JPH10307135A

JPH10307135A - 赤血球形態異常の検出方法

Info

Publication number: JPH10307135A
Application number: JP9114568A
Authority: JP
Inventors: Yuuji Itose; 裕司糸瀬; Kayo Hatanaka; 加代畑中; Tomohiro Sakurai; 智宏櫻井
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1997-05-02
Filing date: 1997-05-02
Publication date: 1998-11-17
Also published as: US6067158A

Abstract

(57)【要約】【課題】従来は検出できなかった赤血球の形態異常をフ
ローサイトメータを用いて簡単に検出する方法を提供す
る。【解決手段】（１）赤血球を含む試料と球状化試薬とを
混合し、（２）前記工程で処理された試料をフローサイ
トメータの検出部に導入し、（３）前記試料より発せら
れる散乱光のうち、赤血球の形態を反映する角度の散乱
光を少なくとも測定して細胞分布データを得、そして
（４）予め決定された正常赤血球の細胞分布データと比
較する、ことによって赤血球形態の異常を検出すること
を特徴とする赤血球形態異常の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、光学的な手段を用
いて赤血球の形態異常を検出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液中の赤血球の形態を観察すること
は、様々な疾患の診断のための貴重な情報を得るのに有
用である。例えば、楕円赤血球は、遺伝性楕円赤血球症
の他、鉄欠乏性貧血、巨赤芽球性貧血でみられ、ウニ状
赤血球は、大部分は採血後に起こるものであるが、まれ
に尿毒症で見られる。涙的赤血球は、骨髄線維症、癌の
骨髄転移、サラセミアで見られる。破砕赤血球は、ＤＩ
Ｃ（Desseminated intravascular coagulation：汎発性
血管内凝固症候群）、尿毒症、細小血管性溶血性貧血で
見られる。また、赤血球大小不同症は、種々の貧血で見
られる。この他の赤血球の形態異常には、鎌状赤血球
（sickle cell）やholly leaf form等がある。

【０００３】現在、血球計数装置が各種市販されている
が、計数原理としては、大別すると電気抵抗方式による
ものと、光方式によるものとがある。また、多くの自動
血球計数装置では、単に計数するだけでなく、ヘモグロ
ビン濃度を測定することも可能であり、血球の粒度分布
に関する情報も提供することができる。さらに、これら
の複数の項目の測定データから判定式にもとづいて、正
常あるいは異常を判定し、計数値の異常の場合にはアブ
ノーマルメッセージを、また何らかの疾患や異常が疑わ
れる場合には、サスペクトメッセージを表示するものも
ある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ところで、血球計数装
置における赤血球系の異常を示すメッセージとしては、
計数値の異常、大きさの異常及び赤血球中のヘモグロビ
ン濃度の異常といった程度のものである。形態異常とし
ては、ＭＣＨＣ（mean cell hemoglobin concentratio
n）が３６．５ｇ／ｄｌを超えたときに球状赤血球症
が、赤血球と血小板の間の粒度分布が異常である場合に
は破砕赤血球の出現が疑われるが、その他の形態異常に
ついては測定データからサスペクトメッセージを出して
示唆することはできない。

【０００５】本発明は、従来は検出できなかった赤血球
の形態異常をフローサイトメータを用いて簡単に検出す
る方法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、鋭意検討
を重ねた結果、赤血球を球状化させると、形態異常のあ
る赤血球は、正常赤血球とは異なった光散乱特性を示す
ことを見出し本発明を完成した。

【０００７】すなわち本発明は、（１）赤血球を含む試
料と球状化試薬とを混合し、（２）前記工程で処理され
た試料をフローサイトメー夕に流し、（３）前記試料よ
り発せられる散乱光のうち、少なくとも赤血球の形態を
反映する角度の散乱光を測定して細胞分布データを得、
そして（４）予め決定された正常赤血球の細胞分布デー
タとを比較する、ことによって赤血球形態の異常を検出
することを特徴とする。

【０００８】本発明でいう赤血球の形態異常は、Willia
m, J. et al.: Hematology, 4th Ed., pp310-311, McGr
aw-Hill, New York, 1990に記載されているような、楕
円赤血球、ウニ状赤血球、涙的赤血球、破砕赤血球、大
小不同赤血球、鎌状赤血球（sickel cell）やholly lea
f form等を含む。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明で用いられる球状化試薬に
は、赤血球を球状化するのに有効な量の界面活性剤を含
有することができる。界面活性剤としては、赤血球を溶
解しなければ特に制限されるものではなく、カチオン性
界面活性剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活
性剤、両性界面活性剤が使用できる。また、界面活性剤
単独では赤血球を溶解してしまう場合には、ホルムアル
デヒド、パラホルムアルデヒド等のアルデヒド類のよう
な固定化剤を赤血球の球状化を妨げない濃度、例えば
０．３〜３ｇ／ｄｌの範囲で含有させることもできる。

【００１０】好適な界面活性剤の例としては、カチオン
性界面活性剤では、以下の構造式を有する四級アンモニ
ウム塩が使用できる：

【化１】（式中、Ｒ₁は炭素数１０〜１６のアルキル基であり、
Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄は−Ｈまたは低級アルキル基であり、
Ｘはハロゲンである）。

【００１１】また、非イオン性界面活性剤では、以下の
構造式を有するものが使用できる：Ｒ₁−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−ＯＨ（式中、Ｒ₁は炭素数８〜１８のアルキル基であり、ｎ
は８〜１８である）。

【００１２】アニオン性界面活性剤では、アルキル硫酸
金属塩、例えばドデシル硫酸ナトリウムが特に好適であ
る。

【００１３】両性界面活性剤では、アルキルベタイン、
アルキルアミドべタイン等が好適である。例えば、ラウ
ラミドプロピルべタイン、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−
ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナー
ト、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ
−１−プロパンスルホナート、ココアミドプロピルベタ
イン、ココアミドスルホベタイン等が挙げられる。これ
らは、特公平３−５７４２３、特公平３−４６７８４、
特公平４−６２３３９及び特開平６−１８０３１６に記
載されている。

【００１４】界面活性剤として特に有用なのは、カチオ
ン性界面活性剤であり、特に以下の構造を有するものが
好ましい：

【化２】（式中、Ｒ₁は炭素数８〜１２のアルキル基であり、Ｒ₂
〜Ｒ₄は同一又は異なっていてよい低級アルキル基であ
り、Ｘはハロゲンである）。

【００１５】式中、炭素数８〜１２のアルキル基として
は、直鎖又は分枝のアルキル基が包含され、例えば、オ
クチル基、デシル基又はラウリル基が挙げられる。中で
もオクチル基とデシル基が好ましい。

【００１６】また、低級アルキル基としては、メチル
基、エチル基、プロピル基及びイソプロピル基が挙げら
れる。

【００１７】カチオン性界面活性剤の具体例としては、
オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＯＴＡ
Ｂ）、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＤＴ
ＡＢ）あるいはラウリルトリメチルアンモニウムクロラ
イド（ＬＴＡＣ）が挙げられる。

【００１８】使用するカチオン性界面活性剤の濃度は、
Ｒ₁〜Ｒ₄の総炭素数に依存し、総炭素数がが増えるごと
に少量で有効になる。

【００１９】例えば、ＯＴＡＢでは３００〜２００００
ｍｇ／ｌ、ＤＴＡＢでは３０〜５０００ｍｇ／ｌ、ＬＴ
ＡＣでは、１０〜５００ｍｇ／ｌが好適である。さらに
は、ＯＡＴＢで４０００〜１００００ｍｇ／ｌ、ＤＡＴ
Ｂで２００〜３０００ｍｇ／ｌ、ＬＴＡＣで３０〜３０
０ｍｇ／ｌが好ましい。カチオン性界面活性剤の量が多
すぎると赤血球に損害を与え、場合によっては溶血を引
き起こすため好ましくない。

【００２０】さらに、球状化試薬には、ｐＨを一定に保
つための緩衝剤を含有することができる。緩衝剤は、数
ｍＭ〜１００ｍＭ程度の濃度で使用される。緩衝剤の種
類は、通常使用されるものであれば特に限定されるもの
ではないが、例えば、カルボン酸塩、リン酸塩、グッド
の緩衝剤、タウリン、トリエタノールアミン等を、所望
のｐＨに応じて適宜使用することができる。本発明にお
ける試薬の好適なｐＨは、６．０〜１１．０の範囲、好
ましくは７．０〜１０．０、より好ましくは、８．０〜
９．５の範囲である。ｐＨが上記の範囲より低すぎる又
は高すぎる場合は、赤血球が脆弱化し、溶血しやすくな
るので好ましくない。

【００２１】また、さらに浸透圧補償剤を含有すること
ができる。浸透圧は赤血球の低張溶血を防止するために
生理学的浸透圧に調整されていることが望ましく、通常
１５０〜６００ｍ０ｓｍ／ｋｇの範囲に調整される。浸
透圧補償剤は特に制限されるものではないが、例えばプ
ロピオン酸等のアルカリ金属塩、グルコース、マンノー
ス等の糖類が好適である。ＮａＣｌのようなアルカリ金
属ハロゲン化物やアルカリ土類金属ハロゲン化物も使用
できる。さらに多価アニオンを使用することもできる。
多価アニオンとしては、硫酸イオン、リン酸イオン、炭
酸イオン及び多価カルボン酸イオンが特に好適であり、
これらを供給し得る化合物としては、例えば、クエン
酸、硫酸、リン酸、ＥＤＴＡやこれらのアルカリ金属塩
等が挙げられる。

【００２２】なお、緩衝剤で測定に適した浸透圧が維持
できる場合には、緩衝剤を浸透圧補償剤としても使用す
ることができる。

【００２３】また、球状化試薬には、上記の構成成分以
外にも、保存中の細菌の増殖を防ぐために、例えば、２
−ピリジルチオ−１−オキシドナトリウム、β−フェネ
チルアルコール、ＢＩＴ（ベンズイソチアゾロン）、ト
リアジン類等の防腐剤を含有することもできる。

【００２４】本発明を実施するには、まず工程（１）に
おいて、赤血球を含む試料と球状化試薬を混合して測定
用試料を調製する。赤血球を含む試料は、抗凝固剤処理
を行った末梢血あるいはあらかじめ生理食塩水等の希釈
液で希釈された血液であってもよい。測定用試料の調製
は、赤血球を含む試料と球状化試薬を１：１００〜１：
１０００の比で混合し反応させることが好ましい。この
時の反応温度は２５〜５０℃程度が好適であり、さらに
は３５〜４５℃が好適である。また好適な反応時間は、
１０秒〜５分程度が好ましく、より好ましくは２０秒〜
２分程度であり、さらに好ましくは２０〜６０秒程度で
ある。

【００２５】次に、工程（２）において、工程（１）で
得られた測定用試料をフローサイトメータの検出部に導
入する。光源としては、フローサイトメータで使用でき
るものであればとくに制限されず、アルゴンレーザー、
Ｈｅ−Ｎｅレーザー、半導体レーザー等公知のものが使
用できる。

【００２６】続いて工程（３）において、赤血球の形態
を反映する角度の散乱光を少なくとも１つ測定して散乱
光強度分布データを得る。赤血球の形態を反映する角度
としては、例えば、散乱光検出角度が光軸に対して８〜
２０度又は７０〜１１０度の範囲である。

【００２７】さらに工程（４）において、工程（３）に
おいて得られた測定データを予め決定された正常検体の
細胞分布データと比較する。

【００２８】本発明においては、赤血球の形態を反映す
る角度の散乱光の他に、赤血球の大きさを反映する角度
の散乱光を測定して、２次元スキャッタグラムを作成
し、それを正常赤血球のデータと比較することによって
形態異常を検出することもできる。この場合、赤血球の
大きさを反映する角度としては、例えば、光軸に対し、
１〜６度の範囲である。従って、例えば第１の角度を８
〜２０度で行い、第２の角度を１〜６度で行うか、ある
いは第１の角度を７０〜１１０度で行い、第２の角度を
１〜６度で行うことにより２次元スキャッタグラムを作
成できる。

【００２９】また、球状化試薬に網状赤血球を染色でき
る蛍光色素を含有させ、これと赤血球を含む試料と混合
し、フローサイトメータの検出部に導入し、試料より発
せられる蛍光及び赤血球の形態を反映する角度の散乱光
を測定して２次元スキャッタグラムを作成し、正常赤血
球のデータと比較することによって形態異常を検出する
こともできる。網状赤血球を染色できる蛍光色素として
は、フラボホスフィン−Ｒ、コリホスフィン−Ｏ、４−
（４’−ジエチルアミノスチリル）−Ｎ−メチルピリジ
ニウムアイオダイド、アクリジンオレンジ、ピロニンＧ
などの塩基性蛍光色素を用いることができる。

【００３０】正常赤血球のデータは、正常検体の領域を
決定するのに有効な数、例えば３０以上の正常検体を測
定し、得られた分布データから境界値を設定することに
より決定できる。境界値の設定のしかたとしては、実験
的に設定したり、分布の平均値や標準偏差等から統計学
的な手法を用いて設定することができる。

【００３１】形態異常を検出する方法としては、例えば
散乱光ヒストグラムで示される粒度分布データの場合、
正常範囲外に分布データが広がっているかどうか、分布
幅が正常範囲を超えているかどうか、単一のピークを持
った分布であるかどうか等を監視することによって検出
できる。また、２次元スキャッタグラムの場合、特定の
領域を設定しておき、その領域内にデータが出現したと
きに形態異常として検出することができる。

【００３２】このようにすれば、異常の種類ごとに分類
するには至らないものの、従来の方法では検出できなか
った形態異常を検知することが可能である。

【００３３】

【実施例】球状化試薬の組成Ｔｒｉｃｉｎｅ１０ｍＭクエン酸３Ｎａｌ００ｍＭＮａＨＣＯ₃ １０．５ｍＭＮａ₂ＣＯ₃ ９．５ｍＭＤＴＡＢ（カチオン性界面活性剤）１０００ｐｐｍｐＨ９．０浸透圧３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ

【００３４】正常域の設定上記の球状化試薬と正常検体とを検体希釈倍率２００倍
で混合し、４０℃で４０秒反応させ、赤色半導体レーザ
ーを光源とするフローサイトメー夕で測定して高角（８
〜２０度）前方散乱光ヒストグラム及び低角（１〜６
度）前方散乱光−高角（８〜２０度）前方散乱光スキャ
ッタグラムを作成し、正常域を決定した。決定のため
に、６０検体の測定を行った。正常検体の一例を図１及
び図２に示す。図１に示すように、高角前方散乱光粒度
分布でほぼ正規分布に近いヒストグラムが得られる。な
お、図２などの２次元スッキャッタグラムでは、Ｘ軸に
低角前方散乱光を，Ｙ軸に高角前方散乱光をプロットし
た。

【００３５】形態異常の検出楕円赤血球、ウニ状赤血球、涙的赤血球、破砕赤血球、
大小不同赤血球の出現した検体を上記と同じ条件で測定
した。それぞれについて高角（８〜２０度）前方散乱光
ヒストグラム及び低角（１〜６度）前方散乱光−高角
（８〜２０度）前方散乱光スキャッタグラムを作成した
結果を図３〜図１２に示す。

【００３６】楕円赤血球、破砕赤血球では、高角前方散
乱光粒度分布で強度が低い方にヒストグラムの裾が広が
っている（図３、図９参照）。

【００３７】ウニ状赤血球、涙的赤血球、大小不同赤血
球では、粒度分布の分布幅（ヒストグラムの標準偏差、
または変動係数等）が正常より大きくなっている（図
５、図７、図１１参照）。

【００３８】また、低角前方散乱光と高角前方散乱光の
スキャッタグラムでは、正常検体ではほとんど出現しな
いところにドットが出現している（図４、図６、図８、
図１０及び図１２参照）。

【００３９】これらのデータからスキャッタグラム上
に、赤血球形態異常が出現する領域の摸式図を描くと図
１３のようになる。

【００４０】

【発明の効果】本発明によれば、フローサイトメータに
おいて光学的手段を用いることにより、従来では検出で
きなかった赤血球の形態異常を簡単に検出することがで
きる。これによって様々な疾患の診断のための情報を得
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】正常検体の高角前方散乱ヒストグラムである。

【図２】正常検体の低角前方散乱−高角前方散乱スキャ
ッタグラムである。

【図３】楕円赤血球の高角前方散乱ヒストグラムであ
る。

【図４】楕円赤血球の低角前方散乱−高角前方散乱スキ
ャッタグラムである。

【図５】ウニ状赤血球の高角前方散乱ヒストグラムであ
る。

【図６】ウニ状赤血球の低角前方散乱−高角前方散乱ス
キャッタグラムである。

【図７】涙的赤血球の高角前方散乱ヒストグラムであ
る。

【図８】涙的赤血球の低角前方散乱−高角前方散乱スキ
ャッタグラムである。

【図９】破砕赤血球の高角前方散乱ヒストグラムであ
る。

【図１０】破砕赤血球の低角前方散乱−高角前方散乱ス
キャッタグラムである。

【図１１】大小不同赤血球の高角前方散乱ヒストグラム
である。

【図１２】大小不同赤血球の低角前方散乱−高角前方散
乱スキャッタグラムである。

【図１３】赤血球形態異常の低角前方散乱−高角前方散
乱スキャッタグラムの摸式図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（１）赤血球を含む試料と球状化試薬と
を混合し、（２）前記工程で処理された試料をフローサイトメータ
の検出部に導入し、（３）前記試料より発せられる散乱光のうち、赤血球の
形態を反映する角度の散乱光を少なくとも１つ測定して
細胞分布データを得、そして（４）予め決定された正常赤血球の細胞分布データと比
較する、ことによって赤血球形態の異常を検出すること
を特徴とする赤血球形態異常の検出方法。
【請求項２】散乱光検出角度が光軸に対して８〜２０
度である請求項１記載の方法。
【請求項３】散乱光検出角度が光軸に対して７０〜１
１０度である請求項１記載の方法。
【請求項４】赤血球の大きさを反映する角度の散乱光
を測定する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項５】散乱光の測定を２つの角度で行い、赤血
球の形態を反映する第１の角度が８〜２０度であり、赤
血球の大きさを反映する第２の角度が１〜６度である請
求項４記載の方法。
【請求項６】散乱光の測定を２つの角度で行い、赤血
球の形態を反映する第１の角度が７０〜１１０度であ
り、赤血球の大きさを反映する第２の角度が１〜６度で
ある請求項４記載の方法。
【請求項７】球状化試薬が、赤血球を溶解せずに球状
化するのに有効な濃度の界面活性剤を含む請求項１記載
の方法。