JPH10280182A - タンパク質固定修飾電極 - Google Patents
タンパク質固定修飾電極Info
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- JPH10280182A JPH10280182A JP9093301A JP9330197A JPH10280182A JP H10280182 A JPH10280182 A JP H10280182A JP 9093301 A JP9093301 A JP 9093301A JP 9330197 A JP9330197 A JP 9330197A JP H10280182 A JPH10280182 A JP H10280182A
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
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Abstract
(57)【要約】
【課題】タンパク質が機能を持った状態で電極表面を被
覆し、ナノメートルレベルでこのタンパク質を制御ある
いは応用のできる電極を提供する。 【解決手段】 電極基板１の表面に、脂質２とタンパク
質３を単分子膜の状態で被覆する。
覆し、ナノメートルレベルでこのタンパク質を制御ある
いは応用のできる電極を提供する。 【解決手段】 電極基板１の表面に、脂質２とタンパク
質３を単分子膜の状態で被覆する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体材料を用いて
構成された電極に関するものである。
構成された電極に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】これまでに電極上へのタンパク質の固定
については、数多くの試みがなされている。その方法と
して例えば、電極に直接タンパク質を吸着させる、ある
いは電極に化学的結合種を固定した後、その結合種を介
してタンパク質を固定させることなどであった。これら
の方法では、結果的に電極表面上が全てタンパク質で覆
われることになり、タンパク質の固定様式が一様になら
ない。
については、数多くの試みがなされている。その方法と
して例えば、電極に直接タンパク質を吸着させる、ある
いは電極に化学的結合種を固定した後、その結合種を介
してタンパク質を固定させることなどであった。これら
の方法では、結果的に電極表面上が全てタンパク質で覆
われることになり、タンパク質の固定様式が一様になら
ない。
【０００３】例えば、特開平５−１３３７９５号公報で
は、脂質二重層中に生体物質及び生体類似物質の双方又
は一方と、電位感受性イオンチャンネルと、生体応答性
物質、例えばバクテリオロドプシンとからなる球状のリ
ポソームを基板上に二次元配列してなることを特徴とす
るバイオ素子について開示している。このバイオ素子
は、結合種として抗体分子等の単分子膜により形成され
たＬＢ膜（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ膜）に
生物応答性物質を含むリポソームを結合させることによ
って作製されている。
は、脂質二重層中に生体物質及び生体類似物質の双方又
は一方と、電位感受性イオンチャンネルと、生体応答性
物質、例えばバクテリオロドプシンとからなる球状のリ
ポソームを基板上に二次元配列してなることを特徴とす
るバイオ素子について開示している。このバイオ素子
は、結合種として抗体分子等の単分子膜により形成され
たＬＢ膜（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ膜）に
生物応答性物質を含むリポソームを結合させることによ
って作製されている。
【０００４】この特開平５−１３３７９５号公報では、
脂質二重層中に生物応答性物質が多数の分子からなる球
状のリポソームの形で基板に付着していて、単分子膜レ
ベルで付着しているわけではない。
脂質二重層中に生物応答性物質が多数の分子からなる球
状のリポソームの形で基板に付着していて、単分子膜レ
ベルで付着しているわけではない。
【０００５】さらに、タンパク質には特定の配向性があ
る。タンパク質は、その配行性を持った状態で、生体膜
あるいは他のタンパク質と相互作用して、その機能を発
現できる。そのため、タンパク質を電極に固定して工業
的に応用するには、配向性が非常に重要となる。また、
シトクロムなどの電子伝達タンパク質は、生体膜の主成
分である脂質と相互作用することで、その活性をより発
揮することが報告されている。
る。タンパク質は、その配行性を持った状態で、生体膜
あるいは他のタンパク質と相互作用して、その機能を発
現できる。そのため、タンパク質を電極に固定して工業
的に応用するには、配向性が非常に重要となる。また、
シトクロムなどの電子伝達タンパク質は、生体膜の主成
分である脂質と相互作用することで、その活性をより発
揮することが報告されている。
【０００６】電子伝達タンパク質、特にシトクロムｃ3
はバイオ素子の材料として注目されており、固定化法の
開発が望まれている。しかし、配向性を無視した従来の
方法では、タンパク質本来の機能を十分に発揮できない
ことが多い。また、タンパク質を直接電極に吸着させる
と、タンパク質の変性が起き、タンパク質の持つ機能が
損なわれることも指摘されている。
はバイオ素子の材料として注目されており、固定化法の
開発が望まれている。しかし、配向性を無視した従来の
方法では、タンパク質本来の機能を十分に発揮できない
ことが多い。また、タンパク質を直接電極に吸着させる
と、タンパク質の変性が起き、タンパク質の持つ機能が
損なわれることも指摘されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】したがって、ナノメー
トルレベルでのタンパク質の制御・応用を目指す上で、
これら従来の方法は不向きであり、より少ないタンパク
質分子で電気化学的な制御を目指す必要がある。そこ
で、本発明の目的は、タンパク質が機能を持った状態で
電極表面を被覆し、固定された、ナノメートルレベルで
のタンパク質の制御と応用ができる電極を提供すること
にある。
トルレベルでのタンパク質の制御・応用を目指す上で、
これら従来の方法は不向きであり、より少ないタンパク
質分子で電気化学的な制御を目指す必要がある。そこ
で、本発明の目的は、タンパク質が機能を持った状態で
電極表面を被覆し、固定された、ナノメートルレベルで
のタンパク質の制御と応用ができる電極を提供すること
にある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、電極基板の表
面を脂質とタンパク質が実質的に単分子膜の状態で被覆
してなる電極を提供する。また、前記脂質は、リン脂質
が好ましい。前記タンパク質は色素タンパク質が好まし
く、さらにシトクロムがより好ましい。より好ましく
は、シトクロムｃ3 である。
面を脂質とタンパク質が実質的に単分子膜の状態で被覆
してなる電極を提供する。また、前記脂質は、リン脂質
が好ましい。前記タンパク質は色素タンパク質が好まし
く、さらにシトクロムがより好ましい。より好ましく
は、シトクロムｃ3 である。
【０００９】本発明では、生体膜の主成分である脂質を
電極とタンパク質との結合の仲介物質として利用し、電
極に固定したタンパク質が配向性を持つようにする。あ
らかじめ脂質とタンパク質に特定の配向性を持たせて結
合させた後、電極上に修飾（被覆および固定）すれば、
より効率的なタンパク質の機能発現が可能である。さら
にタンパク質を脂質に保持させた状態で電極上に修飾す
ることで、タンパク質の電極吸着による変性を防ぎ、か
つ、その脂質と相互作用して活性を発揮させることがで
きる。
電極とタンパク質との結合の仲介物質として利用し、電
極に固定したタンパク質が配向性を持つようにする。あ
らかじめ脂質とタンパク質に特定の配向性を持たせて結
合させた後、電極上に修飾（被覆および固定）すれば、
より効率的なタンパク質の機能発現が可能である。さら
にタンパク質を脂質に保持させた状態で電極上に修飾す
ることで、タンパク質の電極吸着による変性を防ぎ、か
つ、その脂質と相互作用して活性を発揮させることがで
きる。
【００１０】これらの脂質で修飾したタンパク質を単分
子膜の状態に制御しつつ、電極上に固定した本発明の電
極を提供することによって、バイオ素子への利用が可能
なナノレベル電極を開発できる。
子膜の状態に制御しつつ、電極上に固定した本発明の電
極を提供することによって、バイオ素子への利用が可能
なナノレベル電極を開発できる。
【００１１】
【発明の実施の形態】図１に推定される本発明の電極表
面の模式図を示す。本発明の電極は、電極基板１を脂質
２が単分子膜の状態で被覆し、さらに脂質の間をタンパ
ク質３が配行性を持って被覆している。
面の模式図を示す。本発明の電極は、電極基板１を脂質
２が単分子膜の状態で被覆し、さらに脂質の間をタンパ
ク質３が配行性を持って被覆している。
【００１２】電極を単分子膜で修飾する方法の一例とし
て、図２、図３を参照しながら、ＬＢ膜作成装置を用い
た本発明の電極作成方法を示す。なお、図２では、タン
パク質の例としてシトクロームｃ3 が、図２及び図３中
では、脂質の例としてリン脂質が示してある。
て、図２、図３を参照しながら、ＬＢ膜作成装置を用い
た本発明の電極作成方法を示す。なお、図２では、タン
パク質の例としてシトクロームｃ3 が、図２及び図３中
では、脂質の例としてリン脂質が示してある。
【００１３】あらかじめＬＢ膜作成装置のトラフ４中を
既知濃度のタンパク質を含む緩衝液５で満たしておき、
マイクロシリンジ６によってクロロホルムに溶かした一
定量のリン脂質を、緩衝液５の界面上に展開する。展開
前には、ＬＢ膜作成装置のバリヤー７を稼働して表面圧
の変化を測定して、液面表面上に汚れがないかを調べ
る。汚れがあるようであれば、アスピレーターなどを用
いて液面表面のクリーニングを行う。展開されたリン脂
質を含むクロロホルム溶液は、トラフ中の水溶液とは混
ざらず、さらにはクロロホルムは非常に揮発性が高いた
め、すぐさま揮発してしまう。その結果、リン脂質が単
分子膜として緩衝液５の表面上に形成される。またリン
脂質は両親媒性物質であるため、一定の向きを保った単
分子膜が形成される。すなわち、親水性のリン脂質頭部
が液相（緩衝液）と面し、疎水性の炭化水素鎖が気相に
面することになる。リン脂質頭部が液相、炭化水素鎖が
気相に面するように形成された単分子膜に水溶液中のタ
ンパク質が吸着あるいは結合していく。このような方法
をとることで、リン脂質とタンパク質は決まった配向性
を持って結合する。
既知濃度のタンパク質を含む緩衝液５で満たしておき、
マイクロシリンジ６によってクロロホルムに溶かした一
定量のリン脂質を、緩衝液５の界面上に展開する。展開
前には、ＬＢ膜作成装置のバリヤー７を稼働して表面圧
の変化を測定して、液面表面上に汚れがないかを調べ
る。汚れがあるようであれば、アスピレーターなどを用
いて液面表面のクリーニングを行う。展開されたリン脂
質を含むクロロホルム溶液は、トラフ中の水溶液とは混
ざらず、さらにはクロロホルムは非常に揮発性が高いた
め、すぐさま揮発してしまう。その結果、リン脂質が単
分子膜として緩衝液５の表面上に形成される。またリン
脂質は両親媒性物質であるため、一定の向きを保った単
分子膜が形成される。すなわち、親水性のリン脂質頭部
が液相（緩衝液）と面し、疎水性の炭化水素鎖が気相に
面することになる。リン脂質頭部が液相、炭化水素鎖が
気相に面するように形成された単分子膜に水溶液中のタ
ンパク質が吸着あるいは結合していく。このような方法
をとることで、リン脂質とタンパク質は決まった配向性
を持って結合する。
【００１４】ここで、バランス８とプレート９は、表面
圧の検出に用いられる。バランス８は、プレート９につ
ながり、プレート９の重量を計測する。プレート９が清
浄な液面に接している場合は、バランス８は、緩衝液の
表面張力を測定していることになるが、液面上に単分子
膜が存在すると、単分子膜の表面圧の分だけ、緩衝液の
表面張力は見かけ上小さく測定される。従って、単分子
膜がある場合とない場合の表面圧を測定することによ
り、緩衝液の表面圧の減少分、つまり単分子膜の表面圧
を測定できる。
圧の検出に用いられる。バランス８は、プレート９につ
ながり、プレート９の重量を計測する。プレート９が清
浄な液面に接している場合は、バランス８は、緩衝液の
表面張力を測定していることになるが、液面上に単分子
膜が存在すると、単分子膜の表面圧の分だけ、緩衝液の
表面張力は見かけ上小さく測定される。従って、単分子
膜がある場合とない場合の表面圧を測定することによ
り、緩衝液の表面圧の減少分、つまり単分子膜の表面圧
を測定できる。
【００１５】タンパク質をリン脂質膜に結合させた複合
単分子膜の電極上への修飾には、図３に示すようなＬＢ
膜作成装置による垂直浸漬法を用いることができる。こ
の方法では、電極基板１を上方から単分子膜を形成して
いる緩衝液に向かって素早く下ろして行き、電極基板１
の修飾面を液中につける。その後、すぐさま非常にゆっ
くりとしたスピードで上方に上げていく。このような方
法をとることで、複合単分子膜は電極基板１を下ろして
いく過程では電極基板１上に移し取られず、電極基板１
を上げていく過程で単分子膜を移し取ることができる。
この際、単分子膜が電極基板１上へ移し取られる時の表
面圧は、電極基板１上が膜の重なりのない単分子膜での
み修飾されるよう検討するのが好ましい。例えば、卵黄
フォスファチジルコリンとカルジオリピンのリン脂質単
分子膜では、２０〜３０ｍＮ／ｍ程度に表面圧を調節す
るのが好ましい。この表面圧は、当業者が用いる脂質に
合わせて好ましい表面圧を適宜選択することができる。
この電気化学的な測定により、単分子膜中に埋まり込ん
でいるタンパク質の電気の流れを確認することが可能で
ある。
単分子膜の電極上への修飾には、図３に示すようなＬＢ
膜作成装置による垂直浸漬法を用いることができる。こ
の方法では、電極基板１を上方から単分子膜を形成して
いる緩衝液に向かって素早く下ろして行き、電極基板１
の修飾面を液中につける。その後、すぐさま非常にゆっ
くりとしたスピードで上方に上げていく。このような方
法をとることで、複合単分子膜は電極基板１を下ろして
いく過程では電極基板１上に移し取られず、電極基板１
を上げていく過程で単分子膜を移し取ることができる。
この際、単分子膜が電極基板１上へ移し取られる時の表
面圧は、電極基板１上が膜の重なりのない単分子膜での
み修飾されるよう検討するのが好ましい。例えば、卵黄
フォスファチジルコリンとカルジオリピンのリン脂質単
分子膜では、２０〜３０ｍＮ／ｍ程度に表面圧を調節す
るのが好ましい。この表面圧は、当業者が用いる脂質に
合わせて好ましい表面圧を適宜選択することができる。
この電気化学的な測定により、単分子膜中に埋まり込ん
でいるタンパク質の電気の流れを確認することが可能で
ある。
【００１６】本発明で用いるタンパク質は、ヘムタンパ
ク質が好ましいが、ヘムタンパク質の代わりに、他の色
素タンパク質、例えば鉄以外の金属イオンを含むもの
（ヘモシアニンなど）、フラビンを含むもの（グルコー
ス酸化酵素など）、カロチンを含むもの（ロドプシンな
ど）、ピロール誘導体を含むもの（クロロフィルタンパ
ク質など）などを用いることができる。また、電子伝達
に関わるタンパク質、例えば、キノン、フェレドキシン
などのタンパク質を用いることも可能である。
ク質が好ましいが、ヘムタンパク質の代わりに、他の色
素タンパク質、例えば鉄以外の金属イオンを含むもの
（ヘモシアニンなど）、フラビンを含むもの（グルコー
ス酸化酵素など）、カロチンを含むもの（ロドプシンな
ど）、ピロール誘導体を含むもの（クロロフィルタンパ
ク質など）などを用いることができる。また、電子伝達
に関わるタンパク質、例えば、キノン、フェレドキシン
などのタンパク質を用いることも可能である。
【００１７】本発明で用いることのできるヘムタンパク
質は、特にシトクロムが好ましい。本発明で用いること
のできるシトクロムとしては、例として、シトクロム
ｂ、シトクロムｃ3 、シトクロムｃ2 、シトクロムｃ
551 、シトクロムｃ552 、シトクロムｃ553 などが挙げ
られる。このうち、シトクロムｃ3 が以下の点から好ま
しい。すなわち、シトクロームｃ3 は、温度に対する安
定性が高く、１２１度まで耐熱性を有する点、電極と直
接電子授受が可能である点、および、酸化還元電位が高
エネルギー側（負に大きい値）であり、他の物質を還元
する能力が高い点である。また、分子量が小さく、４つ
のヘムを持っており、ヘム密度が高いこともシトクロム
ｃ3 が好ましい理由である。なお、本発明では、１種類
のタンパク質を電極に被覆させることのみならず、２種
類以上のタンパク質を適当な混合比で電極に被覆させる
ことも可能である。
質は、特にシトクロムが好ましい。本発明で用いること
のできるシトクロムとしては、例として、シトクロム
ｂ、シトクロムｃ3 、シトクロムｃ2 、シトクロムｃ
551 、シトクロムｃ552 、シトクロムｃ553 などが挙げ
られる。このうち、シトクロムｃ3 が以下の点から好ま
しい。すなわち、シトクロームｃ3 は、温度に対する安
定性が高く、１２１度まで耐熱性を有する点、電極と直
接電子授受が可能である点、および、酸化還元電位が高
エネルギー側（負に大きい値）であり、他の物質を還元
する能力が高い点である。また、分子量が小さく、４つ
のヘムを持っており、ヘム密度が高いこともシトクロム
ｃ3 が好ましい理由である。なお、本発明では、１種類
のタンパク質を電極に被覆させることのみならず、２種
類以上のタンパク質を適当な混合比で電極に被覆させる
ことも可能である。
【００１８】本発明で用いることのできる脂質は、リン
脂質及び糖脂質を含む複合脂質、単純脂質、誘導脂質を
用いることができる。糖脂質の例としては、ガラクトセ
レブロシド、グリセロフォスフェート、グリコシルジグ
リセリド、セレブロシドを挙げることができ、単純脂質
の例としては、トリアシルグリセロール、コレステロー
ル、パルミナン酸セチルを挙げることができる。これら
の脂質のうち、複合脂質が好ましい。リン脂質は、生体
膜を構成する主な脂質であり、ヘムタンパク質の機能を
十分発揮することができるため、特に好ましい脂質であ
る。
脂質及び糖脂質を含む複合脂質、単純脂質、誘導脂質を
用いることができる。糖脂質の例としては、ガラクトセ
レブロシド、グリセロフォスフェート、グリコシルジグ
リセリド、セレブロシドを挙げることができ、単純脂質
の例としては、トリアシルグリセロール、コレステロー
ル、パルミナン酸セチルを挙げることができる。これら
の脂質のうち、複合脂質が好ましい。リン脂質は、生体
膜を構成する主な脂質であり、ヘムタンパク質の機能を
十分発揮することができるため、特に好ましい脂質であ
る。
【００１９】本発明で用いることのできるリン脂質は、
フォスファチジルコリン、カルジオリピン、フォスファ
チジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、ス
フィンゴミエリン、フォスファチジルグリセロール、フ
ォスファチジルイノシトール、フォスファチジルアミノ
アシルグリセロールを例として挙げられる。また、これ
らのリン脂質を２種類以上適当な混合比で混合したリン
脂質を用いることができる。このうち、フォスファチジ
ルコリン、カルジオリピン、フォスファチジルグリセロ
ール、フォスファチジルエタノールアミン及びそれらの
混合物が、タンパク質を保持する疎水性の強さ、電位を
安定に修飾する親水性の強さ、並びに取り扱いの容易さ
から好ましい。
フォスファチジルコリン、カルジオリピン、フォスファ
チジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、ス
フィンゴミエリン、フォスファチジルグリセロール、フ
ォスファチジルイノシトール、フォスファチジルアミノ
アシルグリセロールを例として挙げられる。また、これ
らのリン脂質を２種類以上適当な混合比で混合したリン
脂質を用いることができる。このうち、フォスファチジ
ルコリン、カルジオリピン、フォスファチジルグリセロ
ール、フォスファチジルエタノールアミン及びそれらの
混合物が、タンパク質を保持する疎水性の強さ、電位を
安定に修飾する親水性の強さ、並びに取り扱いの容易さ
から好ましい。
【００２０】本発明で用いることのできる電極は、利用
しようとする電位領域において、溶解したり、化学変化
を起こさない限り、特に限定されない。例えば、シトク
ロムｃは、−４８６ｍＶｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌに半波電
極があるため、シトクロムｃで修飾した電極は、−６０
０ｍＶ程度まで還元または溶解しない必要がある。電極
の例としては、酸化インジウム錫電極、酸化錫電極、酸
化チタン電極や、金電極、アルミニウム電極などの金属
電極や、グラファイト、カーボンペーストなどの炭素電
極や、水銀電極等を挙げることができる。
しようとする電位領域において、溶解したり、化学変化
を起こさない限り、特に限定されない。例えば、シトク
ロムｃは、−４８６ｍＶｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌに半波電
極があるため、シトクロムｃで修飾した電極は、−６０
０ｍＶ程度まで還元または溶解しない必要がある。電極
の例としては、酸化インジウム錫電極、酸化錫電極、酸
化チタン電極や、金電極、アルミニウム電極などの金属
電極や、グラファイト、カーボンペーストなどの炭素電
極や、水銀電極等を挙げることができる。
【００２１】
【実施例】以下に、例としてシトクロムｃ3 を用いた本
発明の電極について説明するが、本願は、シトクロムｃ
3 を用いた電極のみに限定されるものではなく、他のタ
ンパク質にも広く本発明を適用できる。
発明の電極について説明するが、本願は、シトクロムｃ
3 を用いた電極のみに限定されるものではなく、他のタ
ンパク質にも広く本発明を適用できる。
【００２２】（方法）複合単分子膜の作成及び電極上へ
の修飾には、ＬＢ膜作成装置ＫＳＶ５０００を利用し
た。トラフは表面積５８５．０３cm2 、深さ０．３cmの
ものを用いた。単分子膜形成には、卵黄フォスファチジ
ルコリン（中性リン脂質，ＰＣ）とカルジオリピン（酸
性リン脂質，ＣＬ）を重量比４：１で混合した混合リン
脂質（ＰＣ：ＣＬ系リン脂質）を用いた。またタンパク
質としては、硫酸還元菌宮崎Ｆ株（Ｄv ＭＦ）由来のシ
トクロムｃ3 を用いた。
の修飾には、ＬＢ膜作成装置ＫＳＶ５０００を利用し
た。トラフは表面積５８５．０３cm2 、深さ０．３cmの
ものを用いた。単分子膜形成には、卵黄フォスファチジ
ルコリン（中性リン脂質，ＰＣ）とカルジオリピン（酸
性リン脂質，ＣＬ）を重量比４：１で混合した混合リン
脂質（ＰＣ：ＣＬ系リン脂質）を用いた。またタンパク
質としては、硫酸還元菌宮崎Ｆ株（Ｄv ＭＦ）由来のシ
トクロムｃ3 を用いた。
【００２３】単分子膜の作成ために、まずトラフを２．
０μＭのシトクロムｃ3 を含む緩衝液で満たし、その表
面（界面）上にクロロホルム（ＣＨ3 Ｃｌ）に溶かして
調製した２mg／mlの混合リン脂質を展開した。クロロホ
ルムが揮発することで表面上にリン脂質単分子膜が形成
され、その単分子膜にシトクロムｃ3 が静電気的相互作
用により結合あるいは吸着する。このとき、リン脂質と
シトクロムｃ3 との結合又は吸着が十分に平衡状態に達
するまで放置した。
０μＭのシトクロムｃ3 を含む緩衝液で満たし、その表
面（界面）上にクロロホルム（ＣＨ3 Ｃｌ）に溶かして
調製した２mg／mlの混合リン脂質を展開した。クロロホ
ルムが揮発することで表面上にリン脂質単分子膜が形成
され、その単分子膜にシトクロムｃ3 が静電気的相互作
用により結合あるいは吸着する。このとき、リン脂質と
シトクロムｃ3 との結合又は吸着が十分に平衡状態に達
するまで放置した。
【００２４】このようにして作成した複合単分子膜（Ｐ
Ｃ：ＣＬ−シトクロムｃ3 複合単分子膜）を垂直浸漬法
によって電極上に移し取るが、この際複合単分子膜の表
面圧を２５ｍＮ／ｍに調整した。この表面圧は、図４の
表面圧−面積曲線から判断して、この付近の表面圧状態
にある単分子膜が均一に形成されていることから選ばれ
た。図４において、「PC:CL lipid monolayer 」、「cy
t.c3+lipid monolayer」は、それぞれ「ＰＣ：ＣＬ系脂
質混合単分子膜」、「シトクロムｃ3 脂質混合単分子
膜」を表す。田中らは顕微鏡により、この表面圧の単分
子膜が均一に形成されていることを報告している（田
中、近藤：Journal of Biochem. 117 巻、1151 1155 ペ
ージ、1995年）。
Ｃ：ＣＬ−シトクロムｃ3 複合単分子膜）を垂直浸漬法
によって電極上に移し取るが、この際複合単分子膜の表
面圧を２５ｍＮ／ｍに調整した。この表面圧は、図４の
表面圧−面積曲線から判断して、この付近の表面圧状態
にある単分子膜が均一に形成されていることから選ばれ
た。図４において、「PC:CL lipid monolayer 」、「cy
t.c3+lipid monolayer」は、それぞれ「ＰＣ：ＣＬ系脂
質混合単分子膜」、「シトクロムｃ3 脂質混合単分子
膜」を表す。田中らは顕微鏡により、この表面圧の単分
子膜が均一に形成されていることを報告している（田
中、近藤：Journal of Biochem. 117 巻、1151 1155 ペ
ージ、1995年）。
【００２５】電極は酸化インジウム錫（Indium Tin Oxi
de、以下、「ＩＴＯ」という) 電極を用いた。電極への
複合単分子膜の移し取りの方法は前項の通り、電極を上
方から素早く下ろして行き、電極の修飾面を液中につ
け、その後すぐさま非常にゆっくりとしたスピードで上
方に上げていく方法をとった。このような方法をとるこ
とで、複合単分子膜は電極を下ろしていく過程では電極
上に移し取られず、電極を上げていく過程で移し取られ
た。このとき、累積比は、ほぼ１であり、均一に複合単
分子膜を修飾できたことがわかった。ここで、累積比と
は、界面から単分子膜が減少した面積と、実際に電極に
累積された面積との比であり、界面をおおっていた単分
子膜がどれだけ電極面に移しとられたかを示すものであ
る。累積比が１より小さい場合、電極面は膜でおおわれ
ていない部分があることになる。
de、以下、「ＩＴＯ」という) 電極を用いた。電極への
複合単分子膜の移し取りの方法は前項の通り、電極を上
方から素早く下ろして行き、電極の修飾面を液中につ
け、その後すぐさま非常にゆっくりとしたスピードで上
方に上げていく方法をとった。このような方法をとるこ
とで、複合単分子膜は電極を下ろしていく過程では電極
上に移し取られず、電極を上げていく過程で移し取られ
た。このとき、累積比は、ほぼ１であり、均一に複合単
分子膜を修飾できたことがわかった。ここで、累積比と
は、界面から単分子膜が減少した面積と、実際に電極に
累積された面積との比であり、界面をおおっていた単分
子膜がどれだけ電極面に移しとられたかを示すものであ
る。累積比が１より小さい場合、電極面は膜でおおわれ
ていない部分があることになる。
【００２６】このようにして作成した修飾ＩＴＯ電極に
ついてディファレンシャル・パルス・ボルタンメトリー
（以下、「ＤＰＶ」という）による電気化学的測定を行
った。この測定において、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣ
ｌ、対電極として白金線を用い、作用電極面積は１．０
４cm2 、支持電解液として０．１ＭのＫＣｌ、測定装置
としてＢＡＳ−１００Ｂ（B.S.A. Inc.)を用いた。
ついてディファレンシャル・パルス・ボルタンメトリー
（以下、「ＤＰＶ」という）による電気化学的測定を行
った。この測定において、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣ
ｌ、対電極として白金線を用い、作用電極面積は１．０
４cm2 、支持電解液として０．１ＭのＫＣｌ、測定装置
としてＢＡＳ−１００Ｂ（B.S.A. Inc.)を用いた。
【００２７】（結果） （ＰＣ：ＣＬ−シトクロムｃ3 複合単分子膜を修飾した
ＩＴＯ電極のＤＰＶ測定） ＤＰＶ測定では、その測定
結果から算出される半波電位により定性的な評価を行っ
た。天然と同じ状態の構造を保持しているシトクロムｃ
3 の半波電位は、−４８６ｍＶ( 対Ａｇ／ＡｇＣｌ電
極) と報告されている（仁木、小林、松田：Journal of
Electroanalytical Chemistry、178 巻、333 341 ペー
ジ、1984年）。
ＩＴＯ電極のＤＰＶ測定） ＤＰＶ測定では、その測定
結果から算出される半波電位により定性的な評価を行っ
た。天然と同じ状態の構造を保持しているシトクロムｃ
3 の半波電位は、−４８６ｍＶ( 対Ａｇ／ＡｇＣｌ電
極) と報告されている（仁木、小林、松田：Journal of
Electroanalytical Chemistry、178 巻、333 341 ペー
ジ、1984年）。
【００２８】ＰＣ：ＣＬ−シトクロムｃ3 複合単分子膜
を修飾したＩＴＯ電極のＤＰＶ測定では、その半波電位
は−４８６ｍＶと算出された。この電位は、前記仁木、
小林、松田により報告されている半波電位と一致した。
このことは、複合単分子膜中のシトクロムｃ3 が変性せ
ずに天然と同じ状態の構造を保持して電極と反応してい
ることを示している。
を修飾したＩＴＯ電極のＤＰＶ測定では、その半波電位
は−４８６ｍＶと算出された。この電位は、前記仁木、
小林、松田により報告されている半波電位と一致した。
このことは、複合単分子膜中のシトクロムｃ3 が変性せ
ずに天然と同じ状態の構造を保持して電極と反応してい
ることを示している。
【００２９】（比較例１） （ＩＴＯ電極に吸着したシトクロムｃ3 のＤＰＶ測定）
高濃度のシトクロムｃ3 溶液（１２８μＭ）中にＩＴＯ
電極を十分付けておき、電極上にシトクロムｃ3 を吸着
させ、その電極について実施例と同じ条件でＤＰＶ測定
を行った。その結果、図６に示すように、その半波電位
は−５０２ｍＶと算出され、天然と同じ状態のシトクロ
ムｃ3 より低い電位となった。これまでの報告によれ
ば、ヘムタンパク質が変性してヘムが露出するほど、そ
の酸化還元電位は負にシフトするとわかっている。この
結果から、ＩＴＯ電極上に吸着したシトクロムｃ3 は、
電極上に吸着することで変性し、ヘムが露出してきてい
るのではないかと考えられる。この結果と実施例の結果
を比較すると、リン脂質単分子膜に保持されたシトクロ
ムｃ3 は電極上での変性を受けにくく、天然と同じ構造
に近い状態で電極反応を行っていると考えられる。
高濃度のシトクロムｃ3 溶液（１２８μＭ）中にＩＴＯ
電極を十分付けておき、電極上にシトクロムｃ3 を吸着
させ、その電極について実施例と同じ条件でＤＰＶ測定
を行った。その結果、図６に示すように、その半波電位
は−５０２ｍＶと算出され、天然と同じ状態のシトクロ
ムｃ3 より低い電位となった。これまでの報告によれ
ば、ヘムタンパク質が変性してヘムが露出するほど、そ
の酸化還元電位は負にシフトするとわかっている。この
結果から、ＩＴＯ電極上に吸着したシトクロムｃ3 は、
電極上に吸着することで変性し、ヘムが露出してきてい
るのではないかと考えられる。この結果と実施例の結果
を比較すると、リン脂質単分子膜に保持されたシトクロ
ムｃ3 は電極上での変性を受けにくく、天然と同じ構造
に近い状態で電極反応を行っていると考えられる。
【００３０】（比較例２） （ＰＣ：ＣＬ系リン脂質分子膜のみを修飾したＩＴＯ電
極のＤＰＶ測定）実施例及び比較例１の測定で確認でき
たピーク（図５及び図６）が本当にシトクロムｃ3 由来
のピークであるか確認するため、ＰＣ：ＣＬ系リン脂質
単分子膜のみをＩＴＯ電極に修飾して、シトクロムｃ3
を含まない電極を作製し、ＤＰＶ測定を行った。この修
飾電極の調製法は実施例と同じであり、トラフ中をシト
クロムｃ3 を含む緩衝液のかわりに超純水を用いて行っ
た。その結果を図７に示す。図７では、ピークが確認さ
れないことから、図５及び図６に見られるピークがシト
クロムｃ3 由来のピークであることが確認できた。
極のＤＰＶ測定）実施例及び比較例１の測定で確認でき
たピーク（図５及び図６）が本当にシトクロムｃ3 由来
のピークであるか確認するため、ＰＣ：ＣＬ系リン脂質
単分子膜のみをＩＴＯ電極に修飾して、シトクロムｃ3
を含まない電極を作製し、ＤＰＶ測定を行った。この修
飾電極の調製法は実施例と同じであり、トラフ中をシト
クロムｃ3 を含む緩衝液のかわりに超純水を用いて行っ
た。その結果を図７に示す。図７では、ピークが確認さ
れないことから、図５及び図６に見られるピークがシト
クロムｃ3 由来のピークであることが確認できた。
【００３１】
【発明の効果】本発明により、タンパク質を配向性を維
持し、しかもそのタンパク質の機能を保ったまま固定化
することができる。したがって、本発明の電極を用いれ
ば、様々な反応を電気化学的に制御できる。本発明の電
極は、電子伝達タンパク質を用いた、例えば燃料電池に
おける水分解用電極やバイオ素子の構築に利用できる。
また、本発明の電極と酸化還元酵素を共存させること
で、電気制御による物質変換も可能になると考えられ
る。
持し、しかもそのタンパク質の機能を保ったまま固定化
することができる。したがって、本発明の電極を用いれ
ば、様々な反応を電気化学的に制御できる。本発明の電
極は、電子伝達タンパク質を用いた、例えば燃料電池に
おける水分解用電極やバイオ素子の構築に利用できる。
また、本発明の電極と酸化還元酵素を共存させること
で、電気制御による物質変換も可能になると考えられ
る。
【図１】本発明の電極基板の想像図。
【図２】本発明の電極を作成するＬＢ膜作成装置の一例
を示す図。
を示す図。
【図３】本発明の電極を作成する方法の一例である垂直
浸漬法を示す図。
浸漬法を示す図。
【図４】電極を作成する際のＰＣ：ＣＬ−シトクロムｃ
3 の表面圧−表面積曲線図。
3 の表面圧−表面積曲線図。
【図５】本発明のＰＣ：ＣＬ−シトクロムｃ3 複合単分
子膜を修飾したＩＴＯ電極のＤＰＶ測定図。
子膜を修飾したＩＴＯ電極のＤＰＶ測定図。
【図６】従来法によりＩＴＯ電極に吸着させたシトクロ
ムｃ3 のＤＰＶ測定図。
ムｃ3 のＤＰＶ測定図。
【図７】比較例のＰＣ：ＣＬ系リン脂質単分子膜のみを
修飾したＩＴＯ電極のＤＰＶ測定図。
修飾したＩＴＯ電極のＤＰＶ測定図。
１ 電極基板 ２ 脂質 ３ タンパク質 ４ トラフ ５ 緩衝液 ６ シリンジ ７ バリヤー ８ バランス ９ プレート
Claims (4)
- 【請求項１】 電極基板の表面を脂質とタンパク質が実
質的に単分子膜の状態で被覆してなる電極。 - 【請求項２】 上記脂質がリン脂質である請求項１に記
載の電極。 - 【請求項３】 上記タンパク質が色素タンパク質である
請求項１又は２に記載の電極。 - 【請求項４】 上記色素タンパク質がシトクロムである
請求項３に記載の電極。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9093301A JPH10280182A (ja) | 1997-04-11 | 1997-04-11 | タンパク質固定修飾電極 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9093301A JPH10280182A (ja) | 1997-04-11 | 1997-04-11 | タンパク質固定修飾電極 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10280182A true JPH10280182A (ja) | 1998-10-20 |
Family
ID=14078533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9093301A Withdrawn JPH10280182A (ja) | 1997-04-11 | 1997-04-11 | タンパク質固定修飾電極 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10280182A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003092100A1 (en) * | 2001-08-24 | 2003-11-06 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Bio-based microbattery and methods for fabrication of same |
| JP2005535095A (ja) * | 2002-08-06 | 2005-11-17 | ソントル ナショナル ド ラ ルシェルシュ ションティフィーク | 空気極反応用の及び／又は燃料極反応用の触媒としてバイオフィルムを使用する燃料電池 |
| WO2006090873A1 (ja) * | 2005-02-25 | 2006-08-31 | Ultizyme International Ltd. | 燃料電池型酵素センサー |
| WO2010071071A1 (ja) * | 2008-12-18 | 2010-06-24 | ソニー株式会社 | タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびに機能素子およびその製造方法 |
| US7877895B2 (en) * | 2006-06-26 | 2011-02-01 | Tokyo Electron Limited | Substrate processing apparatus |
| KR20200073200A (ko) * | 2017-07-14 | 2020-06-23 | 프로톤 뉴 에너지 퓨쳐, 에스. 엘 | 박테리오로돕신-감응형 광전극을 갖는 가역적 광전기화학 물-분해 장치 |
| CN115901909A (zh) * | 2021-08-12 | 2023-04-04 | 西南医科大学附属医院 | 一种定量检测血液中肌肉肌醇的方法 |
-
1997
- 1997-04-11 JP JP9093301A patent/JPH10280182A/ja not_active Withdrawn
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003092100A1 (en) * | 2001-08-24 | 2003-11-06 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Bio-based microbattery and methods for fabrication of same |
| US6680142B2 (en) * | 2001-08-24 | 2004-01-20 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Bio-based microbattery and methods for fabrication of same |
| JP2005535095A (ja) * | 2002-08-06 | 2005-11-17 | ソントル ナショナル ド ラ ルシェルシュ ションティフィーク | 空気極反応用の及び／又は燃料極反応用の触媒としてバイオフィルムを使用する燃料電池 |
| WO2006090873A1 (ja) * | 2005-02-25 | 2006-08-31 | Ultizyme International Ltd. | 燃料電池型酵素センサー |
| US7877895B2 (en) * | 2006-06-26 | 2011-02-01 | Tokyo Electron Limited | Substrate processing apparatus |
| WO2010071071A1 (ja) * | 2008-12-18 | 2010-06-24 | ソニー株式会社 | タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびに機能素子およびその製造方法 |
| JP2010145216A (ja) * | 2008-12-18 | 2010-07-01 | Sony Corp | タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびに機能素子およびその製造方法 |
| CN102282461A (zh) * | 2008-12-18 | 2011-12-14 | 索尼公司 | 蛋白质固定化电极及其制造方法，以及功能元件及制造方法 |
| US8609438B2 (en) | 2008-12-18 | 2013-12-17 | Sony Corporation | Protein-immobilized electrode and method of manufacturing the same, and functional element and method of manufacturing the same |
| KR20200073200A (ko) * | 2017-07-14 | 2020-06-23 | 프로톤 뉴 에너지 퓨쳐, 에스. 엘 | 박테리오로돕신-감응형 광전극을 갖는 가역적 광전기화학 물-분해 장치 |
| CN115901909A (zh) * | 2021-08-12 | 2023-04-04 | 西南医科大学附属医院 | 一种定量检测血液中肌肉肌醇的方法 |
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