極めて有
用であり、このモノクローナル抗体を用いるイムノアフ
ィニティークロマトグラフィーによるときには、高純度
の当該ポリペプチドを最小のコストと労力で得ることが
できる。

【００１６】前述のとおり、この発明の方法により得ら
れる活性型のポリペプチドは、有用な生理活性蛋白質で
あるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キラー細胞の
細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する
性質を兼備するので、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞
に感受性を有する各種疾患の治療・予防に著効を発揮す
る。さらに、この発明の方法により得られる活性型のポ
リペプチドは強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することか
ら、一般に少量で所期のＩＦＮ−γを産生でき、また、
毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作
用を惹起することがない。したがって、この発明の方法
により得られる活性型のポリペプチドは、使用に際して
用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を
迅速に誘導できる利点がある。なお、当該ポリペプチド
の感受性疾患剤としての用途は、同じ特許出願人による
特願平８−２８７２２号明細書に詳述されている。

【００１７】以下、実施例に基づきこの発明を説明す
る。

【００１８】

【実施例１】 〈前駆体の調製〉０．５ｍｌ容反応管に１０×ＰＣＲ緩
衝液を１０μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混液を８μｌ、
５単位／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを０．５μ
ｌ、そして、同じ特許出願人が特開平８−１９３０９８
号公報に開示した組換えＤＮＡ『ｐＨＩＧＩＦ』を１ｎ
ｇとり、センスプライマー及びアンチセンスプライマー
として、配列表における配列番号５に示した当該ポリペ
プチドの前駆体をコードするｃＤＮＡの塩基配列に基づ
き化学合成した５´−ＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧ
ＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＡＡＧＧ−３´及び
５´−ＡＣＡＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＡＧＴＣ
ＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧ−３´で表される塩基配
列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ２０ピコモル加え、
滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法により、この混液
を９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間反
応させるサイクルを３０回繰返してＰＣＲ反応させた。
なお、ＰＣＲ反応試薬としては、宝酒造製『タカラＰＣ
Ｒアンプリフィケーションキット』を用いた。

【００１９】得られた反応物を常法にしたがって制限酵
素Ｂｓｔ ＸＩにより切断し、得られた約８００塩基対
のＤＮＡ断片を０．１μｇとり、これを適量の滅菌蒸留
水に溶解し、あらかじめ制限酵素Ｂｓｔ ＸＩにより切
断しておいたインビトロジェン製プラスミドベクター
『ｐＲｃ／ＣＭＶ』を１０ｎｇと適量の１０×ライゲー
ション緩衝液及びＴ４ ＤＮＡリガーゼをそれぞれ加
え、さらに１０ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで加え
た後、１６℃で１８時間反応させてＤＮＡ断片をプラス
ミドベクターｐＲｃ／ＣＭＶに挿入した。得られた組換
えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＪＭ１０９
株に導入して形質転換体とし、これをアンピシリンを５
０μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種
し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体を採
取し、アルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出し
た。この組換えＤＮＡを『ｐＲＣＨｕＧＦ』と命名する
一方、その塩基配列をジデオキシ法により調べたとこ
ろ、図１に示す構造を有していた。図１に見られるよう
に、組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』においては、当該
ポリペプチドの前駆体をコードする約８００塩基対から
なるｃＤＮＡ『ＨｕＩＧＩＦ』が、サイトメガロウイル
スプロモーター『ＰＣＭＶ』の下流に連結されていた。

【００２０】別途、常法にしたがって、チャイニーズハ
ムスター卵巣由来のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ６１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨ
ａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、増殖さ
せた。増殖細胞を採取し、燐酸緩衝生理食塩水（以下、
「ＰＢＳ」と略記する。）により洗浄した後、細胞密度
１×１０⁷ 個／ｍｌになるようにＰＢＳに浮遊させ、そ
の浮遊液の０．８ｍｌを組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧ
Ｆ』１０μｇとともにキュベットにとり、１０分間氷冷
し、バイオラッド製エレクトロポレーション装置『ジー
ンパルサー』に装着し、放電パルスを１回印加した後、
直ちにキュベットを取外し、１０分間氷冷した。次い
で、細胞浮遊液をキュベットから取出し、１０％（ｖ／
ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地
（ｐＨ７．２）に接種し、５％ＣＯ₂ インキュベーター
中、３７℃で３日間培養した後、培養培地にＧ４１８を
最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加え、同じ条件
でさらに３日間培養した。斯くして得られた１００個余
りのコロニーから４８個を選別し、その一部をＧ４１８
を４００μｇ／ｍｌ含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血
清を補足したＨａｍ’ｓＦ１２培地（ｐＨ７．２）を分
注した培養プレートに接種し、上記と同様にして１週間
培養した。その後、培養プレートの各ウェルに５．１ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコー
ル酸ナトリウム、１％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０、
１０μｇ／ｍｌアプロチニン及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｓ
ＤＳをそれぞれ含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．５）を適量加えて細胞を溶解した。

【００２１】細胞溶解物をそれぞれ５０μｌとり、グリ
セロール５０μｌとジチオトレイトールを最終濃度２％
（ｗ／ｖ）になるようにそれぞれ加え、３７℃で１時間
静置した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により、細胞溶解物中のポリペプチドを分離した。次
いで、常法にしたがって、ゲル内で分離されたポリペプ
チドをニトロセルロース膜に移取り、別途調製しておい
た、同じ特許出願人が特開平８−２３１５９８号公報に
開示した当該ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマＨ−１株の培養上清に１時
間浸漬した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含
む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し
て過剰のモノクローナル抗体を除去した。その後、ニト
ロセルロース膜を西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼで
標識したウサギ由来の抗マウスイムノグロブリン抗体を
含むＰＢＳに１時間浸漬し、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイ
ーン２０を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）により洗浄し、０．００５％（ｖ／ｖ）過酸化水素
及び０．３ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジンをそれぞれ含
む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸漬し
て発色させた。その発色度に基づき、当該ポリペプチド
の前駆体の産生能が高い形質転換体のクローンを選別
し、これを『ＲＣＨｕＧＦ』と命名した。

【００２２】この形質転換体『ＲＣＨｕＧＦ』を、４０
０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ
胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ｐＨ７．
２）を分注した角形培養瓶に接種し、培養培地を適宜新
鮮なものと取換えながら、５％ＣＯ₂ インキュベーター
中、３７℃で１週間培養した。その後、培養瓶にギブコ
製トリプシン剤『トリプシン−ＥＤＴＡ』を適量加えて
培養瓶内壁に付着した細胞を剥離し、ＰＢＳで洗浄した
後、さらに１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグ
ネシウム及び０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナト
リウムをそれぞれ含む氷冷した２０ｍＭヘペス緩衝液
（ｐＨ７．４）により洗浄し、３倍容の新鮮な同一緩衝
液中、氷冷下で２０分間静置した。その後、常法にした
がって細胞を破砕し、１０，０００×ｇで３０分間遠心
分離し、当該ポリペプチドの前駆体を含む上清部を採取
した。この前駆体は、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動において分子量約２４，０００
ダルトンを示し、Ｎ末端に配列表における配列番号１に
示すアミノ酸配列を有している。

【００２３】

【実施例２】 〈ＩＣＥの調製〉０．５ｍｌ容反応管に１０×ＰＣＲ緩
衝液を１μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１
０ｍＭ ｄＡＴＰ、１０ｍＭ ｄＧＴＰ、１０ｍＭ ｄ
ＣＴＰ及び１０ｍＭ ｄＴＴＰを各１μｌ、５０μＭラ
ンダムヘキサヌクレオチドを１μｌ、２０単位／μｌリ
ボヌクレアーゼインヒビターを１μｌ、５０単位／μｌ
逆転写酵素を１μｌ、そして、常法にしたがってヒト急
性単球性白血病由来の単球細胞株であるＴＨＰ−１細胞
（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）から別途調製した全ＲＮＡ
抽出液を１μｇそれぞれとり、滅菌蒸留水で全量を２０
μｌとした。この混液を４２℃で３０分間インキュベー
トして逆転写反応させた後、９９℃で５分間加熱して反
応を停止させた。

【００２４】この反応物に１０×ＰＣＲ緩衝液を８μ
ｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、５単位／μｌ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、ヒトのＩ
ＣＥをコードする塩基配列に基づき化学合成した５´−
ＣＴＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＧ
ＴＣＣＴＧ−３´及び５´−ＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴ
ＴＡＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧ−３´で表される
塩基配列のオリゴヌクレオチドをセンスプライマー及び
アンチセンスプライマーとしてそれぞれ２０ピコモル加
え、滅菌蒸留水で全量を１００μｌとした後、９４℃で
１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間反応させるサ
イクルを４０回繰返してＰＣＲ反応させた。なお、逆転
写反応及びＰＣＲ反応用の試薬としては、パーキン・エ
ルマー製『ジーンアンプＲＮＡ ＰＣＲキット』を用い
た。

【００２５】この新たに得られた反応物を常法にしたが
って制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及びＮｏｔＩにより切断し、得
られたＩＣＥをコードする領域を含む約１，２００塩基
対のＤＮＡ断片に、あらかじめ制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及び
Ｎｏｔ Ｉにより切断しておいたインビトロジェン製プ
ラスミドベクター『ｐＣＤＭ８』１０ｎｇとともに、１
０×ライゲーション緩衝液及びＴ４ ＤＮＡリガーゼの
それぞれ適量を加え、さらに、１０ｍＭ ＡＴＰを最終
濃度１ｍＭになるように加えた後、１６℃で１８時間反
応させて上記ＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＣＤＭ
８に挿入した。得られた組換えＤＮＡをコンピテントセ
ル法により大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３株（ＡＴＣＣ４７
０３５）に導入して形質転換体とし、これを２０μｇ／
ｍｌアンピシリンと１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを
それぞれ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、
３７℃で１８時間培養した。培養物から菌体を採取し、
この菌体にアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡ
『ｐＣＤＨＩＣＥ』を得た。ジデオキシ法により組換え
ＤＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』の塩基配列を調べたところ、
図２に示すように、サイトメガロウイルスプロモーター
『ＰＣＭＶ』の下流にＩＣＥをコードする領域を含む約
１，２００塩基対からなるｃＤＮＡ『ＨｕＩＣＥ』が連
結されていた。

【００２６】次に、常法にしたがって、アフリカミドリ
ザル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６
５０）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤＭ
ＥＭ培地（ｐＨ７．４）に接種し、増殖させた。増殖細
胞を採取し、新鮮な同一培地で洗浄し、細胞密度２×１
０⁷ 個／ｍｌになるように浮遊させ、キュベットにその
浮遊液の０．２５ｍｌとともに上記で調製した組換えＤ
ＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』を１０μｇとり、１０分間室温
下で静置した後、キュベットをバイオラッド製エレクト
ロポレーション装置『ジーンパルサー』に装着し、放電
パルスを１回印加した。キュベットを取外し、室温下で
１０分間静置した後、細胞を取出し、１０％（ｖ／ｖ）
ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）に
接種し、５％ＣＯ₂ インキュベーター中、３７℃で２日
間培養した。

【００２７】培養物から上清を吸引除去し、シャーレ底
部に付着した細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸二ナトリウムを含むＰＢＳを適量加え、室
温下で１０分間静置した後、シャーレから剥離した細胞
を採取した。この細胞をＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭ塩化
カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸二ナトリウム及び１ｍＭ（４−ア
ミジノ−フェニル）−メタン−スルホニルフルオライド
をそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）を
適量加え、ホモゲナイザーを用いて氷冷下で細胞を破砕
した。細胞破砕物を１，５００×ｇで５分間遠心分離し
て上清を採取し、これをさらに２２，５００×ｇで６０
分間遠心分離してＩＣＥを２３０単位／ｍｌ含む上清を
得た。

【００２８】

【実施例３】 〈ポリペプチドの製造〉１０％（ｖ／ｖ）グリセロー
ル、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ及び２ｍＭジチオト
レイトールをそれぞれ含む１００ｍＭヘペス緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）に実施例１の方法により得た当該ポリペプチ
ドの前駆体を５００ｎＭになるように溶解して基質溶液
とした。この基質溶液に実施例２の方法により得たＩＣ
Ｅを５００単位／ｍｌになるように加え、３７℃でイン
キュベートした。インキュベート開始から０分後、１０
分後、３０分後、１時間後、３時間後、６時間後及び１
８時間後に反応物の一部をそれぞれ採取し、ヨードアセ
トアミドを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように加え
て反応を停止させた。この採取した反応物に同じ特許出
願人が特開平８−２３１５９８号公報に開示したモノク
ローナル抗体を用いるウェスタン・ブロッティング法を
適用し、当該ポリペプチドの前駆体から活性型のポリペ
プチドが生成する経時変化を調べた。結果を図３に示
す。

【００２９】同時に、ヒト急性骨髄性白血病由来の骨髄
単球系細胞株の一種であるＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ２４６）を免疫担当細胞として用いるバイオアッセ
イ法により、経時的に採取した反応物における活性型の
ポリペプチドの含有量を推定した。すなわち、ＫＧ−１
細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度１．５×１
０⁶ 個／ｍｌになるように浮遊させ、９６ウェルマイク
ロプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注した。上記に
おいて経時的に採取したそれぞれの反応物を１０％（ｖ
／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地
（ｐＨ７．４）により適宜希釈した後、これを上記マイ
クロプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注し、５％Ｃ
Ｏ₂ インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。
培養後、各ウェルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取
し、通常の酵素免疫測定法によりＩＦＮ−γ含量を測定
した。同時に、反応物を省略した系を設け、上記と同様
に処置して対照とした。結果を表１に示す。なお、表１
に示すＩＦＮ−γ含量は、米国国立衛生研究所（ＮＩ
Ｈ）から入手したＩＦＮ−γ標準品（Ｇｇ２３−９０１
−５３０）に基づき国際単位（ＩＵ）に換算している。

【００３０】

【表１】

【００３１】図３のウェスタン・ブロッティングに見ら
れるように、本例の反応条件下においては、前駆体に相
当する分子量約２４，０００ダルトンのバンドが反応開
始から３時間までに漸次消滅し、それに伴って、活性型
のポリペプチドに相当する分子量１８，２００ダルトン
のバンドが出現した。表１のＩＦＮ−γ含量もこの結果
とよく符合しており、分子量１８，２００ダルトンのバ
ンドの出現に伴って反応物のＩＦＮ−γ誘導能が漸次上
昇した。これらの結果は、ＩＣＥが当該ポリペプチドの
前駆体に作用し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産
生を誘導する活性型のポリペプチドを生成したことを示
している。

【００３２】

【実施例４】 〈ポリペプチドの精製と理化学的性質〉

【００３３】

【実施例４−１】 〈ポリペプチドの精製〉実施例３の方法により１８時間
反応させて得た反応物を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．
８）に対して透析した後、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ
６．８）で平衡化しておいた東ソー製イオン交換クロマ
トグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ ５ＰＷ』のカラムに負
荷し、０Ｍから０．５Ｍまで直線的に上昇する塩化ナト
リウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２乃至
０．３Ｍ付近で溶出した画分を採取した。

【００３４】この新たに得られた画分を合一し、ＰＢＳ
に対して透析する一方、同じ特許出願人による特開平８
−２３１５９８号公報に記載された方法にしたがってモ
ノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマ
トグラフィー用ゲルを調製し、これをプラスチック製円
筒管内部にカラム状に充填し、ＰＢＳで洗浄した後、上
記透析内液をカラムに負荷した。カラムに１００ｍＭグ
リシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液し、得られる
溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を
誘導する活性型のポリペプチドを含む画分を採取し、滅
菌蒸留水に対して透析し、膜濾過により濃縮した後、凍
結乾燥して精製ポリペプチドの固状物を得た。収量は、
原料として用いた前駆体に基づく理論収量の約６０％で
あった。

【００３５】

【実施例４−２】 〈ポリペプチドの分子量〉実施例４−１の方法により得
た精製ポリペプチドをユー・ケー・レムリが『ネイチャ
ー』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）
に報告している方法に準じ、還元剤としての２％（ｗ／
ｖ）ジチオトレイトール存在下でＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動したところ、分子量約１８，０００
乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ
誘導能あるポリペプチドの主バンドが観察された。この
ことは、ＩＣＥが分子量約２４，０００ダルトンの当該
ポリペプチドの前駆体に作用し、より低分子量の活性型
のポリペプチドを生成したことを示している。なお、こ
のときの分子量マーカーは、ウシ血清アルブミン（６
７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００
ダルトン）、カーボニックアンヒドロラーゼ（３０，０
００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，
１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４
００ダルトン）であった。

【００３６】

【実施例４−３】 〈ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列〉パーキン・エル
マー製プロテイン・シーケンサー『４７３Ａ型』を使用
し、常法にしたがって分析したところ、実施例４−１の
方法により得た精製ポリペプチドは、Ｎ末端に配列表に
おける配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。こ
のことは、ＩＣＥが当該ポリペプチドの前駆体に作用
し、そのＮ末端アミノ酸配列である配列表の配列番号１
に示すアミノ酸配列における第３６番目のアスパラギン
酸と第３７番目のチロシンの間のペプチド結合を切断し
たことを示している。

【００３７】

【実施例５】 〈ポリペプチドの製造〉常法にしたがって、アフリカミ
ドリザル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１
６５０）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＤ
ＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）に接種し、増殖させた。増殖
細胞を採取し、新鮮な同一培地で洗浄し、細胞密度２×
１０⁷ 個／ｍｌになるように浮遊させ、キュベットにそ
の浮遊液の０．２５ｍｌとともに実施例１の方法により
得た組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』及び実施例２の方
法により得た組換えＤＮＡ『ｐＣＤＨＩＣＥ』をそれぞ
れ１０μｇずつ加え、１０分間室温下で静置した後、キ
ュベットをバイオラッド製エレクトロポレーション装置
『ジーンパルサー』に装着し、放電パルスを１回印加し
た。キュベットを取外し、室温下で１０分間静置した
後、細胞を取出し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補
足したＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．４）に接種し、５％ＣＯ
₂ インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。

【００３８】培養物から上清を吸引除去し、シャーレ底
部に付着した細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸二ナトリウムを含むＰＢＳを適量加え、室
温下で１０分間静置した後、シャーレから剥離した細胞
を採取した。この細胞をＰＢＳで洗浄した後、低張液と
して、１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシ
ウム及び０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ムをそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）
を適量加え、ホモゲナイザーを用いて氷冷下で細胞を破
砕した。細胞破砕物を１，０００×ｇで５分間遠心分離
して上清を採取し、これに当該ポリペプチドに特異的な
モノクローナル抗体を用いる酵素免疫測定法を適用して
上清に含まれる当該ポリペプチドの量を決定した。

【００３９】同時に、組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』
及び『ｐＣＤＨＩＣＥ』の両方又はいずれか一方を省略
する系をそれぞれ設け、これらを上記と同様に処置して
対照とした。結果を表２に示す。

【００４０】

【表２】

【００４１】表２の結果は、ＣＯＳ−１細胞において、
当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡとＩＣＥ
をコードするＤＮＡがそれぞれ良好に発現し、前者の前
駆体に後者のＩＣＥが効率的に作用して、免疫担当細胞
においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプ
チドが生成したことを示している。なお、表２に見られ
るように、当該ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮ
ＡとＩＣＥをコードするＤＮＡの両方又はいずれか一方
を省略した対照系においても免疫担当細胞においてＩＦ
Ｎ−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドが生成し
ていたが、その量は僅少であった。この事実も、ＣＯＳ
−１細胞において、当該ポリペプチドの前駆体をコード
するＤＮＡとＩＣＥをコードするＤＮＡがそれぞれ良好
に発現したことを裏付けている。

【００４２】その後、両ＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細
胞の培養上清に実施例４−１で述べた精製方法を適用し
て活性型のポリペプチドを精製し、得られた精製ポリペ
プチドに実施例４−２の方法を適用して分子量を測定し
たところ、約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに
相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能あるポリペプチドの主
バンドが観察された。さらに、実施例４−３の方法を適
用したところ、その精製ポリペプチドは、Ｎ末端に配列
表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有してい
た。

【００４３】

【実施例６】 〈ポリペプチドの製造〉常法により、生後間もないハム
スターの新生児にウサギ由来の抗胸腺抗血清を注射して
免疫反応を減弱させた後、ハムスターの背部皮下にヒト
顎下腺類表皮癌由来の上皮様細胞株の一種であるＡ−２
５３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ４１）を約１×１０⁴ 個／
匹移植し、通常一般の方法で３２日間飼育した。そし
て、皮下に生じた腫瘍塊（約５ｇ／匹）を摘出し、細切
し、低張液としての１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ
塩化マグネシウム及び０．１ｍＭエチレンジアミン四酢
酸二ナトリウムをそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝液
（ｐＨ７．４）で洗浄した後、−２０℃で凍結した。

【００４４】次に、腫瘍塊を解凍し、腫瘍塊の湿重量１
ｇに対して１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む
新鮮な上記と同一の低張液を１ｍｌ加え、常法にしたが
ってポリトロン処理して細胞を破砕した後、２，５００
ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取した。なお、
この上清はＩＣＥを約５００単位／ｍｌ含んでいた。そ
の後、この上清を４℃又は３７℃でインキュベートしつ
つ、反応物を経時的にサンプリングし、これに当該ポリ
ペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いる酵素免
疫測定法を適用して活性型ポリペプチドの量を決定し
た。結果を図４に示す。

【００４５】図４の結果に見られるように、Ａ−２５３
細胞の抽出液は、インキュベートすると、当該ポリペプ
チドの含量が顕著に高まるが、このことは、ＩＣＥと当
該ポリペプチドの前駆体をそれぞれ含むＡ−２５３細胞
の抽出液において、前者が後者に効果的に作用して活性
型の当該ポリペプチドを生成したことを物語っている。
インキュベートする温度は低温が望ましく、４℃でイン
キュベートしたときの当該ポリペプチドの生成量は３７
℃でインキュベートする場合より有意に高かった。ちな
みに、４℃及び３７℃でインキュベートしたときの当該
ポリペプチドの収量は、腫瘍塊の湿重量１ｇ当り、それ
ぞれ５．０μｇ及び２．５μｇに達した。

【００４６】斯くして得られた活性型ポリペプチドを含
む反応物を実施例４−１の方法により精製し、凍結乾燥
した後、実施例４−２の方法を適用して分子量を測定し
たところ、約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに
相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能あるポリペプチドの主
バンドが観察された。また、実施例４−３の方法を適用
したところ、その精製ポリペプチドは、Ｎ末端に配列表
における配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。
さらに、２−メルカプトエタノールに代えてジチオトレ
イトール又は還元型グルタチオンを用いて上記と同様に
反応させたところ、２−メルカプトエタノールを含むす
べての還元剤が濃度１ｍＭで当該ポリペプチドの生成を
顕著に促進した。

【００４７】

【発明の効果】以上説明したごとく、この発明は、ＩＣ
Ｅが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する
ポリペプチドの前駆体に作用し、活性型のポリペプチド
を生成するという独自の知見に基づくものである。この
発明はＩＣＥのこの作用を利用するものであり、この発
明にしたがって、ＩＣＥを当該ポリペプチドを本来産生
する細胞や当該ポリペプチドをコードする領域を含むＤ
ＮＡにより形質転換した哺乳類由来の宿主細胞が産生す
る当該ポリペプチドの前駆体に作用させるか、ＩＣＥを
コードするＤＮＡを当該ポリペプチドをコードする領域
を含むＤＮＡとともに哺乳類由来の宿主細胞に導入し、
同細胞において両ＤＮＡを共発現させることにより、ヒ
ト細胞におけると同様のプロセッシングを受け、医薬品
として有用なポリペプチドを所望量製造し得ることとな
る。

【００４８】この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する
発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のあ
る発明であると言える。

【００４９】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：41 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：N末端フラグメント 配列 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met 1 5 10 15 Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn 20 25 30 Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu 35 40

【００５０】配列番号：2 配列の長さ：193 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met -35 -30 -25 Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn -20 -15 -10 -5 Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile 1 5 10 Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro 15 20 25 Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg 30 35 40 Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met 45 50 55 60 Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys 65 70 75 Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile 80 85 90 Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly 95 100 105 His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe 110 115 120 Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys 125 130 135 140 Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu 145 150 155 Asp

【００５１】配列番号：3 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：N末端フラグメント 配列 Tyr Phe Gly Lys Leu 1 5

【００５２】配列番号：4 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155

【００５３】配列番号：5 配列の長さ：579 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号：leader peptide 存在位置：1..108 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：109..579 特徴を決定した方法：S 配列 ATG GCT GCT GAA CCA GTA GAA GAC AAT TGC ATC AAC TTT GTG GCA ATG 48 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met -35 -30 -25 AAA TTT ATT GAC AAT ACG CTT TAC TTT ATA GCT GAA GAT GAT GAA AAC 96 Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn -20 -15 -10 -5 CTG GAA TCA GAT TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA 144 Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile 1 5 10 AGA AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT 192 Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro 15 20 25 CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT GCA CCC CGG 240 Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg 30 35 40 ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG 288 Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met 45 50 55 60 GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAG AAA ATT TCA AYT CTC TCC TGT 336 Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys 65 70 75 GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC 384 Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile 80 85 90 AAG GAT ACA AAA AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA 432 Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly 95 100 105 CAT GAT AAT AAG ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT 480 His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe 110 115 120 CTA GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA 528 Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys 125 130 135 140 GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA 576 Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu 145 150 155 GAC 579 Asp

【図面の簡単な説明】

【図１】当該ポリペプチドの前駆体をコードするｃＤＮ
Ａを含む組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』の構造を示す
図である。

【図２】ＩＣＥをコードするｃＤＮＡを含む組換えＤＮ
Ａ『ｐＣＤＨＩＣＥ』の構造を示す図である。

【図３】ウェスタン・ブロッティング法により可視化し
た、当該ポリペプチドの前駆体から活性型の当該ポリペ
プチドが生成する継時変化を示すゲル電気泳動のディス
プレー状に表示した中間調画像である。

【図４】Ａ−２５３細胞の抽出液を、温度を変えてイン
キュベートしたときの当該ポリペプチドの生成状況を示
す図である。

【符合の説明】 ＰＣＭＶ サイトメガロウイルスプロモーター ＨｕＩＧＩＦ 当該ポリペプチドの前駆体をコードす
るｃＤＮＡ ＨｕＩＣＥ ＩＣＥをコードするｃＤＮＡ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 免疫担当細胞においてインターフェロン
   −γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体にインター
   ロイキン−１β変換酵素を作用させることを特徴とする
   免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘
   導する活性型のポリペプチドの製造方法。
2. 【請求項２】 前駆体がＮ末端に配列表における配列番
   号１に示すアミノ酸配列の一部又は全部を有し、インタ
   ーロイキン−１β変換酵素がその配列番号１に示すアミ
   ノ酸配列における第３６番目のアスパラギン酸と第３７
   番目のチロシンの間のペプチド結合を切断する請求項１
   に記載のポリペプチドの製造方法。
3. 【請求項３】 前駆体が配列表における配列番号２に示
   すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示し
   たアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表すもの
   とする。）を含んでなる請求項１又は２に記載のポリペ
   プチドの製造方法。
4. 【請求項４】 活性型のポリペプチドがＮ末端に配列表
   における配列番号３に示すアミノ酸配列を有する請求項
   １、２又は３に記載のポリペプチドの製造方法。
5. 【請求項５】 活性型のポリペプチドが配列表における
   配列番号４に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａ
   ａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレ
   オニンを表すものとする。）を有する請求項１、２、３
   又は４に記載のポリペプチドの製造方法。
6. 【請求項６】 前駆体に対して、それと等モル以下のイ
   ンターロイキン−１β変換酵素を温度４乃至４０℃で作
   用させる請求項１、２、３、４又は５に記載のポリペプ
   チドの製造方法。
7. 【請求項７】 還元剤の存在下で前駆体にインターロイ
   キン−１β変換酵素を作用させる請求項１、２、３、
   ４、５又は６に記載のポリペプチドの製造方法。
8. 【請求項８】 活性型のポリペプチドを塩析、透析、濾
   過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、
   ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
   ー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフ
   ィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
   トグラフィー、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動
   により採取する請求項１、２、３、４、５、６又は７に
   記載のポリペプチドの製造方法。