JPH10309149A - 単球走化性蛋白質類およびその受容体トランスジェニック動物 - Google Patents
単球走化性蛋白質類およびその受容体トランスジェニック動物Info
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- JPH10309149A JPH10309149A JP10056312A JP5631298A JPH10309149A JP H10309149 A JPH10309149 A JP H10309149A JP 10056312 A JP10056312 A JP 10056312A JP 5631298 A JP5631298 A JP 5631298A JP H10309149 A JPH10309149 A JP H10309149A
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- Japan
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- monocyte chemotactic
- rat
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Abstract
(57)【要約】
【課題】外来性単球走化性蛋白質類または（および）そ
の受容体遺伝子を導入させた非ヒト哺乳動物。 【解決手段】本トランスジェニック動物は心疾患、呼吸
器系疾患、関節疾患、腎疾患、動脈硬化症、乾癬症、高
脂血症、アレルギー疾患、骨疾患、血液疾患、脳血管性
傷害、外傷性脳障害、感染症、痴呆症および慢性炎症性
疾患などの病態モデルとして病態機序の解明モデル、上
記疾患の治療モデルおよび治療薬開発における候補化合
物のスクリーニングおよびそれらのin vitro評価に使用
する目的で細胞供給に利用することができる。
の受容体遺伝子を導入させた非ヒト哺乳動物。 【解決手段】本トランスジェニック動物は心疾患、呼吸
器系疾患、関節疾患、腎疾患、動脈硬化症、乾癬症、高
脂血症、アレルギー疾患、骨疾患、血液疾患、脳血管性
傷害、外傷性脳障害、感染症、痴呆症および慢性炎症性
疾患などの病態モデルとして病態機序の解明モデル、上
記疾患の治療モデルおよび治療薬開発における候補化合
物のスクリーニングおよびそれらのin vitro評価に使用
する目的で細胞供給に利用することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は単球走化性蛋白質類
または（および）その受容体遺伝子を導入してなる動
物、その作成に用いるベクター、あるいはトランスジェ
ニックラットの作出方法に関するものである。
または（および）その受容体遺伝子を導入してなる動
物、その作成に用いるベクター、あるいはトランスジェ
ニックラットの作出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】トランスジェニック動物は、動物または
この動物の先祖の胚芽ラインの中へ初期（通常、単細
胞）発育段階において導入された遺伝子を有する。ワグ
ナー（Wagner）等［1981、プロシーデイングス オブ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Proc. Na
t. Acad. Sc. U.S.A.,）第78巻、第5016頁］およびスチ
ュワート（Stewart）等［1982、サイエンス（Scienc
e）、第217巻、第1046頁］は、ヒトグロビン遺伝子を含
有するトランスジェニックマウスを記載している。コン
スタンチーニ（Constantini）等［1981、ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）第２９４巻、第92頁］およびレーシー
（Lacy）等［1983、セル（Cell）第34巻、第343頁］
は、ウサギグロビン遺伝子を含有するトランスジェニッ
クマウスを記載している。マックナイト（McKnight）等
［1983、セル（Cell）第34巻、第335頁］はトランスフ
ェリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを記
載している。ブリンスター（Brinstar）等［1983、ネイ
チャー（Nature）第306巻、第332頁］は、機能的に導入
された免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニ
ックマウスを記載している。パルミター（Palmiter）等
［l982、ネイチャー（Nature）第300巻、第6ll頁］は、
重金属誘発性メタロチオネインプロモーター配列に連結
されたラット成長ホルモン遺伝子を含有するトランスジ
ェニックマウスを記載している。パルミター等［1982、
セル（Cell）第29巻、第701頁］は、メタロチオネイン
プロモーター配列に連結されたチミジンキナーぜ遺伝子
を含有するトランスジェニックマウスを記載している。
パルミター等［1983、サイエンス（Science）第222巻、
第809頁］は、メタロチオネインプロモーター配列に連
結されたヒト成長ホルモン遺伝子を含有するトランスジ
ェニックマウスを記載している。
この動物の先祖の胚芽ラインの中へ初期（通常、単細
胞）発育段階において導入された遺伝子を有する。ワグ
ナー（Wagner）等［1981、プロシーデイングス オブ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Proc. Na
t. Acad. Sc. U.S.A.,）第78巻、第5016頁］およびスチ
ュワート（Stewart）等［1982、サイエンス（Scienc
e）、第217巻、第1046頁］は、ヒトグロビン遺伝子を含
有するトランスジェニックマウスを記載している。コン
スタンチーニ（Constantini）等［1981、ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）第２９４巻、第92頁］およびレーシー
（Lacy）等［1983、セル（Cell）第34巻、第343頁］
は、ウサギグロビン遺伝子を含有するトランスジェニッ
クマウスを記載している。マックナイト（McKnight）等
［1983、セル（Cell）第34巻、第335頁］はトランスフ
ェリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを記
載している。ブリンスター（Brinstar）等［1983、ネイ
チャー（Nature）第306巻、第332頁］は、機能的に導入
された免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニ
ックマウスを記載している。パルミター（Palmiter）等
［l982、ネイチャー（Nature）第300巻、第6ll頁］は、
重金属誘発性メタロチオネインプロモーター配列に連結
されたラット成長ホルモン遺伝子を含有するトランスジ
ェニックマウスを記載している。パルミター等［1982、
セル（Cell）第29巻、第701頁］は、メタロチオネイン
プロモーター配列に連結されたチミジンキナーぜ遺伝子
を含有するトランスジェニックマウスを記載している。
パルミター等［1983、サイエンス（Science）第222巻、
第809頁］は、メタロチオネインプロモーター配列に連
結されたヒト成長ホルモン遺伝子を含有するトランスジ
ェニックマウスを記載している。
【０００３】一方、好中球に対して走化性を示すポリペ
プチド因子として松島（Matsushima）等（1987、ジャー
ナル オブ エクスペリメンタル メディスン（J. Ex
p. Med.）第169巻、第1485頁）がインターロイキン8
（一般にはIL-8と略される）を報告したが、以後、同様
に活性化したリンパ球などに特異的に発現する多くの遺
伝子がクローニングされた。これらは特定の白血球に対
して走化性を示すサイトカインということで、ケモカイ
ン（Chemokine）と呼ばれるようになった。ケモカイン
のひとつである単球走化活性化因子は松島（Matsushim
a）等（1989、ジャーナル オブ エクスペリメンタル
メディスン（J. Exp. Med.）第169巻、第1485頁）が
ヒト単球性白血球細胞株（THP-1）から単離し、続いてc
ＤＮＡのクローニングに成功した。一方、吉村（Yoshim
ura）等（1989、ジャーナルオブ エクスペリメンタル
メディスン（J. Exp. Med.）第169巻、第1449頁）も
ヒトグリオーマ細胞株（U-105MG）から単球走化活性化
因子を単離し、続いてcＤＮＡのクローニングに成功し
た。両者は同一のものであったが松島らはこの因子を単
球走化活性化因子（Monocyte Chemotactic and Activat
ing Factor、一般にはMCAFと略される）、吉村らは単球
走化性蛋白質（Monocyte ChemoattractantProtein 、一
般にはMCP-1と略される）とそれぞれ命名した。両者を
とってMCAF/MCP-1と呼ばれることもある。MCAF/MCP-1は
塩基性ヘパリン結合性ポリペプチドであり、分子中に４
つのシステインをもち、システインが２つ連続するサブ
ファミリーであるC-Cケモカインの一員（βケモカイン
とも呼ばれる）である。遺伝子の構造は翻訳後アミノ酸
末端（一般にN末端と略される）23個のアミノ酸からな
るプロペプチド部分が切断され、76個のアミノ酸からな
る成熟したタンパク質が生成、分泌されることが知られ
ている。その大きさは約8.7kDであり、リジン、アルギ
ニンの塩基性アミノ酸に富み、２個のS-S結合を有し、
ザングら（Zhang, et al.）（1995，モレキュラー ア
ンド セル バイオロジー（Mol. Cell Biol.）第15
巻、第4851頁）によれば、生物活性は2量体形成による
ことが知られている。
プチド因子として松島（Matsushima）等（1987、ジャー
ナル オブ エクスペリメンタル メディスン（J. Ex
p. Med.）第169巻、第1485頁）がインターロイキン8
（一般にはIL-8と略される）を報告したが、以後、同様
に活性化したリンパ球などに特異的に発現する多くの遺
伝子がクローニングされた。これらは特定の白血球に対
して走化性を示すサイトカインということで、ケモカイ
ン（Chemokine）と呼ばれるようになった。ケモカイン
のひとつである単球走化活性化因子は松島（Matsushim
a）等（1989、ジャーナル オブ エクスペリメンタル
メディスン（J. Exp. Med.）第169巻、第1485頁）が
ヒト単球性白血球細胞株（THP-1）から単離し、続いてc
ＤＮＡのクローニングに成功した。一方、吉村（Yoshim
ura）等（1989、ジャーナルオブ エクスペリメンタル
メディスン（J. Exp. Med.）第169巻、第1449頁）も
ヒトグリオーマ細胞株（U-105MG）から単球走化活性化
因子を単離し、続いてcＤＮＡのクローニングに成功し
た。両者は同一のものであったが松島らはこの因子を単
球走化活性化因子（Monocyte Chemotactic and Activat
ing Factor、一般にはMCAFと略される）、吉村らは単球
走化性蛋白質（Monocyte ChemoattractantProtein 、一
般にはMCP-1と略される）とそれぞれ命名した。両者を
とってMCAF/MCP-1と呼ばれることもある。MCAF/MCP-1は
塩基性ヘパリン結合性ポリペプチドであり、分子中に４
つのシステインをもち、システインが２つ連続するサブ
ファミリーであるC-Cケモカインの一員（βケモカイン
とも呼ばれる）である。遺伝子の構造は翻訳後アミノ酸
末端（一般にN末端と略される）23個のアミノ酸からな
るプロペプチド部分が切断され、76個のアミノ酸からな
る成熟したタンパク質が生成、分泌されることが知られ
ている。その大きさは約8.7kDであり、リジン、アルギ
ニンの塩基性アミノ酸に富み、２個のS-S結合を有し、
ザングら（Zhang, et al.）（1995，モレキュラー ア
ンド セル バイオロジー（Mol. Cell Biol.）第15
巻、第4851頁）によれば、生物活性は2量体形成による
ことが知られている。
【０００４】マウスにおいてはロリンズ（Rollins,B.
J.）等（1988、プロシーデイングスオブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス（Proc．Nat．Acad．S
c．U.S.A.）第85巻、第3738頁）が報告したJE遺伝子と
して知られていたものが、ヒトの単球走化活性化因子の
ホモローグであることがわかった。吉村（Yoshimura,
T.）等（1991、バイオケミカル アンド バイオフィジ
カル リサーチ コミュニケーション（Biochem. Bioph
ys. Res. Commun.）第174巻、第504頁）はラットにおけ
るホモローグを報告した。単球走化活性化因子遺伝子は
ヒトは第１７染色体、マウスは第４染色体に座乗し、３
個のエキソンおよび２個のイントロンからなり、AP-1,A
P-2,NF-κB,NF-IL6などの5′上流域には転写因子結合部
位が存在し、3′非翻訳領域にはATTTAモチーフが存在す
る。またcＤＮＡ上での塩基置換が知られている。
J.）等（1988、プロシーデイングスオブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス（Proc．Nat．Acad．S
c．U.S.A.）第85巻、第3738頁）が報告したJE遺伝子と
して知られていたものが、ヒトの単球走化活性化因子の
ホモローグであることがわかった。吉村（Yoshimura,
T.）等（1991、バイオケミカル アンド バイオフィジ
カル リサーチ コミュニケーション（Biochem. Bioph
ys. Res. Commun.）第174巻、第504頁）はラットにおけ
るホモローグを報告した。単球走化活性化因子遺伝子は
ヒトは第１７染色体、マウスは第４染色体に座乗し、３
個のエキソンおよび２個のイントロンからなり、AP-1,A
P-2,NF-κB,NF-IL6などの5′上流域には転写因子結合部
位が存在し、3′非翻訳領域にはATTTAモチーフが存在す
る。またcＤＮＡ上での塩基置換が知られている。
【０００５】単球走化活性化因子はTNF-αまたはリポポ
リサッカライド（一般にはLPSと略される）で刺激をう
けて産生されることが知られている。現在知られている
単球走化活性因子の生物活性としては、（1）走化性亢
進作用、（2）リソゾーム酵素の産生放出作用、（3）IL
-1およびIL-6産生亢進、（4）抗腫瘍活性増強作用、お
よび（5）接着分子（CD11b/c）発現亢進作用などが知ら
れている。また単球走化活性因子の好塩基球に対する生
物活性としては、（1）走化性亢進作用、（2）ヒスタミ
ン放出亢進作用、および（4）脱顆粒作用などをもつこ
とが知られている。さらに単球走化活性因子はＴ細胞の
走化因子であることも知られており、ディボイ（Duboi,
P.M.）等（1996、ジャーナル オブ イミュノロジー
（J. Immunol.）第156巻、第1356頁）は単球走化活性化
因子がMAPキナーゼの活性化を引き起こすことを報告
し、デルポゾ（del Pozo,M.A.）等（1995、ジャーナル
オブセル バイオロジー（J. Cell Biol.）第131巻、
第495頁）は単球走化活性化因子がC-Cケモカインのひと
つであるRANTES（Regulated upon Activation, NormalT
Expressed and presumably Secreted）とともにＴ細胞
の突起形成および細胞表面のCAM3の再分布を誘導するこ
とを報告した。また、単球走化活性化因子のシグナル伝
達機構についても盛んに研究されている。
リサッカライド（一般にはLPSと略される）で刺激をう
けて産生されることが知られている。現在知られている
単球走化活性因子の生物活性としては、（1）走化性亢
進作用、（2）リソゾーム酵素の産生放出作用、（3）IL
-1およびIL-6産生亢進、（4）抗腫瘍活性増強作用、お
よび（5）接着分子（CD11b/c）発現亢進作用などが知ら
れている。また単球走化活性因子の好塩基球に対する生
物活性としては、（1）走化性亢進作用、（2）ヒスタミ
ン放出亢進作用、および（4）脱顆粒作用などをもつこ
とが知られている。さらに単球走化活性因子はＴ細胞の
走化因子であることも知られており、ディボイ（Duboi,
P.M.）等（1996、ジャーナル オブ イミュノロジー
（J. Immunol.）第156巻、第1356頁）は単球走化活性化
因子がMAPキナーゼの活性化を引き起こすことを報告
し、デルポゾ（del Pozo,M.A.）等（1995、ジャーナル
オブセル バイオロジー（J. Cell Biol.）第131巻、
第495頁）は単球走化活性化因子がC-Cケモカインのひと
つであるRANTES（Regulated upon Activation, NormalT
Expressed and presumably Secreted）とともにＴ細胞
の突起形成および細胞表面のCAM3の再分布を誘導するこ
とを報告した。また、単球走化活性化因子のシグナル伝
達機構についても盛んに研究されている。
【０００６】また単球由来細胞THP-1上には13,000個の
受容体が存在し、Kd値0.26nMの親和性を有し、このcDNA
はシャロら（Charo, et al.)（1994、プロシーデイング
スオブ ナショナル・アカデミー オブ サイエンス
（P．N．A．S．U．S．A．）第91巻、第2752頁）はクロ
ーニングを行った。この構造解析から７回膜貫通部位を
有するGタンパク結合型のレセプターであり、受容体は
カルボキシル末端においてオルタナティヴスプライシン
グによる２個のアイソフォームが存在することがわかっ
た。C-Cケモカイン受容体タイプ2A（一般にはCCCK2A、C
CR2AあるいはCCR2と呼ばれている）C-Cケモカイン受容
体タイプ2B（一般にはCCCK2B、CCR2BあるいはCCR2と呼
ばれている）。これは単球走化性蛋白質−２(Monocyte
Chemoattractant Protein -2、一般にMCP-2と呼ばれて
いる）、単球走化性蛋白質−３（Monocyte Chemoattrac
tant Protein -3、一般にMCP-3と呼ばれている)、単球
走化性蛋白質−４（Monocyte Chemoattractant Protein
-4、一般にMCP-4と呼ばれている)あるいは単球走化性
蛋白質−５（Monocyte Chemoattractant Protein -5、
一般にMCP-5と呼ばれている)(Luster,A.D., The New En
gland Journal of Medicine, Vol., 436頁,1988年)とも
親和性を有することが知られている。先にクローニング
されたC-Cケモカイン受容体タイプ1（一般にはCCCK1、C
CR1あるいはCCR1と呼ばれている）と51％の相同性を示
した。モンテクラロら(Monteclaro, et al.) （1996、
ザ ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリー
（The Journal of Biological Chemistry）第272巻、第
23186頁） はリガンドとの結合実験において35アミノ末
端が高い結合能を持つ必須な領域であることを示した。
同受容体を遺伝子導入した細胞を用いてＭＣＰ−１の濃
度依存的にカルシウム濃度が上昇し、ＭＡＰキナーゼの
活性化を促進することが知られている。またＴ細胞突起
形成および細胞表面の接着分子ＩＣＡＭ−３ の再分布
を誘起することがデル ポゾら(del Pozo et al.) （19
95、ジャーナル オブ セル バイオロジー（Journal
of Cell Biology）第131巻、第495頁） により報告
された。
受容体が存在し、Kd値0.26nMの親和性を有し、このcDNA
はシャロら（Charo, et al.)（1994、プロシーデイング
スオブ ナショナル・アカデミー オブ サイエンス
（P．N．A．S．U．S．A．）第91巻、第2752頁）はクロ
ーニングを行った。この構造解析から７回膜貫通部位を
有するGタンパク結合型のレセプターであり、受容体は
カルボキシル末端においてオルタナティヴスプライシン
グによる２個のアイソフォームが存在することがわかっ
た。C-Cケモカイン受容体タイプ2A（一般にはCCCK2A、C
CR2AあるいはCCR2と呼ばれている）C-Cケモカイン受容
体タイプ2B（一般にはCCCK2B、CCR2BあるいはCCR2と呼
ばれている）。これは単球走化性蛋白質−２(Monocyte
Chemoattractant Protein -2、一般にMCP-2と呼ばれて
いる）、単球走化性蛋白質−３（Monocyte Chemoattrac
tant Protein -3、一般にMCP-3と呼ばれている)、単球
走化性蛋白質−４（Monocyte Chemoattractant Protein
-4、一般にMCP-4と呼ばれている)あるいは単球走化性
蛋白質−５（Monocyte Chemoattractant Protein -5、
一般にMCP-5と呼ばれている)(Luster,A.D., The New En
gland Journal of Medicine, Vol., 436頁,1988年)とも
親和性を有することが知られている。先にクローニング
されたC-Cケモカイン受容体タイプ1（一般にはCCCK1、C
CR1あるいはCCR1と呼ばれている）と51％の相同性を示
した。モンテクラロら(Monteclaro, et al.) （1996、
ザ ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリー
（The Journal of Biological Chemistry）第272巻、第
23186頁） はリガンドとの結合実験において35アミノ末
端が高い結合能を持つ必須な領域であることを示した。
同受容体を遺伝子導入した細胞を用いてＭＣＰ−１の濃
度依存的にカルシウム濃度が上昇し、ＭＡＰキナーゼの
活性化を促進することが知られている。またＴ細胞突起
形成および細胞表面の接着分子ＩＣＡＭ−３ の再分布
を誘起することがデル ポゾら(del Pozo et al.) （19
95、ジャーナル オブ セル バイオロジー（Journal
of Cell Biology）第131巻、第495頁） により報告
された。
【０００７】フラドら(Frade, et al.)（1997、ザ
ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーショ
ン（The Journal of Clinical Investigation）第100
巻、第497頁）は単核球における免疫不全ウィルス タ
イプ１(一般にはHIV-1と呼ばれている)の複製に及ぼす
ＭＣＰ−１および同受容体モノクローナル抗体の影響を
調べた。その結果、ＨＩＶ−１の抑制作用および同受容
体アミノ末端のモノクローナル抗体はＭＣＰ−１と同様
ＨＩＶ−１の抑制作用を示した。彼らは同受容体がＣ×
Ｃケモカイン受容体タイプ4（一般にはC×CR4と呼ばれ
ることが多い）、Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ5（一
般にはCCCK5、CCR5あるいはCCR5と呼ばれている）とと
もにＭ、ＴトロピックＨＩＶ−１感染のコファクターと
して作用することを示唆した。スミスら(Smith, et a
l.) (1997、サイエンス(Science) 第277巻、第959頁）
は同受容体の64番目のアミノ酸バリンがイソロイシンへ
の変異を有するＨＩＶ−１感染者はその変異はＨＩＶ−
１感染には影響はないが、後天性免疫不全症候群(一般
にはAIDSと呼ばれている)の進行は他の患者に比較して
２〜４年遅くなることが明らかにした。さらに長期生存
AIDS患者の28-29％がＣ−Ｃケモカイン受容体タイプ５
欠損を有する者か64番目アミノ酸変異を有する者である
ことを示した。しかし、ミカエルら(Michael, et al.)
(1997、ネイチャー メディスン(Nature Medicine)第3
巻、第1160頁）は同受容体のアミノ酸変異はHIV-1のプ
ラズマ中のHIV-1の増殖に変化がみられないことを示
し、その変異がおよぼすAIDS進行への影響はないことを
示唆した。
ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーショ
ン（The Journal of Clinical Investigation）第100
巻、第497頁）は単核球における免疫不全ウィルス タ
イプ１(一般にはHIV-1と呼ばれている)の複製に及ぼす
ＭＣＰ−１および同受容体モノクローナル抗体の影響を
調べた。その結果、ＨＩＶ−１の抑制作用および同受容
体アミノ末端のモノクローナル抗体はＭＣＰ−１と同様
ＨＩＶ−１の抑制作用を示した。彼らは同受容体がＣ×
Ｃケモカイン受容体タイプ4（一般にはC×CR4と呼ばれ
ることが多い）、Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ5（一
般にはCCCK5、CCR5あるいはCCR5と呼ばれている）とと
もにＭ、ＴトロピックＨＩＶ−１感染のコファクターと
して作用することを示唆した。スミスら(Smith, et a
l.) (1997、サイエンス(Science) 第277巻、第959頁）
は同受容体の64番目のアミノ酸バリンがイソロイシンへ
の変異を有するＨＩＶ−１感染者はその変異はＨＩＶ−
１感染には影響はないが、後天性免疫不全症候群(一般
にはAIDSと呼ばれている)の進行は他の患者に比較して
２〜４年遅くなることが明らかにした。さらに長期生存
AIDS患者の28-29％がＣ−Ｃケモカイン受容体タイプ５
欠損を有する者か64番目アミノ酸変異を有する者である
ことを示した。しかし、ミカエルら(Michael, et al.)
(1997、ネイチャー メディスン(Nature Medicine)第3
巻、第1160頁）は同受容体のアミノ酸変異はHIV-1のプ
ラズマ中のHIV-1の増殖に変化がみられないことを示
し、その変異がおよぼすAIDS進行への影響はないことを
示唆した。
【０００８】マウス単球走化活性化因子受容体(JE受容
体と呼ばれることがある)はボーリングら(Boring, et a
l.）（ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（J. Biol. Chem.）第271巻、第7551頁）によってク
ローニングされた。 JE受容体は373アミノ酸をコード
し、その疎水性から7回膜貫通型であることが示唆さ
れ、ヒト単球走化活性化因子受容体と75％の相同性を有
していた。特にカルボキシル末端はC-Cケモカイン受容
体タイプ2Bと81％の相同性を有していた。単球走化活性
化因子受容体について同著者ら(Boring, et al.)（199
7、ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティ
ゲーション（The Journal of Clinical Investigatio
n）第100巻、第2552頁）はその遺伝子欠損マウスを作出
した。このホモ欠損マウスは正常に生育したが、 単球
走化性化因子 (MCP-1)に対する単球走化性は減少してい
た。さらに正常動物と比較してリンパ節でのインターフ
ェロンγの激減による顆粒球サイズの減少が観察され、
Th-1型サイトカインの感受性および産生に重要な役割を
果たしていることがわかった。マウス以外では同受容体
のホモローグは知られていないが、ボニニら(Bonini,et
al.) （1997、ディネヌエー アンド セル バイオロ
ジー（DNA and CellBiology）第16巻、第1249頁）はヒ
トのMCP-1、MCP-3に対して高い結合能を有する受容体(C
CR10)をクローニングした。さらに同著者ら(Bonini, et
al.)（1997、ディネヌエー アンド セル バイオロ
ジー（DNA and Cell Biology）第16巻、第1023頁）はラ
ットにおいてヒトのＭＣＰ−１、ＭＩＰ-１βに対して
高い結合能を有する受容体(rCCR10rR)をクローニングし
た。このrCCR10rRはＲＮＡレベルでは心臓、脳、脾臓、
肺、肝臓、筋肉での発現がみられた。それ以外にも単球
走化活性化因子と親和性を持つ２個の受容体C-Cケモカ
イン受容体タイプ４（一般にはCCCK4と呼ばれている）
およびDuffy antigen/chemokine受容体（一般にはDARC
と呼ばれている）が現在知られているが、そのリガンド
受容体の相互作用性の差異は明らかではない。
体と呼ばれることがある)はボーリングら(Boring, et a
l.）（ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（J. Biol. Chem.）第271巻、第7551頁）によってク
ローニングされた。 JE受容体は373アミノ酸をコード
し、その疎水性から7回膜貫通型であることが示唆さ
れ、ヒト単球走化活性化因子受容体と75％の相同性を有
していた。特にカルボキシル末端はC-Cケモカイン受容
体タイプ2Bと81％の相同性を有していた。単球走化活性
化因子受容体について同著者ら(Boring, et al.)（199
7、ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティ
ゲーション（The Journal of Clinical Investigatio
n）第100巻、第2552頁）はその遺伝子欠損マウスを作出
した。このホモ欠損マウスは正常に生育したが、 単球
走化性化因子 (MCP-1)に対する単球走化性は減少してい
た。さらに正常動物と比較してリンパ節でのインターフ
ェロンγの激減による顆粒球サイズの減少が観察され、
Th-1型サイトカインの感受性および産生に重要な役割を
果たしていることがわかった。マウス以外では同受容体
のホモローグは知られていないが、ボニニら(Bonini,et
al.) （1997、ディネヌエー アンド セル バイオロ
ジー（DNA and CellBiology）第16巻、第1249頁）はヒ
トのMCP-1、MCP-3に対して高い結合能を有する受容体(C
CR10)をクローニングした。さらに同著者ら(Bonini, et
al.)（1997、ディネヌエー アンド セル バイオロ
ジー（DNA and Cell Biology）第16巻、第1023頁）はラ
ットにおいてヒトのＭＣＰ−１、ＭＩＰ-１βに対して
高い結合能を有する受容体(rCCR10rR)をクローニングし
た。このrCCR10rRはＲＮＡレベルでは心臓、脳、脾臓、
肺、肝臓、筋肉での発現がみられた。それ以外にも単球
走化活性化因子と親和性を持つ２個の受容体C-Cケモカ
イン受容体タイプ４（一般にはCCCK4と呼ばれている）
およびDuffy antigen/chemokine受容体（一般にはDARC
と呼ばれている）が現在知られているが、そのリガンド
受容体の相互作用性の差異は明らかではない。
【０００９】疾患との関係においては結核性胸膜炎、肺
線維症、慢性関節リュウマチ、糸球体腎炎、IgA腎症、
動脈硬化症、 乾癬症などの疾患において単球走化活性
化因子の発現が確認されている。高脂血症、動脈硬化に
おいては動脈中脈平滑筋細胞、内膜マクロファージ、血
管内皮細胞において単球走化活性化因子の発現が確認さ
れ、単球走化活性化因子が血管平滑筋細胞増殖抑制の役
割を果たしているという報告もある。慢性心不全患者の
心筋においては単球走化活性化因子ｍＲＮＡの発現がみ
られ、(Seino)等（1995、サイトカイン(Cytokine)第7
巻、第301頁）、急性心不全患者の血中においても単球
走化活性化因子ｍＲＮＡの発現が上昇することが知られ
ている。松島（Matsushima, K.)等（1996、ファセブ
ジャーナル (FASEB J.)第10巻、第1418頁)はラット急性
糸球体腎炎モデルにおいてMCP-1中和抗体が病態を改善
することを示した。感染症、アレルギー疾患、骨疾患、
敗血症、慢性歯肉炎、痴呆症、外傷性脳障害（グラビン
スキー（Glabinski,A.R.)等（1996、ジャーナル オブ
イミュノロジー(J. Immunol.)第156巻、第4363頁）な
どとの関連性も示唆されている。単球走化活性化因子の
トランスジェニックマウスには次の報告がある。中村
（Nakamura, K.）等（1995、ジャーナル オブ インベ
ジュティブ デルマトロジー(J. Invest. Dermatol.)第
105巻、第635頁）は皮膚で発現するJEトランスジェニッ
クマウスが組織学的に単核球の浸潤を認めたことを報告
した。ルトリッジ（Rutledge,B.)等（1995、ジャーナル
オブ イミュノロジー(J.Immunol.)第155巻、第4838
頁）はJEトランスジェニックマウスがListeriaおよびMy
cobacteriumに感受性が高いことを報告した。フエンテ
ス（Fuentes,M.E.)等（1995、ジャーナル オブ イミ
ュノロジー(J. Immunol.)第155巻、第5769頁）は胸腺お
よび脳で発現するJEトランスジェニックマウスで単核球
数が増加することを報告した。さらに同グループのグレ
ワル（Grewal, I.S.)等（1997、ジャーナル オブ イ
ミュノロジー(J. Immunol.)第159巻、第401頁）は膵島
に発現するJEトランスジェニックマウスを作出し、フエ
ンテス等のマウスと交配で、両トランスジェニックマウ
スを作出した。しかし、膵島においてほとんど細胞浸潤
は観察されなかった。岩淵等（1995年度日本免疫学会講
演要旨集）はヒト単球走化活性化因子のトランスジェニ
ックマウスを作出し、胸腺、脾臓、肝臓および精巣でｍ
ＲＮＡレベルの遺伝子発現および血中濃度11,492pg/ml
のヒト単球走化活性化因子を確認した。グン（Gunn,M.
D.)等（1997、ジャーナル オブ イミュノロジー(J. I
mmunol.)第158巻、第376頁）のヒト単球走化活性化因子
トランスジェニック動物はII型肺胞上皮および気管支上
皮で発現するもので肺胞内での白血球の増加と単球およ
びT細胞の増加が認められた。マウス以外のトランスジ
ェニック動物、単球走化活性化因子受容体のトランスジ
ェニック動物、あるいは単球走化活性化因子および単球
走化活性化因子受容体両トランスジェニック動物は現在
まで報告されていない。
線維症、慢性関節リュウマチ、糸球体腎炎、IgA腎症、
動脈硬化症、 乾癬症などの疾患において単球走化活性
化因子の発現が確認されている。高脂血症、動脈硬化に
おいては動脈中脈平滑筋細胞、内膜マクロファージ、血
管内皮細胞において単球走化活性化因子の発現が確認さ
れ、単球走化活性化因子が血管平滑筋細胞増殖抑制の役
割を果たしているという報告もある。慢性心不全患者の
心筋においては単球走化活性化因子ｍＲＮＡの発現がみ
られ、(Seino)等（1995、サイトカイン(Cytokine)第7
巻、第301頁）、急性心不全患者の血中においても単球
走化活性化因子ｍＲＮＡの発現が上昇することが知られ
ている。松島（Matsushima, K.)等（1996、ファセブ
ジャーナル (FASEB J.)第10巻、第1418頁)はラット急性
糸球体腎炎モデルにおいてMCP-1中和抗体が病態を改善
することを示した。感染症、アレルギー疾患、骨疾患、
敗血症、慢性歯肉炎、痴呆症、外傷性脳障害（グラビン
スキー（Glabinski,A.R.)等（1996、ジャーナル オブ
イミュノロジー(J. Immunol.)第156巻、第4363頁）な
どとの関連性も示唆されている。単球走化活性化因子の
トランスジェニックマウスには次の報告がある。中村
（Nakamura, K.）等（1995、ジャーナル オブ インベ
ジュティブ デルマトロジー(J. Invest. Dermatol.)第
105巻、第635頁）は皮膚で発現するJEトランスジェニッ
クマウスが組織学的に単核球の浸潤を認めたことを報告
した。ルトリッジ（Rutledge,B.)等（1995、ジャーナル
オブ イミュノロジー(J.Immunol.)第155巻、第4838
頁）はJEトランスジェニックマウスがListeriaおよびMy
cobacteriumに感受性が高いことを報告した。フエンテ
ス（Fuentes,M.E.)等（1995、ジャーナル オブ イミ
ュノロジー(J. Immunol.)第155巻、第5769頁）は胸腺お
よび脳で発現するJEトランスジェニックマウスで単核球
数が増加することを報告した。さらに同グループのグレ
ワル（Grewal, I.S.)等（1997、ジャーナル オブ イ
ミュノロジー(J. Immunol.)第159巻、第401頁）は膵島
に発現するJEトランスジェニックマウスを作出し、フエ
ンテス等のマウスと交配で、両トランスジェニックマウ
スを作出した。しかし、膵島においてほとんど細胞浸潤
は観察されなかった。岩淵等（1995年度日本免疫学会講
演要旨集）はヒト単球走化活性化因子のトランスジェニ
ックマウスを作出し、胸腺、脾臓、肝臓および精巣でｍ
ＲＮＡレベルの遺伝子発現および血中濃度11,492pg/ml
のヒト単球走化活性化因子を確認した。グン（Gunn,M.
D.)等（1997、ジャーナル オブ イミュノロジー(J. I
mmunol.)第158巻、第376頁）のヒト単球走化活性化因子
トランスジェニック動物はII型肺胞上皮および気管支上
皮で発現するもので肺胞内での白血球の増加と単球およ
びT細胞の増加が認められた。マウス以外のトランスジ
ェニック動物、単球走化活性化因子受容体のトランスジ
ェニック動物、あるいは単球走化活性化因子および単球
走化活性化因子受容体両トランスジェニック動物は現在
まで報告されていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従って、病態モデルと
なるような、単球走化性化因子（ＭＣＰ−１）をはじめ
とする単球走化性蛋白質類（Monocyte Chemoattractant
Proteins）の遺伝子、またはその変異遺伝子を組み込
んだＤＮＡを有するトランスジェニック動物の作製に成
功すれば、単球走化性蛋白質類の機能を解明、心疾患
（例えば、心筋梗塞、急性心不全、慢性心不全、心筋炎
など）、感染性疾患（例えば後天性免疫不全症候群な
ど）、アレルギー疾患（例えば喘息、アレルギー性鼻
炎、アトピー性皮肩炎など）、高脂血症、動脈硬化症、
関節疾患（例えば関節リュウマチ、変形性関節症な
ど）、骨疾患（例えぱ骨粗髷症、くる病、骨軟化症、低
カルシユウム血症など）腎疾患（例えば、腎不全、糸球
体腎炎、IgA腎症など）、サルコイドーシス、敗血症、
呼吸器疾患（例えぱ肺線維症、肺炎など）、慢性的炎症
性疾患（例えば慢性歯肉炎など）、脳血管性傷害、痴呆
症、外傷性脳障害などにおける炎症性機序の解明および
臨床上の治療方法の検討、遺伝子高発現細胞の供給、単
球走化性蛋白質類受容体のリガンド結合の研究、他のケ
モカインとの相互作用の研究などが可能になると考えら
れる。また、外来性単球走化性蛋白質類または（およ
び）その受容体遣伝子を含有し、哺乳動物において発現
しうるベクターを用いることにより、これら遺伝子の欠
損にかかわる疾患の遺伝子治療を可能ならしめる。さら
にヒト型単球走化性蛋白質類遺伝子およびそのヒト型受
容体遺伝子を組み込んだＤＮＡを有するトランスジェニ
ック非ヒト哺乳動物の作製に成功すれば、上記疾患のモ
デル動物に応用することにより単球走化性蛋白質類の機
能解明をヒト受容体レベルで行うことが可能になり、ま
た臨床治療方法、治療薬の開発検討に用いることが可能
になると考えられる。
なるような、単球走化性化因子（ＭＣＰ−１）をはじめ
とする単球走化性蛋白質類（Monocyte Chemoattractant
Proteins）の遺伝子、またはその変異遺伝子を組み込
んだＤＮＡを有するトランスジェニック動物の作製に成
功すれば、単球走化性蛋白質類の機能を解明、心疾患
（例えば、心筋梗塞、急性心不全、慢性心不全、心筋炎
など）、感染性疾患（例えば後天性免疫不全症候群な
ど）、アレルギー疾患（例えば喘息、アレルギー性鼻
炎、アトピー性皮肩炎など）、高脂血症、動脈硬化症、
関節疾患（例えば関節リュウマチ、変形性関節症な
ど）、骨疾患（例えぱ骨粗髷症、くる病、骨軟化症、低
カルシユウム血症など）腎疾患（例えば、腎不全、糸球
体腎炎、IgA腎症など）、サルコイドーシス、敗血症、
呼吸器疾患（例えぱ肺線維症、肺炎など）、慢性的炎症
性疾患（例えば慢性歯肉炎など）、脳血管性傷害、痴呆
症、外傷性脳障害などにおける炎症性機序の解明および
臨床上の治療方法の検討、遺伝子高発現細胞の供給、単
球走化性蛋白質類受容体のリガンド結合の研究、他のケ
モカインとの相互作用の研究などが可能になると考えら
れる。また、外来性単球走化性蛋白質類または（およ
び）その受容体遣伝子を含有し、哺乳動物において発現
しうるベクターを用いることにより、これら遺伝子の欠
損にかかわる疾患の遺伝子治療を可能ならしめる。さら
にヒト型単球走化性蛋白質類遺伝子およびそのヒト型受
容体遺伝子を組み込んだＤＮＡを有するトランスジェニ
ック非ヒト哺乳動物の作製に成功すれば、上記疾患のモ
デル動物に応用することにより単球走化性蛋白質類の機
能解明をヒト受容体レベルで行うことが可能になり、ま
た臨床治療方法、治療薬の開発検討に用いることが可能
になると考えられる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究した結果、外来性単球走化
性蛋白質類または（および）その受容体遺伝子、もしく
はそれらの変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する外来
性単球走化性蛋白質類または（および）その受容体遺伝
子を導入させた動物の作製に成功し、さらに鋭意検討し
た結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明
は、（１）外来性単球走化性化蛋白質類または（およ
び）その受容体遺伝子、もしくはそれらの変異遺伝子を
組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（但し、外来
性マウスまたはヒト単球走化性蛋白質ー１遺伝子を導入
されたマウスを除く）、（２）非ヒト哺乳動物がウサ
ギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ヒ
ツジ、ウシまたはラットである上項（１）記載の動物、
（３）非ヒト哺乳動物がラットである上項（１）記載の
動物、（４）単球走化性蛋白質類がＣーＣケモカイン受
容体と結合する能力を有し、かつ単球走化性を示す蛋白
質または（および）その受容体である上項（１）記載の
非ヒト哺乳動物、（５）単球走化性蛋白質類または（お
よび）その受容体が単球走化性蛋白質−１、単球走化性
蛋白質−２、単球走化性蛋白質−３、単球走化性蛋白質
−４または単球走化性蛋白質−５、または（および）そ
れらの受容体である上項（１）記載の非ヒト哺乳動物、
（６）単球走化性蛋白質類または（および）その受容体
が単球走化性蛋白質−１または（および）その受容体で
ある上項（１）記載の非ヒト哺乳動物、（７）サイトメ
ガロウイルスプロモーターの下流に外来性単球走化性蛋
白質類または（および）その受容体遺伝子、もしくはそ
れらの変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺
乳動物、（８）単球走化性蛋白質類遺伝子がラットまた
はヒト単球走化性蛋白質類遺伝子である上項（５）記載
の動物、（９）外来性ラットまたはヒト単球走化性蛋白
質類または（および）その受容体遺伝子、もしくはそれ
らの変異遺伝子を含有し、哺乳動物において発現しうる
ベクター（但し、単球走化性蛋白質類がマウスまたはヒ
ト単球走化性蛋白質−１であり、マウスにおける発現の
ために用いられるベクターを除く）、（１０）サイトメ
ガロウイルスプロモーターの下流に外来性単球走化性蛋
白質類または（および）その受容体遺伝子、もしくはそ
れらの変異遺伝子を含有し、哺乳動物において発現し得
るベクター、（１１）単球走化性蛋白質類または（およ
び）その受容体遺伝子がラットまたはヒト単球走化性化
蛋白質類または（および）その受容体遺伝子である上項
（９）記載のベクター、（１２）卵胞刺激ホルモン約２
０ないし約５０ＩＵ／個体を投与した後に黄体形成ホル
モン約０ないし約１０ＩＵ／個体を投与した雌ラットを
雄ラットと交配させることを特徴とするトランスジェニ
ックラットの作製方法、（１３）黄体形成ホルモン放出
ホルモンあるいはその類縁体を投与後、雄ラットと交配
させた偽妊娠ラットに外来性遺伝子を導入した受精卵を
着床させることを特徴とするトランスジェニックラット
の作製方法、および（１４）外来性遺伝子が単球走化性
蛋白質類または（および）その受容体遺伝子である上項
（１３）記載の作成方法、を提供するものである。
題を解決するために鋭意研究した結果、外来性単球走化
性蛋白質類または（および）その受容体遺伝子、もしく
はそれらの変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する外来
性単球走化性蛋白質類または（および）その受容体遺伝
子を導入させた動物の作製に成功し、さらに鋭意検討し
た結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明
は、（１）外来性単球走化性化蛋白質類または（およ
び）その受容体遺伝子、もしくはそれらの変異遺伝子を
組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（但し、外来
性マウスまたはヒト単球走化性蛋白質ー１遺伝子を導入
されたマウスを除く）、（２）非ヒト哺乳動物がウサ
ギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ヒ
ツジ、ウシまたはラットである上項（１）記載の動物、
（３）非ヒト哺乳動物がラットである上項（１）記載の
動物、（４）単球走化性蛋白質類がＣーＣケモカイン受
容体と結合する能力を有し、かつ単球走化性を示す蛋白
質または（および）その受容体である上項（１）記載の
非ヒト哺乳動物、（５）単球走化性蛋白質類または（お
よび）その受容体が単球走化性蛋白質−１、単球走化性
蛋白質−２、単球走化性蛋白質−３、単球走化性蛋白質
−４または単球走化性蛋白質−５、または（および）そ
れらの受容体である上項（１）記載の非ヒト哺乳動物、
（６）単球走化性蛋白質類または（および）その受容体
が単球走化性蛋白質−１または（および）その受容体で
ある上項（１）記載の非ヒト哺乳動物、（７）サイトメ
ガロウイルスプロモーターの下流に外来性単球走化性蛋
白質類または（および）その受容体遺伝子、もしくはそ
れらの変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺
乳動物、（８）単球走化性蛋白質類遺伝子がラットまた
はヒト単球走化性蛋白質類遺伝子である上項（５）記載
の動物、（９）外来性ラットまたはヒト単球走化性蛋白
質類または（および）その受容体遺伝子、もしくはそれ
らの変異遺伝子を含有し、哺乳動物において発現しうる
ベクター（但し、単球走化性蛋白質類がマウスまたはヒ
ト単球走化性蛋白質−１であり、マウスにおける発現の
ために用いられるベクターを除く）、（１０）サイトメ
ガロウイルスプロモーターの下流に外来性単球走化性蛋
白質類または（および）その受容体遺伝子、もしくはそ
れらの変異遺伝子を含有し、哺乳動物において発現し得
るベクター、（１１）単球走化性蛋白質類または（およ
び）その受容体遺伝子がラットまたはヒト単球走化性化
蛋白質類または（および）その受容体遺伝子である上項
（９）記載のベクター、（１２）卵胞刺激ホルモン約２
０ないし約５０ＩＵ／個体を投与した後に黄体形成ホル
モン約０ないし約１０ＩＵ／個体を投与した雌ラットを
雄ラットと交配させることを特徴とするトランスジェニ
ックラットの作製方法、（１３）黄体形成ホルモン放出
ホルモンあるいはその類縁体を投与後、雄ラットと交配
させた偽妊娠ラットに外来性遺伝子を導入した受精卵を
着床させることを特徴とするトランスジェニックラット
の作製方法、および（１４）外来性遺伝子が単球走化性
蛋白質類または（および）その受容体遺伝子である上項
（１３）記載の作成方法、を提供するものである。
【００１２】本発明において、単球走化性蛋白質類とは
Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ２と結合する能力を有し
かつ単球走化活性を有する蛋白質を包含する。その例と
しては、ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３、ＭＣＰ
−４あるいはＭＣＰ−５が挙げられる。また単球走化性
蛋白質類の受容体とは、上記蛋白質に対応する受容体を
いう。本発明のトランスジェニック動物は、未受精卵、
受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに
対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚
発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細
胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において、リン酸
カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝
集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン
法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とする遺
伝子を導入することにより作出される。また、該遺伝子
導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに
目的とする単球走化性蛋白質または（および）その受容
体遺伝子を転移し、細胞培養、組織培養などに利用する
こともでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自
体公知の細胞配合法により融合させることによりトラン
スジェニック動物を作出することもできる。
Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ２と結合する能力を有し
かつ単球走化活性を有する蛋白質を包含する。その例と
しては、ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３、ＭＣＰ
−４あるいはＭＣＰ−５が挙げられる。また単球走化性
蛋白質類の受容体とは、上記蛋白質に対応する受容体を
いう。本発明のトランスジェニック動物は、未受精卵、
受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに
対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚
発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細
胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において、リン酸
カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝
集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン
法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とする遺
伝子を導入することにより作出される。また、該遺伝子
導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに
目的とする単球走化性蛋白質または（および）その受容
体遺伝子を転移し、細胞培養、組織培養などに利用する
こともでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自
体公知の細胞配合法により融合させることによりトラン
スジェニック動物を作出することもできる。
【００１３】本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」
としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、
ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス（但
し、Ｔｇｍ系マウスを除く）などがあげられる。なかで
もウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターまたは
ラット、とりわけラット（Wistar，SDなど）、特にWist
ar系統のラットが疾患モデル動物として最も好ましい対
象動物である。本発明で対象とし得る「哺乳動物」とし
ては、上記の「非ヒト哺乳動物」の他にヒトなどがあげ
られる。本発明の外来性単球走化性蛋白質類またはその
受容体遺伝子の変異遺伝子としては、元の外来性単球走
化性蛋白質遺伝子のＤＮＡ配列に変異（例えば、突然変
異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠
損、他の塩基への置換などが生じた遺伝子が挙げられ
る。より具体的には、該塩基の付加、欠損、他の塩基へ
の置換の結果、単球走化性蛋白質を構成するアミノ酸配
列において、１ないし５個（好ましくは１または２個）
のアミノ酸に置換、付加または欠損が生じるように変異
させることが好ましい。
としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、
ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス（但
し、Ｔｇｍ系マウスを除く）などがあげられる。なかで
もウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターまたは
ラット、とりわけラット（Wistar，SDなど）、特にWist
ar系統のラットが疾患モデル動物として最も好ましい対
象動物である。本発明で対象とし得る「哺乳動物」とし
ては、上記の「非ヒト哺乳動物」の他にヒトなどがあげ
られる。本発明の外来性単球走化性蛋白質類またはその
受容体遺伝子の変異遺伝子としては、元の外来性単球走
化性蛋白質遺伝子のＤＮＡ配列に変異（例えば、突然変
異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠
損、他の塩基への置換などが生じた遺伝子が挙げられ
る。より具体的には、該塩基の付加、欠損、他の塩基へ
の置換の結果、単球走化性蛋白質を構成するアミノ酸配
列において、１ないし５個（好ましくは１または２個）
のアミノ酸に置換、付加または欠損が生じるように変異
させることが好ましい。
【００１４】本発明における外来性単球走化性蛋白質類
または（および）その受容体遺伝子は、導入または発現
の対象とする非ヒト哺乳動物と同種あるいは異種のどち
らの哺乳動物由来のものであってもよい。以下、単球走
化性蛋白質遺伝子を例に、その転移方法について述べる
が、その受容体遺伝子についても同様にして転移でき
る。目的とする単球走化活性化蛋白質遺伝子を対象動物
に導入させるにあたっては、当該遺伝子を対象となる動
物の細胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した
遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利であ
る。具体的には、目的とする単球走化性蛋白質遺伝子を
導入させる場合、あるいはヒト単球走化性蛋白質子遺伝
子と相同性が高い単球走化性蛋白質遺伝子を有する各種
哺乳動物（ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスタ
ー、ラット、マウスなど（好ましくはラットなど））由
来の単球走化性蛋白質遺伝子を発現させうる各種プロモ
ーターの下流に、該遺伝子を連結したベクターを、対象
となる非ヒト哺乳動物の受精卵（例えばラット受精卵）
へマイクロインジェクションすることによって、目的と
する単球走化性蛋白質遺伝子を高発現するトランスジェ
ニック非ヒト哺乳動物を作出できる。単球走化性蛋白質
遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、
λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病
ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスま
たはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いら
れる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来
のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好まし
く用いられ、特に大腸菌由来のプラスミドが好ましい。
この遺伝子発現調節を行うプロモーターとしては、たと
えばウィルス（サイトメガロウィルス、モロニー白血病
ウィルス、JCウィルス、乳癌ウィルス、など）由来遺伝
子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イ
ヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスな
ど）および鳥類（ニワトリなど）由来遺伝子［例えば、
アルブミン、インスリンII、エリスロポエチン、エンド
セリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、血
小板由来成長因子β、ケラチンK1,K10およびK14、コラ
ーゲンI型およびII型、心房ナトリウム利尿性因子、ド
ーパミンβ-水酸化酵素、内皮レセプターチロシンキナ
ーゼ（一般にTie2と略される）、ナトリウムカリウムア
デノシン3リン酸化酵素（一般にNa,K-ATPaseと略され
る）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインI
およびIIA、メタロプロティナーゼ１組織インヒビタ
ー、MHCクラスI抗原（一般にH-2Lと略される）、平滑筋
αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子1α（EF-1α）、
βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１
および２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドPコ
ンポーネント、ミオグロビン、レニンなどの遺伝子］の
プロモーターなどがあげられるが、好ましくはサイトメ
ガロウィルスプロモーター、ヒトおよびニワトリβアク
チンプロモーターなどを用いることができるが、サイト
メガロウィルスプロモーターが特に望ましい。上記ベク
ターは、トランスジェニック哺乳動物において目的とす
るメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般に
ターミネターと呼ばれる）を有していることが好まし
く、例えば、ウィルス由来、各種哺乳動物および鳥類由
来の各遺伝子に含まれる同機能を有する配列を用いて遺
伝子発現を操作することが出来る。好ましくは、シミア
ンウィルスのSV40ターミネターなどがよく用いられる。
その他目的遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝
子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核
生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の
5′上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳
領域の3′下流 に連結することも目的により可能であ
る。
または（および）その受容体遺伝子は、導入または発現
の対象とする非ヒト哺乳動物と同種あるいは異種のどち
らの哺乳動物由来のものであってもよい。以下、単球走
化性蛋白質遺伝子を例に、その転移方法について述べる
が、その受容体遺伝子についても同様にして転移でき
る。目的とする単球走化活性化蛋白質遺伝子を対象動物
に導入させるにあたっては、当該遺伝子を対象となる動
物の細胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した
遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利であ
る。具体的には、目的とする単球走化性蛋白質遺伝子を
導入させる場合、あるいはヒト単球走化性蛋白質子遺伝
子と相同性が高い単球走化性蛋白質遺伝子を有する各種
哺乳動物（ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスタ
ー、ラット、マウスなど（好ましくはラットなど））由
来の単球走化性蛋白質遺伝子を発現させうる各種プロモ
ーターの下流に、該遺伝子を連結したベクターを、対象
となる非ヒト哺乳動物の受精卵（例えばラット受精卵）
へマイクロインジェクションすることによって、目的と
する単球走化性蛋白質遺伝子を高発現するトランスジェ
ニック非ヒト哺乳動物を作出できる。単球走化性蛋白質
遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、
λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病
ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスま
たはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いら
れる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来
のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好まし
く用いられ、特に大腸菌由来のプラスミドが好ましい。
この遺伝子発現調節を行うプロモーターとしては、たと
えばウィルス（サイトメガロウィルス、モロニー白血病
ウィルス、JCウィルス、乳癌ウィルス、など）由来遺伝
子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イ
ヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスな
ど）および鳥類（ニワトリなど）由来遺伝子［例えば、
アルブミン、インスリンII、エリスロポエチン、エンド
セリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、血
小板由来成長因子β、ケラチンK1,K10およびK14、コラ
ーゲンI型およびII型、心房ナトリウム利尿性因子、ド
ーパミンβ-水酸化酵素、内皮レセプターチロシンキナ
ーゼ（一般にTie2と略される）、ナトリウムカリウムア
デノシン3リン酸化酵素（一般にNa,K-ATPaseと略され
る）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインI
およびIIA、メタロプロティナーゼ１組織インヒビタ
ー、MHCクラスI抗原（一般にH-2Lと略される）、平滑筋
αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子1α（EF-1α）、
βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１
および２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドPコ
ンポーネント、ミオグロビン、レニンなどの遺伝子］の
プロモーターなどがあげられるが、好ましくはサイトメ
ガロウィルスプロモーター、ヒトおよびニワトリβアク
チンプロモーターなどを用いることができるが、サイト
メガロウィルスプロモーターが特に望ましい。上記ベク
ターは、トランスジェニック哺乳動物において目的とす
るメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般に
ターミネターと呼ばれる）を有していることが好まし
く、例えば、ウィルス由来、各種哺乳動物および鳥類由
来の各遺伝子に含まれる同機能を有する配列を用いて遺
伝子発現を操作することが出来る。好ましくは、シミア
ンウィルスのSV40ターミネターなどがよく用いられる。
その他目的遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝
子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核
生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の
5′上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳
領域の3′下流 に連結することも目的により可能であ
る。
【００１５】単球走化性蛋白質類の翻訳領域は、各種哺
乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハム
スター、ラット、マウスなど）由来の血液、腎臓、線維
芽細胞に由来するＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡ
ライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部を原
料として用い、あるいは血液、腎臓、線維芽細胞に由来
するＲＮＡから公知の方法により調製された相補ＤＮＡ
を原料として用いて、取得することが出来る。また、外
来性ヒト単球走化性蛋白質遺伝子はヒト線維芽細胞に由
来するＲＮＡから公知の方法により調製された相補ＤＮ
Ａを原料として用いて取得することができる。または上
記の細胞あるいは組織より得られた単球走化性蛋白質の
翻訳領域を、点突然変異誘発法などにより変異した翻訳
領域を作製することができる。これらはいずれもトラン
スジェニック動物に利用可能な材料である。該翻訳領域
はトランスジェニック動物において発現しうる遺伝子コ
ンストラクトとして前記のプロモーター下流（好ましく
は、転写終結部位の上流）に連結させる通常の遺伝子工
学的手法により外来性単球走化性蛋白質遺伝子を組み込
んだＤＮＡを作製することができる。
乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハム
スター、ラット、マウスなど）由来の血液、腎臓、線維
芽細胞に由来するＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡ
ライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部を原
料として用い、あるいは血液、腎臓、線維芽細胞に由来
するＲＮＡから公知の方法により調製された相補ＤＮＡ
を原料として用いて、取得することが出来る。また、外
来性ヒト単球走化性蛋白質遺伝子はヒト線維芽細胞に由
来するＲＮＡから公知の方法により調製された相補ＤＮ
Ａを原料として用いて取得することができる。または上
記の細胞あるいは組織より得られた単球走化性蛋白質の
翻訳領域を、点突然変異誘発法などにより変異した翻訳
領域を作製することができる。これらはいずれもトラン
スジェニック動物に利用可能な材料である。該翻訳領域
はトランスジェニック動物において発現しうる遺伝子コ
ンストラクトとして前記のプロモーター下流（好ましく
は、転写終結部位の上流）に連結させる通常の遺伝子工
学的手法により外来性単球走化性蛋白質遺伝子を組み込
んだＤＮＡを作製することができる。
【００１６】受精卵細胞段階における単球走化性蛋白質
遺伝子の導入は、対象非ヒト哺乳動物の胚芽細胞および
体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。トラ
ンスジェニック後の作出動物の胚芽細胞において単球走
化性蛋白質遺伝子が過剰に存在することは、作出動物の
子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに単球走化
性蛋白質遺伝子を過剰に有することを意味する。遺伝子
を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および
体細胞の全てに単球走化性蛋白質を過剰に有する。導入
遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を
取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての
子孫が該遺伝子を安定に保持し、また、該遺伝子を過剰
に有することを確認して、通常の飼育環境で繁殖継代す
ることができる。トランスジェニック対象動物が有する
内在性の遺伝子とは異なる遺伝子（好ましくは、イント
ロンを保持しない遺伝子）である外来性遺伝子（例え
ば、外来性単球走化性蛋白質類またはその受容体遺伝子
など）を対象非ヒト哺乳動物（好ましくはラットなど、
特に好ましくは Wistar 系統のラットなど）またはその
先祖の受精卵に転移する際に用いられる受精卵は同種の
雄非ヒト哺乳動物（好ましくは雄ラットなど、特に好ま
しくは Wistar 系統の雄ラットなど）と雌非ヒト哺乳動
物（好ましくは雌ラットなど、特に好ましくは Wistar
系統の雌ラットなど）を交配させることによって得られ
る。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌非ヒト
哺乳動物（好ましくは雌ラットなど、特に好ましくは W
istar 系統の雌ラットなど）の性周期を人工的に調節し
た後、雄非ヒト哺乳動物（好ましくは雌ラットなど、特
に好ましくは Wistar 系統の雌ラットなど）と交配させ
る方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的
に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモ
ン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にＰＭＳＧと略
する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激
ホルモン、一般に hＣＧと略する）を例えば腹腔注射な
どにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモン
の投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれ
ぞれ異なる。また、Wister 系統のラットを用いる場合
は、約１２時間明期条件（例えば７：００−１９：０
０）で約１週間飼育した８週齢以上のものが好ましい。
非ヒト哺乳動物が雌ラット（好ましくは Wistar 系統の
雌ラット）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、
約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、雄ラットと
交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵
胞刺激ホルモンの投与量は約２０〜約５０ＩＵ／個体、
好ましくは約３０ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与
量は約０〜約１０ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個
体である。
遺伝子の導入は、対象非ヒト哺乳動物の胚芽細胞および
体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。トラ
ンスジェニック後の作出動物の胚芽細胞において単球走
化性蛋白質遺伝子が過剰に存在することは、作出動物の
子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに単球走化
性蛋白質遺伝子を過剰に有することを意味する。遺伝子
を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および
体細胞の全てに単球走化性蛋白質を過剰に有する。導入
遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を
取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての
子孫が該遺伝子を安定に保持し、また、該遺伝子を過剰
に有することを確認して、通常の飼育環境で繁殖継代す
ることができる。トランスジェニック対象動物が有する
内在性の遺伝子とは異なる遺伝子（好ましくは、イント
ロンを保持しない遺伝子）である外来性遺伝子（例え
ば、外来性単球走化性蛋白質類またはその受容体遺伝子
など）を対象非ヒト哺乳動物（好ましくはラットなど、
特に好ましくは Wistar 系統のラットなど）またはその
先祖の受精卵に転移する際に用いられる受精卵は同種の
雄非ヒト哺乳動物（好ましくは雄ラットなど、特に好ま
しくは Wistar 系統の雄ラットなど）と雌非ヒト哺乳動
物（好ましくは雌ラットなど、特に好ましくは Wistar
系統の雌ラットなど）を交配させることによって得られ
る。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌非ヒト
哺乳動物（好ましくは雌ラットなど、特に好ましくは W
istar 系統の雌ラットなど）の性周期を人工的に調節し
た後、雄非ヒト哺乳動物（好ましくは雌ラットなど、特
に好ましくは Wistar 系統の雌ラットなど）と交配させ
る方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的
に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモ
ン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にＰＭＳＧと略
する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激
ホルモン、一般に hＣＧと略する）を例えば腹腔注射な
どにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモン
の投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれ
ぞれ異なる。また、Wister 系統のラットを用いる場合
は、約１２時間明期条件（例えば７：００−１９：０
０）で約１週間飼育した８週齢以上のものが好ましい。
非ヒト哺乳動物が雌ラット（好ましくは Wistar 系統の
雌ラット）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、
約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、雄ラットと
交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵
胞刺激ホルモンの投与量は約２０〜約５０ＩＵ／個体、
好ましくは約３０ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与
量は約０〜約１０ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個
体である。
【００１７】得られた受精卵に前述の方法により外来性
遺伝子（例えば外来性単球走化性蛋白質または（およ
び）その受容体遺伝子）が導入された後、雌非ヒト哺乳
動物に人工的に移植・着床され外来性遺伝子（例えば外
来性単球走化性蛋白質または（および）その受容体遺伝
子）を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が得ら
れる。好ましくは、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一
般にＬＨＲＨと略する）あるいはその類縁体を投与後、
雄ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起
された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物に得られた受精卵を人工
的に移植・着床させる方法が好ましい。ＬＨＲＨあるい
はその類縁体の投与量ならびにその投与後に雄非ヒト哺
乳動物と交配させる時期は非ヒト哺乳動物の種類により
それぞれ異なる。非ヒト哺乳動物が雌ラット（好ましく
は Wistar 系統の雌ラット）の場合は、通常、ＬＨＲＨ
あるいはその類縁体(（例えば[3,5-Dil-Tyr5]-LH-RH,
[Gln8]-LH-RH, [D-Ala6]-LH-RH, des-Gly10, [D-His(Bz
l)6]-LH-RH) Ethylamide など）投与後、約４日目に雄
ラットと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいは
その類縁体の投与量は、通常、約１０〜６０μg／個
体、好ましくは約４０μg／個体である。
遺伝子（例えば外来性単球走化性蛋白質または（およ
び）その受容体遺伝子）が導入された後、雌非ヒト哺乳
動物に人工的に移植・着床され外来性遺伝子（例えば外
来性単球走化性蛋白質または（および）その受容体遺伝
子）を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物が得ら
れる。好ましくは、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一
般にＬＨＲＨと略する）あるいはその類縁体を投与後、
雄ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起
された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物に得られた受精卵を人工
的に移植・着床させる方法が好ましい。ＬＨＲＨあるい
はその類縁体の投与量ならびにその投与後に雄非ヒト哺
乳動物と交配させる時期は非ヒト哺乳動物の種類により
それぞれ異なる。非ヒト哺乳動物が雌ラット（好ましく
は Wistar 系統の雌ラット）の場合は、通常、ＬＨＲＨ
あるいはその類縁体(（例えば[3,5-Dil-Tyr5]-LH-RH,
[Gln8]-LH-RH, [D-Ala6]-LH-RH, des-Gly10, [D-His(Bz
l)6]-LH-RH) Ethylamide など）投与後、約４日目に雄
ラットと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいは
その類縁体の投与量は、通常、約１０〜６０μg／個
体、好ましくは約４０μg／個体である。
【００１８】単球走化性蛋白質類または（および）その
受容体遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動
物は、目的遺伝子が高発現されており、内在性の単球走
化性蛋白質遺伝子の機能を促進することにより最終的に
心疾患（例えば、急性心不全、慢性心不全、心筋炎な
ど）、呼吸器系疾患、関節疾患（例えば、関節リュウマ
チ、変形性関節症など）、腎疾患（例えば、腎不全、糸
球体腎炎、ＩｇＡ腎症など）、動脈硬化症、乾癬症、高
脂血症、アレルギー疾患（例えば、喘息、アレルギー性
鼻炎、アトピー性皮膚炎など）、骨疾患（例えば、骨粗
鬆症、くる病、骨軟化症、低カルシュウム血症など）、
血液疾患、脳血管性傷害、外傷性脳障害、感染症、痴呆
症および慢性炎症性疾患などを発症することがあり、そ
の病態モデル動物として利用することができる。具体的
には、本発明のトランスジェニック動物を用いて、これ
ら疾患の病態機序の解明、治療方法の検討および治療薬
研究開発を目的とした候補化合物スクリーニングを行う
ことが可能である。その場合、単球走化性蛋白質類また
は（および）その受容体遺伝子の生体内における機能が
さらに解明される可能性が考えられ、それらの機構を解
明する実験モデルとしての利用も期待される。特にサイ
トメガロウイルスプロモーターの下流に外来性単球走化
性蛋白質類または（および）その受容体遺伝子、もしく
はそれらの変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒ
ト哺乳動物は、特に体重抑制作用、眼瞼肥厚作用などが
見られ、特に慢性炎症性疾患、アレルギー疾患（例え
ば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎など）
などの病態モデル動物として利用することができる。さ
らに単球走化性蛋白質類または（および）その受容体遺
伝子を組み込んだベクターを利用することにより、これ
ら目的遺伝子が欠損することに起因する疾患の遺伝子治
療をも可能ならしめる。
受容体遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動
物は、目的遺伝子が高発現されており、内在性の単球走
化性蛋白質遺伝子の機能を促進することにより最終的に
心疾患（例えば、急性心不全、慢性心不全、心筋炎な
ど）、呼吸器系疾患、関節疾患（例えば、関節リュウマ
チ、変形性関節症など）、腎疾患（例えば、腎不全、糸
球体腎炎、ＩｇＡ腎症など）、動脈硬化症、乾癬症、高
脂血症、アレルギー疾患（例えば、喘息、アレルギー性
鼻炎、アトピー性皮膚炎など）、骨疾患（例えば、骨粗
鬆症、くる病、骨軟化症、低カルシュウム血症など）、
血液疾患、脳血管性傷害、外傷性脳障害、感染症、痴呆
症および慢性炎症性疾患などを発症することがあり、そ
の病態モデル動物として利用することができる。具体的
には、本発明のトランスジェニック動物を用いて、これ
ら疾患の病態機序の解明、治療方法の検討および治療薬
研究開発を目的とした候補化合物スクリーニングを行う
ことが可能である。その場合、単球走化性蛋白質類また
は（および）その受容体遺伝子の生体内における機能が
さらに解明される可能性が考えられ、それらの機構を解
明する実験モデルとしての利用も期待される。特にサイ
トメガロウイルスプロモーターの下流に外来性単球走化
性蛋白質類または（および）その受容体遺伝子、もしく
はそれらの変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒ
ト哺乳動物は、特に体重抑制作用、眼瞼肥厚作用などが
見られ、特に慢性炎症性疾患、アレルギー疾患（例え
ば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎など）
などの病態モデル動物として利用することができる。さ
らに単球走化性蛋白質類または（および）その受容体遺
伝子を組み込んだベクターを利用することにより、これ
ら目的遺伝子が欠損することに起因する疾患の遺伝子治
療をも可能ならしめる。
【００１９】また、上記のトランスジェニック哺乳動物
のその他の利用可能性として 組織培養のための細胞源としての使用、 本発明のトランスジェニックマウスの組織中のＤＮ
ＡもしくはＲＮＡを直接分析するかあるいは遺伝子によ
り発現されたタンパク組織を分析することによる、核内
レセプターの複雑な作用と転写因子との関連性について
の解析、 遺伝子を有する組織の細胞を標準組織培養技術によ
り培養し、これらを使用して、たとえば平滑筋細胞のよ
うな一般に培養が困難な組織に由来する細胞の機能の研
究、 上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を
高めるような薬剤のスクリーニング、および 高発現した単球走化性性蛋白質類またはその受容体
の単離精製およびその抗体の作製などが考えられる。
のその他の利用可能性として 組織培養のための細胞源としての使用、 本発明のトランスジェニックマウスの組織中のＤＮ
ＡもしくはＲＮＡを直接分析するかあるいは遺伝子によ
り発現されたタンパク組織を分析することによる、核内
レセプターの複雑な作用と転写因子との関連性について
の解析、 遺伝子を有する組織の細胞を標準組織培養技術によ
り培養し、これらを使用して、たとえば平滑筋細胞のよ
うな一般に培養が困難な組織に由来する細胞の機能の研
究、 上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を
高めるような薬剤のスクリーニング、および 高発現した単球走化性性蛋白質類またはその受容体
の単離精製およびその抗体の作製などが考えられる。
【００２０】
【発明の実施の形態】以下に、実施例を挙げて本発明を
より具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されな
いことは言うまでもない。
より具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されな
いことは言うまでもない。
【００２１】
実施例１ 1) ラットＭＣＰ−１遺伝子のクローニング 吉村（Yoshimura, T.）等（1991、バイオケミカル ア
ンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーショ
ン（Biochem. Biophys. Res. Commun.）第174巻、第504
頁）に記載されているラット単球走化性蛋白質（ラット
MCP-1） cＤＮＡの塩基配列から27マーのプライマー１
（5′-CTTGTCGACATGCAGGTCTCTGTCACG-3′：配列番号
1）、およびラットＭＰＣ−１ cＤＮＡ中の28マーのプ
ライマー２（5′-CTTGTCGACACTAGTTCTCTGTCATACT-3′：
配列番号2）を作製した。続いてラットマクロファージ
５′−ストレッチ cＤＮＡライブラリー（クロンテック
社製）を材料にして常法により反応液を調製後、94℃３
分、55℃２分、72℃３分反応させ、次いで94℃１分、55
℃１分、72℃３分のサイクルを35回反復し、最後に94℃
１分、55℃１分、72℃10分反応させ、４℃一晩保存する
条件でポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を
行った。続いてＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマ
ー社製）を用い、常法に従って塩基配列を決定し、公知
のライブラリー単球走化活性化因子 cＤＮＡであること
を確認した。次に上記のラットＭＰＣ−１とcＤＮＡプ
ラスミド pAKKO-111H［日沼（Hinuma, S.）等（1994, B
iochim. Biophys. Acta., 第1219巻, 第251頁）］を制
限酵素 SalＩで切断し、該ラットＭＣＰ−１ cＤＮＡと
pAKKO−111H 断片（4.5kbp）をタカラライゲーション
キット（宝酒造株式会社製）を用いて16℃、60分処理し
た後、連結させ、この反応液を用いて大腸菌JM109（ニ
ッポンジーン社製）を形質転換し、アンピシリン耐性
（Ampr）株を得た。この形質転換株（Escherichia coli
JM109/p）からプラスミドＤＮＡを回収し、常法に従い
塩基配列を決定し、ラットＭＣＰ−１ cＤＮＡ断片が p
AKKO-111H 内に連結されていることを確認し、プラスミ
ド pAKKO-111-RatMCP-1（4.9kbp）を得た。この遺伝子
コンストラクトを多重制限酵素切断によって検査したと
ころ、検出しうる転位を含まなかった。
ンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーショ
ン（Biochem. Biophys. Res. Commun.）第174巻、第504
頁）に記載されているラット単球走化性蛋白質（ラット
MCP-1） cＤＮＡの塩基配列から27マーのプライマー１
（5′-CTTGTCGACATGCAGGTCTCTGTCACG-3′：配列番号
1）、およびラットＭＰＣ−１ cＤＮＡ中の28マーのプ
ライマー２（5′-CTTGTCGACACTAGTTCTCTGTCATACT-3′：
配列番号2）を作製した。続いてラットマクロファージ
５′−ストレッチ cＤＮＡライブラリー（クロンテック
社製）を材料にして常法により反応液を調製後、94℃３
分、55℃２分、72℃３分反応させ、次いで94℃１分、55
℃１分、72℃３分のサイクルを35回反復し、最後に94℃
１分、55℃１分、72℃10分反応させ、４℃一晩保存する
条件でポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を
行った。続いてＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマ
ー社製）を用い、常法に従って塩基配列を決定し、公知
のライブラリー単球走化活性化因子 cＤＮＡであること
を確認した。次に上記のラットＭＰＣ−１とcＤＮＡプ
ラスミド pAKKO-111H［日沼（Hinuma, S.）等（1994, B
iochim. Biophys. Acta., 第1219巻, 第251頁）］を制
限酵素 SalＩで切断し、該ラットＭＣＰ−１ cＤＮＡと
pAKKO−111H 断片（4.5kbp）をタカラライゲーション
キット（宝酒造株式会社製）を用いて16℃、60分処理し
た後、連結させ、この反応液を用いて大腸菌JM109（ニ
ッポンジーン社製）を形質転換し、アンピシリン耐性
（Ampr）株を得た。この形質転換株（Escherichia coli
JM109/p）からプラスミドＤＮＡを回収し、常法に従い
塩基配列を決定し、ラットＭＣＰ−１ cＤＮＡ断片が p
AKKO-111H 内に連結されていることを確認し、プラスミ
ド pAKKO-111-RatMCP-1（4.9kbp）を得た。この遺伝子
コンストラクトを多重制限酵素切断によって検査したと
ころ、検出しうる転位を含まなかった。
【００２２】2）サイトメガロウイルスの遺伝子制御領
域の下流にラットＭＣＰ−１遺伝子を有するプラスミド
pBK-CMV-RatMCP-1の構築 サイトメガロウイルスウィルス（CMV)プロモーターは市
販のプラスミドpBK-CMV（ストラタジーン社製）を利用
した。最初、前記(1)で得られたpAKKO-111-RatMCP-1を
制限酵素SalＩで切断し、取得したcＤＮＡを含む400bp
の断片100ngを仔牛小腸アルカリフォスファターゼ（宝
酒造株式会社製）で5′端の脱リン酸化を行った。つぎ
に市販のpBK-CMVのLacZに挿入されたマルチクローニン
グサイト(MCS)にある制限酵素SalＩで切断し、pAKKO-11
1SalＩ断片（400bp）とpBK-CMV断片（4.5kbp）をタカラ
ライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて16
℃、６０分処理し、連結させ、この反応液を用い大腸菌
JM109（ニッポンジーン社製）を形質転換し、ネオマイ
シン耐性株(Neor)を得た。この形質転換株（Escherichi
a coli JM109/p）からプラスミドＤＮＡを回収し、制限
酵素切断を行い、pAKKO-111SalＩ断片がpBK-CMV断片内
に正方向に連結されていることを確認し、プラスミドpB
K-CMV-RatMCP-1（4.9kbp）を得た。このプラスミドの構
築過程を（図１）に示す。この遺伝子コンストラクトを
多重制限酵素切断によって検査したところ、検出しうる
転位を含まなかった。
域の下流にラットＭＣＰ−１遺伝子を有するプラスミド
pBK-CMV-RatMCP-1の構築 サイトメガロウイルスウィルス（CMV)プロモーターは市
販のプラスミドpBK-CMV（ストラタジーン社製）を利用
した。最初、前記(1)で得られたpAKKO-111-RatMCP-1を
制限酵素SalＩで切断し、取得したcＤＮＡを含む400bp
の断片100ngを仔牛小腸アルカリフォスファターゼ（宝
酒造株式会社製）で5′端の脱リン酸化を行った。つぎ
に市販のpBK-CMVのLacZに挿入されたマルチクローニン
グサイト(MCS)にある制限酵素SalＩで切断し、pAKKO-11
1SalＩ断片（400bp）とpBK-CMV断片（4.5kbp）をタカラ
ライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて16
℃、６０分処理し、連結させ、この反応液を用い大腸菌
JM109（ニッポンジーン社製）を形質転換し、ネオマイ
シン耐性株(Neor)を得た。この形質転換株（Escherichi
a coli JM109/p）からプラスミドＤＮＡを回収し、制限
酵素切断を行い、pAKKO-111SalＩ断片がpBK-CMV断片内
に正方向に連結されていることを確認し、プラスミドpB
K-CMV-RatMCP-1（4.9kbp）を得た。このプラスミドの構
築過程を（図１）に示す。この遺伝子コンストラクトを
多重制限酵素切断によって検査したところ、検出しうる
転位を含まなかった。
【００２３】3）サイトメガロウイルスの遺伝子制御領
域の下流にラットＭＣＰ−１遺伝子融合体を含有するト
ランスジェニックラットの作出 採卵用としてラットWistar系統は８週齢で購入し、7:00
〜19:00 １２時間明期条件で1週間飼育し、まず１日目1
1:00に卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモ
ン、一般にPMSGと略する）（30IU/個体）を腹腔注射
し、３日目11:00に黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン、一般にhCGと略する）（5 IU/個体）を腹
腔注射して雄ラットWistar系統10週齢以降の個体と17:0
0 に1:1で同居、交配させた。４日目9:00に交配させた
雌ラットの膣栓確認を行い、13:30から膣栓確認した個
体を屠殺後、採卵を開始した。受精卵で前核形成卵を選
択し、14:30から上記 2）で得られたプラスミドpBK-CMV
-RatMCP-1をApaLＩおよびMLuＩによって切断し、10μg
〜100μg/mlの濃度に調製し、その1〜2μlを顕微鏡下で
観察しながら受精した単細胞期のWistar系統ラット卵の
雄前核へ注入した。続いて、卵細胞を自体公知のHER培
地で培養し、5日目13:30に2細胞期胚を確認してから、
ワグナー（Wagner）ら（l98l、プロシーデイングス オ
ブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Pro
c. Nat. Acad. Sc. U.S.A.）第78巻、第5016頁）により
記載された方法に従って、偽妊娠の雌Wistar系統ラット
の卵管に移植し、着床させた。偽妊娠の雌Wistar系統ラ
ット（11週齢以降）は０日目13:00にLHRH皮下注射（40
μg/個体）し、４日目17:00に雄Zucker lean系統12週以
降の個体と17:00に1:1で同居、交配させた。５日目9:00
に交配させた雌ラットの膣栓確認を行い、上記の目的で
使用した。
域の下流にラットＭＣＰ−１遺伝子融合体を含有するト
ランスジェニックラットの作出 採卵用としてラットWistar系統は８週齢で購入し、7:00
〜19:00 １２時間明期条件で1週間飼育し、まず１日目1
1:00に卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモ
ン、一般にPMSGと略する）（30IU/個体）を腹腔注射
し、３日目11:00に黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン、一般にhCGと略する）（5 IU/個体）を腹
腔注射して雄ラットWistar系統10週齢以降の個体と17:0
0 に1:1で同居、交配させた。４日目9:00に交配させた
雌ラットの膣栓確認を行い、13:30から膣栓確認した個
体を屠殺後、採卵を開始した。受精卵で前核形成卵を選
択し、14:30から上記 2）で得られたプラスミドpBK-CMV
-RatMCP-1をApaLＩおよびMLuＩによって切断し、10μg
〜100μg/mlの濃度に調製し、その1〜2μlを顕微鏡下で
観察しながら受精した単細胞期のWistar系統ラット卵の
雄前核へ注入した。続いて、卵細胞を自体公知のHER培
地で培養し、5日目13:30に2細胞期胚を確認してから、
ワグナー（Wagner）ら（l98l、プロシーデイングス オ
ブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Pro
c. Nat. Acad. Sc. U.S.A.）第78巻、第5016頁）により
記載された方法に従って、偽妊娠の雌Wistar系統ラット
の卵管に移植し、着床させた。偽妊娠の雌Wistar系統ラ
ット（11週齢以降）は０日目13:00にLHRH皮下注射（40
μg/個体）し、４日目17:00に雄Zucker lean系統12週以
降の個体と17:00に1:1で同居、交配させた。５日目9:00
に交配させた雌ラットの膣栓確認を行い、上記の目的で
使用した。
【００２４】4) ラットＭＣＰ−１トランスジェニック
ラットの遺伝子発現解析 分析用のＲＮＡは、常法に従い、上記のトランスジェニ
ックラット(個体番号R03125-8)および対照ラットそれぞ
れの脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、精巣および眼瞼
の一部からグアニジン中で組織破砕し、抽出した。得ら
れた核酸ペレットを70％エタノール中で1回洗浄し、乾
燥後、滅菌水に再懸濁させた。上記のプライマー（配列
番号3および配列番号4）およびキットRT-PCR plus（東
洋紡）を用いてリバーストランスポリメラーゼチェイン
リアクション法（RT-PCR）を行った。ＲＮＡ調製物20μ
gを基質に用いて、まずリバーストランスクリプターゼ
で60℃30分間続いて94℃2分間処理後、Taqポリメラーゼ
を添加後、94℃1分、60℃1.5分の反応40回反復後60℃7
分間処理を行い、反応物を1.0％アガロースGTG（FMCバ
イオプロダクト社製）ゲルを通して電気泳動した。その
結果、検定に用いたトランスジェニックラット(個体番
号R03125-8)すべての臓器で両転移遺伝子の発現が観察
された。
ラットの遺伝子発現解析 分析用のＲＮＡは、常法に従い、上記のトランスジェニ
ックラット(個体番号R03125-8)および対照ラットそれぞ
れの脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、精巣および眼瞼
の一部からグアニジン中で組織破砕し、抽出した。得ら
れた核酸ペレットを70％エタノール中で1回洗浄し、乾
燥後、滅菌水に再懸濁させた。上記のプライマー（配列
番号3および配列番号4）およびキットRT-PCR plus（東
洋紡）を用いてリバーストランスポリメラーゼチェイン
リアクション法（RT-PCR）を行った。ＲＮＡ調製物20μ
gを基質に用いて、まずリバーストランスクリプターゼ
で60℃30分間続いて94℃2分間処理後、Taqポリメラーゼ
を添加後、94℃1分、60℃1.5分の反応40回反復後60℃7
分間処理を行い、反応物を1.0％アガロースGTG（FMCバ
イオプロダクト社製）ゲルを通して電気泳動した。その
結果、検定に用いたトランスジェニックラット(個体番
号R03125-8)すべての臓器で両転移遺伝子の発現が観察
された。
【００２５】実施例２ 1）トランスジェニックラットの遺伝子解析 ３週齢に達した出産仔の尾から採取したＤＮＡを用い
て、ポリメラーゼチェインリアクション法により試験し
た。すなわち、ラットＭＣＰ−１cＤＮＡ中の20マーの
プライマー３（5′−CGGCTCGTATATTGTGTGGA−3′：配列
番号3）、およびラット単球走化活性化因子cＤＮＡ中の
22マーのプライマー４（5′−CTTCAGATTTATGGGTCAAGTT
−3′：配列番号4）を用いてポリメラーゼチェインリア
クション（PCR）を行った。合計181個体の産仔ラットを
解析した結果、PCR陽性個体および擬陽性個体は12個体
であった。
て、ポリメラーゼチェインリアクション法により試験し
た。すなわち、ラットＭＣＰ−１cＤＮＡ中の20マーの
プライマー３（5′−CGGCTCGTATATTGTGTGGA−3′：配列
番号3）、およびラット単球走化活性化因子cＤＮＡ中の
22マーのプライマー４（5′−CTTCAGATTTATGGGTCAAGTT
−3′：配列番号4）を用いてポリメラーゼチェインリア
クション（PCR）を行った。合計181個体の産仔ラットを
解析した結果、PCR陽性個体および擬陽性個体は12個体
であった。
【００２６】
【表１】
【００２７】これらPCR陽性擬陽性１２個体について、
さらに、尾ＤＮＡ調製物を用いて、ラットＭＣＰ−１遺
伝子配列を含むジコキシゲニン−ＤＮＡプローブ（自体
公知のリボプローブ法により標識）によるサザンハイブ
リダイゼーション法により分析した。それぞれの場合、
尾からのＤＮＡをNdeＩおよびMluＩにより切断し、かつ
ラットＭＣＰ−１遺伝子融合体（図１）から精製した断
片にジコキシゲニンを標識した断片をプローブとして試
験した。標識には市販のDIGルミネッセント検出キット
（ベリンガーマンイハイム社製）を用いた。分析用のＤ
ＮＡは、ホーガン（Hogan,B.）等（1986、マニピユレー
ティング ザ マウス エンブリオ（コールド スプリン
グ ハーバー ラボラトリー発行））に記載された方法
により、尾の約1cm断片からＤＮＡを抽出した。得られ
た核酸ペレットを70％エタノール中で1回洗浄、乾燥
し、200μlの10mMトリス（pH 8.0）、1mM EDTAに再懸濁
させた。尾ＤＮＡ調製物1μlを滅菌水で50倍に希釈し
て、プライマー１およびプライマー２を用いて、94℃30
秒、60℃1分、72℃1分30回の反応を行い、反応物を1.2
％アガロースGTG（FMCバイオプロダクト社製）ゲルを通
して電気泳動して、509bpの大きさのＤＮＡバンドがみ
られるラットを選別した。１８１匹の出産仔のうち１２
匹が509bpの大きさのＤＮＡバンドがみられた。さら
に、これら１２匹のＰＣＲ陽性擬陽性個体ＤＮＡそれぞ
れ10μgを制限酵素Nde IおよびMlu Iで完全に切断し、
1.0％アガロースゲルを通して電気泳動を行い、かつサ
ザン（Southern）（1975、ジヤーナル・モレキユラー・
バイオロジー、第98巻、第503頁）により記載された方
法でナイロンフイルターへ移した。このフィルターをプ
ローブと一晩ハイブリッド化させ、2xSSC、0.1％SDSに
て室温で２回洗浄し、次に0.1xSSC、0.1％SDSにて68℃
で２回洗浄した。このサザンハイブリダイゼーション法
の結果、検定した１２匹中８匹において1.7Kbpの位置に
シグナルがみられたので、これら8匹は注入されたラッ
トＭＣＰ−１遺伝子を保持していたことを示した。PCR
陽性個体12匹についてサザンハイブリダイゼーションを
行った結果、8匹の個体でラットＭＣＰ−１遺伝子導入
が確認された。以上の結果からトランスジェニックラッ
トは個体番号R03056-2（雄）,R03073-7（雌）,R03124-4
（雌）,R03125-4（雄）,R03125-8（雌）,R03142-2
（雄）,R03142-12（雌）およびR03143-5（雄）の8個体
であることが確認された（図４）。
さらに、尾ＤＮＡ調製物を用いて、ラットＭＣＰ−１遺
伝子配列を含むジコキシゲニン−ＤＮＡプローブ（自体
公知のリボプローブ法により標識）によるサザンハイブ
リダイゼーション法により分析した。それぞれの場合、
尾からのＤＮＡをNdeＩおよびMluＩにより切断し、かつ
ラットＭＣＰ−１遺伝子融合体（図１）から精製した断
片にジコキシゲニンを標識した断片をプローブとして試
験した。標識には市販のDIGルミネッセント検出キット
（ベリンガーマンイハイム社製）を用いた。分析用のＤ
ＮＡは、ホーガン（Hogan,B.）等（1986、マニピユレー
ティング ザ マウス エンブリオ（コールド スプリン
グ ハーバー ラボラトリー発行））に記載された方法
により、尾の約1cm断片からＤＮＡを抽出した。得られ
た核酸ペレットを70％エタノール中で1回洗浄、乾燥
し、200μlの10mMトリス（pH 8.0）、1mM EDTAに再懸濁
させた。尾ＤＮＡ調製物1μlを滅菌水で50倍に希釈し
て、プライマー１およびプライマー２を用いて、94℃30
秒、60℃1分、72℃1分30回の反応を行い、反応物を1.2
％アガロースGTG（FMCバイオプロダクト社製）ゲルを通
して電気泳動して、509bpの大きさのＤＮＡバンドがみ
られるラットを選別した。１８１匹の出産仔のうち１２
匹が509bpの大きさのＤＮＡバンドがみられた。さら
に、これら１２匹のＰＣＲ陽性擬陽性個体ＤＮＡそれぞ
れ10μgを制限酵素Nde IおよびMlu Iで完全に切断し、
1.0％アガロースゲルを通して電気泳動を行い、かつサ
ザン（Southern）（1975、ジヤーナル・モレキユラー・
バイオロジー、第98巻、第503頁）により記載された方
法でナイロンフイルターへ移した。このフィルターをプ
ローブと一晩ハイブリッド化させ、2xSSC、0.1％SDSに
て室温で２回洗浄し、次に0.1xSSC、0.1％SDSにて68℃
で２回洗浄した。このサザンハイブリダイゼーション法
の結果、検定した１２匹中８匹において1.7Kbpの位置に
シグナルがみられたので、これら8匹は注入されたラッ
トＭＣＰ−１遺伝子を保持していたことを示した。PCR
陽性個体12匹についてサザンハイブリダイゼーションを
行った結果、8匹の個体でラットＭＣＰ−１遺伝子導入
が確認された。以上の結果からトランスジェニックラッ
トは個体番号R03056-2（雄）,R03073-7（雌）,R03124-4
（雌）,R03125-4（雄）,R03125-8（雌）,R03142-2
（雄）,R03142-12（雌）およびR03143-5（雄）の8個体
であることが確認された（図４）。
【００２８】実施例３ 1）ラットＭＣＰ−１トランスジェニックラットの体重
変化 ＣＭＶ-ＭＣＰ−１トランスジェニックラットR03125-8
系統（F0世代）の体重測定を生後22週齡まで行った。そ
の結果、R03125-8では同腹ラットに比較して体重が少な
く、同腹ラットが週齡とともに増加傾向にあるのに対し
てR03125-8ではその傾向はみられなかった。体重増加抑
制が認められ、R03073-7においてもやや体重増加抑制が
認められた。しかし、R03056-2,R03124-4,R03125-4,R03
142-2,R03142-12およびR03143-5のそれぞれの体重変化
は同腹ラットに比較して同様の傾向を示し、明らかな差
異は認められなかった。これらトランスジェニックラッ
トの雄（R03056-2,R03125-4,R03142-2,R03143-5）は正
常Wistar系統ラット雌２匹（８週齡）とそれぞれ同居さ
せ、交配を図った。その結果、各トランスジェニックラ
ットの仔ラットが得られた。トランスジェニックラット
の雌（R03073-7,R03124-4,R03125-8,,R03142-12）は正
常Wistar系統ラット雄１匹（１１週齡）と同居させ、交
配を図った。その結果、各トランスジェニックラットの
仔ラットが得られた。これら3週齢仔の尾からＤＮＡを
採取し、上記のプライマー３（5′−CGGCTCGTATATTGTGT
GGA−3′：配列番号3）、およぴプライマー４（5′−CT
TCAGATTTATGGGTCAAGTT−3′：配列番号4）を用いてポリ
メラーゼチェインリアクション（PCR）を行い、トラン
スジェニックラットの判定した。これらのうちR03125-8
より得られたトランスジェニックラット（F1世代）にお
いて同様に体重測定を生後６週齡まで行った。トランス
ジェニックラットの中でR03125-8-6（雌）は体重増加抑
制が顕著に認められる個体であった。R03125-8-4および
R03125-8-4（雄）はやや体重増加抑制は少ない個体であ
った（図５ないし図１３）。
変化 ＣＭＶ-ＭＣＰ−１トランスジェニックラットR03125-8
系統（F0世代）の体重測定を生後22週齡まで行った。そ
の結果、R03125-8では同腹ラットに比較して体重が少な
く、同腹ラットが週齡とともに増加傾向にあるのに対し
てR03125-8ではその傾向はみられなかった。体重増加抑
制が認められ、R03073-7においてもやや体重増加抑制が
認められた。しかし、R03056-2,R03124-4,R03125-4,R03
142-2,R03142-12およびR03143-5のそれぞれの体重変化
は同腹ラットに比較して同様の傾向を示し、明らかな差
異は認められなかった。これらトランスジェニックラッ
トの雄（R03056-2,R03125-4,R03142-2,R03143-5）は正
常Wistar系統ラット雌２匹（８週齡）とそれぞれ同居さ
せ、交配を図った。その結果、各トランスジェニックラ
ットの仔ラットが得られた。トランスジェニックラット
の雌（R03073-7,R03124-4,R03125-8,,R03142-12）は正
常Wistar系統ラット雄１匹（１１週齡）と同居させ、交
配を図った。その結果、各トランスジェニックラットの
仔ラットが得られた。これら3週齢仔の尾からＤＮＡを
採取し、上記のプライマー３（5′−CGGCTCGTATATTGTGT
GGA−3′：配列番号3）、およぴプライマー４（5′−CT
TCAGATTTATGGGTCAAGTT−3′：配列番号4）を用いてポリ
メラーゼチェインリアクション（PCR）を行い、トラン
スジェニックラットの判定した。これらのうちR03125-8
より得られたトランスジェニックラット（F1世代）にお
いて同様に体重測定を生後６週齡まで行った。トランス
ジェニックラットの中でR03125-8-6（雌）は体重増加抑
制が顕著に認められる個体であった。R03125-8-4および
R03125-8-4（雄）はやや体重増加抑制は少ない個体であ
った（図５ないし図１３）。
【００２９】2）異常個体の取得 体重増加抑制が認められたトランスジェニックラットR0
3125-8（F0世代）より上記 1）記載の方法と同様にして
交配させることにより得られたトランスジェニックラッ
ト１産目のうちのF1世代３例中１匹に顕著な体重増加抑
制が認められた。この個体は離乳後も両眼眼瞼の肥厚と
副涙腺からの分泌物の付着が認められた。他の1例にも
眼瞼（両眼）の肥厚と副涙腺からの分泌物の付着が認め
られた。また、同様に交配して得られた2産目のトランス
ジェニックラット3例のうち、１例が生後２週目に死亡
した。他２例のトランスジェニックラットでも体重増加
抑制および眼瞼の肥厚と分泌物の付着が認められた（図
１４）。
3125-8（F0世代）より上記 1）記載の方法と同様にして
交配させることにより得られたトランスジェニックラッ
ト１産目のうちのF1世代３例中１匹に顕著な体重増加抑
制が認められた。この個体は離乳後も両眼眼瞼の肥厚と
副涙腺からの分泌物の付着が認められた。他の1例にも
眼瞼（両眼）の肥厚と副涙腺からの分泌物の付着が認め
られた。また、同様に交配して得られた2産目のトランス
ジェニックラット3例のうち、１例が生後２週目に死亡
した。他２例のトランスジェニックラットでも体重増加
抑制および眼瞼の肥厚と分泌物の付着が認められた（図
１４）。
【００３０】実施例４ 1）ヒトＭＣＰ−１（ｈＭＣＰ−１)遺伝子 のクローニ
ング ｈＭＣＰ−１cＤＮＡを単離する目的で、市販のLPS刺激
ヒト単球λgt10cＤＮＡライブラリー（クロンテック社
製）をEscherichia coli C600 で増幅し、得られたcＤ
ＮＡをもとにｈＭＣＰ−１cＤＮＡ中の19マーのプライ
マー 5（5′−CTCTCGCCTCCAGCATGAA−3′：配列番号
5）、および同じラットＭＣＰ−１cＤＮＡ中の20マーの
プライマー6（5′−AAGACCCTCAAAACATCCCA−3′：配列
番号6）を用いてポリメラーゼチェインリアクション（P
CR）を行った。その結果、577bpのPCR産物を得ることが
できた。その断片はPCRダイレクトクローニングキット
（インビトロジェン社製）のプラスミドpCR II（3.9kb
p）を制限酵素SacＩおよびNotＩで切断し、取得したcＤ
ＮＡ577bpの断片を連結させた。この反応液を用い大腸
菌JM109（ニッポンジーン社製）を形質転換し、アンピ
シリン耐性株を得た。この形質転換株（Escherichia co
li JM109/p）からプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素
切断を行い、hMCP-1がpCRII断片内に連結されているこ
とを確認し、プラスミドpCRII-hMCP-1（4.5kbp）を得
た。ＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマー株式会社
製）を用い、常法に従って塩基配列を決定し、ｈＭＣＰ
−１cＤＮＡであることを確認した。
ング ｈＭＣＰ−１cＤＮＡを単離する目的で、市販のLPS刺激
ヒト単球λgt10cＤＮＡライブラリー（クロンテック社
製）をEscherichia coli C600 で増幅し、得られたcＤ
ＮＡをもとにｈＭＣＰ−１cＤＮＡ中の19マーのプライ
マー 5（5′−CTCTCGCCTCCAGCATGAA−3′：配列番号
5）、および同じラットＭＣＰ−１cＤＮＡ中の20マーの
プライマー6（5′−AAGACCCTCAAAACATCCCA−3′：配列
番号6）を用いてポリメラーゼチェインリアクション（P
CR）を行った。その結果、577bpのPCR産物を得ることが
できた。その断片はPCRダイレクトクローニングキット
（インビトロジェン社製）のプラスミドpCR II（3.9kb
p）を制限酵素SacＩおよびNotＩで切断し、取得したcＤ
ＮＡ577bpの断片を連結させた。この反応液を用い大腸
菌JM109（ニッポンジーン社製）を形質転換し、アンピ
シリン耐性株を得た。この形質転換株（Escherichia co
li JM109/p）からプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素
切断を行い、hMCP-1がpCRII断片内に連結されているこ
とを確認し、プラスミドpCRII-hMCP-1（4.5kbp）を得
た。ＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマー株式会社
製）を用い、常法に従って塩基配列を決定し、ｈＭＣＰ
−１cＤＮＡであることを確認した。
【００３１】2）サイトメガロウイルスの遺伝子制御領
域の下流にｈＭＣＰ−１遺伝子を有するプラスミドpBK-
CMV-hMCP-1の構築 最初、pCRII-hMCP-1（4.5kbp）を制限酵素SacＩおよびN
otＩで切断し、一方、プラスミドpBK-CMV内に挿入され
ているマルチクローニングサイトを制限酵素ＳａｃＩお
よびＮｏｔＩで切断し、pBK-CMV断片（4.5kbp）とhMCP-
1断片（600bp）をタカラライゲーションキット（宝酒造
株式会社製）を用いて16℃、60分処理し、連結させ、こ
の反応液を用い大腸菌JM109（ニッポンジーン株式会社
製）を形質転換し、ネオマイシン耐性株を得た。この形
質転換株（Escherichia coli JM109/p）からプラスミド
ＤＮＡを回収し、SacＩで制限酵素切断を行い、hMCP-1
断片がpBK-CMV断片内に連結されていることを確認し、
プラスミドpBK-CMV-hMCP-1（5.1kbp）を得た。このプラ
スミドの構築図を図１５に示す。この遺伝子コンストラ
クトを多重制限酵素切断によって検査したところ、検出
しうる転位を含まなかった。
域の下流にｈＭＣＰ−１遺伝子を有するプラスミドpBK-
CMV-hMCP-1の構築 最初、pCRII-hMCP-1（4.5kbp）を制限酵素SacＩおよびN
otＩで切断し、一方、プラスミドpBK-CMV内に挿入され
ているマルチクローニングサイトを制限酵素ＳａｃＩお
よびＮｏｔＩで切断し、pBK-CMV断片（4.5kbp）とhMCP-
1断片（600bp）をタカラライゲーションキット（宝酒造
株式会社製）を用いて16℃、60分処理し、連結させ、こ
の反応液を用い大腸菌JM109（ニッポンジーン株式会社
製）を形質転換し、ネオマイシン耐性株を得た。この形
質転換株（Escherichia coli JM109/p）からプラスミド
ＤＮＡを回収し、SacＩで制限酵素切断を行い、hMCP-1
断片がpBK-CMV断片内に連結されていることを確認し、
プラスミドpBK-CMV-hMCP-1（5.1kbp）を得た。このプラ
スミドの構築図を図１５に示す。この遺伝子コンストラ
クトを多重制限酵素切断によって検査したところ、検出
しうる転位を含まなかった。
【００３２】実施例５ 1）サイトメガロウイルスの遺伝子制御領域の下流にヒ
トＭＣＰ−１遺伝子融合体を含有するトランスジェニッ
クラットの作出 採卵用としてラットWister 系統は８週齢で購入し、7:0
0〜19:00 １２時間明期条件で1週間飼育し、まず１日
目11:00に卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホル
モン、一般にPMSGと略する）（30IU/個体）を腹腔注射
し、３日目11:00に黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン、一般にhCGと略する）（5 IU/個体）を腹
腔注射して雄ラットWister 系統10週齢以降の個体と17:
00 に1:1で同居、交配させた。 ４日目9:00に交配させ
た雌ラットの膣栓確認を行い、13:30から膣栓確認した
個体を屠殺後、採卵を開始した。受精卵で前核形成卵を
選択し、14:30から上記実験例４で得られたプラスミドp
BK-CMV-hMCP-1をApaLＩおよびMLuＩによって切断し、10
μg〜100μg/mlの濃度に調製し、その1〜2μlを顕微鏡
下で観察しながら受精した単細胞期のWistar系統ラット
卵の雄前核へ注入した。HER培地で培養し、5日目13:30
に2細胞期胚を確認してからワグナー（Wagner）ら（l98
l、プロシーデイングス オブ ナショナル アカデミ
ー オブ サイエンス（Proc. Nat. Acad. Sc. U.S.
A.）第78巻、第5016頁）により記載された方法に従っ
て、偽妊娠の雌Wistar系統ラットの卵管に移植し、着床
させた。偽妊娠の雌Wistar系統ラット（11週齢以降）は
0日目13:00にLHRHを皮下注射（40μg/個体）し、４日目
17:00に雄Zucker lean系統12週以降の個体と17:00に1:1
で同居、交配させた。
トＭＣＰ−１遺伝子融合体を含有するトランスジェニッ
クラットの作出 採卵用としてラットWister 系統は８週齢で購入し、7:0
0〜19:00 １２時間明期条件で1週間飼育し、まず１日
目11:00に卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホル
モン、一般にPMSGと略する）（30IU/個体）を腹腔注射
し、３日目11:00に黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン、一般にhCGと略する）（5 IU/個体）を腹
腔注射して雄ラットWister 系統10週齢以降の個体と17:
00 に1:1で同居、交配させた。 ４日目9:00に交配させ
た雌ラットの膣栓確認を行い、13:30から膣栓確認した
個体を屠殺後、採卵を開始した。受精卵で前核形成卵を
選択し、14:30から上記実験例４で得られたプラスミドp
BK-CMV-hMCP-1をApaLＩおよびMLuＩによって切断し、10
μg〜100μg/mlの濃度に調製し、その1〜2μlを顕微鏡
下で観察しながら受精した単細胞期のWistar系統ラット
卵の雄前核へ注入した。HER培地で培養し、5日目13:30
に2細胞期胚を確認してからワグナー（Wagner）ら（l98
l、プロシーデイングス オブ ナショナル アカデミ
ー オブ サイエンス（Proc. Nat. Acad. Sc. U.S.
A.）第78巻、第5016頁）により記載された方法に従っ
て、偽妊娠の雌Wistar系統ラットの卵管に移植し、着床
させた。偽妊娠の雌Wistar系統ラット（11週齢以降）は
0日目13:00にLHRHを皮下注射（40μg/個体）し、４日目
17:00に雄Zucker lean系統12週以降の個体と17:00に1:1
で同居、交配させた。
【００３３】2）トランスジェニックラットの遺伝子解
析 ３週齢に達した出産仔の尾から採取したＤＮＡを用い
て、ポリメラーゼチェインリアクション法により試験し
た。すなわち、ｈＭＣＰ−１cＤＮＡ中の21マーのプラ
イマー７（5′−TTTCCAAGTCTCCACCCCATT−3′：配列番
号7）、およびｈＭＣＰ−１cＤＮＡ中の21マーのプライ
マー８（5′−TTCTTTGGGACACTTGCTGCT−3′：配列番号
8）を用いてポリメラーゼチェインリアクション（PCR）
を行った。これらPCR陽性8個体について、さらに、尾Ｄ
ＮＡ調製物を用いてNotＩで切断し、ｈＭＣＰ−１遺伝
子配列を含むジコキシゲニン−ＲＮＡプローブ（リボプ
ローブ法により標識）を用いてサザンハイブリダイゼー
ション法により分析した。それぞれの場合、尾からのＤ
ＮＡをNotＩにより切断し、電気泳動を行った。電気泳
動後に回収した断片［ｈＭＣＰ−１遺伝子融合体（pBK-
CMV-hMCP-1）］（図１５）に含まれたT3配列をプライマ
ーにして作製したＲＡＮプローブをジコキシゲニンで標
識して試験した。標識には市販のDIGルミネッセント検
出キット（ベリンガーマンイハイム社製）を用いた。分
析用のＤＮＡは、ホーガンら（1986、マニピユレーティ
ング ザ マウス エンブリオ（コールド スプリング
ハーバーラボラトリー発行））に記載された方法によ
り、尾の約1cm断片からＤＮＡを抽出した。得られた核
酸ペレットを70％エタノール中で1回洗浄、乾燥し、200
μlの10mMトリス（pH8.0）、1mM EDTAに再懸濁させた。
尾ＤＮＡ調製物1μlを滅菌水で50倍に希釈して、プライ
マー７およびプライマー８を用いて、94℃30秒、65℃1
分、72℃1分30回の反応を行い、反応物を1.2％アガロー
スGTG（FMCバイオプロダクト社製）ゲルを通して電気泳
動して、594bpの大きさのＤＮＡバンドがみられるラッ
トを選別した。８匹の出産仔のうち５匹が594bpの大き
さのＤＮＡバンドがみられた。
析 ３週齢に達した出産仔の尾から採取したＤＮＡを用い
て、ポリメラーゼチェインリアクション法により試験し
た。すなわち、ｈＭＣＰ−１cＤＮＡ中の21マーのプラ
イマー７（5′−TTTCCAAGTCTCCACCCCATT−3′：配列番
号7）、およびｈＭＣＰ−１cＤＮＡ中の21マーのプライ
マー８（5′−TTCTTTGGGACACTTGCTGCT−3′：配列番号
8）を用いてポリメラーゼチェインリアクション（PCR）
を行った。これらPCR陽性8個体について、さらに、尾Ｄ
ＮＡ調製物を用いてNotＩで切断し、ｈＭＣＰ−１遺伝
子配列を含むジコキシゲニン−ＲＮＡプローブ（リボプ
ローブ法により標識）を用いてサザンハイブリダイゼー
ション法により分析した。それぞれの場合、尾からのＤ
ＮＡをNotＩにより切断し、電気泳動を行った。電気泳
動後に回収した断片［ｈＭＣＰ−１遺伝子融合体（pBK-
CMV-hMCP-1）］（図１５）に含まれたT3配列をプライマ
ーにして作製したＲＡＮプローブをジコキシゲニンで標
識して試験した。標識には市販のDIGルミネッセント検
出キット（ベリンガーマンイハイム社製）を用いた。分
析用のＤＮＡは、ホーガンら（1986、マニピユレーティ
ング ザ マウス エンブリオ（コールド スプリング
ハーバーラボラトリー発行））に記載された方法によ
り、尾の約1cm断片からＤＮＡを抽出した。得られた核
酸ペレットを70％エタノール中で1回洗浄、乾燥し、200
μlの10mMトリス（pH8.0）、1mM EDTAに再懸濁させた。
尾ＤＮＡ調製物1μlを滅菌水で50倍に希釈して、プライ
マー７およびプライマー８を用いて、94℃30秒、65℃1
分、72℃1分30回の反応を行い、反応物を1.2％アガロー
スGTG（FMCバイオプロダクト社製）ゲルを通して電気泳
動して、594bpの大きさのＤＮＡバンドがみられるラッ
トを選別した。８匹の出産仔のうち５匹が594bpの大き
さのＤＮＡバンドがみられた。
【００３４】
【表２】
【００３５】さらに、これら５匹のＤＮＡそれぞれ10μ
gを制限酵素Apa LＩおよびMluＩで完全に切断し、1.0％
アガロースゲルを通して電気泳動を行い、かつサザン
（Southern）（1975、ジャーナル・モレキユラー・バイ
オロジー、第98巻、第503頁）により記載された方法で
ナイロンフイルターへ移した。このフィルターをプロー
ブと一晩ハイブリッド化させ、2xSSC、0.1％SDSにて室
温で２回洗浄し、次に0.1xSSC、0.1％SDSにて68℃で２
回洗浄した。このサザンハイブリダイゼーション法の結
果、検定した5匹において2.3kbpの位置にシグナルがみ
られたので、これら５匹全ては注入されたｈＭＣＰ−１
遺伝子を保持していたことを示した。
gを制限酵素Apa LＩおよびMluＩで完全に切断し、1.0％
アガロースゲルを通して電気泳動を行い、かつサザン
（Southern）（1975、ジャーナル・モレキユラー・バイ
オロジー、第98巻、第503頁）により記載された方法で
ナイロンフイルターへ移した。このフィルターをプロー
ブと一晩ハイブリッド化させ、2xSSC、0.1％SDSにて室
温で２回洗浄し、次に0.1xSSC、0.1％SDSにて68℃で２
回洗浄した。このサザンハイブリダイゼーション法の結
果、検定した5匹において2.3kbpの位置にシグナルがみ
られたので、これら５匹全ては注入されたｈＭＣＰ−１
遺伝子を保持していたことを示した。
【００３６】ＰＣＲ陽性個体5匹についてサザン解析を
行った結果、全ての個体でｈＭＣＰ−１遺伝子導入が確
認された。以上の結果からトランスジェニックラットは
個体番号R04091-4（雄）,R04182-1（雄）,R04231-6
（雄）,R04232-5（雄）およびR05142-7（雌）の５個体
であることが確認された（図１７）。
行った結果、全ての個体でｈＭＣＰ−１遺伝子導入が確
認された。以上の結果からトランスジェニックラットは
個体番号R04091-4（雄）,R04182-1（雄）,R04231-6
（雄）,R04232-5（雄）およびR05142-7（雌）の５個体
であることが確認された（図１７）。
【００３７】実施例６ 1) ヒトｈＭＣＰ−１受容体遺伝子のクローニング 上記のこの受容体のｃＤＮＡはシャロら(Charo, et a
l.)（1994、プロシーデイングス オブ ナショナル・
アカデミー オブ サイエンス（P．N．A．S．U．S．
A．）第91巻、第2752頁）に記載されているラットｍＭ
ＣＰ−１受容体cDNAの塩基配列からSalＩ認識配列を付
加した33マーのプライマー（5′−ATCGTCGACATGCTGTCCA
CATCTCGTTCTCGG−3′：配列番号9）、およぴラットｈＭ
ＣＰ−１受容体cDNA中の制限酵素XbaＩ認識配列を付加
した33マーのプライマー(5′−CTCTCTAGATTATAAACCAGCC
GAGACTTCCTG−3′：配列番号10）を作製した。続いてヒ
トcDNAライブラリー（クロンテック社製）を材料にして
ポリメラーゼチェインリアクション(PCR)を行った。DNA
シークエンサー（パーキンエルマー株式会社製）を用
い、常法に従って塩基配列を決定し、ラットＭＣＰ−１
受容体cDNAであることを確認した。次にプラスミドpAKK
O-111Hを制限酵素SalＩで切断し、上記のラットＭＣＰ
−１受容体cDNAとpAKKO-111H断片（4.5kbp）をタカララ
イゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて15
℃、一晩処理し、結合させた。この反応液を用いて大腸
菌JM109（ニッポンジーン株式会社製）を形質転換し、
アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株（Escheric
hia coli JM109/p）からプラスミドDNAを回収し、制限
酵素切断を行い、ラットＭＣＰ−１cDNA断片がpAKKO-11
1H内に結合されていることを確認し、プラスミドpAKKO-
111-hMCP-1（5.6 kbp）を得た。この遺伝子コンストラ
クトを多重制限酵素切断によって検査したところ、検出
しうる転位を含まなかった。
l.)（1994、プロシーデイングス オブ ナショナル・
アカデミー オブ サイエンス（P．N．A．S．U．S．
A．）第91巻、第2752頁）に記載されているラットｍＭ
ＣＰ−１受容体cDNAの塩基配列からSalＩ認識配列を付
加した33マーのプライマー（5′−ATCGTCGACATGCTGTCCA
CATCTCGTTCTCGG−3′：配列番号9）、およぴラットｈＭ
ＣＰ−１受容体cDNA中の制限酵素XbaＩ認識配列を付加
した33マーのプライマー(5′−CTCTCTAGATTATAAACCAGCC
GAGACTTCCTG−3′：配列番号10）を作製した。続いてヒ
トcDNAライブラリー（クロンテック社製）を材料にして
ポリメラーゼチェインリアクション(PCR)を行った。DNA
シークエンサー（パーキンエルマー株式会社製）を用
い、常法に従って塩基配列を決定し、ラットＭＣＰ−１
受容体cDNAであることを確認した。次にプラスミドpAKK
O-111Hを制限酵素SalＩで切断し、上記のラットＭＣＰ
−１受容体cDNAとpAKKO-111H断片（4.5kbp）をタカララ
イゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて15
℃、一晩処理し、結合させた。この反応液を用いて大腸
菌JM109（ニッポンジーン株式会社製）を形質転換し、
アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株（Escheric
hia coli JM109/p）からプラスミドDNAを回収し、制限
酵素切断を行い、ラットＭＣＰ−１cDNA断片がpAKKO-11
1H内に結合されていることを確認し、プラスミドpAKKO-
111-hMCP-1（5.6 kbp）を得た。この遺伝子コンストラ
クトを多重制限酵素切断によって検査したところ、検出
しうる転位を含まなかった。
【００３８】2) サイトメガロウイルスの遺伝子制御領
域の下流にヒトＭＣＰ−１受容体遺伝子を有するプラス
ミドpBK-hMCP-1Rの構築 最初、pAKKO-111-hMCP-1R（4.5kbp）を制限酵素SalＩお
よびBam HＩで切断し、一方、プラスミドpBK-CMV内に挿
入されているマルチクローニングサイトを制限酵素Sal
ＩおよびBam HＩ切断し、pBK-CMV断片（4.5kbp）と断片
（1100bp）をタカラライゲーションキット（宝酒造株式
会社製）を用いて16℃、60分処理し、結合させ、この反
応液を用い大腸菌JM109（ニッポンジーン株式会社製）
を形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転
換株（Escherichia coli JM109/p）からプラスミドDNA
を回収し、制限酵素切断を行い、hMCP-1R 断片がpBK-CM
V断片内に正方向に結合されていることを確認し、プラ
スミドpBK-hMCP-1R（5.6kbp）を得た。このプラスミド
の構築図を図15に示す。この遺伝子コンストラクトを多
重制限酵素切断によって検査したところ、検出しうる転
位を含まなかった。
域の下流にヒトＭＣＰ−１受容体遺伝子を有するプラス
ミドpBK-hMCP-1Rの構築 最初、pAKKO-111-hMCP-1R（4.5kbp）を制限酵素SalＩお
よびBam HＩで切断し、一方、プラスミドpBK-CMV内に挿
入されているマルチクローニングサイトを制限酵素Sal
ＩおよびBam HＩ切断し、pBK-CMV断片（4.5kbp）と断片
（1100bp）をタカラライゲーションキット（宝酒造株式
会社製）を用いて16℃、60分処理し、結合させ、この反
応液を用い大腸菌JM109（ニッポンジーン株式会社製）
を形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転
換株（Escherichia coli JM109/p）からプラスミドDNA
を回収し、制限酵素切断を行い、hMCP-1R 断片がpBK-CM
V断片内に正方向に結合されていることを確認し、プラ
スミドpBK-hMCP-1R（5.6kbp）を得た。このプラスミド
の構築図を図15に示す。この遺伝子コンストラクトを多
重制限酵素切断によって検査したところ、検出しうる転
位を含まなかった。
【００３９】実施例７ 1) サイトメガロウイルスの遺伝子制御領域の下流にヒ
トＭＣＰ−１受容体遺伝子融合体を含有するトランスジ
ェニックラットの作出 採卵用としてラットWister 系統は8週齢で購入し、7:00
〜19:00 １２時間明期条件で1週間飼育した９週齢の動
物を用い、まず１日目11:00に卵胞刺激ホルモン（妊馬
血清性性腺刺激ホルモン、一般にPMSGと略する）(30IU/
個体)を腹腔注射して同様に飼育し、３日目11:00黄体形
成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にhCG
と略する）(5 IU/個体)に腹腔注射して雄ラットWister
系統１０週齢以降の個体と１７：００ に1:1で同居、
交配させた。 ４日目9:00に交配させた雌ラットの膣栓
確認を行い、13:30から膣栓確認した個体を屠殺後、採
卵を開始した。受精卵で前核形成卵を選択し、14:30か
ら上記プラスミドpBK-hMCP-1RをNaeＩおよびApa LＩに
よって切断し、10μg〜100μg/mlの濃度に調製し、その
1〜2μlを顕微鏡下で観察しながら受精した単細胞期のW
istar系統ラット卵の雄前核へ注入した。HER培地で培養
し、５日目13:30に2cell胚を確認してからワグナー（Wa
gner）ら（l98l、プロシーデイングス オブ ナショナ
ルアカデミー オブサイエンス（P. N. A. S. U. S.
A.）第78巻、第5016頁）により記載された方法に従って
偽妊娠の雌Wistar系統ラットの卵管に移植し、着床させ
た。偽妊娠の雌Wistar系統ラット（11週齢以降）は０日
目13:00性腺刺激ホルモン放出ホルモン(Luteinizing Ho
rmone-Releasing Hormone, 一般にＬＨＲＨと略され
る）あるいはその類縁体を皮下注射(40μg/個体)し、４
日目17:00に精管結紮した雄Zucker lean系統あるいはWi
star系統12週以降の個体と17:00に1:1で同居、交配させ
た。５日目9:00に交配させた雌ラットの膣栓確認を行
い、上記の目的で使用した。
トＭＣＰ−１受容体遺伝子融合体を含有するトランスジ
ェニックラットの作出 採卵用としてラットWister 系統は8週齢で購入し、7:00
〜19:00 １２時間明期条件で1週間飼育した９週齢の動
物を用い、まず１日目11:00に卵胞刺激ホルモン（妊馬
血清性性腺刺激ホルモン、一般にPMSGと略する）(30IU/
個体)を腹腔注射して同様に飼育し、３日目11:00黄体形
成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にhCG
と略する）(5 IU/個体)に腹腔注射して雄ラットWister
系統１０週齢以降の個体と１７：００ に1:1で同居、
交配させた。 ４日目9:00に交配させた雌ラットの膣栓
確認を行い、13:30から膣栓確認した個体を屠殺後、採
卵を開始した。受精卵で前核形成卵を選択し、14:30か
ら上記プラスミドpBK-hMCP-1RをNaeＩおよびApa LＩに
よって切断し、10μg〜100μg/mlの濃度に調製し、その
1〜2μlを顕微鏡下で観察しながら受精した単細胞期のW
istar系統ラット卵の雄前核へ注入した。HER培地で培養
し、５日目13:30に2cell胚を確認してからワグナー（Wa
gner）ら（l98l、プロシーデイングス オブ ナショナ
ルアカデミー オブサイエンス（P. N. A. S. U. S.
A.）第78巻、第5016頁）により記載された方法に従って
偽妊娠の雌Wistar系統ラットの卵管に移植し、着床させ
た。偽妊娠の雌Wistar系統ラット（11週齢以降）は０日
目13:00性腺刺激ホルモン放出ホルモン(Luteinizing Ho
rmone-Releasing Hormone, 一般にＬＨＲＨと略され
る）あるいはその類縁体を皮下注射(40μg/個体)し、４
日目17:00に精管結紮した雄Zucker lean系統あるいはWi
star系統12週以降の個体と17:00に1:1で同居、交配させ
た。５日目9:00に交配させた雌ラットの膣栓確認を行
い、上記の目的で使用した。
【００４０】2) トランスジェニックラットの遺伝子解
析 ３週齢に達した出産仔の尾から採取したＤＮＡを用いて
ポリメラーゼチェインリアクション法により試験した．
すなわち、ヒトＭＣＰ−１受容体cDNA中の22マーのプラ
イマー（5′−CGGGGTCATTAGTTCATAGCCC−3′：配列番号
11）、および同受容体ｃＤＮＡ中の22マーのプライマー
(5′−GACTCTCACTGCCCTATGCCTC−3′：配列番号12）を
用いてポリメラーゼチェインリアクション(PCR)を行っ
た。合計８７個体の産仔ラットを解析した結果、PCR陽
性個体は１０個体であった。これらＰＣＲ陽性個体につ
いてさらに、尾DNA調製物を用いてXbaＩおよびBam HＩ
で切断し、ヒトＭＣＰ−１受容体遺伝子配列を含むジコ
キシゲニン一DNAプローブ（リボプローブ法により標
識）を調製によるサザンハイプリダイゼーション法によ
り分析した。それぞれの場合、ヒトＭＣＰ−１受容体遺
伝子融合体（図15）から精製した、ジコキシゲニン標識
された断片をプローブとして試験した。標識には市販の
DIGルミネッセント検出キット（ベリンガーマンイハイ
ム社製）を用いた。分析用のＤＮＡは、ホーガンら(198
6、マニピユレーティング ザ マウスエンブリオ（コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行））
に記載された方法により、尾の約1cm断片からＤＮＡを
抽出した。得られた核酸ペレットを70％エタノール中で
1回洗浄、乾燥し、そして200μlの10mMトリス（pH8.
0）、1mM EDTAに再懸濁させた。尾DNA調製物1μlを滅菌
水で５０倍に希釈して、プライマー〔配列番号11〕およ
ぴプライマー〔配列番号12〕を用いて、94℃30秒、61℃
1分、72℃2分25回の反応を行い、反応物を1.2％アガロ
ースGTG（FMCバイオプロダクト社製）ゲルを通して電気
泳動して、608bpの大きさのDNAバンドがみられるラット
を選別した。87匹の出産仔のうち10匹が608 bpの大き
さのDNAバンドがみられた。そのうち生存個体７匹のＤ
ＮＡをそれぞれ10μgを制限酵素SalＩおよびBam HＩで
完全に切断し、1.0％アガロースゲルを通して電気泳動
を行い、かつサザン（Southern）（1975、ジャーナル・
モレキユラー・バイオロジー、第98巻、第503頁）によ
り記載された方法でナイロンフイルターへ移した。この
フィルターをプローブと一晩ハイブリッド化させ、2xSS
C、0.1％SDSにて室温で2回洗浄し、次に0.1xSSC、0.1％
SDSにて68℃で2回洗浄した。このサザンハイブリダイゼ
ーション法の結果、検定した７匹において1.1kbpの位置
にシグナルがみられたので、これら７匹全ては注入され
たヒトＭＣＰ−１受容体遺伝子を保持していることを示
した。以上の結果からトランスジェニックラットは個体
番号CM-02181F3（雌）、CM-02251M1（雄）、CM-02251M5
（雄）、CM-02251M7（雄）、CM-02251F2（雌）、CM-022
51F7（雌）およびCM-03041M1（雄）の７個体であること
が確認された。
析 ３週齢に達した出産仔の尾から採取したＤＮＡを用いて
ポリメラーゼチェインリアクション法により試験した．
すなわち、ヒトＭＣＰ−１受容体cDNA中の22マーのプラ
イマー（5′−CGGGGTCATTAGTTCATAGCCC−3′：配列番号
11）、および同受容体ｃＤＮＡ中の22マーのプライマー
(5′−GACTCTCACTGCCCTATGCCTC−3′：配列番号12）を
用いてポリメラーゼチェインリアクション(PCR)を行っ
た。合計８７個体の産仔ラットを解析した結果、PCR陽
性個体は１０個体であった。これらＰＣＲ陽性個体につ
いてさらに、尾DNA調製物を用いてXbaＩおよびBam HＩ
で切断し、ヒトＭＣＰ−１受容体遺伝子配列を含むジコ
キシゲニン一DNAプローブ（リボプローブ法により標
識）を調製によるサザンハイプリダイゼーション法によ
り分析した。それぞれの場合、ヒトＭＣＰ−１受容体遺
伝子融合体（図15）から精製した、ジコキシゲニン標識
された断片をプローブとして試験した。標識には市販の
DIGルミネッセント検出キット（ベリンガーマンイハイ
ム社製）を用いた。分析用のＤＮＡは、ホーガンら(198
6、マニピユレーティング ザ マウスエンブリオ（コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行））
に記載された方法により、尾の約1cm断片からＤＮＡを
抽出した。得られた核酸ペレットを70％エタノール中で
1回洗浄、乾燥し、そして200μlの10mMトリス（pH8.
0）、1mM EDTAに再懸濁させた。尾DNA調製物1μlを滅菌
水で５０倍に希釈して、プライマー〔配列番号11〕およ
ぴプライマー〔配列番号12〕を用いて、94℃30秒、61℃
1分、72℃2分25回の反応を行い、反応物を1.2％アガロ
ースGTG（FMCバイオプロダクト社製）ゲルを通して電気
泳動して、608bpの大きさのDNAバンドがみられるラット
を選別した。87匹の出産仔のうち10匹が608 bpの大き
さのDNAバンドがみられた。そのうち生存個体７匹のＤ
ＮＡをそれぞれ10μgを制限酵素SalＩおよびBam HＩで
完全に切断し、1.0％アガロースゲルを通して電気泳動
を行い、かつサザン（Southern）（1975、ジャーナル・
モレキユラー・バイオロジー、第98巻、第503頁）によ
り記載された方法でナイロンフイルターへ移した。この
フィルターをプローブと一晩ハイブリッド化させ、2xSS
C、0.1％SDSにて室温で2回洗浄し、次に0.1xSSC、0.1％
SDSにて68℃で2回洗浄した。このサザンハイブリダイゼ
ーション法の結果、検定した７匹において1.1kbpの位置
にシグナルがみられたので、これら７匹全ては注入され
たヒトＭＣＰ−１受容体遺伝子を保持していることを示
した。以上の結果からトランスジェニックラットは個体
番号CM-02181F3（雌）、CM-02251M1（雄）、CM-02251M5
（雄）、CM-02251M7（雄）、CM-02251F2（雌）、CM-022
51F7（雌）およびCM-03041M1（雄）の７個体であること
が確認された。
【００４１】実施例８ ヒトＭＣＰ−１およびヒトＭＣＰ−１受容体遺伝子融合
体を含有するトランスジェニックラットの作出 実施例５で記載したヒトＭＣＰ−１遺伝子融合体を含有
するトランスジェニックラットおよび実施例７で記載し
たヒトＭＣＰ−１受容体遺伝子融合体を含有するトラン
スジェニックラットの４組の交配により両遺伝子融合体
を含有するトランスジェニックラットの作製を行った。
すなわち、ヒトＭＣＰ−１受容体トランスジェニック
ラットCM-02181F3（雌）とヒトＭＣＰ−１トランスジェ
ニックラットCM-04182M1（雄）、ヒトＭＣＰ−１受容
体トランスジェニックラットCM-02251F7（雌）とヒトＭ
ＣＰ−１トランスジェニックラットCM-04131M6（雄）、
ヒトＭＣＰ−１受容体トランスジェニックラットCM-0
2251F2（雌）とヒトＭＣＰ−１トランスジェニックラッ
トCM-04232M5（雄）、ヒトＭＣＰ−１トランスジェニ
ックラットCM-05142F7（雌）とヒトＭＣＰ−１受容体ト
ランスジェニックラットCM-02251M1（雄）である。その
結果、の交配組み合わせでは雌８個体および雄７個体
のF1個体が１９９７年７月１２日に得られた。の交配
組み合わせでは雌２個体および雄１個体のF1個体が１９
９７年７月８日に得られた。の交配組み合わせでは雌
１０個体のF1個体が１９９７年７月１１日に得られた。
の交配組み合わせでは雌１個体および雄２個体のF1個
体が１９９７年７月１２日に得られた。
体を含有するトランスジェニックラットの作出 実施例５で記載したヒトＭＣＰ−１遺伝子融合体を含有
するトランスジェニックラットおよび実施例７で記載し
たヒトＭＣＰ−１受容体遺伝子融合体を含有するトラン
スジェニックラットの４組の交配により両遺伝子融合体
を含有するトランスジェニックラットの作製を行った。
すなわち、ヒトＭＣＰ−１受容体トランスジェニック
ラットCM-02181F3（雌）とヒトＭＣＰ−１トランスジェ
ニックラットCM-04182M1（雄）、ヒトＭＣＰ−１受容
体トランスジェニックラットCM-02251F7（雌）とヒトＭ
ＣＰ−１トランスジェニックラットCM-04131M6（雄）、
ヒトＭＣＰ−１受容体トランスジェニックラットCM-0
2251F2（雌）とヒトＭＣＰ−１トランスジェニックラッ
トCM-04232M5（雄）、ヒトＭＣＰ−１トランスジェニ
ックラットCM-05142F7（雌）とヒトＭＣＰ−１受容体ト
ランスジェニックラットCM-02251M1（雄）である。その
結果、の交配組み合わせでは雌８個体および雄７個体
のF1個体が１９９７年７月１２日に得られた。の交配
組み合わせでは雌２個体および雄１個体のF1個体が１９
９７年７月８日に得られた。の交配組み合わせでは雌
１０個体のF1個体が１９９７年７月１１日に得られた。
の交配組み合わせでは雌１個体および雄２個体のF1個
体が１９９７年７月１２日に得られた。
【００４２】2) トランスジェニックラットの遺伝子解
析 ３週齢に達した出産仔の尾から上記に記載した方法で採
取したＤＮＡを用いてポリメラーゼチェインリアクショ
ン法により転移した遺伝子を検出した。すなわち、ヒト
ＭＣＰ−１受容体ｃＤＮＡ中のプライマー（配列番号1
1）およぴプライマー（配列番号12）、続いてヒトＭＣ
Ｐ−１ｃＤＮＡ中のプライマー（配列番号7）およぴプ
ライマー（配列番号8）を用いてポリメラーゼチェイン
リアクション(PCR)を行った。すべての産仔ラットを解
析した結果、両遺伝子のＰＣＲ陽性個体は、の交配組
み合わせでは雌１個体および雄２個体、の交配組み合
わせでは雌１個体、の交配組み合わせでは雄４個体、
合計８個体得られた。の交配組み合わせでは得られな
かった。
析 ３週齢に達した出産仔の尾から上記に記載した方法で採
取したＤＮＡを用いてポリメラーゼチェインリアクショ
ン法により転移した遺伝子を検出した。すなわち、ヒト
ＭＣＰ−１受容体ｃＤＮＡ中のプライマー（配列番号1
1）およぴプライマー（配列番号12）、続いてヒトＭＣ
Ｐ−１ｃＤＮＡ中のプライマー（配列番号7）およぴプ
ライマー（配列番号8）を用いてポリメラーゼチェイン
リアクション(PCR)を行った。すべての産仔ラットを解
析した結果、両遺伝子のＰＣＲ陽性個体は、の交配組
み合わせでは雌１個体および雄２個体、の交配組み合
わせでは雌１個体、の交配組み合わせでは雄４個体、
合計８個体得られた。の交配組み合わせでは得られな
かった。
【００４３】3) トランスジェニックラットの遺伝子発
現解析 分析用のＲＮＡは、常法に従い、の交配組み合わせ
の交配組み合わせから得られたトランスジェニックラッ
トおよび対照ラットそれぞれの脳、心臓、肝臓、肺、腎
臓、脾臓、精巣あるいは卵巣をグアニジン中で組織破砕
して抽出した。得られた核酸ペレットを70％エタノール
中で1回洗浄し、乾燥後、滅菌水に再懸濁させた。ヒト
単球走化活性化因子発現を調べる目的でプライマー（配
列番号7および配列番号8）およびキットRT-PCR plus
（東洋紡）を用いてリバーストランスポリメラーゼチェ
インリアクション法（RT-PCR）を行った。RNA調製物20
μgを基質に用いて、まずリバーストランスクリプター
ゼで60℃30分間続いて94℃2分間処理後、Taqポリメラー
ゼを添加後、94℃1分、60℃1.5分の反応40回反復後60℃
7分間処理を行い、反応物を1.0％アガロースGTG（FMCバ
イオプロダクト社製）ゲルを通して電気泳動した。ヒト
ＭＣＰ−１受容体発現を調べる目的ではプライマー（配
列番号11および配列番号12）およびキットRT-PCR plus
（東洋紡）を用いてリバーストランスポリメラーゼチェ
インリアクション法（RT-PCR）を行った。実験条件は同
条件である。その結果、検定に用いたすべての個体で両
導入遺伝子の発現が観察された。
現解析 分析用のＲＮＡは、常法に従い、の交配組み合わせ
の交配組み合わせから得られたトランスジェニックラッ
トおよび対照ラットそれぞれの脳、心臓、肝臓、肺、腎
臓、脾臓、精巣あるいは卵巣をグアニジン中で組織破砕
して抽出した。得られた核酸ペレットを70％エタノール
中で1回洗浄し、乾燥後、滅菌水に再懸濁させた。ヒト
単球走化活性化因子発現を調べる目的でプライマー（配
列番号7および配列番号8）およびキットRT-PCR plus
（東洋紡）を用いてリバーストランスポリメラーゼチェ
インリアクション法（RT-PCR）を行った。RNA調製物20
μgを基質に用いて、まずリバーストランスクリプター
ゼで60℃30分間続いて94℃2分間処理後、Taqポリメラー
ゼを添加後、94℃1分、60℃1.5分の反応40回反復後60℃
7分間処理を行い、反応物を1.0％アガロースGTG（FMCバ
イオプロダクト社製）ゲルを通して電気泳動した。ヒト
ＭＣＰ−１受容体発現を調べる目的ではプライマー（配
列番号11および配列番号12）およびキットRT-PCR plus
（東洋紡）を用いてリバーストランスポリメラーゼチェ
インリアクション法（RT-PCR）を行った。実験条件は同
条件である。その結果、検定に用いたすべての個体で両
導入遺伝子の発現が観察された。
【００４４】
【発明の効果】本発明の単球走化性蛋白質類または（お
よび）その受容体遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物
は、それら遺伝子の過剰発現に起因する異常個体を作出
することができる。本発明の動物は心疾患、呼吸器系疾
患、関節疾患、腎疾患、動脈硬化症、乾癬症、高脂血
症、アレルギー疾患、骨疾患、血液疾患、脳血管性傷
害、外傷性脳障害、感染症、痴呆症および慢性炎症性疾
患などを発症する可能性があり、その疾患モデル動物と
して利用することができる。たとえば、本発明のトラン
スジェニックラットを用いて、これら病態機序の解明お
よびこれら疾患を治療方法の検討を行うことが可能であ
る。本発明動物を用いた単球走化性蛋白質類または（お
よび）その受容体遺伝子の高発現細胞の供給、ケモカイ
ンおよびその受容体のシグナル伝達機構を解明する目的
に利用し得る。
よび）その受容体遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物
は、それら遺伝子の過剰発現に起因する異常個体を作出
することができる。本発明の動物は心疾患、呼吸器系疾
患、関節疾患、腎疾患、動脈硬化症、乾癬症、高脂血
症、アレルギー疾患、骨疾患、血液疾患、脳血管性傷
害、外傷性脳障害、感染症、痴呆症および慢性炎症性疾
患などを発症する可能性があり、その疾患モデル動物と
して利用することができる。たとえば、本発明のトラン
スジェニックラットを用いて、これら病態機序の解明お
よびこれら疾患を治療方法の検討を行うことが可能であ
る。本発明動物を用いた単球走化性蛋白質類または（お
よび）その受容体遺伝子の高発現細胞の供給、ケモカイ
ンおよびその受容体のシグナル伝達機構を解明する目的
に利用し得る。
【００４５】
配列番号（SEQ ID NO）：1 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：２７ 配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＴＹＰＥ）：核酸（nucl
eic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CTTGTCGACATGCAGGTCTCTGTCACG-3′ 配列番号（SEQ ID NO）：2 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：28 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CTTGTCGACACTAGTTCTCTGTCATACT-3′
eic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CTTGTCGACATGCAGGTCTCTGTCACG-3′ 配列番号（SEQ ID NO）：2 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：28 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CTTGTCGACACTAGTTCTCTGTCATACT-3′
【００４６】配列番号（SEQ ID NO）：3 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：20 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CGGCTCGTATATTGTGTGGA−3′ 配列番号（SEQ ID NO）：4 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：22 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CTTCAGATTTATGGGTCAAGTT−3′
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CGGCTCGTATATTGTGTGGA−3′ 配列番号（SEQ ID NO）：4 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：22 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CTTCAGATTTATGGGTCAAGTT−3′
【００４７】配列番号（SEQ ID NO）：5 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：19 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CTCTCGCCTCCAGCATGAA−3′ 配列番号（SEQ ID NO）：6 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：20 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−AAGACCCTCAAAACATCCCA−3′
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CTCTCGCCTCCAGCATGAA−3′ 配列番号（SEQ ID NO）：6 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：20 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−AAGACCCTCAAAACATCCCA−3′
【００４８】配列番号（SEQ ID NO）： 7 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：20 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−TTTCCAAGTCTCCACCCCAT−3′ 配列番号（SEQ ID NO）： ８ 配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＥＮＧＴＨ）：21 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状(linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid) アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−TTCTTTGGGACACTTGCTGCT−3′
leic acid） アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−TTTCCAAGTCTCCACCCCAT−3′ 配列番号（SEQ ID NO）： ８ 配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＥＮＧＴＨ）：21 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状(linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid) アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−TTCTTTGGGACACTTGCTGCT−3′
【００４９】配列番号（SEQ ID NO）： 9 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：33 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状(linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid) アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−ATCGTCGACATGCTGTCCACATCTCGTTCTCGG−3′ 配列番号（SEQ ID NO）： 10 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：33 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状(linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid) アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CTCTCTAGATTATAAACCAGCCGAGACTTCCTG−3′
leic acid) アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−ATCGTCGACATGCTGTCCACATCTCGTTCTCGG−3′ 配列番号（SEQ ID NO）： 10 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：33 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状(linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid) アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CTCTCTAGATTATAAACCAGCCGAGACTTCCTG−3′
【００５０】配列番号（SEQ ID NO）： 11 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：22 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状(linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid) アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CGGGGTCATTAGTTCATAGCCC−3′ 配列番号（SEQ ID NO）： 12 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：22 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状(linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid) アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−GACTCTCACTGCCCTATGCCTC−3′
leic acid) アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−CGGGGTCATTAGTTCATAGCCC−3′ 配列番号（SEQ ID NO）： 12 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：22 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状(linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nuc
leic acid) アンチセンス（ANTI‐SENCE）：No 配列：5′−GACTCTCACTGCCCTATGCCTC−3′
【図１】実施例１で構築したプラスミドpBK-CMV-RatMCP
-1構築図を示す。
-1構築図を示す。
【図２】実施例１で得られたサイトメガロウイルスプロ
モーター（Cytomegalovirus promoter）の下流にラット
単球走化性蛋白質ー１遺伝子（Rat MCP-1 cDNA）を組み
込んだ遺伝子の構造を示す。
モーター（Cytomegalovirus promoter）の下流にラット
単球走化性蛋白質ー１遺伝子（Rat MCP-1 cDNA）を組み
込んだ遺伝子の構造を示す。
【図３】実施例２で実施したサザンハイブリダイジェー
ション法の結果（電気泳動）を示す。
ション法の結果（電気泳動）を示す。
【図４】実施例２で実施したラット単球走化性蛋白質ー
１遺伝子（Rat MCP-1 cDNA）の導入解析の結果を示す。
１遺伝子（Rat MCP-1 cDNA）の導入解析の結果を示す。
【図５】実施例３で実施したトランスジェニックラット
R03056-2（雄）の体重測定の結果を示す。
R03056-2（雄）の体重測定の結果を示す。
【図６】実施例３で実施したトランスジェニックラット
R03073-7（雌）の体重測定の結果を示す。
R03073-7（雌）の体重測定の結果を示す。
【図７】実施例３で実施したトランスジェニックラット
R03124-4（雌）の体重測定の結果を示す。
R03124-4（雌）の体重測定の結果を示す。
【図８】実施例３で構築したトランスジェニックラット
R03125-4（雄）の体重測定の結果を示す。
R03125-4（雄）の体重測定の結果を示す。
【図９】実施例３で実施したトランスジェニックラット
R03125-8（雌）の体重測定の結果を示す。
R03125-8（雌）の体重測定の結果を示す。
【図１０】実施例３で実施したトランスジェニックラッ
トR03142-2（雄）の体重測定の結果を示す。
トR03142-2（雄）の体重測定の結果を示す。
【図１１】実施例３で実施したトランスジェニックラッ
トR03142-12（雌）の体重測定の結果を示す。
トR03142-12（雌）の体重測定の結果を示す。
【図１２】実施例３で実施したトランスジェニックラッ
トR03143-5（雄）の体重測定の結果を示す。
トR03143-5（雄）の体重測定の結果を示す。
【図１３】実施例３で実施したトランスジェニックラッ
トR03125-8F1系統の体重測定の結果を示す。
トR03125-8F1系統の体重測定の結果を示す。
【図１４】実施例３で取得したトランスジェニックラッ
トR03125-8F1系統の異常個体を示す。
トR03125-8F1系統の異常個体を示す。
【図１５】実施例４で構築したプラスミドpBK-CMV-hMCP
-1の構築図を示す。
-1の構築図を示す。
【図１６】実施例４で得られたサイトメガロウイルスプ
ロモーター（CMV promoter）の下流にヒト単球走化性蛋
白質−１遺伝子（human MCP 1）を組み込んだ遺伝子の
構造を示す。
ロモーター（CMV promoter）の下流にヒト単球走化性蛋
白質−１遺伝子（human MCP 1）を組み込んだ遺伝子の
構造を示す。
【図１７】実施例５で実施したサザンハイブリダイジェ
ーション法の結果（電気泳動を示す）。
ーション法の結果（電気泳動を示す）。
Claims (14)
- 【請求項１】外来性単球走化性蛋白質類または（およ
び）その受容体遺伝子、もしくはそれらの変異遺伝子を
組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（但し、外来
性マウスまたはヒト単球走化性蛋白質−１遺伝子を導入
されたマウスを除く）。 - 【請求項２】非ヒト哺乳動物がウサギ、イヌ、ネコ、モ
ルモット、ハムスター、マウス、ヒツジ、ウシまたはラ
ットである請求項１記載の動物。 - 【請求項３】非ヒト哺乳動物がラットである請求項１記
載の動物。 - 【請求項４】単球走化性蛋白質類がＣ−Ｃケモカイン受
容体と結合する能力を有し、かつ単球走化活性を示す蛋
白質または（および）その受容体である請求項１記載の
非ヒト哺乳動物。 - 【請求項５】単球走化性蛋白質類または（および）その
受容体が単球走化性蛋白質−１、単球走化性蛋白質−
２、単球走化性蛋白質−３、単球走化性蛋白質−４また
は単球走化性蛋白質−５、または（および）それらの受
容体である請求項１記載の非ヒト哺乳動物。 - 【請求項６】単球走化性蛋白質類または（および）その
受容体が単球走化性蛋白質−１または（および）その受
容体である請求項１記載の非ヒト哺乳動物。 - 【請求項７】サイトメガロウイルスプロモーターの下流
に外来性単球走化性蛋白質類または（および）その受容
体遺伝子、もしくはそれらの変異遺伝子を組み込んだＤ
ＮＡを有する非ヒト哺乳動物。 - 【請求項８】単球走化性蛋白質類遺伝子がラットまたは
ヒト単球走化性蛋白質類遺伝子である請求項５記載の動
物。 - 【請求項９】外来性ラットまたはヒト単球走化性蛋白質
類または（および）その受容体遺伝子、もしくはそれら
の変異遺伝子を含有し、哺乳動物において発現しうるベ
クター（但し、単球走化性蛋白質類がマウスまたはヒト
単球走化性蛋白質−１であり、マウスにおける発現のた
めに用いられるベクターを除く）。 - 【請求項１０】サイトメガロウイルスプロモーターの下
流に外来性単球走化性蛋白質類または（および）その受
容体遺伝子、もしくはそれらの変異遺伝子を含有し、哺
乳動物において発現しうるベクター。 - 【請求項１１】単球走化性蛋白質類または（および）そ
の受容体遺伝子がラットまたはヒト単球走化性蛋白質類
または（および）その受容体遺伝子である請求項９記載
のベクター。 - 【請求項１２】卵胞刺激ホルモン約２０ないし約５０Ｉ
Ｕ／個体を投与した後に黄体形成ホルモン約０ないし約
１０ＩＵ／個体を投与した雌ラットを雄ラットと交配さ
せることを特徴とするトランスジェニックラットの作製
方法。 - 【請求項１３】黄体形成ホルモン放出ホルモンあるいは
その類縁体を投与後、雄ラットと交配させた偽妊娠ラッ
トに外来性遺伝子を導入した受精卵を着床させることを
特徴とするトランスジェニックラットの作製方法。 - 【請求項１４】外来性遺伝子が単球走化性蛋白質類また
は（および）その受容体遺伝子である請求項１３記載の
作成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10056312A JPH10309149A (ja) | 1997-03-10 | 1998-03-09 | 単球走化性蛋白質類およびその受容体トランスジェニック動物 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5512997 | 1997-03-10 | ||
| JP9-55129 | 1997-03-10 | ||
| JP10056312A JPH10309149A (ja) | 1997-03-10 | 1998-03-09 | 単球走化性蛋白質類およびその受容体トランスジェニック動物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10309149A true JPH10309149A (ja) | 1998-11-24 |
Family
ID=26395980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10056312A Withdrawn JPH10309149A (ja) | 1997-03-10 | 1998-03-09 | 単球走化性蛋白質類およびその受容体トランスジェニック動物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10309149A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002011530A1 (fr) * | 2000-08-09 | 2002-02-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Animal transgenique |
| JP2002142610A (ja) * | 2000-11-07 | 2002-05-21 | Tohoku Techno Arch Co Ltd | Ａｌｓモデルラット |
| JP2003520047A (ja) * | 2000-01-19 | 2003-07-02 | ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ヨーク | 評価方法 |
| JP2013051960A (ja) * | 2000-01-19 | 2013-03-21 | Novocellus Ltd | 評価方法 |
-
1998
- 1998-03-09 JP JP10056312A patent/JPH10309149A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003520047A (ja) * | 2000-01-19 | 2003-07-02 | ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ヨーク | 評価方法 |
| JP2013051960A (ja) * | 2000-01-19 | 2013-03-21 | Novocellus Ltd | 評価方法 |
| WO2002011530A1 (fr) * | 2000-08-09 | 2002-02-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Animal transgenique |
| JP2002142610A (ja) * | 2000-11-07 | 2002-05-21 | Tohoku Techno Arch Co Ltd | Ａｌｓモデルラット |
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