JPH10295386A

JPH10295386A - 新規ａｒｏＥ

Info

Publication number: JPH10295386A
Application number: JP10009351A
Authority: JP
Inventors: Martin Karl R Burnham; マーティン・カール・ラッセル・バーナム
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-01-21
Publication date: 1998-11-10
Also published as: EP0854188A2; EP0854188A3; CA2220850A1

Abstract

(57)【要約】【課題】化合物を抗生物質活性についてスクリーニン
グするために用いることができ、感染、機能障害および
疾患の発生病理にてその役割を決定するのに用いること
もできる因子の解明が望まれている。【解決手段】本発明は、上記課題を解決するのに用い
ることができる、（ａ）配列番号２のアミノ酸１ないし
２５７からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌ
クレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して
相補性のポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または
（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも連続した１５塩
基からなるポリヌクレオチドからなる群より選択される
ポリヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチドを
提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規に同定された
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、その製造および
使用、ならびにその変種、アゴニストおよびアンタゴニ
スト、ならびにその使用に関するものである。特に、こ
れらのおよびその他の点に関して、本発明は、芳香族ア
ミノ酸生合成ファミリー（以下、「aroＥ」という）の
新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】ストレプトコッカス属（Streptococci）
は医学的に重要な微生物属を形成しており、ヒトに例え
ば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、
膿胸および心内膜炎、特に例えば脳脊髄液の感染のごと
き髄膜炎を包含する、いくつかの型の疾患を引き起こす
ことが知られている。ストレプトコッカス属の単離から
１００年以上も経過しているため、ストレプトコッカス
・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）は、より
詳細な研究が為された微生物の一つである。例えば、事
実、ＤＮＡが遺伝物質であるという初期の見解の大部分
は、この微生物を用いたGriffithならびに、Avery、Mac
leodおよびMcCartyの研究にて断言された。ストレプト
コッカス・ニューモニエ（S.pneumoniae）に関する研究
は膨大であるにも関わらず、この微生物の毒性に関して
は多くの疑問が残されている。抗生物質の開発のための
標的としてストレプトコッカス属の遺伝子および遺伝子
産物を用いるのはとりわけ好ましいことである。Henner
はバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）のhisＨ、
tyrＡおよびaroＥ遺伝子の構成およびヌクレオチド配列
を開示した。Henner,DJ、Band L、Flaggs G、Chen E、G
ene 49：147−152（1986）。

【０００３】化合物を抗生物質活性についてスクリーニ
ングするために用いることができるファクターが必要と
されているのは明らかであり、そのファクターは感染、
機能障害および疾患の発生病理におけるその役割を決定
するのに用いることもできる。感染、機能不全または疾
病の予防、改善または治癒に役割を果たし得るかかる因
子ならびにそのアンタゴニストおよびアゴニストを同定
および特徴づけする必要もある。本発明のポリペプチド
は、既知エシェリキア・コリ（Escherichia coli）シキ
メート５−デヒドロゲナーゼタンパク質に対するアミノ
酸配列相同性を有する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の一つの目的
は、図2に示されるアミノ酸配列と、既知のエシェリキ
ア・コリ・シキメート５−デヒドロゲナーゼタンパク質
のごときその他のタンパク質の既知アミノ酸配列（複数
でも可）の間の相同性により、新規aroＥポリペプチド
として同定されたポリペプチドを提供することである。
本発明のさらなる目的は、aroＥポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、特に本明細書においてaroＥと
称されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明のこの態様のとり
わけ好ましい具体例では、該ポリヌクレオチドは、図１
（配列番号１）に示される配列を有してなるaroＥポリ
ペプチドをコードする領域、またはその変種を有してな
る。本発明の別の特に好ましい具体例には、図２（配列
番号２）のアミノ酸配列を有してなるストレプトコッカ
ス・ニューモニエに由来する新規aroＥタンパク質また
はその変種がある。本発明の別の態様によれば、ＮＣＩ
ＭＢ受託番号４０７９４に含まれるストレプトコッカス
・ニューモニエ０１００９９３株により発現可能な成熟
ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供される。
本発明のさらなる態様では、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡを含め、aroＥ、特にストレプトコッカス・ニ
ューモニエaroＥをコードする単離核酸分子が提供され
る。本発明のこの態様のさらなる具体例は、生物学的、
診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用なその変
種、およびそのものを含んでなる組成物を包含する。

【０００６】本発明の別の態様によれば、治療または予
防目的で、特に遺伝的免疫化における本発明のポリヌク
レオチドの使用を提供する。本発明のこの態様の特に好
ましい具体例には、aroＥの天然の対立遺伝子変種およ
びそれによりコードされるポリペプチドがある。本発明
のこの態様によれば、本明細書でaroＥと称するストレ
プトコッカス・ニューモニエの新規ポリペプチド、なら
びに生物学的、診断学的、予防的、臨床的または治療的
に有用なその変種、およびそのものを含んでなる組成物
が提供される。本発明のこの態様のとりわけ好ましい具
体例には、aroＥ遺伝子の天然の対立遺伝子によりコー
ドされるaroＥポリペプチドの変種がある。本発明のこ
の態様の好ましい具体例において、前記のaroＥポリペ
プチドの製造方法が提供される。

【０００７】本発明のさらに別の態様によれば、例え
ば、抗体を含め、抗菌剤として有用な、かかるポリペプ
チドに対する阻害剤が提供される。本発明のこの態様の
ある好ましい具体例によれば、（ｉ）aroＥ発現を評価
し、（ｉｉ）疾病、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌
血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、特に例
えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎を治療し、（ｉｉ
ｉ）遺伝的変異を評価し、（ｉｖ）生物にaroＥポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドを投与して細菌、特にス
トレプトコッカス・ニューモニエ細菌に対する免疫応答
を生じさせるための物質、組成物および方法が提供され
る。本発明のこのおよび他の態様のある好ましい具体例
によれば、aroＥポリヌクレオチド配列に、特にストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリ
ヌクレオチドが提供される。本発明のこの態様のある好
ましい具体例では、aroＥポリペプチドに対する抗体が
提供される。

【０００８】本発明のさらに別の態様によれば、aroＥ
アゴニストおよびアンタゴニストが提供され、好ましく
は各々が静細菌性または殺細菌性である。本発明のさら
なる態様では、aroＥポリヌクレオチドまたはaroＥポリ
ペプチドを含んでなる、単細胞または多細胞生物に投与
するための組成物が提供される。開示した本発明の精神
および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記載
および本明細書のその他の部分を読むことにより、当業
者に容易に明らかとなろう。

【０００９】

【発明の実施の形態】

定義本明細書中で頻繁に使用されるある種の用語をその理解
を容易にするために以下に定義する。「宿主細胞」は外
来性ポリヌクレオチド配列によって形質転換またはトラ
ンスフェクションされた、あるいは形質転換またはトラ
ンスフェクションされることのできる細胞である。「同
一性」は、当該分野で公知であり、配列の比較で測定さ
れるような、２またはそれ以上のポリペプチド配列ある
いは２またはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関
係である。また、当該分野では、「同一性」は、場合に
よっては、配列の鎖間の対合によって測定されるよう
な、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列
の関連性の度合を意味する。「同一性」または「類似
性」は公知の方法（COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOG
Y，Lesk，A.M.編，Oxford University Press，New Yor
k，1988；BIOCOMPUTING：INFORMATICS AND GENOME PROJ
ECTS，Smith,D.W.編，Academic Press，New York，199
3；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PＡＲT I，G
riffin, A.M.およびGriffin, H.G.編，Humana Press，N
ew Jersey，1994；SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BI
OLOGY，Von Heinje,G．Academic Press，1987；およびS
EQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribskov,M.およびDevereu
x,J.編，M Stockton Press，New York，1991）により容
易に算出することができる。２つの配列間の同一性およ
び類似性を測定する多くの方法があるが、両方の用語と
も、当業者によく知られている（Sequence Analysis in
MolecularBiology，von Heinge,G.，Academic Press，
1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov,M.およびD
evereux,J.、M.StocktonPress編、New York、1991；お
よびCarillo,H.およびLipman,D.、SIAM J.Applied Mat
h.,48：1073（1988）。配列間の同一性または類似性を
測定するのに通常用いられる方法は、限定されるもので
はないが、Carllio,HおよびLipman,D.、SIAM J.Applied
Math.,48:1073(1988)に記載されている方法が挙げられ
る。同一性を測定する好ましい方法は、テストする配列
間に最大の対合を与えるように設計されている。同一性
および類似性を測定する方法は公に入手できるコンピュ
ータ・プログラムに組み込まれている。２つの配列の間
の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュータ
・プログラム方法には、限定するものではないが、例え
ば、ＧＣＳプログラムパッケージ（Devereux,J.ら，Nuc
leic Acids Research（1984）12（1）：387）、ＢＬＡ
ＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Atschul,S.
F.ら, J.Molec.Biol.（1990）215：403-410）が包含さ
れる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の
源（ＢＬＡＳＴ Manual，Altshul,S．ら，ＮＣＢＩＮ
ＬＭＮＩＨ Bethesda，MD20894；Altschul,S．ら，
J．Mol．Biol.，215：403-410(1990)）から公に入手で
きる。

【００１０】「単離された」とは、「ヒトの手によ
り」、その天然の状態から変えられること、すなわち、
天然物の場合、その本来的な環境から変化または除去あ
るいは両方されたことを意味する。例えば、生体に天然
に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離された」ものではないが、その天然状態で共存する物
質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドは、本明細書で用いる用語としての「単離された」
ものである。

【００１１】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボ
ヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾ＲＮＡ
またはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであっ
てもよい。「ポリヌクレオチド」は、単鎖および二本鎖
ＤＮＡ、単鎖および二本鎖領域または単鎖、二本鎖およ
び三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二本鎖
ＲＮＡ、単鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、
および単鎖またはより典型的には二本鎖または三本鎖領
域または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよ
いＤＮＡおよびＲＮＡを含有してなるハイブリッド分子
を包含するが、これに限定されない。加えて、本明細書
にて用いる「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮ
Ａ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる三本鎖
領域をいう。これらの領域の鎖は同じ分子からのもので
も、異なる分子からのものでもよい。該領域は、これら
分子の一またはそれ以上の全てを含んでもよいが、より
典型的には、分子の幾つかの領域のみを含む。三本螺旋
領域の分子の一つは、しばしば、オリゴヌクレオチドで
ある。本明細書にて用いる場合、ポリヌクレオチド（複
数でも可）なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾され
た塩基を含有する上記ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
すなわち、安定性または他の理由で修飾された骨格を有
するＤＮＡまたはＲＮＡも該用語が本明細書で意図する
ところのポリヌクレオチド（複数でも可）である。さら
に、イノシンなどの通常でない塩基、またはトリチル化
された塩基などの修飾塩基を有してなるＤＮＡまたはＲ
ＮＡ（２つの例だけを示す）も、その用語を本明細書で
用いる場合のポリヌクレオチドである。多種の修飾がＤ
ＮＡおよびＲＮＡになされており、当業者に公知のよう
に多くの有用な目的に使用されている。本明細書で用い
る「ポリヌクレオチド」なる語は、ポリヌクレオチドの
このような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形
態、ならびにウイルスおよび、例えば、単純型細胞およ
び複雑型細胞などの細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡ
の化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド（複数で
も可）」はしばしばオリゴヌクレオチド（複数でも可）
と称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。

【００１２】「ポリペプチド（複数でも可）」は、ペプ
チド結合または修飾ペプチド結合で互いに結合した２つ
またはそれ以上のアミノ酸を含有してなるいずれのペプ
チドまたはタンパク質をもいう。「ポリペプチド（複数
でも可）」は、通常、ペプチド、オリゴペプチドまたは
オリゴマーと称される短い鎖、および一般にタンパク質
と称される長い鎖の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝
子コードされている２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を
含有してもよい。「ポリペプチド（複数でも可）」は、
プロセッシングおよび他の翻訳後の修飾のごとき自然の
工程、または当該分野において周知の化学修飾技法のい
ずれかによって修飾されたものを包含する。かかる修飾
は、基本テキストにて、およびより詳細な研究論文に
て、ならびに膨大な研究文献にて詳しく記載されてお
り、それらは当業者に周知である。同じ型の修飾が、所
定のポリペプチド中、いくつかの部位で、同じまたは異
なる程度にて存在してもよいことは明らかであろう。ま
た、所定のペプチドは多くの型の修飾を有していてもよ
い。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまた
はカルボキシル末端を含め、ポリペプチドのどこででも
起こりうる。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−
リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分
の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の
共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチ
ジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスル
フィド結合形成、脱メチル化、共有交差結合の形成、シ
ステインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル
化、ガンマーカルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカ
ー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリス
トイル化、酸化、蛋白分解的プロセッシング、リン酸
化、プレニル化、ラセミ化、糖鎖形成、リピド付加、硫
酸化、グルタミン酸残基のガンマーカルボキシル化、ヒ
ドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノイル
化、硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白
質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化を包含する。
例えば、PROTEINS−STRUCTURE AND MOLECULＡＲ PROPER
TIES, 第２版，Ｔ.Ｅ.Ｃreighton，Ｗ.Ｈ.Ｆreeman and
Ｃompany，New York（1993）およびＷold,Ｆ.，POSTTR
ANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，Pos
ttranslationalProtein Modifications：Perspectives
and Prospects,pgs.1-12，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，New York（1983）；Se
ifterら,Meth Enzymol.（1990）182：626-646、およびR
attanら,“Protein Synthesis：Posttranslational Mod
ifications and Aging”，Ann N.Y. Acad Sci（1992）6
63：48-62を参照のこと。ポリペプチドは、分枝しても
よく、分枝と共にまたはなしで環状であってもよい。環
状、分枝化および分枝化環状ポリペプチドは、翻訳後の
天然の工程の結果であり、同様に全く合成的な方法で合
成できる。

【００１３】本明細書中で使用される「変種」なる語
は、各々、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドと異なるが、本質的な特性を保持しているポリヌク
レオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチド
の典型的な変種は、別の対照標準のポリヌクレオチドと
ヌクレオチド配列において異なっている。変種のヌクレ
オチド配列における変化は、対照標準のポリヌクレオチ
ドによってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列と
変わっていてもよいし、または変わっていなくてもよ
い。ヌクレオチドの変化は、後記するように、対照標準
の配列によってコードされたポリペプチドにおいて、ア
ミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をもたらしう
る。ポリペプチドの典型的な変種は、別の対照標準のポ
リペプチドとはアミノ酸配列において異なっている。一
般に、差異は、対照標準のポリペプチドとその変種の配
列が全体的に非常に類似しており、多くの領域において
は同一であるように限定される。変種および対照標準の
ポリペプチドは、一またはそれ以上の置換、付加、欠失
のいずれかの組み合わせによって、アミノ酸配列におい
て異なってもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基
は、遺伝コードによってコードされたものであってもな
くてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変
種は、対立遺伝子変種のような天然に存在するものであ
ってもよく、または天然に存在することが知られていな
い変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの天然に存在しない変種は、変異誘発法または直
接合成あるいは当業者に公知の他の組換え法によって作
られてもよい。

【００１４】本発明は、以下により詳細に記載されるよ
うな新規aroＥポリペプチドおよびポリヌクレオチドに
関する。特に、本発明は、既知のエシェリキア・コリシ
キメート５−デヒドロゲナーゼポリペプチドに対するア
ミノ酸相同性により関連付けられる、ストレプトコッカ
ス・ニューモニエの新規aroＥ遺伝子のポリペプチドお
よびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、各
々、図１および図２に示されるヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列を有するaroＥに、およびＮＣＩＭＢ受託番号
４０７９４中のＤＮＡのaroＥヌクレオチド配列および
それによりコードされるアミノ酸配列に関する。

【００１５】特に、実験室条件および宿主感染条件下で
の生存性に適用すると、その技法は細菌における一時的
な遺伝子発現を評価するのに利用できる。それ自体生存
に必須であるかまたは感染の確立および／もしくは維持
に必須である遺伝子を同定するために、多くの方法を用
いることができる。これらの方法の一つにより配列の発
現を同定するで、その機能についてのさらなる情報が得
られ、かかる配列をスクリーニングの標的としてさらに
開発するための選別が可能となる。簡単には、これらの
研究は例えば：

【００１６】１）シグナチャータグ化突然変異法（Sign
ature Tagged Mutagenesis：STM）この技法は、Henselら、Science 269：400−403（199
5）に記載されており、その内容を出典明示により本明
細書の一部とする。シグナチャータグ化突然変異誘発
は、所定感染モデルにおける感染の確立／維持に必要な
遺伝子を同定するものである。この技法は、種々の手段
（例えば、トランスポゾン）により、標的生物にランダ
ムに変異を誘発し、独特なＤＮＡ配列タグを変異部位に
非常に近接して挿入することに基づく。細菌性変異体お
よび感染宿主から回収した細菌の混合集団からのタグ
は、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーション
分析により検出される。毒性を減じた変異体は、感染宿
主から回収した細菌のプールのタグの欠如により表され
る。ストレプトコッカス・ニューモニエにおいては、ト
ランスポゾンシステムはあまり開発されていないので、
タグ化変異体を作るためのより有効な方法は、その内容
を出典明示により本明細書の一部とする、Morrisonら、
J.Bacteriol.159：870（1984）に記載される挿入−複製
変異法を用いる。

【００１７】２）インビボ発現法（In Vivo Expression
Technology：IVET）この技術はCamilliら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA．9
1：2634−2638（1994）およびMahanら、Infectious Age
nts and Diseases 2：263−268（1994）に記載されてお
り、各々の内容を出典明示により本明細書の一部とす
る。IVETは、実験培養と比較した場合、感染において重
要な役割を有する、感染中にアップレギュレーションす
る遺伝子を同定する。この技法により同定される配列は
感染の確立／維持に重要な役割を有する。この技法で
は、標的生物のランダムな染色体フラグメントは、プラ
スミドベクターのプロモーター不含リポーター遺伝子の
上流でクローン化される。プールを宿主に導入し、感染
後の種々の時間に細菌を回収し、リポーター遺伝子発現
の存在を評価できる。発現したリポーター遺伝子の上流
に担持される染色体フラグメントは、感染中に正常なア
ップレギュレーションをうけるプロモーターまたは遺伝
子部分を担持するはずである。リポーター遺伝子の上流
を配列決定すると、アップレギュレーションされた遺伝
子を同定できる。

【００１８】３）特徴ディスプレイこの技法は、その内容を出典明示により本明細書の一部
とする、Chuangら、J.Bacteriol.175：2026−2036（199
3）に記載されている。この方法はランダムプライムＲ
Ｔ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの存在を同定することによ
り、生体に発現する遺伝子を同定するものである。感染
前および感染後のプロフィールを比較することにより、
感染中にアップレギュレーションおよびダウンレギュレ
ーションされる遺伝子を同定でき、ＲＴ−ＰＣＲ生成物
が配列決定され、ライブラリー配列に適合させられる。

【００１９】４）トランスポゾン突然変異誘発による条
件致死変異体の発生この技法は、de Lorenzo，V.ら、Gene 123：17−24（19
93）；Neuwald,A.F.ら、Gene 125：69−73（1993）およ
びTakiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174：1544−1553（199
2）に記載されており(その内容を出典明示により本明細
書の一部とする）、発現が細胞の生存性に必須である遺
伝子を同定するものである。この技法では、一方向また
は両方向でトランスポゾンから外側へ転写する、調節可
能なプロモーターを担持するトランスポゾンを生じる。
これらのトランスポゾンを標的生物にランダムに挿入
し、続いてプロモーター活性のインデューサーの存在下
で挿入突然変異体を単離すると、発現が細胞の生存に必
須である遺伝子のコーディング領域とプロモーターとを
分離するインサートが回収されることが確認される。こ
のインサートは生存できないので、引き続いてインデュ
ーサー不含のレプリカ平板法でかかるインサートを同定
する。トランスポゾンに隣接する領域の配列決定により
挿入部位を同定し、分断された遺伝子を同定する。イン
デューサー不存在下での成長中の細胞の過程／形態の変
化を正確にモニターし、遺伝子の機能に関する情報を得
る。このようなモニター観察には、フローサイトメトリ
ー（細胞分割、溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製）、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの
放射性化学的標識前駆体の取り込み、既知の細胞性スト
レスに反応するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター
等がある。

【００２０】５）化学的突然変異法による条件致死突然
変異体の発生この技法は、出典明示により本明細書の一部とする、Be
ckwith,J.Methods inEnzymology 204：3−18（1991）に
記載されている。この技法では標的生物のランダム化学
的突然変異を誘発し、生理学的温度（許容温度）とは異
なる温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法を行い、異
なる温度（例えばｔｓ同定のためには４２℃、ｃｓ同定
のためには２５℃）で成長させ、その時成長できなかっ
た単離物（条件付き突然変異体）を同定する。前記のよ
うに、非許容温度での増殖における変化を正確にモニタ
ーし、変異遺伝子の機能に関する情報を得る。標的生物
からのライブラリーにより条件致死突然変異を相補し、
および相補遺伝子を配列決定することにより、ライブラ
リー配列と適合させることができる。これらの技法の各
々は、個々の適用に応じて有利であったり、不利であっ
たりする。当業者は意図する特定の使用目的に最も関連
する方法を選択するであろう。例えば、いくつかの遺伝
子は感染に必須であると認識されているが、実際には感
染の開始にのみ必要であり、そのためそれらの産物は、
確立された慢性の感染を治療するために開発された抗菌
物質にとってはそれほど魅力的な標的ではない。

【００２１】６）ＲＴ−ＰＣＲ細菌性メッセンジャーＲＮＡ、好ましくはストレプトコ
ッカス・ニューモニエのものを、細菌感染した組織、例
えば４８時間ネズミ・肺感染の組織から単離し、ランダ
ムヘキサヌクレオチドでプライムしたＲＮＡサンプルを
逆転写し、続いて遺伝子特異的プライマー対を用いるＰ
ＣＲにより、ｍＲＮＡ種の各々の量を評価する。得られ
たＰＣＲ生成物の定量化により特定のｍＲＮＡ種の存在
および量を決定し、感染した組織に転写された細菌遺伝
子に関する情報を得る。遺伝子転写の分析は、感染の種
々の時間で実施でき、細菌による発病における遺伝子制
御に関する詳細な知識を得ることができ、遺伝子産物が
新規な抗菌物質をスクリーニングする標的に相当するこ
とが明快に理解できるようになる。用いたＰＣＲプライ
マーの遺伝子特異性のために、細菌性ｍＲＮＡ調製物は
遊離の哺乳動物ＲＮＡである必要はないことが理解され
るべきである。これにより研究者は、感染組織から簡単
かつ迅速なＲＮＡ調製を行うことができ、細菌中で非常
に短時間しか生育できない（半減期２分程度）細菌性ｍ
ＲＮＡ種を得ることができる。最適には、非常に短時間
のTRIsole（ギブコ−ＢＲＬ）の存在下、機械的に破壊
することにより、細菌性ｍＲＮＡを感染ネズミ肺組織か
ら調製し、続いてTRIzole試薬の製造者の指示に従って
プロセッシングし、DNAase処理して夾雑ＤＮＡを除去す
る。好ましくは、適宜標識した配列特異的オリゴヌクレ
オチドプローブを用いてノーザンをプロービングするこ
とにより検出されるような細菌性１６SリボソームＲＮ
Ａ、好ましくはストレプトコッカス・ニューモニエの１
６ＳリボソームＲＮＡの最大量を得る条件を見出すこと
によりプロセッシングが最適化される。典型的には、
５’色素標識化プライマーを、最適には８から２５サイ
クルで終了するＰＣＲ反応における各ＰＣＲプライマー
対に用いる。ＰＣＲ生成物は６％ポリアクリルアミドゲ
ルで分離し、GeneScanner（ＡＢＩ製）を用いて検出お
よび定量する。これら技法を本発明の配列に適用して用
いると、感染の間に発現する細菌性タンパク質の同定が
可能であり、その阻害剤は抗菌療法にて有用性を有する
であろう。

【００２２】寄託材料ストレプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３株を
含む寄託株を、１９９６年４月１１日に、スコットラン
ド、ＡＢ２１ＲＹ、アバディーン、マチャードライブ
２３Ｓt.のナショナル・コレクション・オブ・インダス
トリアル・アンド・マリーン・バクテリア・リミテッド
（本明細書にて「ＮＣＩＭＢ」という）に、ＮＣＩＭＢ
受託番号４０７９４の下で寄託した。そのストレプトコ
ッカス・ニューモニエ寄託株を、本明細書中、本明細書
では「寄託株」または「寄託株のＤＮＡ」と称する。

【００２３】寄託材料は完全長aroＥＤＮＡを含有する
株であり、寄託後は、「ＮＣＩＭＢ４０７９４」と称さ
れる。る。寄託材料に含まれるポリヌクレオチドの配列
ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列は、本明細書における配列の記載とのいずれの不
一致も調節するものである。寄託は、特許手続き上の微
生物寄託の国際承認に関するブタペスト条約の条件下で
行われている。特許が発行されると何ら制限または条件
もなく、最終的に株は分譲される。寄託株は当業者の便
宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条の下
に要求されるような、寄託が実施可能要件であることを
承認するものではない。寄託材料を製造、使用または販
売するには、ライセンスが必要であるが、そのようなラ
イセンスはここで付与されるものではない。

【００２４】ポリペプチド本発明のポリペプチドは、図２（配列番号２）のポリペ
プチド（とりわけ成熟ポリペプチド）ならびに、特に、
aroＥの生物活性を有し、図２（配列番号２）のポリペ
プチドまたはその該当部分と少なくとも７０％の同一
性、好ましくは図２（配列番号２）のポリペプチドに対
して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは図２
（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも９０
％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一
性）、さらにより好ましくは図２（配列番号２）のポリ
ペプチドに対して少なくとも９５％の類似性（さらによ
り好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリ
ペプチドおよびフラグメントを包含し、さらに、一般
に、少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは、少
なくとも５０個のアミノ酸を含むポリペプチドの部分を
有するかかるポリペプチドの部分も包含する。

【００２５】本発明のポリペプチドのフラグメントであ
る変種をペプチド合成により対応する完全長ポリペプチ
ドを調製するために用いることができる；したがって、
これらの変種を完全長ポリペプチドを製造するための中
間体として用いてもよい。本発明のポリペプチドのフラ
グメントである変種を用いて本発明の完全長ポリヌクレ
オチドを合成してもよい。フラグメントは、その全体
が、上記したポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではな
いが、一部と同じであるアミノ酸配列を有する変種ポリ
ペプチドである。aroＥポリペプチドと同様、フラグメ
ントは「自立している」であるか、またはそれらが一の
部分または領域、最も好ましくは単一の連続した領域、
単一のより大きなポリペプチドを形成するより大きなポ
リペプチドの中に含まれていてもよい。

【００２６】好ましいフラグメントは、例えば、アミノ
末端を含む連続した一連の残基またはカルボキシル末端
を含む連続した一連の残基の欠失あるいはアミノ末端を
含む残基とカルボキシル末端を含む残基の２つの連続し
た一連の残基の欠失を除く、図２［配列番号２］のアミ
ノ酸配列またはその変種の一部を有する切断ポリペプチ
ドを包含する。宿主細胞、特に、ストレプトコッカス・
ニューモニエ中の本発明のポリペプチドの分解型も好ま
しい。アルファヘリックスおよびアルファヘリックス形
成領域、ベータシートおよびベータシート形成領域、タ
ーンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領
域、親水領域、疎水領域、アルファ両親媒性領域、ベー
タ両親媒性領域、可変領域、界面形成領域、基質結合領
域、および高抗原指数領域を含んでなるフラグメントの
ような、構造的または機能的属性によって特徴づけられ
るフラグメントもまた好ましいフラグメントである。類
似活性または改良活性を有するもの、または望ましくな
い活性が減少したフラグメントを含め、aroＥの活性を
媒介するフラグメントである生物学的に活性なフラグメ
ントも好ましいフラグメントである。さらに、動物、特
にヒトにおいて抗原性または免疫原性であるフラグメン
トも含まれる。

【００２７】ポリヌクレオチド本発明のもう一つの態様
は、図２［配列番号２］の推定アミノ酸配列を有するAr
oＥポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、
それに密接に関連するポリヌクレオチドおよびそれらの
変種に関する。図１［配列番号１］に示すポリヌクレオ
チド配列のような本明細書の情報を使用し、出発材料と
してストレプトコッカス・ニューモニエ０１００９９３
細胞からの染色体ＤＮＡフラグメントをクローニング
し、配列決定し、つづいて完全長クローンを得る標準的
クローニングおよびスクリーニングを使用して、aroＥ
ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを
得ることができる。例えば、図１［配列番号１］に示す
配列のような本発明のポリヌクレオチド配列を得るに
は、典型的には、エシェリキア・コリまたは他の適当な
宿主中のストレプトコッカス・ニューモニエ０１００９
９３の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを、部分
配列から由来する放射標識したオリゴヌクレオチド、好
ましくは１７倍量以上の長さのオリゴヌクレオチドでプ
ローブする。ついで、該プローブと同じＤＮＡを有する
クローンをストリンジェントな条件を使用して区別でき
る。該オリジナル配列から設計された配列決定プライマ
ーで同定された個々のクローンを配列決定することによ
り、該配列を両方の方向に伸長し、完全長を決定するこ
とが可能である。都合よくは、プラスミド・クローンか
ら調製された変性二本鎖ＤＮＡを用いてかかる配列決定
を行う。適当な技法は、Maniatis,T.，Fritsch,E.F.お
よびSambrookら、MOLECULＡＲ CLONING：A LABORATORY
MANUAL，2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Hａｒbor, New York（1989）（ハイブ
リダイゼーションによるスクリーニング１.９０および
変性二本鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定１３.７０を参照のこ
と）により記載されている。例えば、図１［配列番号
１］に示すポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス・
ニューモニエ０１００９３３から由来するＤＮＡライブ
ラリー中で見いだしたものである。

【００２８】こうして得られたＤＮＡ配列を図１［配列
番号１］に示す。それは、図２［配列番号２］に示す概
数のアミノ酸残基を有し、当該分野にて周知のアミノ酸
残基の分子量から計算できる推定分子量を有するタンパ
ク質をコードするオープンリーディングフレームを有す
る。本発明のaroＥは、構造的に、寄託株のaroＥをコ
ードするＤＮＡを配列決定した結果として判明した、芳
香族アミノ酸生合成ファミリーの他のタンパク質に関連
付けられる。そのタンパク質は、公知タンパク質の中で
も、エシェリキア・コリ・シキメート５−デヒドロゲナ
ーゼタンパク質に対して最も大きな相同性を示す。図２
［配列番号２］の新規aroＥは、エシェリキア・コリの
シキメート５−デヒドロゲナーゼ（Ｄ９０８１１）とそ
の全長にわたってアミノ酸レベルで有意に類似性または
同一性を有する。

【００２９】本発明の配列はまた、図１［配列番号１］
のコード配列と、その全長に亙って同一である。また、
本発明は、成熟ポリペプチドまたはそのフラグメント用
のコード配列自体ならびにリーダーまたは分泌配列、プ
レ、プロまたはプレプロタンパク質配列をコードするコ
ード配列のような他のコード配列を有するリーディング
・フレーム中の成熟ポリペプチドまたはフラグメントの
コード配列を提供する。ポリヌクレオチドはまた、例え
ば、転写配列、非翻訳配列、終止シグナル、リボソーム
結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配列、イントロン、ポ
リアデニル化シグナルおよび別のアミノ酸をコードする
付加コード配列のような非コード５’および３’配列を
含む、非コード配列を含むが、これに限定するものでは
ない。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するマー
カー配列をコードすることができる。本発明のある種の
具体例において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qi
agen,Inc.）において提供され、Gentzら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA（1989）86：821-824に記載されるような、
ヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、またはＨＡタグ
である（Wilsoｎら，Cell，37:767(1984)）。本発明の
ポリヌクレオチドは、限定するものではないが、構造遺
伝子および遺伝子の発現を調節する天然に伴う配列から
なるポリヌクレオチドを包含する。

【００３０】前記によれば、本明細書で使用する「ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、
本発明のポリペプチド、特に、細菌性、より詳しくは、
図２［配列番号２］に示されるアミノ酸配列を有するス
トレプトコッカス・ニューモニエaroＥのポリペプチド
をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
この用語はコードおよび／非コード配列を含んでもよい
さらなる領域と共に、該ポリペプチドをコードする単一
の連続または非連続領域（例えば、組み込まれたファー
ジまたは挿入された配列またはエデティング（editin
g）により中断されている）を含むポリヌクレオチドを
包含する。本発明はさらに、図２［配列番号２］の推定
アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコードす
る、本明細書にて前記したポリヌクレオチドの変種に関
する。

【００３１】さらに好ましい具体例は、数個、わずか
な、５〜１０、１〜５、１〜３、２または１個あるいは
０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、
欠失または付加された図２［配列番号２］のaroＥポリ
ペプチドのアミノ酸配列を有する、aroＥ変種をコード
するポリヌクレオチドである。特に好ましくは、aroＥ
の特性、活性を変化させないサイレント置換、付加およ
び欠失である。本発明のさらに好ましい具体例は、図２
［配列番号２］に示すアミノ酸配列をを有するaroＥポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドの完全長にわ
たって少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオ
チドおよびそのようなポリヌクレオチドに相補性のポリ
ヌクレオチドである。また、最も好ましいものは、寄託
株のストレプトコッカス・ニューモニエＤＮＡのaroＥ
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと完全長に
わたって少なくとも８０％の同一性を有する領域からな
るポリヌクレオチドおよびそれと相補性のポリヌクレオ
チドである。この点で、その同じものと完全長にわたっ
て少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド
が特に好ましく、中でも少なくとも９５％の同一性を有
するものが特に好ましい。さらには、少なくとも９５％
の同一性を有するものの中で少なくとも９７％の同一性
を有するものがより好ましく、中でも少なくとも９８％
および少なくとも９９％の同一性を有するものが特に好
ましい。少なくとも９９％の同一性を有するものがより
好ましい。この点における好ましい具体例は、さらに
は、図１［配列番号１］のＤＮＡによってコードされて
いる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能また
は活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドである。

【００３２】さらに本発明は、本明細書にて上記した配
列にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関
する。この点において、本発明は特に、本明細書にて上
記したポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下で
ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書で用いる場合、「ストリンジェントな条
件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件」という語は、ハイブリダイゼーションが、配列
間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の
同一性がある場合にのみ起こることを意味する。ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例とし
て、５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ
ＮaＣl、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ
リン酸ナトリウム（pＨ７.６）、５ｘデンハート（Denh
ardt’s）溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μ
ｇ／ｍｌ変性切断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中、
４２℃で一夜インキュベーションし、ついでそのフィル
ターを０.１ｘＳＳＣ（約６５℃）で洗浄することが挙
げられる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は公
知であり、Sambrookら、MOLECULＡＲ CLONING：A LABOR
ATORY MANUAL，Second Edition，Cold Spring Hａｒbo
r, N.Y.（1989）、特に、第11章に例示されている（そ
の内容を出典明示により本明細書の一部とする）。

【００３３】本発明は、実質的に、配列番号１に示した
ポリヌクレオチド配列の完全遺伝子を含む適当なライブ
ラリーを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下、配列番号１に示す該ポリヌクレオチド配列の配
列を有するプローブまたはそのフラグメントでスクリー
ニングし、該ＤＮＡ配列を単離することにより得ること
ができるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチ
ドを提供する。そのようなポリヌクレオチドを得るのに
有用なフラグメントには、例えば、本明細書に記載する
プローブおよびプライマーが包含される。

【００３４】本明細書において本発明のポリヌクレオチ
ドの分析についてさらに説明するように、例えば、上記
したような本発明のポリヌクレオチドを、ＲＮＡ、ｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーショ
ン・プローブとして使用し、aroＥをコードする完全長
ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、aroＥ遺伝子
に対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡ
およびゲノムクローンを単離することができる。そのよ
うなプローブは、一般に、少なくとも１５塩基を有して
なるであろう。好ましくは、そのようなプローブは少な
くとも３０塩基からなり、少なくとも５０塩基を有して
もよい。特に好ましいプローブは、少なくとも３０塩基
を有し、５０以下の塩基を有する。例えば、aroＥ遺伝
子のコード領域は、既知のＤＮＡ配列を使用してスクリ
ーニングしてオリゴヌクレオチド・プローブを合成する
ことにより単離できる。ついで、本発明の遺伝子の配列
と相補性の配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを
用いてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブ
ラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバ
ーがプローブとハイブリダイズするか決定する。

【００３５】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、とりわけ、本明細書においてポリヌクレオチド
分析に関してさらに説明するように、疾患、特にヒトの
疾患に対する治療および診断の発見のための研究試薬お
よび研究材料として用いることができる。配列番号１お
よび２の配列から由来するオリゴヌクレオチドである本
発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法に使
用できるが、好ましくはＰＣＲに使用し、本明細書で同
定したポリヌクレオチドが全体として、または部分的に
感染組織において転写されるか否か測定する。そのよう
な配列はまた、病因が達した感染の段階およびタイプの
診断においても有用性がある。

【００３６】ポリヌクレオチドは、成熟蛋白にさらなる
アミノまたはカルボキシ末端アミノ酸が加わるか、成熟
ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わった（例えば、成
熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリ
ペプチドをコードしうる。このような配列は、とりわ
け、前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシン
グにおいて役割を果たし、タンパク質を運び、タンパク
質の半減期を長くしたり、短くしたり、あるいは分析ま
たは生産のためのタンパクしtの操作を容易にすること
ができる。in vivoで一般的なように、該付加アミノ酸
は細胞酵素により成熟タンパク質からプロセッシングに
より除かれる。一またはそれ以上のプロ配列に融合した
ポリペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は該
ポリペプチドの不活性形でもよい。プロ配列がそのよう
な不活性前駆体から除かれると、一般に活性化される。
プロ配列の幾らかまたは全体を、活性化の前に除去でき
る。一般に、そのような前駆体はプロタンパク質と称さ
れる。

【００３７】総じて、本発明のポリヌクレオチドは成熟
タンパク質、リーダー配列の加わった成熟タンパク質
（プレタンパク質とも称される）、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有す
る成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列と、一
般に、ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセ
ッシング工程の間に除去される１またはそれ以上のプロ
配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタ
ンパク質をコードする。

【００３８】ベクター、宿主細胞、発現本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌ
クレオチドを含んでなるベクター、本発明のベクターで
遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本発
明のポリペプチドの産生に関する。さらに無細胞翻訳系
を用い、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用して
かかるタンパク質を製造することができる。組換え体産
生のために、宿主細胞を遺伝子操作し、発現系もしくは
それらの一部、または本発明のポリヌクレオチドを取り
込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導
入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランス
ベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質
媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、
トランスダクション、スクレープ・ローディング、弾道
導入および感染のような、Davisら、BASIC METHODS IN
MOLECULＡＲ BIOLOGY（1986）およびSambrookら、MOLEC
ULＡＲ CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd Ed. Cold
Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Hａｒbo
r, N.Y.（1989）のごとき複数の標準的研究室マニュア
ルに記載されている方法によって行うことができる。

【００３９】適当な宿主の代表例は、レンサ球菌（stre
ptococcus）、ブドウ球菌（staphylococcus）、大腸菌
（E.coli）、ストレプトマイセス（streptomyces）およ
び枯草菌（Bacillus subtilis）細胞のごとき細菌細
胞；酵母細胞およびアスペルギルス（Aspergillus）細
胞のごとき真菌細胞；ドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２
およびスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞のごとき
昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨeＬa、Ｃ１２７、３Ｔ
３、ＢＨＫ、２９３およびボーウェス（Bowes）メラノ
ーマ細胞のごとき動物細胞；および植物細胞を包含す
る。本発明のポリペプチド産生のために非常に多様な発
現系を使用することができる。かかる系は、とりわけ、
染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、
細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トラン
スポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由来、酵
母染色体因子由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０のごと
きパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイ
ルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスお
よびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、
およびコスミドおよびファージミドなどのプラスミドお
よびバクテリオファージの遺伝因子由来のベクターのご
とき、それらの組み合わせに由来するベクターを包含す
る。発現系構築物は、発現を制御ならびに引き起こす調
節領域を有していてもよい。一般に、宿主においてポリ
ヌクレオチドを維持、増幅または発現し、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した系またはベクター
を、この点にて発現に使用してもよい。適当なＤＮＡ配
列を、例えば、Sambrookら、MOLECULＡＲ CLONING，A L
ABORATORY MANUAL（前掲）に示されている技術のごと
き、種々のよく知られた慣用的技術のいずれかによっ
て、発現系に挿入してもよい。

【００４０】翻訳されたタンパク質を、小胞体内腔、周
辺腔または細胞外環境に分泌するために、適当な分泌シ
グナルを発現されるポリペプチドに挿入してもよい。こ
れらのシグナルは、ポリペプチドに固有のものであって
もよく、または異種のシグナルであってもよい。本発明
のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール
沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグ
ラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水
相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ
ーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する、よく
知られた方法によって組換え細胞培養物から回収および
精製できる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフ
ィーが精製に使用される。ポリペプチドが単離および／
または精製の間に変性する場合、タンパク質を再生する
ためのよく知られた方法を用いて、活性コンホメーショ
ンを再生してもよい。

【００４１】診断アッセイ本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のar
oＥポリヌクレオチドの使用にも関連付けられる。真核
生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるaroＥの検
出は、疾患の診断のための診断方法を提供する。真核生
物（本明細書において「個体」とも称する）、とりわけ
哺乳動物、特にヒトがaroＥ遺伝子を含む生物に感染す
ると、種々の方法によりＤＮＡレベルで検出できる。診
断に供する核酸は、感染した個体の細胞および組織、例
えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚より得ることがで
きる。ゲノムＤＮＡは直接的に検出するのに使用できる
か、または分析に付す前にＰＣＲもしくはその他の増幅
法を用いることにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡまた
はｃＤＮＡも同じ方法にて使用できる。増幅すると、真
核生物、特に哺乳動物、とりわけヒト中に存在する原核
生物の株を原核細胞遺伝子の遺伝子型の分析により特徴
づけすることができる。対照配列の遺伝子型と比較した
増幅生成物の大きさの変化により、欠失および挿入を検
出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識したaroＥ
ポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするこ
とにより同定できる。完全に対合した配列は、Rnase消
化により、または融解温度の差により、誤対合二重らせ
んと区別できる。ＤＮＡ配列の差はまた、変性剤と共に
または無しでゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の
移動度の変化により、または直接的なＤＮＡの配列決定
により検出できる。例えば、Myersら、Science，230:12
42（1985）を参照のこと。特異的な位置での配列の変化
はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えば、ＲＮase
およびＳ１保護または化学的切断法によっても明らかに
することができる。例えば、Cottonら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.,USA，85:4397-4401（1985）を参照のこと。

【００４２】本発明の遺伝子の突然変異または多型性を
担持する細胞はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベル
で、例えばセロタイピングすることにより検出できる。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出すること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲを自動検出系、例えばＧeneＳc
an等と組み合わせて用いるのが特に好ましい。ＲＮＡま
たはｃＤＮＡもまた同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣ
Ｒに用いることができる。一例として、aroＥをコード
する核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて突然変異
を同定および分析することができる。代表的なプライマ
ーの例を表１に示す。

【００４３】

【表１】 aroＥポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー配列番号プライマー配列３５’−CTTGATGGCTATACACGT−３’ ４５’−CCTGACTTCTAGCCCATTTC−３’

【００４４】これらのプライマーを用いて個体から由来
の試料より単離したaroＥを増幅することもできる。本
発明はさらに５’および／または３’末端より除去した
１、２、３または４個のヌクレオチドを含むこれらプラ
イマーを提供する。該プライマーを用いて、感染した個
体から単離した遺伝子を増幅してもよく、ついで、該遺
伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供するこ
とができる。このように、ＤＮＡ配列における突然変異
を検出し、これを用いて感染を診断し、感染性物質をセ
ロタイプまたは分類することができる。本発明は、疾
患、好ましくは細菌感染、さらに好ましくはストレプト
コッカス・ニューモニエによる感染、および最も好まし
くは中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞
炎、膿胸および心内膜炎、最も好ましくは脳脊髄液の感
染のような髄膜炎の診断方法であって、図１［配列番号
１］の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上
昇を、個体由来のサンプルから決定することを特徴とす
る方法を提供する。aroＥポリヌクレオチドの発現の増
加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該
分野で周知の方法である任意の方法、例えば増幅、ＰＣ
Ｒ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノーザンブロッティ
ングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いて
測定できる。

【００４５】加えて、正常対照組織サンプルと比較して
aroＥタンパク質の過剰発現を検出するための本発明に
よる診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出す
ることができる。宿主由来のサンプル中のaroＥタンパ
ク質のレベルを決定するために用いることができるアッ
セイ技法は、当業者に周知である。このようなアッセイ
法は、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウ
ェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含
する。

【００４６】抗体本発明のポリペプチドもしくはその変種、またはそれら
を発現する細胞は、このようなポリペプチドに免疫特異
的な抗体を産生する免疫原として用いることができる。
本明細書で用いる「抗体」は、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体および
ヒト化抗体、ならびにＦａｂ免疫グロブリン発現ライブ
ラリーの生成物を包含するＦａｂフラグメントを包含す
る。本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリ
ペプチドまたはエピトープが付いたフラグメント、アナ
ログまたは細胞を、好ましくはヒト以外の動物に、慣用
的プロトコルを用いて投与することにより得ることがで
きる。モノクローナル抗体を調製する場合、連続的細胞
系培養により産生される抗体を提供する当業者周知の技
術を用いることができる。例えば、Kohler，G.およびMi
lstein,C.,Nature，256:495-497（1975）；Kozborら、I
mmunology Today，4:72（1983）；Coleら、Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.、77
-96頁（1985）に記載されるような種々の技法が挙げら
れる。

【００４７】一本鎖抗体を製造するための技術（米国特
許第４９４６７７８号）を用いて、本発明のポリペプチ
ドに対する一本鎖抗体を産生することができる。また、
トランスジェニックマウスまたは他の生物、例えば他の
哺乳動物を用いて、ヒト化抗体を発現させることができ
る。別法として、ファージディスプレイ（phage displa
y）技法を利用して、抗aroＥを保持することについてス
クリーニングしたヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅した
ｖ遺伝子のレパートリー由来の、または無処理のライブ
ラリー由来のポリペプチドに対する結合活性を有する抗
体遺伝子を選択してもよい（McCafferty,J.ら、Nature
348:552-554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnology 10:
779-783(1992)）。これらの抗体の親和性はチェインシ
ャフリング（chain shuffling）により改善することも
できる（Clackson,T.ら、Nature 352:624-628（199
1））。二つの抗原結合ドメインが存在する場合、各ド
メインは異なるエピトープに向けることができ、それを
「二特異性」抗体と称する。前記の抗体を用いてポリペ
プチドを発現するクローンを単離または同定することが
でき、アフィニティークロマトグラフィーにより該ポリ
ペプチドを精製することができる。

【００４８】従って、とりわけ、aroＥに対する抗体を
用いて、感染、とりわけ細菌感染、特に中耳炎、結膜
炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内
膜炎、最も好ましくは、例えば、脳脊髄液の感染のよう
な髄膜炎を治療することができる。ポリペプチド変種
は、本発明の特定の態様を形成する、抗原的、エピトー
プ的または免疫学的に等価な変種を包含する。本明細書
で用いる「抗原的に等価な誘導体」なる用語は、本発明
に係るタンパク質またはポリペプチドに対して誘起され
た場合、病原体および哺乳動物宿主間での即時的な物理
的相互作用を妨害するある種の抗体により特異的に認識
されるポリペプチドまたはその同等物を包含する。本明
細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、
脊椎動物において抗体を誘起させるのに適した処方を用
いた場合、抗体が病原体および哺乳動物宿主間での即時
的な物理的相互作用を妨害するように作用するペプチド
またはその等価物を包含する。

【００４９】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはその融合タンパク質は、マウスま
たは他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免疫す
るための抗原として使用される。融合タンパク質はポリ
ペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合す
ることにより、免疫原性キャリヤタンパク質、例えばウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リムペ
ット・ヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin：Ｋ
ＬＨ）に結合させることができる。別法として、タンパ
ク質もしくはポリペプチド、またはその抗原的もしくは
免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピーを含む多重
抗原性ペプチドは、免疫原性を改良するのに十分な抗原
性を有しており、キャリヤを使用しなくてすむ。

【００５０】抗体またはその変種を修飾し、個体におけ
る免疫原性を減少させることが好ましい。例えば、個体
がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒト化」さ
れており；例えばJones,P.ら、Nature 321:522-525（19
86）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273（199
1）に記載されているように、ハイブリドーマ由来の抗
体の相補性決定領域がヒトモノクローナル抗体に移植さ
れている。本発明のポリヌクレオチドの遺伝的免疫にお
ける使用は、好ましくは、プラスミドＤＮＡの筋肉への
直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet 1:363（1992）；Ma
nthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419（1963））、特異的タ
ンパク質キャリヤを複合させたＤＮＡの送達（Wuら、J.
Biol Chem.264:16985（1989））、リン酸カルシウムを
用いるＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshef、PNAS 83:955
1（1986））、種々の形態のリポソーム中へのＤＮＡ封
入（Kanedaら、Science 243:375（1989））、微粒子爆
撃（Tangら、Nature 356:152（1992）；Eisenbraunら、
DNA Cell Biol.12:791（1993））およびクローン化レト
ロウイルスベクターを用いたインビボ感染（Seegerら、
PNAS 81:5849（1984））などの適当な送達方法を用い
る。

【００５１】さらに、本発明のポリペプチドを用いて、
例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、お
よび天然産物の混合物中の、小分子基質とリガンドとの
結合を評価することもできる。これらの基質およびリガ
ンドは天然の基質およびリガンドでよく、または構造上
もしくは機能上の擬似物質でもよい。例えば、Coligan
ら、Current Protocols in Immunology 1(2):第5章（19
91）を参照のこと。

【００５２】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子本発明はまた、aroＥポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドの作用を亢進（アゴニスト）または遮断（アンタゴ
ニスト）する化合物を同定するために化合物をスクリー
ニングする方法を提供する。例えば、アゴニストまたは
アンタゴニストをスクリーニングするために、aroＥポ
リペプチドおよびかかるポリペプチドの標識基質または
リガンドを含んでなる合成反応混合物、膜、細胞エンベ
ロープもしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、
またはそれらのいずれかの調製物を、aroＥアゴニスト
またはアンタゴニストであるかもしれない候補分子の存
在下または不在下でインキュベーションする。候補分子
がaroＥポリペプチドに作動または拮抗する能力は、標
識リガンドの結合の低下またはかかる基質からの生成物
の生成低下に反映される。結合しても影響を及ぼさない
分子、すなわちaroＥの効果を誘起しない分子は、ほと
んどの場合、良好なアンタゴニストであろう。よく結合
し、基質からの生成物の生成速度を高める分子はアゴニ
ストである。基質からの生成物の生成速度またはレベル
はリポーターシステムを用いることにより増強できる。
この点に関して有用なリポーターシステムは、生成物に
転換される比色標識基質、aroＥ活性の変化に応答する
リポーター遺伝子、および当該分野で公知の結合アッセ
イを包含するが、これらに限定するものではない。

【００５３】aroＥアンタゴニストのアッセイの別の例
は、競争阻害アッセイに適した条件下で、aroＥおよび
潜在的なアンタゴニストを、AroＥ結合分子、組換えAro
Ｅ結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質も
しくはリガンド擬似物質と混合する、競合アッセイであ
る。AroＥを例えば放射活性または比色化合物により標
識し、結合分子に結合した、または生成物に変換したAr
oＥ分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニス
トの効果を評価できる。潜在的なアンタゴニストは、本
発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合し、
それによりその活性を阻害し、消滅させる小有機分子、
ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を包含する。潜在的
アンタゴニストはまた、aroＥ誘発活性を誘導しない結
合分子のような、結合分子の同一部位に結合し、aroＥ
を結合より排除することによりaroＥの作用を妨げる、
密接に関連したタンパク質または抗体のような小有機分
子、ペプチド、ポリペプチドであるかもしれない。

【００５４】潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチド
の結合部位に結合して占領し、それにより細胞性結合分
子への結合を防御して、正常な生物学的活性を防御する
小分子を包含する。小分子の例は、小有機分子、ペプチ
ド、ペプチド様分子を包含するが、これらに限定するも
のではない。その他の潜在的なアンタゴニストはアンチ
センス分子を包含する（これらの分子についての記載に
関しては、Okano,J.，Neurochem. 56:560（1991）；Oli
godeoxynucleotides as Antisense Inhibitorsof Gene
Expression，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ
州（1988）を参照のこと）。好ましい潜在的アンタゴニ
ストは、aroＥに関連する化合物およびその変種を包含
する。

【００５５】特定の態様において、本発明は、本発明の
ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻害剤の使用で
あって、感染の続発症に関与する、病因および哺乳動物
宿主間の最初の物理的相互作用を妨害するための使用を
提供する。特に本発明の分子を、ｉ）細菌、特にグラム
陽性細菌の内在装置上の哺乳動物細胞外マトリックスタ
ンパク質、または創傷部の細胞外マトリックスタンパク
質への付着の妨げ；ｉｉ）例えば、哺乳動物性チロシン
キナーゼのリン酸化の開始による、aroＥタンパク質媒
介の哺乳動物細胞侵入の遮断（Rosenshineら、Infect.I
mmun.60：2211(1992))；ｉｉｉ）哺乳動物細胞外マトリ
ックスタンパク質と組織損傷を媒介する細菌性aroＥタ
ンパク質との間の細菌付着の遮断；ｉｖ）内在装置の埋
め込みまたはその他の手術以外により開始した感染にお
ける病因の正常な進行の遮断に使用することができる。

【００５６】本明細書で得られるＤＮＡ配列は、各々、
抗菌化合物の発見および開発に用いることができる。発
現時に、コードされたタンパク質は、抗菌薬物をスクリ
ーニングするための標的として用いることができる。加
えて、コードされたタンパク質もしくはShine-Delgarno
または他の個々のｍＲＮＡの翻訳容易化配列のアミノ末
端領域をコードするＤＮＡ配列を用いて、目的とするコ
ーディング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構
築することができる。本発明のアンタゴニストおよびア
ゴニストを用いて、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌
血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、最も好
ましくは、例えば、脳脊髄液の感染のような髄膜炎を阻
害することができる。

【００５７】ワクチン本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物における免疫
学的応答を誘発する方法であって、抗体を生成するのに
適当なaroＥ、またはそのフラグメントもしくは変種を
個体に接種し、該個体を感染、特に細菌感染、最も好ま
しくはストレプトコッカス・ニューモニエ感染から防御
することからなる方法に関する。本発明のさらにもう一
つ別の態様は、個体における免疫学的応答を誘発する方
法であって、遺伝子治療を介して、in vivoでaroＥまた
はそのフラグメントまたは変種を発現するために、該ar
oＥまたはそのフラグメントまたは変種をコードする遺
伝子をデリバリーし、免疫学的応答を誘発し、抗体を産
生し、該個体を疾患から保護することからなる方法に関
する。

【００５８】本発明のさらなる態様は、その中に免疫学
的応答を誘発する能力を有するか、または誘発している
宿主に導入されると、その宿主においてaroＥまたはそ
れからコードされるタンパク質に対する免疫学的応答を
誘発する免疫学的組成物であって、該aroＥまたはそれ
からコードされるタンパク質の抗原をコードし、発現す
るＤＮＡを含む組換えaroＥまたはそれからコードされ
るタンパク質からなる組成物に関する。

【００５９】aroＥまたはそのフラグメントは、それ自
体抗体を産生しないが、第一タンパク質の安定化ならび
に免疫原性および保護特性を有するであろう融合タンパ
ク質の産生能を有する補タンパク質（co−Protein）と
融合させることができる。このような融合組換えタンパ
ク質は、好ましくは、さらに、グルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベータガラクトシダー
ゼのような抗原性補タンパク質、タンパク質を可溶化
し、その産生および精製を容易にするような比較的大き
い補タンパク質からなる。さらに、補タンパク質は、免
疫系の汎化した刺激を与える上で、アジュバントとして
作用できる。補タンパク質は第一タンパク質のアミノま
たはカルボキシ末端のいずれかに結合してもよい。本発
明は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドお
よび、Sato，Y.ら，Science，273：352(1996)に記載さ
れるような免疫刺激ＤＮＡ配列からなる組成物、特にワ
クチン組成物および方法を提供する。

【００６０】また、本発明は、ストレプトコッカス・ニ
ューモニエ感染の動物モデルにおけるそのような遺伝的
免疫実験において使用したＤＮＡ構築物中で細菌細胞表
面タンパク質の非可変領域をコードすることが明らかに
された記載のポリヌクレオチドまたはその特定のフラグ
メントを使用する方法も提供するもので、予防的または
治療的免疫応答を起こさせることのできるタンパク質エ
ピトープの同定に特に有用である。この方法により、動
物、とりわけヒトにおける細菌感染、特にストレプトコ
ッカス・ニューモニエ感染の予防剤または治療剤の開発
のために、動物の必要な器官から感染の抵抗または除去
に特に有用なモノクローナル抗体を産生させることがで
きる。該ポリペプチドを宿主を免疫化するための抗原と
して用い、例えば、損傷組織への細菌の付着を遮断する
ことにより、細菌の侵入に拮抗する特異抗体を生じさせ
ることができる。組織損傷の例としては、例えば、機械
的、化学的または熱的損傷による、または内在装置の移
植による皮膚や結合組織の傷、あるいは口、乳腺、子宮
または膣のような粘膜における傷が挙げられる。

【００６１】本発明はまた、免疫原性組換えタンパク質
と、適当な担体とからなるワクチン処方も包含する。タ
ンパク質は胃で破壊されうるので、非経口的投与（例え
ば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内等の投与を包含する）
が望ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩
衝剤、抗菌剤、およびその処方を個体の体液、好ましく
は血液と等張にする溶質を含有してもよい、水性および
非水性滅菌注射溶液；懸濁化剤または増粘剤を含有して
もよい、水性および非水性滅菌懸濁液を包含する。処方
は、単位投与または複数投与用コンテナ、例えば、密封
されたアンプルおよびバイアルにて提供され、使用直前
に滅菌液体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯
蔵することができる。ワクチン処方はまた、水中油系の
ごとき処方の免疫原性を高めるアジュバント系および当
該分野において知られている他の系を有してもよい。投
与量はワクチンの比活性に依存し、慣用的実験操作によ
って容易に決定できる。本発明をある種のaroＥタンパ
ク質について記載したが、この記載は天然のタンパク質
のフラグメントおよび組換えタンパク質の免疫原性を実
質的に変化させない付加、欠失、置換を有する同様なタ
ンパク質も包含することが理解されるであろう。

【００６２】組成物、キットおよび投与本発明はまた、上記したポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドあるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニス
トからなる組成物に関する。本発明のポリペプチドは、
対象への投与に適した医薬担体のような細胞、組織また
は器官用の非滅菌または滅菌担体と組み合わせて使用で
きる。かかる組成物は、例えば、媒体添加または治療上
有効量の本発明のポリペプチドと、医薬上許容される担
体または賦形剤を含有してなる。かかる担体は、限定す
るものではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノールおよびその組み合わ
せを包含する。処方は投与方法に適していなければなら
ない。本発明は、さらには、上記した本発明の組成物の
一またはそれ以上の成分を充填した、一またはそれ以上
の容器を有してなる診断および医薬用パックおよびキッ
トに関する。

【００６３】本発明のポリペプチドおよび他の化合物
を、単独で、または、治療用化合物などの他の化合物と
組み合わせて用いてもよい。該医薬組成物は、例えば、
局所、経口、経肛門、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、
皮下、経鼻、経皮等を含む、いずれかの有効な、都合の
よい方法で投与される。治療および予防において、活性
成分は個体に注射用組成物、例えば、滅菌水性分散液、
好ましくは等張の水性分散液として投与される。また、
組成物は、例えば、軟膏、クリーム、ローション、眼軟
膏、点眼剤、点耳剤、マウスウォッシュ、含浸包帯およ
び縫合糸ならびにエアゾルの形態の局所用処方とするこ
とができ、適当な通常の添加剤、例えば、保存料、薬剤
浸透を助ける溶媒、軟膏やクリームにおけるエモリエン
ト等を含むことができる。そのような局所用処方はま
た、適合する通常の担体、例えば、クリームまたは軟膏
基剤、ローション用のエタノールまたはオレイルアルコ
ールも含有することができる。このような担体は、処方
全量に対して約１〜９８重量％、通常、約８０重量％ま
で含有できる。

【００６４】哺乳動物、特にヒトに投与するには、１日
の活性薬剤の用量は、０.０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／
ｋｇ、典型的には約１ｍｇ／ｋｇである。いずれにして
も、個体に最も適した実際の用量は医者により決定さ
れ、個体の年齢、体重および応答により変化する。上記
の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より
高いまたは低い用量範囲が適当な個体もあり、それらも
本発明の範囲内である。内在装置には外科移植、補綴お
よびカテーテル、すなわち、個体の体内に導入され、そ
の位置に長時間止まる装置が包含される。例えば、その
ような装置としては、人工関節、心臓弁、ペースメーカ
ー、血管グラフト、血管カテーテル、脊髄液シャント、
尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（continuous ambulat
ory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カテーテルが挙
げられる。

【００６５】本発明の組成物は、内在装置の挿入の直前
に関連する細菌に対する全身的効果を達成するために注
射で投与できる。治療は、手術の後、装置が体内にある
間継続できる。加えて、組成物は、細菌の傷汚染、特
に、ストレプトコッカス・ニューモニエの傷汚染を防止
するために、いずれの手術用の手術周辺カバーの拡張に
も使用できる。多くの整形外科医は、補綴関節を有する
ヒトは、菌血症を生じ得る歯の治療前に抗生物質による
予防を考慮すべきと考えている。後の重い感染は、重篤
な合併症となり、時に、補綴関節の損失および著しい罹
病率、致死率を伴う。したがって、該活性物質を、この
状況の予防的抗生物質の代替品として使用することにま
で拡張することができる。

【００６６】上記した治療に加えて、本発明の組成物
は、一般に、傷組織に露出したマトリックス・タンパク
質への細菌付着を予防するための傷治療剤、抗生物質予
防に代え、あるいは共に、歯の治療における予防的用途
に使用できる。別法として、本発明の組成物は挿入直前
に内在装置を浸すのに使用できる。該活性物質は、傷ま
たは内在装置を浸する場合、１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／
ｍｌの濃度で使用できる。ワクチン組成物は、都合よく
は、注射剤の形態である。通常のアジュバントを使用し
て免疫応答を促進できる。ワクチン用の適当な単位投与
量は抗体０.５〜５μｇ／ｋｇであり、この用量を、好
ましくは１〜３週間の間隔で１〜３回投与する。指示し
た用量範囲で、本発明の化合物では、その化合物の適当
な個体への投与を妨げる、有害な毒作用は何も観察され
ない。前記した抗体はまた、aroＥタンパク質を有する
細菌の存在を検出するための診断薬として用いることが
できる。

【００６７】

【実施例】以下の実施例は、別に詳細に記載したこと以
外は、当業者に周知で慣用的な標準的な技法を用いて実
施する。実施例は例示であって、本発明を限定するもの
ではない。

【００６８】実施例１ライブラリーの製造配列番号１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチド
は、エシェリキア・コリにおけるストレプトコッカス・
ニューモニエの染色体ＤＮＡのクローンライブラリーよ
り得た。ある場合には、重複するストレプトコッカス・
ニューモニエＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のク
ローンからの配列データを用いて、配列番号１の連続し
たＤＮＡ配列を構築した。ライブラリーは常套手段、例
えば以下の方法１および２により製造してもよい。全細
胞ＤＮＡをストレプトコッカス・ニューモニエ０１００
９９３より、標準法に従って単離し、二つの方法のいず
れかによりサイズ分画する。

【００６９】方法１標準的方法に従ってサイズ分画するために、全細胞ＤＮ
Ａをニードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐま
での大きさのＤＮＡフラグメントをエキソヌクレアーゼ
およびＤＮＡポリメラーゼで処理することによって平滑
末端とし、ＥｃｏＲＩリンカーを付加する。フラグメン
トを、ＥｃｏＲＩで切断したベクター、ラムダＺａｐＩ
Ｉに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケー
ジングし、次いでパッケージングしたライブラリーでエ
シェリキア・コリを感染させる。ライブラリーを標準方
法により増幅させる。

【００７０】方法２全細胞ＤＮＡをライブラリーベクターにクローニングす
るための一連のフラグメントを得るのに適当な１つの制
限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓ
ｈｌ２３５Ｉ）またはその組み合わせで部分的に加水分
解し、かかるフラグメントを標準的方法に従ってサイズ
分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡに連結し、次い
でそのフラグメントをＥｃｏＲＩで切断したベクター、
ラムダＺａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラ
リーをパッケージングし、パッケージングしたライブラ
リーでエシェリキア・コリを感染させる。ライブラリー
を標準方法により増幅させる。

【００７１】

【配列表】

（１）一般的情報：（ｉ）出願人：バーナム，ケイ・ラッセル（ｉｉ）発明の名称：新規aroＥ（ｉｉｉ）配列の数：４（ｉｖ）連絡先：（Ａ）宛名：デチャート・プライス＆ローズ（Ｂ）通り名：４０００・ベル・アトランティック・
タワー、１７１７アーク・ストリート（Ｃ）都市名：フィラデルフィア（Ｄ）州名：ペンシルベニア州（Ｅ）国名：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：１９１０３−２７９３（ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：（Ａ）媒体形態：ディスケット（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：ウィンドウズ・バージョン２.０
用のＦａｓｔＳＥＱ（ｖｉ）現出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）先の出願データ（Ａ）出願番号：６０／０３６１２５（Ｂ）出願日：１９９７年１月２１日（ｖｉｉｉ）代理人等の情報：（Ａ）氏名：フォーク，ステファン・テイー（Ｂ）登録番号：３６７９５（Ｃ）代理人等における処理番号：GM50000 （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報：（Ａ）電話番号：２１５−９９４−２４８８（Ｂ）テレファックス番号：２１５−９９４−２２２２（Ｃ）テレックス：

【００７２】（２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：７７２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１： ATGAAGCTTG ATGGCTATAC ACGTTTAGCT GCAGTTGTTG CCAATCCTAT TAAGCATTCT 60 ATTTCTCCCT TCATCCACAA TAGAGCCTTT GAGGCGACAG CTACCAACGG TGCTTATGTG 120 GCTTGGGAGA TTGAAGCGAG TGACTTGGTA GAAACAGTGG CCAATATTCG TCGCTACCAG 180 ATGTTTGGCA TCAATCTGTC CATGCCCTAT AAGGAGCAGG TGATTCCTTA TTTGGATAAG 240 CTGAGCGATG AAGCGCGCTT GATTGGTGCG GTTAATACGG TTGTCAATGA GAATGGCAAT 300 TTAATTGGAT ATAATACAGA TGGCAAGGGA TTTTTTAAGT GCTTGCCTTC TTTTACAATT 360 TCAGGTAAAA AGATGACCCT GCTGGGTGCA GGTGGTGCGG CTAAATCAAT CTTGGCACAG 420 GCTATTTTGG ATGGCGTCAG TCAGATTTCG GTCTTTGTTC GTTCCGTTTC TATGGAAAAA 480 ACAAGACCTT ACCTAGACAA GTTACAGGAG CAGACAGGCT TTAAAGTGGA TTTGTGTGCT 540 TTAGAATATG TTTCTGAACT GCAAGCAAGG ATTGCCGAGT CGGATTTGCT AGTTAATGCC 600 ACCAGTGTGG GCATGGATGG CCAATTCTCT CCTGTTCCTG AAAACATAGT CTTACCAGAA 660 ACTCTCTTAG TTGCAGATAT CATATACCAA CCCTTTGAAA CACCGTTTTT GAAATGGGCT 720 AGAAGTCAGG GCAATCCAGC AGTCAATGGT CTGGGAATGT TGCTCTATCA AG 772

【００７３】（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５７アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Lys Leu Asp Gly Tyr Thr Arg Leu Ala Ala Val Val Ala Asn Pro 1 5 10 15 Ile Lys His Ser Ile Ser Pro Phe Ile His Asn Arg Ala Phe Glu Ala 20 25 30 Thr Ala Thr Asn Gly Ala Tyr Val Ala Trp Glu Ile Glu Ala Ser Asp 35 40 45 Leu Val Glu Thr Val Ala Asn Ile Arg Arg Tyr Gln Met Phe Gly Ile 50 55 60 Asn Leu Ser Met Pro Tyr Lys Glu Gln Val Ile Pro Tyr Leu Asp Lys 65 70 75 80 Leu Ser Asp Glu Ala Arg Leu Ile Gly Ala Val Asn Thr Val Val Asn 85 90 95 Glu Asn Gly Asn Leu Ile Gly Tyr Asn Thr Asp Gly Lys Gly Phe Phe 100 105 110 Lys Cys Leu Pro Ser Phe Thr Ile Ser Gly Lys Lys Met Thr Leu Leu 115 120 125 Gly Ala Gly Gly Ala Ala Lys Ser Ile Leu Ala Gln Ala Ile Leu Asp 130 135 140 Gly Val Ser Gln Ile Ser Val Phe Val Arg Ser Val Ser Met Glu Lys 145 150 155 160 Thr Arg Pro Tyr Leu Asp Lys Leu Gln Glu Gln Thr Gly Phe Lys Val 165 170 175 Asp Leu Cys Ala Leu Glu Tyr Val Ser Glu Leu Gln Ala Arg Ile Ala 180 185 190 Glu Ser Asp Leu Leu Val Asn Ala Thr Ser Val Gly Met Asp Gly Gln 195 200 205 Phe Ser Pro Val Pro Glu Asn Ile Val Leu Pro Glu Thr Leu Leu Val 210 215 220 Ala Asp Ile Ile Tyr Gln Pro Phe Glu Thr Pro Phe Leu Lys Trp Ala 225 230 235 240 Arg Ser Gln Gly Asn Pro Ala Val Asn Gly Leu Gly Met Leu Leu Tyr 245 250 255 Gln

【００７４】（２）配列番号３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３： CTTGATGGCT ATACACGT 18

【００７５】（２）配列番号４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本（Ｄ）トポロジー：線状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４： CCTGACTTCT AGCCCATTTC 20

【図面の簡単な説明】

【図１】ストレプトコッカス・ニュモニエaroＥのポ
リヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。

【図２】図１のポリヌクレオチド配列より推定したス
トレプトコッカス・ニューモニエaroＥ（配列番号２）
のアミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 ＣＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:46 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸１ないし２５
７からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレ
オチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補性のポリ
ヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも連続した１５塩基からなるポリヌクレオチドからな
る群より選択されるポリヌクレオチド配列からなる単離
ポリヌクレオチド。
【請求項２】ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】配列番号１に示されるヌクレオチド１な
いし７７２からなる請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】配列番号１に示されるaroＥをコードす
るヌクレオチドからなる請求項２記載のポリヌクレオチ
ド。
【請求項６】配列番号２のアミノ酸１ないし２５７か
らなるポリペプチドをコードする請求項２記載のポリヌ
クレオチド。
【請求項７】（ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４に含
まれるaroＥ遺伝子により発現されるのと同じ成熟ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
とも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補性のポリ
ヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５塩基からなるポリヌクレオチドからなる群より
選択されるポリヌクレオチド配列からなる単離ポリヌク
レオチド。
【請求項８】請求項２に記載のＤＮＡからなるベクタ
ー。
【請求項９】請求項８に記載のベクターからなる宿主
細胞。
【請求項１０】請求項９に記載の宿主細胞からそのＤ
ＮＡによってコードされるポリペプチドを発現させるこ
とからなるポリペプチドの製造法。
【請求項１１】ポリペプチドを発現する細胞の製造方
法であって、細胞が請求項８に記載のベクターに含まれ
るｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現する
ように、該細胞をそのベクターで形質転換またはトラン
スフェクションすることからなる方法。
【請求項１２】 aroＥポリペプチドまたはフラグメン
トの製造方法であって、該ポリペプチドまたはフラグメ
ントを産生するのに十分な条件下で、請求項９に記載の
宿主を培養することからなる方法。
【請求項１３】配列番号２のアミノ酸１ないし２５７
に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有
してなるポリペプチド。
【請求項１４】配列番号２に示されるアミノ酸配列か
らなるポリペプチド。
【請求項１５】請求項１３に記載のポリペプチドに対
する抗体。
【請求項１６】請求項１３に記載のポリペプチドの活
性を阻害するアンタゴニスト。
【請求項１７】 aroＥを必要とする個体の治療方法で
あって、請求項１３に記載のポリペプチドの治療上有効
量を該個体に投与することからなる方法。
【請求項１８】ポリペプチドをコードするＤＮＡを個
体に付与し、インビボにてそのポリペプチドを発現させ
ることにより、該ポリペプチドの治療上有効量を投与す
る請求項１７記載の方法。
【請求項１９】 aroＥポリペプチドの阻害を必要とす
る個体の治療方法であって、請求項１６に記載のアンタ
ゴニストの治療上有効量を該個体に投与することからな
る方法。
【請求項２０】請求項１３に記載のポリペプチドの発
現に関係する疾患の診断方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列を測定することか
らなる方法。
【請求項２１】宿主から由来の試料中における請求項
１３に記載のポリペプチドの存在について分析すること
からなる診断方法。
【請求項２２】請求項１３に記載のポリペプチドに結
合し、その活性を阻害する化合物の同定方法であって、細胞表面でそのポリペプチドについての結合部（その結
合部はスクリーニングすべき化合物の該結合部への結合
に応答して検出可能なシグナルを提供することのできる
第２の成分と関与する）を発現する細胞を、その結合部
への結合を可能とする条件下で、その化合物と接触さ
せ；および該化合物とその結合部との相互反応から生じ
るシグナルの有無を検出して、該化合物が結合部に結合
し、その結合部を活性を活性化するか、阻害するかを測
定することからなる方法。
【請求項２３】哺乳動物において免疫応答を誘導する
方法であって、抗体を産生し、該動物を疾患から保護す
るのに十分な、aroＥあるいはそのフラグメントまたは
変種を該哺乳動物に接種することからなる方法。
【請求項２４】哺乳動物において免疫応答を誘導する
方法であって、免疫応答を誘発し、抗体を産生して該動
物を疾患から保護するために、インビボにてaroＥある
いはそのフラグメントまたは変種を発現させるのに、遺
伝子治療を介して、aroＥフラグメントまたはその変種
をコードする遺伝子をデリバリーすることからなる方
法。
【請求項２５】 aroＥポリヌクレオチドまたはそれに
よりコードされるタンパク質をコードし、発現するＤＮ
Ａからなる免疫学的組成物であって、哺乳動物に導入さ
れると、哺乳動物にて所定のaroＥポリヌクレオチドま
たはそれからコードされるタンパク質に対する免疫応答
を誘発する組成物。
【請求項２６】配列番号１に示されるポリヌクレオチ
ド配列の配列を有するプローブとのストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件下、完全な遺伝子を含有す
る適当なライブラリーを配列番号１に示されるポリヌク
レオチド配列についてスクリーニングすることにより得
ることができるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド。