JPH10295363A - ミドリゾウリムシ共生藻のクローニングおよび得られた共生藻クローン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ミドリゾウリムシ細胞内の共生藻をクローン
化し、単離培養するための簡便、かつ、再現性が高い方
法を確立すること、及び、無藻ミドリゾウリムシに対し
高い感染率を示す共生藻のクローンを取得すること。 【解決手段】 ミドリゾウリムシ（Paramecium bursar
ia ）を野菜浸出液中で、ミドリゾウリムシを破砕する
が共生藻を破壊しない程度の超音波で処理し、処理液を
遠心分離処理した後、共生藻懸濁液を培養液で洗浄し、
寒天培地に接種して照明下に培養し、形成したコロニー
を再び同じ培養液を含む寒天培地に移植して培養する。
培養工程を複数回繰り返し継代することによりミドリゾ
ウリムシ共生藻をクローニングする。得られたクローン
は無藻ミドリゾウリムシに対して高い再感染率を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞質内に多量の
共生藻を有する繊毛虫ミドリゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅ
ｃｉｕｍ ｂｕｒｓａｒｉａ）から分離した共生藻をク
ローニングする方法、および共生藻除去ミドリゾウリム
シ（以下、“無藻ミドリゾウリムシ”という）に対し高
い再感染率を示す共生藻のクローンに関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】単一のミドリゾウリムシはその細胞質内
に、数百にも及ぶ多数のクロレラ属に属すると思われる
藻を有することが知られている。これらの内部共生藻
は、宿主の特殊な膜（ｐｅｒｉａｌｇａｌ ｖａｃｕｏ
ｌｅ）内に個々に封入されており、接合の際に保持さ
れ、細胞分裂において両娘細胞に伝達される。ミドリゾ
ウリムシの細胞質から共生藻を除去することは可能であ
り、又、共生藻もその宿主とは独立して生育することが
できることも知られている。

【０００３】本発明者は、バクテリア特にクレブシエラ
・ニューモニアイ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ）を接種した野菜浸出液培地を用いて、ミド
リゾウリムシを、その内部共生藻を除去し得る有効量で
且つ該ミドリゾウリムシの生存許容量の１，１′−ジメ
チル−４，４′−ビピリジリウム塩（パラコート）の存
在下に培養することを特徴とする、短時間で簡便かつ確
実に共生藻を除去して無藻ミドリゾウリムシを創製する
方法を確立し、先に特願平８−１５２２９８号として提
案した。

【０００４】無藻ミドリゾウリムシを培養して得られる
株には外部共生藻を或いはその他の微生物さえも再感染
させることができる。更に、無藻ミドリゾウリムシに共
生藻を経口摂取させると、共生藻はミドリゾウリムシの
細胞質中で増殖を開始し、一定の細胞密度で見かけ上増
殖が停止する。これらの共生藻は、形態学的には自由生
活性のクロレラに類似しているが、正確な種の同定はい
まだ行われておらず、ミドリゾウリムシの細胞質中に存
在する共生藻がすべて同一種であるのか否かについても
解明されていない。

【０００５】これらの共生藻は、宿主であるミドリゾウ
リムシから単離し、培養できることが知られている。過
去において、シーゲル［Ｓｉｅｇｅｌ Ｒ．Ｗ．（１９
６０）：Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，
２３９−２５２］とカラカシアン［Ｋａｒａｋａｓｈｉ
ａｎ Ｓ．Ｊ．（１９６３）：Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｚｏｏ
ｌ．，３６，５２−６８］らは、共生藻をもったミドリ
ゾウリムシを培養すると、発育相（ｇｒｏｗｔｈ ｐｈ
ａｓｅ）の進行に伴い、藻が培養液中に出現してくるこ
とに注目し、この細胞外の藻をローファーの培地（Ｌｏ
ｅｆｅｒ’ｓｍｅｄｉｕｍ）を含む寒天培地で培養し、
それを再感染実験に用いた。然し乍ら、これらの藻が本
来、共生関係にあった藻であるのかどうかは確かではな
い。

【０００６】また、ワイス［Ｗｅｉｓ Ｄ．Ｓ．（１９
７８）：Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．，２５，３６６−３
７０］はミドリゾウリムシから共生藻を単離し、純粋培
養する方法を報告している。しかし、この方法は再現性
に乏しく、あまり行われていない。それは、（１）ミド
リゾウリムシの年齢や発育を全く問題にしておらず、
（２）共生藻の正確な種の同定はおろか、ミドリゾウリ
ムシの細胞内の藻類が全て同一種であるかどうかも不明
のまま材料として用いており、（３）共生藻のクローン
化も、至適培養条件の検討も行われていなかった、等に
よる。

【０００７】従って、この方面の研究者は、研究者相互
間の個人的繋がりや、手紙のやり取り等で交換しあって
共生藻を入手しているのが現状である。ところが上述し
たように、共生藻の正確な種の同定はおろか、ミドリゾ
ウリムシの細胞内の藻類が全て同一種であるかどうかも
不明であり、個々の研究者はこのような異なった共生藻
を使用して独自の研究成果を発表するため、成果に質的
混乱が生じていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は上述の如
く、ミドリゾウリムシより共生藻を除去して無藻ミドリ
ゾウリムシを取得することに成功したが、更に、これら
の藻を用いて、共生関係の成立やミドリゾウリムシ内で
の共生藻の増殖調節のメカニズムを解明するためには、
先ず、ミドリゾウリムシの細胞質中に存在する共生藻を
クローン化する必要があると考えた。そこで、本発明の
目的はミドリゾウリムシ細胞内の共生藻をクローン化
し、単離培養するための簡便、かつ、再現性が高い方法
を確立するにある。また、別の目的は、特に後述のＣＡ
培地において、無藻ミドリゾウリムシに対し高い感染率
を示す共生藻のクローンを取得するにある。更に、本発
明の終局的な目的はゾウリムシを始め動物内細胞生態に
おける感染過程を解明するための頗る重要な研究材料を
提供するにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
ミドリゾウリムシ細胞内の共生藻をクローン化し、単離
培養する方法を確立するために鋭意研究を重ねた結果、
貧栄養培地、特に後述のＣＡ培地において、無藻ミドリ
ゾウリムシに高い再感染率を示す共生藻のクローン化に
成功し本発明を完成したものである。また、更に本発明
者等は、このようにしてクローン化した共生藻と無藻ミ
ドリゾウリムシを用いて、再感染実験の最適条件をも検
討した。

【００１０】即ち、本発明によるミドリゾウリムシ共生
藻のクローニング方法は、（１）ミドリゾウリムシ（Ｐ
ａｒａｍｅｃｉｕｍ ｂｕｒｓａｒｉａ）を野菜浸出液
中で、ミドリゾウリムシを破砕するが共生藻を破壊しな
い程度の超音波で処理する工程、（２）超音波処理液を
遠心分離処理に付する工程、（３）分離した共生藻懸濁
液を培養液で洗浄する工程、（４）共生藻懸濁液を上記
培養液を含有する寒天培地に接種する工程、（５）照明
下に培養する工程、（６）寒天培地上に形成されたコロ
ニーを任意に選んでかきとり、再び同じ培養液を含む寒
天培地に移植して培養する工程、よりなる一連の操作を
経た後、上記工程（４）〜（６）を複数回繰り返すこと
を特徴とする。

【００１１】上記クローニング方法の各工程における好
ましい条件としては、工程（１）の野菜浸出液はレタス
浸出液であること、工程（５）の培養を温度２４±１℃
で少なくとも３０日間行うこと、および工程（４）〜
（６）を少なくとも９回繰り返すことである。

【００１２】更に、前記培養液は、下記培地組成表のう
ちＣ，ＣＡ，ＭＧ，ＣＡａおよびＣＡｂ培地から選ばれ
る何れか１種の培養液を含む貧栄養培地であること、特
にＣＡ培地であることが好ましい。また、１回の培養期
間は少なくとも３０日間となすことが望ましい。

【００１３】

【表２】

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明方法に用いるミドリゾウリ
ムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｂｕｒｓａｒｉａ）は、
予めミドリゾウリムシの有機栄養源となるバクテリアと
して、クレブジエラ・ニューモニアイ（Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を接種した野菜浸出液
培地中で１２時間明期：１２時間暗期、２３±１℃で培
養する。上記培地は、野菜、特に緑色野菜の浸出液に少
量の無機成分を含む半合成培地であることが好ましく、
このような野菜浸出液としてはレタス浸出液が最も好ま
しい。野菜浸出液は、例えば乾葉レタス粉末に少量のＣ
ａＣＯ₃ を加え、約１０００〜１５００倍容の水で数分
間煮沸浸出し、濾過した後、オートクレーブして調製す
る。その他、酵母抽出物、ペプトン、グルコース等、微
生物用培地に慣用される有機成分を適宜添加してもよい
ことは言うまでもない。

【００１５】共生藻をミドリゾウリムシより分離するに
は、上記野菜浸出液中に懸濁したミドリゾウリムシに超
音波処理を施す。超音波処理は、ミドリゾウリムシを完
全に破砕するが、共生藻には影響を及ぼさない程度の適
宜な出力及び処理時間を選定して行う。適宜な処理時間
は３０秒〜１分で目的を達することができる。次いで、
ミドリゾウリムシを破砕した液を遠心し、上清を除去し
て共生藻を得る。

【００１６】分離された共生藻に、好ましくはＣＡ培地
（ＣＡ液体培地）を添加して十分に洗いその懸濁液を、
好ましくはＣＡ液体培地を含む２％寒天培地（ＣＡ寒天
培地）に接種し、２４時間照明下、約２４±１℃で培養
する。約１カ月後に、共生藻のコロニーの任意のものを
選んでかきとり、再びＣＡ寒天培地に植え替え培養す
る。１回の培養期間は少なくとも３０日間とすることが
よい。これらの操作による継代を複数回繰り返すことに
より共生藻のクローンを取得することができる。

【００１７】上述の手法によりＣＡ寒天培地でクローン
化した共生藻をＣＡ液体培地で、約２４±１℃で２４時
間照明下で振盪培養し、培養約７日後に共生藻の一部を
新鮮なＣＡ培地に接種し、以後約７日おきに継代を繰り
返すことによりクローン化共生藻を大量培養することが
できる。

【００１８】

【実施例】本発明方法を以下の実施例により更に詳述す
る。 ＜実験材料＞実験材料として、ミドリゾウリムシ（Ｐａ
ｒａｍｅｃｉｕｍ ｂｕｒｓａｒｉａ）シンジェン１
（ｓｙｎｇｅｎ１）のミドリゾウリムシの株、ＯＫ−３
１２（交配型Ｉ）、ＯＫｗ−３１２（Ｉ）、ＨＤＫ−１
２４（Ｉ）、及びＫＳＫ−１０３（ＩＶ）を用いた。株
ＯＫ−３１２は１９９１年に広島県東広島市奥田大池か
ら［Ｋｏｓａｋａ Ｔ．：Ｚｏｏｌ．Ｓｃｉ．，１１，
５１７−５２６（１９９４）］、株ＨＤＫ−１２４は１
９９４年に広島県府中市羽高湖から、また、株ＫＳＫ−
１０３は１９９５年に広島県府中市河佐峡からそれぞれ
採集したものである。株ＯＫｗ−３１２は、本発明者等
が特願平８−１５２２９８号の方法により、株ＯＫ−３
１２をパラコート処理して得られた無藻ミドリゾウリム
シ株である。これらの株はレタス浸出液培地に予めミド
リゾウリムシの有機栄養源となるバクテリアとしてクレ
ブジエラ・ニューモニアイ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を接種し、１２時間明期：１２時
間暗期、２３±１℃で培養した後に使用した。

【００１９】培地の調製に使用するレタス浸出液は次の
ようにして作った。即ち、レタスの葉を洗浄し３０−６
０秒間煮沸し、６０−８０℃で乾燥した後、粉末となし
デシケーターに貯えた。この乾燥レタス粉末０．５ｇを
ＣａＣＯ₃ （片山化学）２ｍｇと共に再蒸留水０．７リ
ットル中で５−１０分煮沸して浸出液を調製し、室温ま
で冷却後濾過する。濾液に再蒸留水を加えて全容１００
０ｍｌとし、オートクレーブ処理（約１５分）後、培地
に使用した。

【００２０】＜ミドリゾウリムシ個体数の測定＞以下の
実施例中で、ミドリゾウリムシの個体数の測定は、ガラ
スシャーレを振動させて培養液内の細胞の分布を一様に
した後、マイクロピペットでＯ．１ｍｌを、デプレッシ
ョン・スライド（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｌｉｄｅ
ｓ）に取り、捕れた個体を一個体ずつガラスシャーレに
戻し、個体数を測定した。この操作を５回繰り返し、そ
の平均値を０．１ｍｌ中の個体数とし、それを１ｍｌに
換算してその時点での細胞密度とした。なお、デプレッ
ション・スライドに残った培養液は全てガラスシャーレ
に戻した。

【００２１】＜共生藻＞実験材料として用いた共生藻
は、ミドリゾウリムシ株ＯＫ−３１２、ＨＤＫ−１２
４、及びＫＳＫ−１０３から単離し、２４±１℃、２４
時間照明下（約２０００ルクス）で寒天もしくは液体培
地で培養した。また、自由生活性のクロレラとして、ク
ロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａ
ｒｉｓ、Ｃ−２７株）を用い、共生藻と同様の方法で培
養した。

【００２２】＜透過型電子顕微鏡観察＞寒天培養（培養
開始１カ月）もしくは、液体培養（培養開始７日目）し
た共生藻を遠心（１０００ｒｐｍ、２分）で集め、３％
グルタルアルデヒド（ＴＡＡＢ）と２ｍＭ硫酸マグネシ
ウムを加えた１００ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ：６．
８）を細胞の溶液と等量加え、３０分、室温で前固定し
た。次いで、１％四酸化オスミウムを加えた５０ｍＭカ
コジル酸緩衝液中で１時間室温で後固定した。その後、
アルコールシリーズで脱水し、スパー氏低粘度樹脂（Ｔ
ＡＡＢ）［Ｓｐｕｒｒ Ａ．Ｒ．：Ｊ．Ｕｌｔｒａｓｔ
ｒｕｃｔ．Ｒｅｓ．，２６，３１−４３，（１９６
９）］を用いて包埋した。超薄切片は、３％酢酸ウラン
（メルク社製）で１０分、１％クエン酸鉛で３分間電子
染色し、透過型電子顕微鏡（日本電子製：ＪＥＯＬ １
２００ＥＸ^TM）を用い、８０ｋＶで観察した。

【００２３】（実施例１） ＜クローニング方法＞ミドリゾウリムシの共生藻（Ａｌ
ｇａｅ）は、ミドリゾウリムシ株ＯＫ−３１２、ＨＤＫ
−１２４（Ｉ）、及びＫＳＫ−１０３から次の手順で単
離した。即ち、ミドリゾウリムシ各株をレタス浸出液で
３回洗い、その後、再びレタス浸出液中に懸濁し、超音
波発振装置、ソニファー・モデル・４５０^TM（ＢＲＡＮ
ＳＯＮ社製）を用い、出力２で３０秒間超音波破砕し
た。この破砕条件では、ミドリゾウリムシは完全に破砕
されたが、共生藻には影響はなかった。この破砕液を７
２０ｘｇで５分間遠心し、上清を除去した後、共生藻を
培養するための前記培地組成表に示す各培養液を加え洗
浄した。この操作を３回繰り返し、共生藻をよく洗っ
た。この懸濁液を前記培地組成表に示す各培養液のそれ
ぞれ同種の培養液を含む２％寒天（Ｄｉｆｃｏ社製）培
地に接種し、２４時間照明下（約２０００ルクス）、２
４℃で培養し、共生藻のコロニーが形成されるかどうか
を検討した。

【００２４】その結果は、前記培地組成表に示す通り、
プロテオース・ペプトンやグルコース等を含む富栄養培
地（Ｐｒｏ、Ｔｒｅ、及びＭＣａ）では、バクテリアの
増殖が盛んで、共生藻のコロニーは形成されなかった。
一方、貧栄養培地（Ｃ、ＣＡ、ＭＧ、ＣＡａ、ＣＡｂ、
ＭＤＭおよびＭＢＭ）で培養開始後、約１カ月で共生藻
のコロニーが形成された。それらのコロニーを数え、そ
れぞれ１つのコロニーを任意に選んでかきとり、再び同
じ培養液を含む寒天培地に植え替えた。これらの操作を
繰り返すことで共生藻のクローンを得た。

【００２５】（実験例１） ＜再感染実験＞ミドリゾウリムシ株ＯＫ−３１２から得
られた共生藻クローンの感染能を調べるために、定常期
（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）の無藻ミドリゾ
ウリムシＯＫｗ−３１２を用いた。貧栄養培地（Ｃ、Ｃ
Ａ、ＭＧ、ＣＡａ、ＣＡｂ、ＭＤＭ及びＭＢＭ）で培養
した共生藻の各クローンを用いて無藻ミドリゾウリムシ
への再感染実験を行った。

【００２６】寒天培養（培養開始１カ月）もしくは、液
体培養（培養開始７日目）した共生藻を７２０ｘｇで５
分間遠心し、レタス浸出液で３回洗浄した。この懸濁液
に無藻ミドリゾウリムシの１００個体を加え、最終濃度
約１．０ｘ１０⁴ ａｌｇａｅ／ｐａｒａｍｅｃｉｕｍに
調整し、１２時間明期：１２時間暗期、２３±１℃の条
件で、２４時間培養した。その後、ミドリゾウリムシを
含む懸濁液をデプレッションスライド上にとり、レタス
浸出液中で１個体ずつ、３回洗い、ミドリゾウリムシに
取り込まれた共生藻以外の藻を除去した。

【００２７】次いで、直径９ｃｍのシャーレの底を２５
の方形区に区画し、その１区画ごとにバクテリアを接種
したレタス浸出液約１５μｌを置いて、この培養液１ド
ロップあたり１細胞となるようにミドリゾウリムシを移
した。さらに、シャーレの蓋の内側に濾紙を置いて、蒸
留水で湿らせ、この上に水滴を置いた側を下にして（ｕ
ｐ−ｓｉｄｅ ｄｏｗｎ）シャーレをかぶせ、以後この
ハンギング・ドロップ（ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ）状
態で培養した。ミドリゾウリムシに再感染できなかった
共生藻は消化吸収されるか、細胞外に排出されると考え
られるため、その後、２４時間、４８時間後に各ドロッ
プ中のミドリゾウリムシを前述したように洗い、培養液
中に出現してくる共生藻を除去した。ハンギング・ドロ
ップで培養を開始してから５日後、ミドリゾウリムシの
細胞内に共生藻が存在するか否かを観察し、１ドロップ
中に１細胞でも共生藻を保持しているミドリゾウリムシ
が観察された場合にはその細胞系（ｃｅｌｌ ｌｉｎ
ｅ）は再感染したものと判定した。共生藻は赤色の自家
蛍光を発するため、共生藻の有無は蛍光顕微鏡（ニコ
ン、Ｏｐｔｉｐｈｏｔ ＢＦＤ２^TM）を用いて判定し、
全細胞系のうち共生藻が再感染した細胞系の割合を再感
染率としてあらわした。その結果得られた各培地ごとの
再感染率を図１に示す。

【００２８】同図において、横軸は実験に用いた共生藻
を培養した培地の種類を表す。用いた共生藻はそれぞれ
「Ｃ」は３回、「ＣＡ」は５回、「ＭＧ」は２回、「Ｃ
Ａａ」は２回、「ＣＡｂ」は２回継代したものである。
同図から明らかなようにＣＡ培地でクローン化した共生
藻は、他の貧栄養培地で培養したものと比べ再感染率が
最も高かった。

【００２９】（実施例２） ＜ＣＡ液体培地によるクローン化共生藻の培養＞上記実
施例１によりＣＡ寒天培地でクローン化した共生藻を５
ｍｌのＣＡ液体培地で、２４℃、２４時間照明下（約２
０００ルクス）に振盪培養した。培養７日後、共生藻の
一部を新鮮なＣＡ液体培地に接種し、以後７日おきに継
代を繰り返し共生藻のクローンを得た。各継代回数毎に
得られた共生藻の無藻ミドリゾウリムシに対する再感染
率を上記実験例１の方法に準じて調べ、その結果を図２
に示した。同図の横軸は共生藻の継代回数を示す。その
結果、継代（４回〜９回）を繰り返しても再感染率は常
に７０％以上と変わらなかった。以上のことから、共生
藻のクローン化にはＣＡ培地が適当であることが分かっ
た。ＨＤＫ−１２４、ＫＳＫ−１０３由来の共生藻、及
び、自由生活性のクロレラも同様に無藻ミドリゾウリム
シ（ＯＫｗ−３１２）に対する感染能を調べた。

【００３０】（実施例３） ＜ＣＡ液体培地による大量培養＞ミドリゾウリムシの超
音波破砕液をＣＡ培地に接種し（ＣＡ１）、更にこれら
の継代を１カ月毎に９回繰り返し、得られた共生藻（Ｃ
Ａ９）をクローン化共生藻として用いた。興味深いこと
に、これまで何度となく共生藻のクローニングを繰り返
しても、バクテリアを除去できず、図３Ｂに示すように
常に共生藻のコロニー周辺にバクテリアの増殖が観察さ
れ、ある種のバクテリアが共生藻に共生している可能性
が考えられるが、詳細は未だ不明である。然し乍ら、共
生藻自身はクローン化されたと考えられるので、この共
生藻のクローンを用いて共生藻の性質について検討を行
った。

【００３１】寒天培地上では共生藻のコロニーが形成さ
れるまで１〜２カ月かかり、自由生活性のクロレラに比
べ増殖が極めて遅いことが分かった。また、大量の共生
藻を得ることも難しいため、得られた共生藻のクローン
を液体ＣＡ培地中で２４℃、２４時間照明下に培養し
た。先ず、寒天培地上から共生藻（ＣＡ９）のコロニー
を１つかきとり、ＣＡ液体培地中に１０⁴ ａｌｇａｅ／
ｍｌの初期密度で懸濁し培養した（ＣＡ９ ｌｉｑ．
１）。その後、７日ごとに新鮮なＣＡ液体培地に継代し
（ＣＡ９ ｌｉｑ．２、ＣＡ９ ｌｉｑ．３、・・
・）、培養開始７日目の共生藻の感染能について調べ図
４（Ａ）に示した。白丸のプロットはＣＡ９ ｌｉｑ．
３、黒丸はＣＡ９ ｌｉｑ．３２である。図４（Ａ）か
ら明らかなように、液体培地では培養開始７日で約１０
⁷ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの個体密度にまで増殖した。

【００３２】（実験例２）無藻ミドリゾウリムシとクロ
ーン化共生藻をＣＡ培地において２４時間培養すると、
ミドリゾウリムシの細胞内には５０〜１００個体の共生
藻が観察される。その後、共生藻はミドリゾウリムシの
細胞内で増殖を開始し、７日以内に５００〜１０００個
体の細胞密度で見かけ上増殖が停止する。クローン化共
生藻は液体培地中で７日以内に初期密度の１０００倍ま
で増殖するが、宿主内では１０倍しか増殖しない。この
ことから、宿主内に共生藻の増殖調節のメカニズムが存
在することが考えられるが、このメカニズムは解明され
ていない。このように本発明によって取得された共生藻
のクローンは、特に、ＣＡ培地において、無藻ミドリゾ
ウリムシに対し高い感染率と増殖率を示すことが判明し
た。

【００３３】また、ＣＡ液体培地で培養したクローン化
共生藻は図４（Ｂ）に示すように、継代を繰り返しても
８０％以上の常に高い再感染率を示した。ミドリゾウリ
ムシの細胞内では、宿主の発育（ｇｒｏｗｔｈ）の進行
に伴い共生藻の形態が変化するが、寒天培養（ＣＡ１
２）および液体培養（ＣＡ９ ｌｉｑ．１５）のどちら
のクローンも、光学顕微鏡および電子顕微鏡観察により
形態学的には顕著な差はみられなかった。図５は、寒天
培養（Ａ、ＢがＣＡ１２）及び、液体培養（Ｃ、ＤがＣ
Ａ９ ｌｉｑ．１５）したクローン化共生藻の光学顕微
鏡像（Ａ、Ｃ）と電子顕微鏡像（Ｂ、Ｄ）であり、Ａ、
Ｃのスケールバーは１０μｍ、Ｂ、Ｄのスケールバーは
１μｍである。これらのクローンは、共に直径４〜６μ
ｍで、ピレノイドを持ち、クロロプラストの形状はガー
ドル型と呼ばれるものであった。

【００３４】（実験例３） ＜再感染実験の最適条件＞液体培養した共生藻のクロー
ン（ＯＫ−３１２株由来）を用いて再感染実験の最適条
件を決定した。無藻ミドリゾウリムシ１個体当たり１〜
１０⁴ 個体の共生藻を与え、５分から２４時間培養した
後、ミドリゾウリムシを単離し、上記の実験例１の方法
で再感染率を求めた。ミドリゾウリムシ１個体当たりに
与える共生藻数を変えると、図６（Ａ）に示すように、
１個体当たり少なくとも１０³ 個体の共生藻を与えて初
めて再感染することが分かった。過去にワイス等［Ｗｅ
ｉｓＤ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏ
ｌ，２６，２４５−２４８（１９７９）］も、共生藻の
再感染には１０³ 個体の共生藻が必要であることを報告
している。

【００３５】一方、共生藻を与える時間を変えると、図
６（Ｂ）に示すように、時間依存的に再感染率は高くな
り、２４時間で最大の再感染率を示した（約９０％）。
したがって、再感染実験には、無藻ミドリゾウリムシ１
個体当たり１０⁴ 個体の共生藻を与え、２４時間培養の
条件を採用した。

【００３６】（実験例４） ＜共生藻と自由生活性のクロレラの比較＞クローン化さ
れた共生藻は形態学的には自由生活性のクロレラに類似
している。過去に共生藻の分類がいくつか試みられてお
り、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕ
ｌｇａｒｉｓ）グループであると言われている。しかし
ながら、ミドリゾウリムシ細胞内の共生藻は宿主の発育
相（ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）に伴って形態が変化す
ることから、形態学的な特徴をもとにクロレラの種を分
類するのは難しいと思われる。そこで、本発明者等は、
共生藻と自由生活性のクロレラの成長曲線（ｇｒｏｗｔ
ｈ ｃｕｒｖｅ）と、無藻ミドリゾウリムシに対する感
染能について比較する。共生藻と自由生活性のクロレラ
Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｃ２７株）を初期密度１０⁴ ａ
ｌｇａｅ／ｍｌで培養したところ、それぞれ１０⁷ と１
０⁸ ａｌｇａｅ／ｍｌの細胞密度まで増殖した。図７は
その成長曲線である。図中、黒丸は共生藻（ＣＡ９ ｌ
ｉｑ．７４）、白丸は自由生活性のクロレラＣ．ｖｕｌ
ｇａｒｉｓ（ＣＡ３ ｌｉｑ．２５）のそれぞれプロッ
トであり、バー（縦線）は標準誤差を示す。

【００３７】更に自由生活性のクロレラと比較するため
に、いくつかのミドリゾウリムシ株から共生藻のクロー
ンを単離した。ミドリゾウリムシ株ＯＫ−３１２、ＨＤ
Ｋ−１２４、及びＫＳＫ−１０３から得られた共生藻ク
ローンをそれぞれＳＡ−１、ＳＡ−２、及びＳＡ−３と
命名した。感染実験は、無藻ミドリゾウリムシ１個体当
たり１０⁴ 個体の共生藻を与え、２４時間培養した。図
８に示すように、これら３株の共生藻は、無藻ミドリゾ
ウリムシ（ＯＫｗ−３１２）に対して８０％前後の高い
再感染率を示したが、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｃ２７
株）は、無藻ミドリゾウリムシ（ＯＫｗ−３１２）に全
く感染しなかった。

【００３８】過去に、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓを含む自由
生活性のクロレラがミドリゾウリムシに感染するとい
う、本発明者等による実験結果と異なる報告がある［ボ
ンフォード（Ｂｏｍｆｏｒｄ Ｒ．：Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚ
ｏｏｌ．，１２，２２１−２２４（１９６５）；カラカ
シアン等（Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ Ｓ．Ｊ．，ｅｔａ
ｌ．：Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，１９，３６８−３７７（１
９６５）；エーラー（Ｏｅｈｌｅｒ Ｒ．：Ｅｘｐ．Ｔ
ｈｅｒａｐ．Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，１５，５−２１（１
９２２）；シーゲル等（Ｓｉｅｇｅｌ Ｒ．Ｗ．，ｅｔ
ａｌ．：Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．，１３４，６３９（１９
５９）］。しかしながら、これら過去の研究において
は、自由生活性の藻類の種名が明らかにされておらず、
共生を確立したとする基準も不明であるなど、不明瞭な
点が多く、上記相違の原因の解明は今後の課題であろ
う。

【００３９】

【発明の効果】上述の実施例で例証した通り、本発明
は、ミドリゾウリムシ細胞内の共生藻をクローン化し、
単離培養するための簡便、かつ、再現性が高い方法を確
立することに成功し、特にＣＡ培地上で継代を繰り返す
ことにより、ミドリゾウリムシの共生藻のクローンを得
る点に本発明方法の高いオリジナリティーが存する。従
って、この方面の研究者は、研究者相互間の個人的繋が
りや、手紙のやり取り等で交換しあって共生藻を入手し
ているという不安定かつ不確実な現状が打開され、共生
藻の正確な種の同定が可能となり、本発明方法で取得し
たクローンを用いてミドリゾウリムシと共生藻の共生関
係の成立やミドリゾウリムシ内での共生藻の増殖調節の
メカニズムを解明することにより、細胞間認識機構、免
疫機構、オルガネラの進化等の生物学的現象を明らかに
することが可能となり、個々の研究者は研究成果を質的
混乱なく発表することができる。このように、本発明
は、ゾウリムシを始め動物内細胞生態における感染過程
を解明するための頗る重要な研究材料を提供するもので
ある。

【００４０】また、ミドリゾウリムシでは、細胞内の共
生藻が光エネルギーを利用して産生する「糖分」を栄養
分として利用するという興味深い事実が明らかにされて
いる。この現象を解明し応用することは、動物細胞に共
生藻（クロレラ）を共生させ、光エネルギーを利用し得
る動物細胞を創製する道を拓くことに繋がり、本発明
は、従来、植物しか利用することの出来なかった無尽蔵
の光エネルギーを動物が利用する可能性を示す画期的な
ものである。また、有効な利用法が確立されれば、将
来、社会および産業界へ与える影響は測り知れないもの
があるとも言える。例えば、共生藻を導入した家畜類を
創り出すことにより、牧草地ではない場所での放牧も夢
ではなくなることが期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明方法に用いる貧栄養培地で培養した共生
藻の無藻ミドリゾウリムシに対する再感染能を示すグラ
フグラフである。

【図２】本発明方法により生成した共生藻クローンの継
代回数と無藻ミドリゾウリムシに対する感染能との関係
を示すグラフである。

【図３】（Ａ）は共生藻を培養したＣＡ寒天培地の顕微
鏡写真であり、（Ｂ）はその一部拡大写真である。

【図４】（Ａ）は本発明方法によりＣＡ液体培地で培養
した共生藻クローンの成長曲線であり、（Ｂ）は、その
無藻ミドリゾウリムシに対する再感染能を示すグラフで
ある。

【図５】本発明方法培養したクローン化共生藻の顕微鏡
写真であり、（Ａ）は寒天培養したＣＡ１２の光学顕微
鏡像、（Ｂ）はその電子顕微鏡像、（Ｃ）は液体培養し
たＣＡ９ ｌｉｑ．１５の光学顕微鏡像、（Ｄ）はその
電子顕微鏡像である。

【図６】本発明方法により生成した共生藻クローンの無
藻ミドリゾウリムシに対する再感染能を示すグラフであ
り、（Ａ）は無藻ミドリゾウリムシ１細胞当たりに与え
る共生藻数の影響を示し、（Ｂ）は、無藻ミドリゾウリ
ムシと共生藻とを培養する時間の影響を示す。

【図７】本発明方法によりＣＡ液体培地で培養したクロ
ーン化共生藻と自由生活性のクロレラの成長曲線であ
る。

【図８】本発明方法で得られた共生藻クローンと自由生
活性のクロレラの無藻ミドリゾウリムシに対する感染能
を示すグラフである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（１）ミドリゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃ
   ｉｕｍ ｂｕｒｓａｒｉａ）を野菜浸出液中で、ミドリ
   ゾウリムシを破砕するが共生藻を破壊しない程度の超音
   波で処理する工程、（２）超音波処理液を遠心分離処理
   に付する工程、（３）分離した共生藻懸濁液を培養液で
   洗浄する工程、（４）共生藻懸濁液を上記培養液を含有
   する寒天培地に接種する工程、（５）照明下に培養する
   工程、（６）寒天培地上に形成されたコロニーを任意に
   選んでかきとり、再び同じ培養液を含む寒天培地に移植
   して培養する工程、よりなる一連の操作を経た後、上記
   工程（４）〜（６）を複数回繰り返すことを特徴とする
   ミドリゾウリムシ共生藻のクローニング方法。
2. 【請求項２】 前記工程（１）の野菜浸出液がレタス浸
   出液である請求項１の方法。
3. 【請求項３】 前記工程（５）の培養を温度２４±１℃
   で少なくとも３０日間行う請求項１の方法。
4. 【請求項４】 上記工程（４）〜（６）を少なくとも９
   回繰り返す請求項１の方法。
5. 【請求項５】 前記培養液が、下表に示す組成を有する
   Ｃ，ＣＡ，ＭＧ，ＣＡａおよびＣＡｂ培地から選ばれる
   何れか１種の培養液を含む貧栄養培地である請求項１の
   方法。 【表１】
6. 【請求項６】 前記培養液がＣＡ培地である請求項１の
   方法。
7. 【請求項７】 培養期間を少なくとも３０日間となす請
   求項５または６の何れか１項の方法。
8. 【請求項８】（１）ミドリゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃ
   ｉｕｍ ｂｕｒｓａｒｉａ）を野菜浸出液中で、ミドリ
   ゾウリムシを破砕するが共生藻を破壊しない程度の超音
   波で処理する工程、（２）超音波処理液を遠心分離処理
   に付する工程、（３）分離した共生藻懸濁液を培養液で
   洗浄する工程、（４）共生藻懸濁液を上記培養液を含有
   する寒天培地に接種する工程、（５）照明下に培養する
   工程、（６）寒天培地上に形成されたコロニーを任意に
   選んでかきとり、再び同じ培養液を含む寒天培地に移植
   して培養する工程、よりなる一連の操作を経た後、上記
   工程（４）〜（６）を複数回繰り返すことにより取得し
   たミドリゾウリムシ共生藻のクローンを、（７）前記培
   養液を含む液体培地に移植し振盪培養する工程による継
   代を複数回繰り返すことを特徴とするミドリゾウリムシ
   共生藻のクローンの大量培養方法。
9. 【請求項９】 前記工程（７）の振盪培養を照明下、温
   度２４±１℃で行う前記請求項８の方法。
10. 【請求項１０】 前記請求項１〜９の何れか１項によっ
    て創製されたミドリゾウリムシ共生藻のクローン。