JPH10295381A

JPH10295381A - 新規シグナル伝達因子、およびそれをコードする遺伝子

Info

Publication number: JPH10295381A
Application number: JP9105892A
Authority: JP
Inventors: Kenji Okazaki; 賢二岡崎; Koki Kitamura; 幸喜北村
Original assignee: SEIBUTSU BUNSHI KOGAKU KENKYUSHO KK
Current assignee: SEIBUTSU BUNSHI KOGAKU KENKYUSHO KK
Priority date: 1997-04-23
Filing date: 1997-04-23
Publication date: 1998-11-10
Also published as: US6020464A; EP0874046A1

Abstract

(57)【要約】【課題】新規シグナル伝達因子およびそれをコードす
る遺伝子を提供する。【解決手段】新規シグナル伝達因子は、例えば配列表
の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、それをコー
ドしているＤＮＡ配列は、例えば配列番号１に記載の配
列を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、トランスフォーミ
ング増殖因子ベータ（以下、TGFβという）ファミリー
に属する生理活性物質により生じた刺激を、細胞内で伝
達するSmadと呼ばれる蛋白質群をコードする新規遺伝子
に関する。

【０００２】

【従来の技術】TGFβファミリーは動物界に広く分布す
る一群のペプチド性の生理活性物質である。このファミ
リーに含まれる物質には、がん細胞の増殖に関与する物
質として発見されたTGFβ、ヒトを含む脊椎動物の骨格
形成に重要な機能を持つ骨形成因子（BMP）、脳下垂体
からの卵胞刺激ホルモン分泌を調整するインヒビン、赤
血球分化因子としての活性を持つアクチビン、そしてグ
リア細胞由来の神経栄養因子などの極めて重要な生理活
性ペプチドが含まれる(Bock, G. R. & Marsh, J.eds. 1
991, Clinical Application of TGFβ. Ciba Foundatio
n Symposium. Johns Wiler & Sons)。TGFβファミリー
のペプチドが如何にして細胞に働きかけるのかという疑
問に対する解答の糸口は、まずこれらのペプチドに対す
る受容体のcDNAのクロン化とヌクレオチド配列の解明、
そしてこの配列から予想される受容体蛋白質のアミノ酸
配列から得られた。このファミリーに対する受容体は細
胞膜貫通型のセリン（及びスレオニン）特異的蛋白質リ
ン酸化酵素（プロテインキナーゼ）活性を持ち、このこ
とから細胞内蛋白質のリン酸化がTGFβファミリーから
の刺激の伝達に関与していることが示された(Sporn, M.
B. & Roberts, A. B.eds. 1990, Peptide Growth Fact
ors and Their Receptors, part I & II. Springer-Ver
lag, Berlin.)。

【０００３】従来、TGFβファミリーからの刺激を媒介
する因子として、ショウジョウバエではMad、線虫ではS
maと呼ばれる遺伝子が知られていた。近年、ヒトを含め
た数種類の脊椎動物において、MadおよびSmaと相同性を
持つ複数の遺伝子が発見され、そのcDNAがクロン化され
ると共にヌクレオチド配列が明らかにされた。これらの
遺伝子及びこれらの遺伝子にコードされる蛋白質はSmad
と命名され、現在までにSmad1、Smad2、Smad3、Smad4、
Smad5、Smad6が報告されている(Derynck R. etal. 199
6, Nomenclature: Vertebrate mediators of TGFβ fam
ily signals. Cell, 18, 173)。また、アフリカツメガ
エルの受精卵を用いたテストから、動物個体の初期発生
において、胚のどちら側が腹となりどちら側が背となる
かという根本的かつ重大な決定にSmad1が必要であるこ
とが知られている(Graff, J. M. et al. 1996, Cell, 8
5, 479-487)。Smad2遺伝子はその失活がヒト結腸がんの
原因の一つであり、一方、Smad4遺伝子は膵臓がんの抑
制に強く相関することの知られているがん抑制遺伝子DP
C4と同一であることが示されている(Eppert, K. etal.
1996, Cell, 86, 543-552; Hahn, S. A. et al. 1996,
Science, 271, 350-353)。従って、Smad蛋白質ファミリ
ーはTGFβファミリーの生理活性ペプチドからの刺激を
伝えるシグナル伝達因子であると共に、がんの生成にも
深く関与する因子であるということができる。

【０００４】既知のSmadファミリー蛋白質は相互に比較
的よく保存されたアミノ末端側領域及びカルボキシ末端
領域を有する、アミノ酸残基４００から５５０個程度よ
り構成される細胞質内蛋白質である。TGFβファミリー
の刺激によって特異的受容体のキナーゼ活性が上昇する
のに伴い、Smad蛋白質は急速なリン酸化を受けると共
に、細胞核内へと集結する。遺伝子発現の場である細胞
核内において、Smad蛋白質は同種分子間の多量体形成、
もしくは、異種Smad間の多量体形成を介した未知の相互
作用を通じて、特異的な遺伝子発現の調節を行っている
(Massagu J. 1996, Cell, 85, 947-950.)。

【０００５】TGFβをはじめとして、ホルモンやサイト
カインを含む多様な生理活性物質の作用が、最終的には
標的細胞の遺伝子発現の調節を通じて行われていること
が、近年ますます明らかにされている。これらの生理活
性物質の作用の特異性は、各々に対する受容体とその後
に続くシグナル伝達因子によって担われている。また、
単一種の生理活性物質に起因するシグナルが、複数のシ
グナル伝達因子を活性化することによって、伝達経路を
複数に分岐させることも多い。従って、これらのシグナ
ル伝達因子を単離しその性質を明らかにすることは、種
々の生理活性物質の作用機構を解明するため、あるいは
また、これを治療目的の医薬の標的として利用する上で
有用である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】既述したように、TGF
βファミリーは、増殖制御、免疫反応、細胞分化、胎生
期の形態形成などの多様な生理現象にきわめて重要な機
能を果たしている。現在までに５０種以上が発見されて
いるTGFβファミリーの生理活性物質のうちには、その
量的な不足や過剰あるいは質的な変化を含む異常が上記
生理現象にかかわる病態、すなわち、がん、自己免疫疾
患、骨粗鬆症、貧血、先天性奇形などに関与する事例が
知られている。同様に、TGFβファミリーからの刺激
（シグナル）を細胞内で伝達するSmadファミリーの異常
が、がんを筆頭にさまざまな異常や病態に関与すること
も遺伝学的な解析から明らかにされている。とりわけが
んは日本をはじめとする先進国において死亡原因の第１
位であり、その予防と治療のためにはがんに関与する遺
伝子の全てを明らかにすることが望まれる。ところが、
既知のTGFβファミリーの生理活性物質の数にくらべる
と、現時点で同定されているSmadの数はほんのわずかな
ものでしかない。このことは未知のSmadファミリーが存
在していることを示すものである。そこで、新規Smad遺
伝子を単離することができれば、TGFβファミリーによ
る新規の経路を解明することができるし、また、かかる
遺伝子は、がんをはじめとした疾患について、遺伝子レ
ベルでの異常を判定するための診断薬としての用途が期
待される。本発明は、TGFβファミリーの生理活性物質
のシグナルを伝達するSmadファミリーに属する新規因子
及びそれをコードする遺伝子を提供することを目的とし
ている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、生体反応
制御におけるTGFβペプチドとそのシグナルを伝達するS
madファミリー蛋白質の重要な働きに注目し、新規Smad
遺伝子のクロン化を目的としてハツカネズミ起源のcDNA
を探索したところ、１７日胚の組織全体に由来するcDNA
混合物の中から新規Smadファミリー蛋白質をコードする
mRNAに対応するcDNAを同定し、本発明を完成した。即
ち、本発明の第一の目的は、Smadファミリーに属する新
規なシグナル伝達因子をコードする遺伝子を提供するも
のである。

【０００８】また、本発明の第二の目的は、上記遺伝子
によりコードされる蛋白質、即ちシグナル伝達因子を提
供するものである。

【０００９】（１）シグナル伝達因子Smad7をコードす
る遺伝子本発明における新規Smad（Smad 7）をコードするcDNAは
以下の特徴を持つ。１）コード領域配列番号１に記載のように１２８１ヌクレオチド対から
なり、配列番号４に記載の４２６アミノ酸配列をコード
する。２）５’側非コード領域配列番号２に記載の209ヌクレオチド対を有し、その
３’側に連続して１)に記載のコード領域の配列がつな
がる。３）３’側非コード領域配列番号３に記載の207ヌクレオチド対を有し、１)に記
載のコード領域の配列の直後から連続する。

【００１０】本発明に係る新規Smad（Smad 7）のcDNA
は、以下のような方法で取得することができた。まず、
既に発表されている脊椎動物のSmadファミリーのアミノ
酸配列間で相同性の高い領域を検索した。そのアミノ酸
配列はSmadファミリーの持つ重要な機能に必要であり、
未知のSmadにおいても保存されていると考えられるの
で、その情報を基礎にPCR（polymerase chain reactio
n）法(Saiki, R. et al. 1985, Science, 230, 1350-13
54)によるDNA増幅を行うためのプライマーオリゴヌクレ
オチドを設計、合成した。PCR反応の鋳型として用いるD
NAは、公知の方法(岡崎賢二 1995, mRNAの調整法. 右田
俊介他編、免疫実験操作法I、pp.349-352、南江堂)によ
ってハツカネズミ胚より調製したポリアデニル酸化RNA
から作成したcDNA混合物にアダプターDNAを連結させた
ものを用いた。上記のプライマーオリゴヌクレオチドと
アダプターDNA特異的なオリゴマーとの組み合わせでPCR
反応を行い、得られた産物のヌクレオチド配列から推測
される部分アミノ酸配列がSmadファミリーのアミノ酸配
列と相同性を持つことを確認した。ここで得られたヌク
レオチド配列をもとに５’末端及び３’末端に対応する
オリゴマーを合成し、上記cDNA混合物を鋳型としてPCR
反応を行うことによって、全コード領域を含むcDNAを得
た。このcDNAを公知の汎用プラスミドベクターを用いて
クロン化した後、ヌクレオチド配列の決定を行った。な
お、本cDNAのヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３
に明らかにしてあるので、DNAの５’末端及び３’末端
のそれぞれに対応するセンスオリゴマー及びアンチセン
スオリゴマーを合成し、ハツカネズミ胚cDNA を鋳型に
してPCR反応を行うことによっても本cDNAを得ることが
できる。

【００１１】ここで得られたcDNAの配列から予想される
アミノ酸配列を、公知のSmad1のアミノ酸配列(NCBI(米
国National Center for Biotechnology Information)Id
entification numbers：1332714, 1333647, 1381671, 1
518645, 1654323)と比較したところ、C末端領域におい
て、６５％という比較的高い相同性を示すことが判明
し、本cDNAがSmadファミリー蛋白質をコードするcDNAで
あることが明らかになった。また、このアミノ酸配列
は、従来発表されている脊椎動物由来のSmadファミリー
であるSmad1からSmad6(NCBI Identification：Smad1; 1
518645, 1658159, 1333647, 1654323, 1469308, 143807
7, 1332714：Smad2; 1407782, 1575530：Smad3; 167357
7, 1552532：Smad4; 1724091, 1163234：Smad5; 151864
7, 1654325：Smad6; 1654327)までのいずれとも明確に
相異しており、かつ、無脊椎動物由来のショウジョウバ
エMad(NCBI Identification : 1085150, 551489)および
線虫Sma(NCBI Identification : 1173452, 1173453, 11
73454)とも明確に相異しているので、本cDNAを新規Smad
ファミリー蛋白質のcDNAと認定し、これをSmad7と命名
した。さらに、本cDNAのヌクレオチド配列は、既に発表
されているSmadファミリーのcDNA(GenBank accession n
umbers：Smad1; U54826, U57456, U58992, U59912, U59
423, U58834, L77888：Smad2; U59911, U60530, U6501
9, U68018, L77885：Smad3; U68019, U76622：Smad4; U
79748, U44378：Smad5; U58993：Smad6; U59914)のいず
れとも明確に相異している。

【００１２】（２）Smad7蛋白質本発明のSmad7蛋白質は以下の特徴を持つ。１）アミノ酸配列上記Smad7 cDNAのヌクレオチド配列から予想されるSmad
7蛋白質のアミノ酸配列は配列番号４に示す通りであ
る。２）分子量配列番号４に示したアミノ酸配列から計算したSmad7蛋
白質の分子量は 46516である。３）等電点配列番号４に示したアミノ酸配列から計算したSmad7蛋
白質の等電点は8.3である。

【００１３】Smad7蛋白質は、以下のような方法で取得
することができた。配列番号１に示したSmad7 cDNAを公
知の発現用プラスミドベクター内のプロモーター領域の
下流に連結し、大腸菌を形質転換した後、プラスミドDN
Aを精製した。これを培養細胞に導入し、形質転換細胞
の中でSmad7を発現させた。このようなSmad7の発現を目
的としたベクターとして、本発明者らが作成したpactEF
-mSmad7（図１）を利用した。このベクターで形質転換
した大腸菌、エシエリシア・コリ（pactEF-mSmad7）
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る（受託日：平成９年４月８日；受託番号：ＦＥＲＭ
Ｐ−１６１８７）。また、Smad7 cDNAを形質転換した大
腸菌内でSmad7蛋白質を合成することもできる。大腸菌
内での発現を目的としたベクターは数多くのものが公知
となっており、Smad7 cDNAを連結することによって、目
的に応じた発現ベクターを作成することができる。例え
ば、pＥＴシリーズベクターおよびpＫＣ３０などを挙げ
ることができる(Sambrook, J. et al. 1989, Molecular
Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, US
A)。

【００１４】また、Smad7蛋白質の全体または一部分
を、他のアミノ酸配列を付加した融合蛋白質として発現
させることもできる。そのためには、付加すべきアミノ
酸配列をコードする遺伝子DNAまたはオリゴヌクレオチ
ドと、Smad7 cDNAの全長または一部分とを、コドンフレ
ームの合致するように連結させる。

【００１５】さらに、配列番号１に示したSmad7 cDNAを
鋳型として利用してRNAに転写させ、しかる後に、このR
NAを細胞内翻訳系または無細胞翻訳系に添加することに
よってSmad7蛋白質を合成することができる。クロン化
されたDNAをRNAに転写するためのベクターは多くのもの
が公知となっており、例えば、pＳＰ６４、pＩＢＩ３
１、およびpＧＥＭ３などが利用できる(Sambrook, J. e
t al. 1989, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, USA)。RNAポリメラーゼとしては、
バクテリオファージSP6、T3またはT7由来のものが使用
できる。合成されたセンス鎖RNAをもとにして蛋白質を
合成する系として、アフリカツメガエルの卵母細胞を利
用する系が知られている(西沢真由美、佐方功幸、199
2、in vitroのタンパク質の生合成；日本生化学会編、
新生化学実験講座１・タンパク質VI、東京化学同人)。
また、無細胞翻訳系としては、ウサギ網状赤血球抽出液
を用いる方法を用いることもできる(Kozak, M. 1990, N
uc. Acids Res., 18, 2828)。一方、配列番号１、２、
または３に示したSmad7 cDNAまたはその一部分を鋳型と
して、Smad7に対するアンチセンスRNAを合成することが
できる。アンチセンスRNAはSmad7に関連する病態の診断
に用いることができる。また、 Smad7の配列を含む転写
ベクターに適当な配列を持ったDNAヌクレオチドを連結
させることにより、リボザイム活性を持つRNA分子とし
てアンチセンスRNAを合成することができる。

【００１６】当業者は公知技術に従い、配列表の配列番
号１に記載したDNA配列に突然変異、例えば部位特異的
突然変異を施すことにより、配列番号４に記載したアミ
ノ酸配列に１または複数個のアミノ酸残基の欠失、置
換、または挿入が施された変異体蛋白質をコードするDN
A変異体を得ることができる。かかる変異体蛋白質の
内、シグナル伝達因子としての活性を保持しているもの
は本発明の範囲に包含される。

【００１７】

【実施例】以下に、本発明を実施例によってさらに詳細
に説明する。

【００１８】〔実施例１〕ハツカネズミSmad7 cDNAの
クロン化１）プライマーオリゴヌクレオチドの設計及びPCR反応
の実施 Smad蛋白質間で良く保存された以下のアミノ酸配列：

【化１】 Pro Cys Trp Leu/Ile Glu Val/Ile His Leu Asn をもとに遺伝子特異的アンチセンスオリゴマー、GSP1
（ＧｅｎｅＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｉｍｅｒ１）と
して

【化２】５’−ＧＴＴ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）Ａ（Ａ／Ｇ）
ＧＴＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＡＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＣ（Ａ／Ｃ
／Ｇ／Ｔ）−Ａ（Ｇ／Ｔ）ＣＣＡＧＣＡ（Ａ／Ｃ／Ｇ／
Ｔ）ＧＧ−３’ を合成し、

【化３】 Phe Val Lys Gly Trp Gly Ala/Pro Cys/Glu Tyr をもとに遺伝子特異的アンチセンスオリゴマー、GSP2と
して

【化４】5'-GTA(A/C/G/T)(C/T)(A/C)(A/C/G/T)G(C/G)(A
/C/G/T)CCCCA(A/C/G/T)CC(C/T)TT(A/C/G/T)AC(A/G)AA-
3' を合成した。

【００１９】最初のPCR反応は、ハツカネズミ１７日胚
由来のcDNA混合物にアダプターオリゴヌクレオチドを連
結したもの（米国CLONTECH社製）を鋳型とし、アダプタ
ー特異的オリゴマー１

【化５】(AP1)：5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' をセンスオリゴマーとし、上記GSP1をアンチセンスオリ
ゴマーとして行った。反応条件は、96℃、180秒間の
後、変性；96℃、30秒間，会合および伸長反応；72℃、
240秒間を5サイクル、変性；96℃、30秒間，会合および
伸長反応；70℃、240秒間を5サイクル、変性；96℃、30
秒間，会合反応；60℃、30秒間，伸長反応；68℃、120
秒間を25サイクルである。

【００２０】次いで、ここで得られた反応液の500分の1
量に含まれるDNAを鋳型とし、アダプター特異的オリゴ
ヌクレオチド２

【化６】(AP2)：5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3' をセンスオリゴマーとし、上記GSP2をアンチセンスオリ
ゴマーとして二回目のPCR反応を行った。反応条件は、9
6℃、2 分間の後、変性；96℃、30秒間，会合および伸
長反応；68℃、120秒間を20サイクルである。なお、耐
熱性DNAポリメラーゼとしては、Expand High Fidelity
PCR System(ドイツ BOEHRINGER MANNHEIM社製)(Barnes,
W. M. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2216-
2220)を、熱サイクル装置としては、PCR Thermal Cycle
r MP(宝酒造社製)を使用した。

【００２１】このPCR反応で得られた約1200bpのDNA断片
のヌクレオチド配列を解析したところ、Smadファミリー
間で保存されたアミノ酸配列である

【化７】Lys Lys Leu Lys Glu 及び

【化８】Arg Trp Pro Asp Leu の両者をコードする配列を含んでいたので、このDNA断
片をSmadファミリー蛋白質をコードするcDNAに由来する
ものと認定した。

【００２２】２）５’末端及び３’末端領域の解析上記１)で得られたヌクレオチド配列をもとに、5'-RACE
(rapid amplificationof 5'-cDNA ends)(Frohman, M.
A. 1993, Methods. Enzymol. 218, 340-358)を実施する
ためのSmad特異的アンチセンスオリゴマー

【化９】5'-CCGGACGAGCGCAGATCGTTTGGTCC-3' を合成した。また同様に、3'-RACE(rapid amplificatio
n of 3'-cDNA ends)(Frohman, M. A. 1993, Methods. E
nzymol. 218, 340-358)を実施するためのSmad特異的セ
ンスオリゴマー

【化１０】5'-TTCATGCAGCAACCATGGACGGGTTTC-3' を合成した。反応は１)において用いたものと同じハツ
カネズミ１７日胚由来のcDNA混合物を鋳型とし、AP2とS
mad特異的アンチセンスオリゴマーを用いて5'-RACEを行
い、Smad特異的センスオリゴマーとAP2を用いて3'-RACE
を行った。反応条件は、96℃、180秒間の後、変性；96
℃、30秒間，会合および伸長反応；72℃、240秒間を5サ
イクル、変性；96℃、30秒間会合，および伸長反応；70
℃、240秒間を5サイクル、変性；96℃、30秒間，会合反
応；60℃、30秒間，伸長反応；68℃、240秒間を25サイ
クルであった。

【００２３】この5'-RACE反応で得られた約250bpのDNA
断片のヌクレオチド配列を決定したところ、Smadファミ
リー間で保存された位置の翻訳開始コドンと、配列番号
２に示した5'非コード領域を含む配列であった。また、
3'-RACE反応で得られた約400bpのDNA断片のヌクレオチ
ド配列を決定したところ、終止コドンと配列番号３に示
した3'非コード領域を含む配列であった。

【００２４】３）Smad7コード領域のクロン化上記２)で得られたヌクレオチド配列をもとに、Smad7全
コード領域を含むcDNAを得るための特異的センスオリゴ
マー（クロン化のため5'末にNheIサイトを付加してあ
る）：

【化１１】 5'-CCGCTAGCACCATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGCTCGTC-3' およびアンチセンスオリゴマー（クロン化のため5'末に
BamHIサイトを付加してある）：

【化１２】 5'-CCGGATCCTATCGCGAGTTGAAGATGACCTCCAGCCAGCACG-3' を作成した。これら二つを用い、１)において使用した
ものと同じcDNA混合物を鋳型としてPCR反応を行った。
反応条件は、96℃、180秒間の後、変性；96℃、30秒
間，会合および伸長反応；72℃、60秒間を5サイクル、
変性；96℃、30秒間，会合および伸長反応；70℃、60秒
間を5サイクル、変性；96℃、30秒間，会合および伸長
反応；68℃、60秒間を25サイクルである。

【００２５】この反応で得られた約0.5μgの約1300bpの
DNA断片を、制限酵素NheI（米国NewEngland Biolabs社
製）およびBamHI（米国New England Biolabs社製）で、
３７℃で、１時間処理した後、0.7％低融点アガロース
を用いたゲル電気泳動法を用いて精製した。次に、公知
のプラスミドベクターであるpIBIΔ(米国International
Biotechnologies, Inc.社製、pIBI31から、Furuno, N.
et al. 1994, EMBO J13, 2399-2410の方法によって作
製することができる。)と宿主である大腸菌K-12株由来
のJM109株(Sambrook, J. et al. 1989, Molecular Clon
ing. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA)（日
本国東洋紡績社）を用いてクロン化し、プラスミドpIBI
Δ-mSmad7（図３）を得た。このプラスミドで形質転換
した大腸菌、エシエリシア・コリ（pIBIΔ-mSmad7）
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る（受託日：平成９年４月８日；受託番号：ＦＥＲＭ
Ｐ−１６１８８）。次いでこのプラスミドDNAを単離
し、cDNAのヌクレオチド配列を決定した。ヌクレオチド
配列は配列番号１に記載した。なお、上記の方法を用い
て、ハツカネズミ１１日胚からも、配列番号１に示した
ヌクレオチド配列を持つSmad7 cDNAを取得することがで
きた。

【００２６】〔実施例２〕 Smasd7発現ベクターの構築上記の方法で得られた全コード領域を含むSmad7 cDNA
を、培養動物細胞用の発現ベクターであるpactEF(ドイ
ツ国BOEHRINGER MANNHEIM社製、pEMBL9(+)より、Okazak
i K. & Sagata, N. 1995, EMBO J. 14, 5048-5059の方
法によって作製することができる。)に連結し、pactEF-
mSmad7（図１）を作成した。このベクターで形質転換し
た大腸菌、エシエリシア・コリ（pactEF-mSmad7）は、
既述した通り、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託されている。図１において、β-Actin promoter/EF-1
α enhancerはニワトリゲノム由来のベータ・アクチン
の転写プロモーターおよびヒトゲノム由来のエロンゲー
ションファクター１アルファの転写エンハンサー：f1 o
riはf1 ファージのDNA複製開始領域：blaはベータラク
タマーゼ遺伝子(スルベニシリン耐性、アンピシリン耐
性を与える)：oriはpUCプラスミド由来のDNA複製開始領
域：poly AはSV40由来の転写終結およびポリアデニル酸
付加シグナル：Smad7はSmad7 cDNA：HindIII, BanIII,
ScaI, BamHIは各々の制限酵素の切断位置である。

【００２７】さらに、Smad7のN末端に公知のエピトープ
ペプチドであるMyc-tag(Evan, G. I. et al. 1985, Mo
l. Cell. Biol. 5, 3610-3616)の配列：

【化１３】Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu を含む配列が付加された融合蛋白質を発現させるための
ベクター pactEF-Myc-mSmad7を作成した。このベクター
で形質転換した大腸菌、エシエリシア・コリ（pactEF-M
yc-mSmad7）は、工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託されている（受託日：平成９年４月８日；受託番
号：ＦＥＲＭＰ−１６１８６）。このベクターの作成
のためには、DNAオリゴマー

【化１４】5'-ATGTCTGAGCAGAAGCTGATCTCTGAGGAAGACCTTG
GAGCTAGCACC-3' をSmad7の翻訳開始コドンの直前に挿入した。このベク
ターDNAを公知のリン酸カルシウム法(Graham, F. L. &
van der Eb, A. J. 1973, Virology, 52, 456-457)によ
ってNIH3T3細胞に導入し、４８時間後、変性ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法(Laemmli, U. K. et al. 1970
J. Mol. Biol. 49, 99-113)で全細胞抽出物を分離し、
抗Myc-tagモノクローナル抗体（米国SANTA CRUZ社製）
を用いたイムノブロッティング法(Harlow,E & Lane D.
1988, Antibodies. Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, USA)によって解析したところ、分子量約48000の位
置にSmad7とMyc-tagの融合蛋白質が合成されていること
を確認した(図２)。図２において、Mは分子量マーカ
ー：レーン１は動物細胞で合成されたSmad7とMyc-tagペ
プチドとの融合蛋白質である。

【００２８】〔実施例３〕 Smad7 RNAの合成実施例１においてSmad7 cDNAをクロン化したベクターで
あるpIBIΔは、このcDNAの上流にファージT7 RNAポリメ
ラーゼに対するプロモーター配列を有しており、下流に
はファージT3 RNAポリメラーゼに対するプロモーター配
列を有する(Furuno, N. et al. 1994, EMBO J. 13, 239
9-2410)。そこで、Smad7のセンス鎖RNAを得るため、Sma
d7 cDNAがpIBIΔにクロン化されたプラスミドである実
施例１に記載のpIBIΔ-mSmad7(図３)２μgを制限酵素Ba
mHIで３７℃、１時間処理し、直鎖化した後、T7 RNAポ
リメラーゼ（米国Ambion社製）により既知の方法で転写
反応をさせることによって(Melton, D. A. et al. 198
4, Nucl. Acid. Res. 12, 7035-7056)、ゲル電気泳動上
均一なRNAを合成した(図４)。また、上記cDNA ２μgを
制限酵素HindIIIで３７℃、１時間の処理により直鎖化
した後、T3 RNAポリメラーゼ（米国Ambion社製）により
転写反応をさせ、ゲル電気泳動上均一なアンチセンスRN
Aを合成した(図４)。図３において、f1 oriはf1ファー
ジのDNA複製開始領域：blaはベータラクタマーゼ遺伝子
(スルベニシリン耐性、アンピシリン耐性を与える)：or
iはpUCプラスミド由来のDNA複製開始領域：p T7はファ
ージT7のRNAポリメラーゼによって転写が開始されるプ
ロモーター配列：Smad7はSmad7 cDNA：p T3はファージT
3のRNAポリメラーゼによって転写が開始されるプロモー
ター配列：FspI, SspI, ScaI, HindIII, BamHI, EcoRI,
AatIは各々の制限酵素の切断位置である。図４におい
て、レーン１はSmad7 mRNA(センス鎖RNA)：レーン２はS
mad7 アンチセンスRNAである。

【００２９】〔実施例４〕 Smad7蛋白質の合成実施例３において得たSmad7センス鎖RNAのうち約１μg
をを³⁵S標識アミノ酸（英国Amersham社製）と共に公知
のウサギ網状赤血球由来の無細胞抽出液（米国Promega
社製）に添加して、翻訳反応を３０℃、１時間行わせる
ことにより、Smad7蛋白質を合成した。分子量マーカー
(英国Amersham社製)と共に、変性ポリアクリルアミド電
気泳動法によって分離した結果、合成されたSmad7は分
子量が約47000の均一な蛋白質であることが示された(図
５)。図５において、Mは分子量マーカー：レーン１はin
vitro合成されたSmad7蛋白質：レーン２はレーン１の
２倍量のSmad7 蛋白質：レーン３はレーン１の４倍量の
Smad7 蛋白質：矢じりはSmad7蛋白質の位置である。図
６に示したように、Smad7のアミノ酸配列は新規の物で
ありながら、既に知られているシグナル伝達因子である
Smad1と高い相同性を保持している領域を持つ。また、
この高い相同性を持つ領域は他のSmadファミリー蛋白質
に於いても良く保存されており、Smadの活性に必要な領
域であると予測される。従って、この領域を保持してい
るSmad7はシグナル伝達因子としての機能を保持してい
るものと考えられる。

【００３０】〔実施例５〕上記の方法で得た発現ベクタ
ーを用いて合成したSmad7蛋白質を抗原として用い、公
知の方法（Harlow, E. & Lane D., 1988, Antibodies.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA）によって
ウサギに対して免疫することによりSmad7蛋白質に特異
的な抗血清を得ることができる。さらにここで得た抗血
清を原料とし、Smad7蛋白質を媒体としたアフィニティ
精製を公知の方法（Harlow, E. & Lane D., 1988, Anti
bodies. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA）
によって行うことにより、Smad７蛋白質に対する特異性
の高い阻害抗体を得ることができる。この阻害抗体を反
応液中に添加することにより、Smad7の活性を検定する
ことができる。また、この阻害抗体を公知の方法で（Ca
pecchi, M., 1980, Cell 22, 479-488）生細胞内へ微小
注入することによって、細胞内でのシグナル因子として
の活性を確認することができる。さらに、前述の発現ベ
クターpactEF-mSmad7 DNA(図１)を直接に細胞へ注入し
て発現させることにより、産生物であるSmad7蛋白質の
活性を検定することができる。

【００３１】

【発明の効果】本発明に係る新規シグナル伝達因子及び
それをコードする遺伝子は医薬としてあるいは診断薬と
して有用である。

【００３２】

【配列表】

【００３３】配列番号：１配列の長さ：１２８１配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ハイポセティカル配列：アンチセンス：起源生物名：Mus musculus(ハツカネズミ) 系統名：Swiss-Webster/NIH 配列 ATGTTCAGGA CCAAACGATC TGCGCTCGTC CGGCGTCTCT GGAGGAGCCG TGCGCCCGGC 60 GGCGAGGACG AGGAGGAGGG CGTGGGGGGT GGCGGCGGAG GAGGCGAGCT GCGGGGAGAA 120 GGGGCGACGG ACGGCCGGGC TTATGGGGCT GGTGGCGGCG GTGCGGGCAG GGCTGGCTGC 180 TGCCTGGGCA AGGCAGTCCG AGGTGCCAAA GGTCACCACC ATCCCCATCC CCCAACCTCG 240 GGTGCCGGGG CGGCCGGGGG CGCCGAGGCG GATCTGAAGG CGCTCACGCA CTCGGTGCTC 300 AAGAAACTCA AGGAGCGGCA GCTGGAGCTG CTGCTTCAGG CCGTGGAGTC CCGCGGCGGT 360 ACGCGCACCG CGTGCCTCCT GCTGCCCGGC CGCCTGGACT GCAGGCTGGG CCCGGGGGCG 420 CCCGCCAGCG CGCAGCCCGC GCAGCCGCCC TCGTCCTACT CGCTCCCCCT CCTGCTGTGC 480 AAAGTGTTCA GGTGGCCGGA TCTCAGGCAT TCCTCGGAAG TCAAGAGGCT GTGTTGCTGT 540 GAATCTTACG GGAAGATCAA CCCCGAGCTG GTGTGCTGCA ACCCCCATCA CCTTAGTCGA 600 CTCTGTGAAC TAGAGTCTCC CCCTCCTCCT TACTCCAGAT ACCCAATGGA TTTTCTCAAA 660 CCAACTGCAG GCTGTCCAGA TGCTGTACCT TCCTCCGCGG AAACCGGGGG AACGAATTAT 720 CTGGCCCCTG GGGGGCTTTC AGATTCCCAA CTTCTTCTGG AGCCTGGGGA TCGGTCACAC 780 TGGTGCGTGG TGGCATACTG GGAGGAGAAG ACTCGCGTGG GGAGGCTCTA CTGTGTCCAA 840 GAGCCCTCCC TGGATATCTT CTATGATCTA CCTCAGGGGA ATGGCTTTTG CCTCGGACAG 900 CTCAATTCGG ACAACAAGAG TCAGCTGGTA CAGAAAGTGC GGAGCAAGAT CGGCTGTGGC 960 ATCCAGCTGA CGCGGGAAGT GGATGGCGTG TGGGTTTACA ACCGCAGCAG TTACCCCATC 1020 TTCATCAAGT CCGCCACACT GGACAACCCG GACTCCAGGA CGCTGTTGGT GCACAAAGTG 1080 TTCCCTGGTT TCTCCATCAA GGCTTTTGAC TATGAGAAAG CCTACAGCCT GCAGCGGCCC 1140 AATGACCACG AGTTCATGCA GCAACCATGG ACGGGTTTCA CCGTGCAGAT CAGCTTTGTG 1200 AAGGGCTGGG GCCAGTGCTA CACCCGCCAG TTCATCAGCA GCTGCCCGTG CTGGCTGGAG 1260 GTCATCTTCA ACAGCCGGTA G 1281

【００３４】配列番号：２配列の長さ：209 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA ハイポセティカル配列：アンチセンス：起源生物名：Mus musculus(ハツカネズミ) 系統名：Swiss-Webster/NIH 配列 CGGCGCCCGC GCGCGCCCCG GCCTCTGGGA GACTGGCGCA TGCCACGGAG CGCCCCTCGG 60 GCCGCCGCCG CTTCTGCCCG GGCCCCTGCT GTTGCTGCTG TCGCCTGCGC CTGCTGCCCC 120 AACTCGGCGC CCGACTTCTT CATGGTGTGC GGAGGTCATG TTCGCTCCTT AGCCGGCAAA 180 CGACTTTTCT CCTCGCCTCC TCGCCCCGC 209

【００３５】配列番号：３配列の長さ：207 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：アンチセンス：起源生物名：Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ（ハツカネズミ) 系統名：Swiss-Webster/NIH 配列 TCGGTCGTGT GGTGGGGAGA AGAGGACAGG GCGGATCGTG AGCCGAGCAG GCCCCCGTTC 60 AAACTACTTG CTGCTAACCT TTCCCGAGTG ATTGCTTTTC ATGCAAACTC TTTGGTTGGT 120 GTTGTTATTG CCATTCATTG TTGGTTTTGT TTTGTTCTGT TCTGGTTTGT TTTTTTTTTT 180 TTTTTCCTCC TCCTTTCTCG TTAAAAA 207

【００３６】配列番号：４配列の長さ：426 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質ハイポセティカル配列：アンチセンス：起源生物名：Mus musculus(ハツカネズミ) 系統名：Swiss-Webster/NIH 配列 Met Phe Arg Thr Lys Arg Ser Ala Leu Val Arg Arg Leu Trp Arg Ser 5 10 15 Arg Ala Pro Gly Gly Glu Asp Glu Glu Glu Gly Val Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Glu Leu Arg Gly Glu Gly Ala Thr Asp Gly Arg Ala Tyr 35 40 45 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Ala Gly Cys Cys Leu Gly Lys 50 55 60 Ala Val Arg Gly Ala Lys Gly His His His Pro His Pro Pro Thr Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Glu Ala Asp Leu Lys Ala Leu Thr 85 90 95 His Ser Val Leu Lys Lys Leu Lys Glu Arg Gln Leu Glu Leu Leu Leu 100 105 110 Gln Ala Val Glu Ser Arg Gly Gly Thr Arg Thr Ala Cys Leu Leu Leu 115 120 125 Pro Gly Arg Leu Asp Cys Arg Leu Gly Pro Gly Ala Pro Ala Ser Ala 130 135 140 Gln Pro Ala Gln Pro Pro Ser Ser Tyr Ser Leu Pro Leu Leu Leu Cys 145 150 155 160 Lys Val Phe Arg Trp Pro Asp Leu Arg His Ser Ser Glu Val Lys Arg 165 170 175 Leu Cys Cys Cys Glu Ser Tyr Gly Lys Ile Asn Pro Glu Leu Val Cys 180 185 190 Cys Asn Pro His His Leu Ser Arg Leu Cys Glu Leu Glu Ser Pro Pro 195 200 205 Pro Pro Tyr Ser Arg Tyr Pro Met Asp Phe Leu Lys Pro Thr Ala Gly 210 215 220 Cys Pro Asp Ala Val Pro Ser Ser Ala Glu Thr Gly Gly Thr Asn Tyr 225 230 235 240 Leu Ala Pro Gly Gly Leu Ser Asp Ser Gln Leu Leu Leu Glu Pro Gly 245 250 255 Asp Arg Ser His Trp Cys Val Val Ala Tyr Trp Glu Glu Lys Thr Arg 260 265 270 Val Gly Arg Leu Tyr Cys Val Gln Glu Pro Ser Leu Asp Ile Phe Tyr 275 280 285 Asp Leu Pro Gln Gly Asn Gly Phe Cys Leu Gly Gln Leu Asn Ser Asp 290 295 300 Asn Lys Ser Gln Leu Val Gln Lys Val Arg Ser Lys Ile Gly Cys Gly 305 310 315 320 Ile Gln Leu Thr Arg Glu Val Asp Gly Val Trp Val Tyr Asn Arg Ser 325 330 335 Ser Tyr Pro Ile Phe Ile Lys Ser Ala Thr Leu Asp Asn Pro Asp Ser 340 345 350 Arg Thr Leu Leu Val His Lys Val Phe Pro Gly Phe Ser Ile Lys Ala 355 360 365 Phe Asp Tyr Glu Lys Ala Tyr Ser Leu Gln Arg Pro Asn Asp His Glu 370 375 380 Phe Met Gln Gln Pro Trp Thr Gly Phe Thr Val Gln Ile Ser Phe Val 385 390 395 400 Lys Gly Trp Gly Gln Cys Tyr Thr Arg Gln Phe Ile Ser Ser Cys Pro 405 410 415 Cys Trp Leu Glu Val Ile Phe Asn Ser Arg 420 425

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｓｍａｄ７を動物細胞で発現させるための発
現ベクターpactEF-Smad7のマップを示す図である。

【図２】 Smad7とMyc-tagペプチドとの融合蛋白質の変
性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す写真である。

【図３】 Smad7をクロン化したプラスミドベクターpIB
IΔ-mSmad7のマップを示す図である。

【図４】 Smad7のmRNA(センス鎖RNA)およびアンチセン
スRNAのアガロース電気泳動を示す写真である。

【図５】 in vitro合成されたSmad7蛋白質の変性ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を示す写真である。

【図６】 Smad7とSmad1の配列比較表である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【書類名】受託番号変更届

【提出日】平成１０年４月２２日

【旧寄託機関の名称】通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【旧受託番号】ＦＥＲＭＰ−１６１８７

【新寄託機関の名称】通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【新受託番号】ＦＥＲＭＢＰ−６３１６

【書類名】受託番号変更届

【旧受託番号】ＦＥＲＭＰ−１６１８８

【新受託番号】ＦＥＲＭＢＰ−６３１７

【書類名】受託番号変更届

【旧受託番号】ＦＥＲＭＰ−１６１８６

【新受託番号】ＦＥＲＭＢＰ−６３１５

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配
列を含んでなる、シグナル伝達活性を有する蛋白質、ま
たは該アミノ酸配列に１または複数個のアミノ酸残基の
欠失、置換、または挿入を施すことにより得られる、シ
グナル伝達活性を保持している該蛋白質の変異体。
【請求項２】配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配
列をコードしている核酸。
【請求項３】配列表の配列番号１に記載のDNA配列を
含んでなる、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】請求項２に記載の核酸を含有する発現ベ
クター。
【請求項５】請求項４に記載の発現ベクターを含有す
る形質転換体。
【請求項６】配列表の配列番号２に記載のDNA配列を
含んでなるDNA。
【請求項７】配列表の配列番号３に記載のDNA配列を
含んでなるDNA。