JPH10310536A

JPH10310536A - イムノアッセイ法

Info

Publication number: JPH10310536A
Application number: JP24927797A
Authority: JP
Inventors: James Douglas Thacker; ジェームズ・ダグラス・サッカー; Ellen Schalk Casale; エレン・シャルク・カーサル; Stanley Stephen Stavinski; スタンリー・ステファン・スタビンスキー; Shuguang Wu; シャガング・ウー
Original assignee: Rohm and Haas Co
Current assignee: Rohm and Haas Co
Priority date: 1996-08-12
Filing date: 1997-08-12
Publication date: 1998-11-24
Also published as: ZA977188B; HU9701386D0; HUP9701386A2; HUP9701386A3; TW562925B

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】免疫原、抗体、キット及びそれを用いてジアシ
ルヒドラジン化合物を測定する方法を提供する。【解決手段】キャリア材料に結合した次式：（式中、Ｒ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独
立して、水素、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル及び置換（Ｃ_１
〜Ｃ_６）アルキル、（Ｃ_２〜Ｃ_６）アルケニル及び置換
（Ｃ_２〜Ｃ_６）アルケニル、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルコキ
シ、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルオキシ及びハライドであ
る）の化合物を含む免疫原及びこの免疫原に対して産生
された抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ジアシルヒドラジン化合物を測
定するためのイムノアッセイ法に関する。

【０００２】ジアシルヒドラジン化合物を測定するため
の方法は公知である。例えば、高圧液クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）、気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）、
ＧＣ−マススペクトル法及びＨＰＬＣ−マススペクトル
法があるが、現在利用可能な方法は僅かである。しかし
ながら、これらの方法は幾つかの欠点を有している。こ
れらの方法は、概して、高価で複雑な装置を必要とす
る。更に、試料の調製及び実際の分析は非常に時間がか
かり、かかる方法に関して特別に訓練を受けた化学者及
び技術者を必要とする。更に、かかる従来法では、類縁
体又は代謝産物或いはその両方を、同一の工程で迅速に
スクリーニングすることはできない。むしろ、検出を行
なう前に、個々の化合物を分離することが概して必要で
ある。したがって、これらの方法は、例えばフィールド
試験又は大容量試験において必要とされているような迅
速で低コストの測定のためには実施することができな
い。

【０００３】ジアシルヒドラジン化合物は、農薬として
の特定用途が見出されている。具体的には、毛虫の脱皮
促進剤化合物（ＭＡＣ）としての用途が見出されてい
る。全ての潜在的な毒性化学物質と同様に、かかる農薬
は、政府によって規制を受ける。かかる使用に関して好
適な感受性を有するアッセイを必要とする連邦殺虫剤、
殺菌剤及び殺鼠剤法（ＦＩＦＲＡ）登録ガイドライン、
サブディビジョンＯにおいては、規制の認可を得るプロ
セス中において残留物の分析が必要とされる場合があ
る。更に、アッセイは、ジアシルヒドラジン殺鼠剤の主
たる代謝生成物に対する適当な交叉反応性を有してい
て、ＦＩＦＲＡ登録ガイドラインサブディビジョンＮに
おいて要求されているような代謝及び環境に対する影響
の研究において用いるのに好適なものでなければならな
い。アッセイは、また、農薬の使用を監視するためにも
要求されている。

【０００４】したがって、ＦＩＦＲＡガイドラインを満
足する十分な感受性及び交叉反応性を有し、迅速なスク
リーニングを可能にし、用いるのに簡単で高価でないジ
アシルヒドラジンアッセイに対する必要性がある。

【０００５】本発明者らは、ＦＩＦＲＡガイドライン下
における使用を適正化するのに十分に感受性であり、十
分な交叉反応性を有する免疫化学アッセイを開発した。
更に、このアッセイは、用いるのに簡単で高価でない。

【０００６】本発明の第１の態様においては、キャリア
材料に結合した次式：

【化２】（式中、Ｒ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³及びＲ⁴は、それぞれ独立し
て、水素、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル及び置換（Ｃ₁〜Ｃ₆）
アルキル、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルケニル及び置換（Ｃ₂〜
Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁〜Ｃ
₆）アルキルオキシ及びハライドである）の化合物を含
む免疫原が提供される。

【０００７】本発明の第２の態様においては、以下の工
程：（Ａ）未知量のジアシルヒドラジンを含む試料を提供
し；（Ｂ）試料を、固定化された（immobilized）ジアシル
ヒドラジン抗原の存在下でジアシルヒドラジン抗原に対
する結合親和性（binding affinity）を有する抗体と接
触させて、結合及び未結合の抗体−抗原コンプレックス
（bound and unbound antibody-antigen complex）を形
成し；（Ｃ）未結合の抗体−抗原コンプレックスを結合抗体−
抗原コンプレックスから分離し；（Ｄ）結合抗体コンプレックスを検出可能な標識で標識
化し；（Ｅ）標識中において測定可能な変化を起こさせ；（Ｆ）試料中のジアシルヒドラジンを測定する；工程を
含む、ジアシルヒドラジン又はその誘導体を測定する方
法が提供される。

【０００８】本発明の第３の態様においては、以下の工
程：（Ａ）未知量のジアシルヒドラジンを含む試料を提供
し；（Ｂ）試料を、ジアシルヒドラジン抗原に対する結合親
和性を有する固定化抗体と接触させて、固定化抗体−抗
原コンプレックスを形成し；（Ｃ）検出可能な標識で標識化されたジアシルヒドラジ
ン抗原を、未コンプレックス化固定化抗体と接触させ
て、標識化抗体−抗原コンプレックスを形成し；（Ｄ）標識中において測定可能な変化を起こさせ；（Ｅ）試料中のジアシルヒドラジンを測定する；工程を
含む、ジアシルヒドラジン又はその誘導体を測定する方
法が提供される。

【０００９】本発明の第４の態様においては、以下の成
分：（Ａ）ジアシルヒドラジンに対する結合親和性を有する
抗体；（Ｂ）抗体に結合することのできる標識；及び（Ｃ）標識の存在下で測定可能な変化を生起させること
のできる基質；を含む、ジアシルヒドラジンを測定する
ためのキットが提供される。

【００１０】ここで用いる「抗原」という用語は、抗体
生成を刺激（stimulating）することのできる任意の物
質を意味すると理解される。同様に、「ジアシルヒドラ
ジン抗原」という用語は、抗体生成を刺激することので
きる任意のジアシルヒドラジン化合物であって、生成す
る抗体がジアシルヒドラジン及びその誘導体に対して結
合親和性を有するものを意味すると理解される。また、
「免疫原」という用語は、免疫応答を誘発させるのに用
いられる任意の物質を包含すると理解される。免疫原
は、概して、キャリア分子及び他の構成成分（ハプテン
（hapten））から構成される。

【００１１】ここで用いる「測定」という用語は、定性
分析、即ち試料中の分析対象物の存在の確認と、定量分
析、即ち試料中の分析対象物の量の測定の両方を包含す
ると理解される。また、この用語は、当該技術において
周知の標準試料及び標準曲線の調製をも包含し得ると理
解される。

【００１２】ここで用いる「ジアシルヒドラジン化合
物」という用語は、その範囲内において、ジアシルヒド
ラジン及び、それから誘導される代謝産物、合成類縁
体、環境的分解物及び光化学分解物を包含すると理解さ
れる。

【００１３】ここで用いる「ＩＣ₅₀」という用語は、吸
光度を、抑制剤が存在しない場合に測定した吸光度の１
／２に減少させるのに必要な抑制剤の濃度として定義さ
れる。この測定は、残留活性の割合（％）を抑制剤の濃
度に対してプロットすることによって行なわれる。ここ
で、残留活性割合（％）は、以下の式で与えられる。

【００１４】活性（％）＝（Ａ₀−Ａ_i／Ａ₀）×１００（式中、Ａ₀は抑制剤が存在しない場合の測定吸光度で
あり、Ａ_iは抑制剤濃度ｉにおける測定吸光度である）

【００１５】次に、抑制（％）は、１００−（活性
（％））の式によって与えられる。交叉反応性（cross
reactivity）（％）は、次式によって誘導される。交叉反応性（％）＝（ＩＣ_50,5992／ＩＣ_50,類縁体）×
１００（式中、ＩＣ_50,5992は上記で測定したＲＨ５９９２に
関するＩＣ₅₀濃度であり、ＩＣ_50,類縁体は、類縁体、
即ちＲＨ２７０３、ＲＨ２６５１及びＲＨ０３４５のＩ
Ｃ₅₀濃度である）

【００１６】ｎｇでの感受性は、次式で記載されている
ような標準濃度の繰り返し分析の標準偏差の回帰分析か
ら決定される抑制剤の濃度から算出する。Ｓ＝（Ｙ_int／ｍ）×Ｖ（式中、Ｓは感受性（ｎｇ）であり、Ｙ_intは、繰り返
し分析の標準偏差からの回帰線のＹ切片（吸光度単位）
であり、ｍは回帰線の傾き（ｎｇ／ｍｌあたりの吸光度
単位）であり、Ｖはマイクロタイタープレートへ施した
試料の容量（ｍｌ）である）

【００１７】回収率（％）は次式から算出される。％Ｒ＝（Ｃ₀／Ｃ_a）×１００（式中、Ｃ₀は観察（測定）濃度であり、Ｃ_aは実際（ス
パイク（spike））濃度である）

【００１８】上記に示したように、ジアシルヒドラジン
に対する抗体を調製するのに有用な免疫原が提供され
る。概して、免疫原は、ハプテン及びキャリア分子を含
む。

【００１９】ハプテンは、一般に、ジアシルヒドラジン
分子又はその誘導体である。一態様においては、ハプテ
ンはベンゾイルヒドラジンである。ベンゾイルヒドラジ
ン化合物は、上式（１）の化合物である。

【００２０】（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルの好適な例として
は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ
−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチ
ル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソ
ヘキシル等が挙げられるが、これらに限定されない。
（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換アルキルの好適な例としては、ヒドロ
キシ、ハライド、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルコキシ及びニトロに
よって置換された、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イ
ソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチ
ル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−
ヘキシル等が挙げられるが、これらに限定されない。

【００２１】（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルケニルの好適な例として
は、エテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−
ブテニル、イソブテニル、ｔｅｒｔ−ブテニル、ｎ−ペ
ンテニル、イソペンテニル、ネオペンテニル、ｎ−ヘキ
セニル等が挙げられるが、これらに限定されない。（Ｃ
₂〜Ｃ₆）置換アルケニルの好適な例としては、ヒドロキ
シ、ハライド又はニトロ基によって置換された、エテニ
ル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、
イソブテニル、ｔｅｒｔ−ブテニル、ｎ−ペンテニル、
イソペンテニル、ネオペンテニル、ｎ−ヘキセニル等が
挙げられるが、これらに限定されない。

【００２２】（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシの好適な例として
は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポ
キシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキ
シ、ｎ−ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ
及びｎ−ヘキソキシが挙げられるが、これらに限定され
ない。

【００２３】（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルオキシの好適な例と
しては、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、アセチルオキシ
（−ＣＨ₂ＣＯＯＨ）、プロピルオキシ（−ＣＨ₂ＣＨ₂
ＣＯＯＨ）及びｎ−ブチルオキシ（−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂
ＣＯＯＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【００２４】ハライドの好適な例としては、Ｃｌ−、Ｂ
ｒ−、Ｆ−及びＩ−が挙げられるが、これらに限定され
ない。

【００２５】好ましい態様においては、Ｒは−ＣＨ₂Ｃ
ＯＯＨであり、Ｒ¹及びＲ²はそれぞれメチルであり、Ｒ
³及びＲ⁴はそれぞれ水素である。より好ましい態様にお
いては、Ｒは−ＣＯＯＨであり、Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ
メチルであり、Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ水素である。

【００２６】キャリア材料は、タンパク質、例えば（限
定なしに）、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、又
はキーホールリンペットヘモシアニン；多糖類、例えば
（限定なしに）、デキストラン、セファロース、アガロ
ース又はセルロース；又は合成ポリマー又はコポリマ
ー、例えば（限定なしに）、ポリアクロレイン、ポリア
ミド、ポリアクリルアミド、ポリブチレート、ポリ尿
素、ポリウレアミド又はポリスチレンであってよい。

【００２７】好ましい態様においては、キャリア材料
は、キャリアタンパク質、より好ましくはウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）又はキーホールリンペットヘモシアニ
ン（ＫＬＨ）、最も好ましくはキーホールリンペットヘ
モシアニンである。

【００２８】本発明の免疫原を用いて、ジアシルヒドラ
ジン化合物に対する抗体を調製することができる。免疫
原を、好適な動物中に導入して抗体を採取し、単離し、
精製する。得られた抗体は、ジアシルヒドラジン化合物
及びその誘導体、特にベンゾイルヒドラジン及びその誘
導体に対する高い結合親和性及び交叉反応性を有するポ
リクローナル抗体である。

【００２９】また、免疫原を用い、当該技術において周
知のハイブリドーマ法を使用して、モノクローナル抗体
を調製することができる。

【００３０】一態様においては、抗体を、キャリア材料
に結合した式（１）の免疫原に対して産生させる（ｒａ
ｉｓｅｄ）。好ましい態様においては、抗体を、キャリ
ア材料に結合した、Ｒが−ＣＨ₃ＣＯＯＨであり、Ｒ¹及
びＲ²がメチルであり、Ｒ³及びＲ⁴が水素である式
（１）の免疫原に対して産生させる。より好ましい態様
においては、抗体を、キャリア材料に結合した、Ｒが−
ＣＯＯＨであり、Ｒ¹及びＲ²がメチルであり、Ｒ³及び
Ｒ⁴が水素である式（１）の免疫原に対して産生させ
る。

【００３１】上記に示したように、本発明は、ジアシル
ヒドラジン又はその誘導体を測定する方法を提供する。
まず、本方法は、（Ａ）未知量のジアシルヒドラジンを
含む試料を提供する工程を含む。

【００３２】試料は、一般に、ジアシルヒドラジンを含
む可能性のある任意の材料である。好適な例としては、
空気、水、土壌及び生物学的材料が挙げられる。一態様
においては、試料は、空気試料又は空気試料から誘導さ
れた試料であってよい。他の態様においては、試料は、
水試料又は水試料から誘導された試料であってよい。更
に他の態様においては、試料は、土壌試料又は土壌試料
から誘導された試料であってよい。

【００３３】一態様においては、試料は、生物学的材料
又は生物学的材料を含む試料或いは生物学的材料から誘
導された試料であってよい。生物学的材料の好適な例と
しては、制限なしに、植物材料；血液、血清、血漿、リ
ンパ液、胃洗浄液、胆汁、硝子体液（vitreous humor）
のような生物学的液体；植物及び動物組織のような生物
学的組織、及びバクテリア及びビールスのような微生物
学的試料が挙げられる。

【００３４】好ましい態様においては、試料は土壌又は
植物材料又はそれから誘導された試料である。

【００３５】ジアシルヒドラジン化合物は、式（１）に
おいて上記したようなもの並びにその誘導体である。か
かる誘導体は、制限なしに、それから誘導された代謝産
物、合成類縁体、環境的分解物、光化学分解物であって
よい。特に有用なジアシルヒドラジン類は、以下の表１
に示す式（１）のベンゾイルヒドラジンである。

【００３６】

【表１】ベンゾイル R R¹ R² R³ R⁴ ヒドラジン RH5992 -CH₂CH₃ -CH₃ -CH₃ H H RH2485 H -CH₃ -CH₃ -CH₃ -OCH₃ RH2703 -CH₂COOH -CH₃ -CH₃ H H RH2651 -COOH -CH₃ -CH₃ H H RH0345 -Cl H H H H

【００３７】工程（Ａ）の試料を、工程（Ｂ）におい
て、固定化されたジアシルヒドラジン抗原の存在下でジ
アシルヒドラジンに対する結合親和性を有する抗体と接
触させる。

【００３８】抗体は、上記に記載のようなものであり、
ＫＬＨに結合したＲＨ２６５１を含む免疫原から産生さ
れた抗体が好ましい。

【００３９】固定化ジアシルヒドラジン抗原の抗原は、
上記に記載の任意のキャリア分子に結合した上記に記載
の任意のジアシルヒドラジンであってよい。好ましい態
様においては、固定化抗原は、キャリアタンパク質に結
合したＲＨ２６５１又はＲＨ２７０３、より好ましくは
ＢＳＡに結合したＲＨ２７０３である。抗原とキャリア
分子との組み合わせは、被覆抗原（coating antigen）
と称する。

【００４０】被覆抗原は、概して、かかる抗原の付着に
敏感に反応し得る表面を有する固体支持体上に固定化さ
れる。好適な例としては、制限なしに、マイクロタイタ
ープレート；ニトロセルロース、セルロース、セルロー
スアセテート、ポリカーボネート等のような膜材料；試
験管；ビーズ、カラム充填材料等のような粒子；及びそ
の上に付着した抗原を結合させることのできる結合ドメ
インを有する誘導体化表面が挙げられる。概して、被覆
抗原は、固体支持体に施し、その上に吸着させる。

【００４１】一態様においては、被覆抗原はマイクロタ
イタープレート上に吸着させる。工程（Ｂ）において
は、遊離抗原、即ち試料中の未知量のベンゾイルヒドラ
ジンと、固定化、即ち結合した抗原との間に、ジアシル
ヒドラジンに対する高い親和性を有する抗体上の結合部
位に対する競合が起こる。その結果、結合及び未結合の
抗原−抗体コンプレックスが形成される。工程（Ｃ）に
おいては、結合コンプレックスを未結合コンプレックス
から分離する。分離は、制限なしに、重力分離、磁気分
離及び未結合コンプレックスを除去するための洗浄をは
じめとする当該技術において公知の任意の手段によるこ
とができる。

【００４２】未結合抗原−抗体コンプレックスから分離
したら、工程（Ｄ）において、結合コンプレックスを、
検出可能な標識で標識化する。標識は、結合抗原−抗体
コンプレックスに結合させて検出することのできる任意
の材料であってよい。標識は、直接に、又は基材との相
互作用を介して間接的に検出することができる。好適な
例としては、制限なしに、酵素、着色染料、ケイ光材
料、化学ルミネセンス材料、生物ルミネセンス材料及び
放射線同位元素が挙げられる。好ましい態様において
は、検出可能な標識は酵素である。概して、酵素を、結
合抗体−抗原コンプレックスに対して結合親和性を有す
る材料に結合させる。コンプレックスに対する標識の結
合は、抗体−抗原、タンパク質−リガンド、又はアビジ
ン（ストレパビジン）−ビオチン結合によることができ
る。好ましい態様においては、結合は抗体−抗原結合で
あり、標識は、結合抗体−抗原コンプレックスに対する
結合親和性を有する抗体に結合させる。かかる結合によ
って、当該技術において周知の典型的な「サンドイッ
チ」構造が形成される。標識に結合した抗体は、ポリク
ローナル又はモノクローナルであってよい。更に、Ｆａ
ｂフラグメントのような抗体の結合領域を含む上記記載
の任意の抗体の抗体フラグメントを用いることができ
る。勿論、標識に結合させる具体的な抗体は、抗原に結
合させる抗体のタイプに依存する。即ち、標識に結合さ
せる抗体は、固定化抗体−抗原コンプレックスに対する
結合親和性を有するように選択される。

【００４３】例えば、好ましい態様においては、本発明
の抗原に結合した抗体を、ウサギ内で産生させる。した
がって、標識に結合した抗体は、ウサギ抗体に対する結
合親和性を有する抗ウサギ抗体である。

【００４４】固定化抗体−抗原コンプレックスを標識化
したら、工程（Ｅ）において、標識内に測定可能な変化
を起こさせる。測定可能な変化は、ＵＶ−可視光、ケイ
光及び電気波形の照射又は標識と相互作用して測定可能
な変化を生起させる基質の導入によって行なうことがで
きる。測定可能な変化は標識において固有であり、例え
ば、標識は放射線同位元素であってよく、この場合に
は、放射能例えばガンマ線であり、これは放射能を測定
する手段を導入することによって簡単に行なうことがで
きると理解される。

【００４５】一態様においては、測定可能な変化は、標
識化コンプレックスを基質と接触させることによって行
なわれる。かかる基質は、当該技術において周知であ
り、勿論、用いる標識のタイプに依存する。好ましい態
様においては、標識は酵素であり、基質は、酵素と相互
作用して測定可能な変化を生起させることのできる化合
物である。より好ましい態様においては、酵素はホスフ
ァターゼであり、基質はホスフェート化合物である。酵
素と基質との相互作用によって、概して、測定可能な特
性を有する化合物が得られる。例えば、ケイ光性である
化合物は、強い吸光度を有する、などである。

【００４６】最後に、工程（Ｅ）において測定可能な変
化を起こさせたら、ジアシルヒドラジンを工程（Ｆ）に
おいて測定する。かかる測定は、当該技術において公知
の方法、例えばＵＶ−可視分光光度測定法、ケイ光測定
法、ガンマ計数法等による。

【００４７】上記記載のアッセイは、一般に、間接アッ
セイ法として知られている。また、本発明の範囲内に
は、直接アッセイ法も包含されると理解される。まず、
直接法は、工程（Ａ）において、未知量のジアシルヒド
ラジンを含む試料を提供する工程を包含する。試料及び
ジアシルヒドラジンは上記に記載の通りである。

【００４８】工程（Ａ）の試料を、工程（Ｂ）におい
て、ジアシルヒドラジンに対する結合親和性を有する固
定化抗体と接触させて、固定化抗体−ジアシルヒドラジ
ンコンプレックスを形成させる。抗体は上記記載の通り
であり、ＲＨ２６５１に対して産生された抗体が好まし
い。

【００４９】抗体は、一般に、かかる抗体の付着に対し
て敏感に反応し得る表面を有する固体支持体上に固定化
される。好適な例としては、制限なしに、マイクロタイ
タープレート；ニトロセルロース、セルロース、セルロ
ースアセテート、ポリカーボネート等のような膜材料；
試験管；ビーズ、カラム充填材料等のような粒子；及び
その上に付着した抗体を結合させることのできる結合ド
メインを有する誘導体化表面が挙げられる。好ましい態
様においては、抗体は、被覆抗原に関して上記に記載し
たような固体支持体に固着せしめられた被覆抗体であ
る。

【００５０】工程（Ｂ）において、固定化ポリクローナ
ル抗体の結合部位は、遊離抗原、即ち試料中の未知量の
ベンゾイルヒドラジンによって満たされて、固定化抗体
−抗原コンプレックスを形成する。工程（Ｃ）におい
て、検出可能な標識で標識化されたジアシルヒドラジン
抗原を、試料からのベンゾイルヒドラジンに結合してい
ない固定化抗体上の部位と接触させる。したがって、標
識化抗原によって、抗体上の残りの結合部位が満たされ
る。これによって、固定化抗体は、標識化及び未標識化
抗原と結合する。ジアシルヒドラジン抗原及び標識は、
上記に記載の通りである。しかしながら、好ましい態様
においては、抗原はＲＨ２６５１であり、標識は酵素、
好ましくはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）である。

【００５１】最後に、工程（Ｄ）において、測定可能な
変化を標識内に起こさせて、ジアシルヒドラジンを工程
（Ｅ）において測定する。測定可能な変化を起こさせ、
ジアシルヒドラジンを測定する方法は、間接アッセイに
関して上記に記載した通りである。

【００５２】ＲＨ５９９２及びその誘導体であるＲＨ２
７０３、ＲＨ２６５１、ＲＨ０３４５及びＲＨ２４８５
のようなジアシルヒドラジンに関してここに記載したア
ッセイは、ＦＩＦＲＡ登録によって要求されているフィ
ールド残留物調査に対して適用するのに十分な感受性を
有する。更に、アッセイは、ＲＨ０３４５のような構造
的に類似しない類縁体との十分な交叉反応性を有してお
り、即ち、アッセイは、置換Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ，Ｎ’
−ベンゾイルヒドラジン農薬のすべてのクラスに対して
適用可能であると考えられる。

【００５３】ＲＨ５９９２に代表される農薬のクラスに
対するアッセイの感受性（ｐｐｂ）及びその一般的な有
用性とは別に、最も大きな有利性は、向上せしめられた
実験室効率性であるかもしれない。例えば、単一の分析
者が、一日あたり２０個の試料を容易に処理することが
できることが示された。これは試料の調製と結果の計算
の時間を含んでいる。一日１０時間として、１試料あた
り僅か約３０人−分の作業コストしかかからない。

【００５４】本発明の抗体に関する更なる用途として
は、抗体を固体支持体に結合させて、試料マトリクスか
らの残留物を濃縮し、ケイ光タグで標識化して、細胞内
での殺鼠剤残留物の所在を確認するための組織研究にお
いて用いることができるようにすることが挙げられる。
この情報によって、特定のジアシルヒドラジン化合物の
作用モード又は毒性及び代謝のメカニズムに関する重要
な情報が提供される。また、直接イムノアッセイ法を、
フィールド分析及び用途の実地調査タイプ（survey typ
es）のためのディップスティック試験（dip-stick tes
t）中に包含させることができる。

【００５５】以下の略号を、以下の実施例及び明細書の
他の部分において用いる。ＢＣＡ：ビシンコニン酸（bicinchoninic acid）ＢＳＡ：ウシ血清アルブミンＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミドＤＥＡ：ジエタノールアミンＤＭＦ：ジメチルホルムアミドＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼＫＬＨ：キーホールリンペットヘモシアニンＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドＰＢＳ：ホスフェート緩衝食塩水ＰＢＳＴ：ＰＢＳ及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０ＰＮＰＰ：パラ−ニトロフェニルホスフェート

【００５６】実施例１免疫原の合成５ｍｌの西洋ナシ形フラスコに、２１マイクロモルのハ
プテンＲＨ２６５１を加え、２００μｌのＤＭＦ（Fish
er Scientific）中に溶解した。別の４ｍｌの試験管中
において、１６ｍｇのＤＣＣ（ＥＭＳｃｉｅｎｃｅ）
及び９．１ｍｇのＮＨＳ（Sigma Chemical）を、２００
μｌのＤＭＦ中に溶解した。ＤＣＣ及びＮＨＳを、ハプ
テンを含むフラスコに移し、反応物質を室温で約２時間
攪拌した。反応系を冷却室に移して、４℃で攪拌を一晩
継続した。

【００５７】キャリアタンパク質であるＫＬＨ（Imjec
t，Pierce Chemical Co．，ＰＢＳ中タンパク質２０ｍ
ｇ）（戻すとｐＨ７．２）を、脱イオン水５．４ｍｌ中
で戻した（reconstituted）。活性化されたハプテンを
マイクロ遠心分離器（Microcentrifuge Model 235B，Fi
sher Scientific）に移し、５分間遠心分離して、置換
された尿素沈殿物を除去した。上澄み液を、戻したキャ
リアタンパク質溶液に移し、室温で４時間攪拌を継続し
た。

【００５８】タンパク質反応混合物を、１４０００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離して、沈殿したタンパク質を除去し
た。上澄み液の全量を、Ｓｗｉｆｔポリアクリルアミド
脱塩カラム（Pierce Chemical Co．）に施し、３ｍｌフ
ラクション中の０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．３）で溶出
した。試料を完全にカラム上に充填した後に、フラクシ
ョンを採取した。１０個の３ｍｌフラクションを採取
し、２８０ｎｍにおける吸光度を、それぞれのフラクシ
ョンに関して測定した。免疫原を含むフラクションをプ
ールし、ＢＣＡ法（ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬説明
書：ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．を参照）
によってタンパク質濃度を測定した。

【００５９】ハプテン／タンパク質結合比を以下のよう
にして測定した。０μｇ／ｍｌ〜１２００μｇ／ｍｌの
範囲の２５４ｎｍにおけるＫＬＨの吸光度の標準曲線を
作成した。ＢＣＡ法によって測定した免疫原フラクショ
ンのタンパク質濃度を、標準曲線から２５４ｎｍにおけ
る吸光度に変換した。２５４ｎｍにおけるハプテンＲＨ
２６５１及びＲ２７０３の吸光度の標準曲線を、ＲＨ２
７０３に関しては２６〜２６０ナノモル／ｍｌ、ＲＨ２
６５１に関しては６．５〜２１０ナノモル／ｍｌの濃度
範囲に亙って作成した。

【００６０】免疫原の吸光度を２５４ｎｍにおいて測定
し（Ａ_conj）、ＫＬＨからの２５４ｎｍにおける吸光度
に対する算出寄与（calculated contribution）
（Ａ_KLH）を差し引いて、ハプテンから得られた吸光度
（Ａ_Hap）を得た。この値Ａ_Hapを、ハプテンに関する標
準曲線から濃度（ナノモル／ｍｌ）に変換した。

【００６１】ハプテンの算出濃度（ナノモル／ｍｌ）を
免疫原の測定濃度で割ることによって、タンパク質に対
するハプテンのモル結合比を算出した。ＫＬＨに関して
６．７×１０⁶ダルトンの平均分子量を用いた。モル結
合比を６７０で割ることによって、ＫＬＨ１０，００
０ａｍｕあたりのハプテン分子の平均数を算出した。結
果を表２に示す。

【００６２】実施例２更なる免疫原の合成用いたハプテンがＲＨ２７０３である他は実施例１の手
順にしたがって免疫原を調製した。結果を表２に示す。

【００６３】実施例３被覆抗原の合成キャリアタンパク質としてＫＬＨをＢＳＡ（Imject、Pi
erce Chemical Co．）に代えた他は実施例１における免
疫原の調製手順にしたがって、被覆抗原（ＲＨ２７０３
及びＲＨ２６５１）を調製した。モル結合比の算出にお
いて用いたＢＳＡの平均分子量は６８，０００ダルトン
であった。モル結合比を６．８で割ることによって、Ｂ
ＳＡ１０，０００ａｍｕあたりのハプテン分子の平均
数を算出した。調製した被覆抗原に関する結果を表２に
示す。

【００６４】

【表２】試料タンパク質ハプテンハプテン／Ｎ⁽¹⁾ マイクロモル／ｍｌマイクロモル／ｍｌタンパク質 RH2651-KLH 2.8×10^-4 0.437 1560 2 RH2703-KLH 2.9×10^-4 0.943 3250 5 RH2651-BSA 0.03 1.5 50 7 RH2703-BSA 0.04 2.2 55 8⁽¹⁾ Ｎはタンパク質１０，０００ａｍｕあたりのハプテンの分子数である。

【００６５】実施例４抗体の製造免疫原（０．０１ＭのＰＢＳ中において１ｍｇ／ｍｌに
戻した実施例２の生成物）２．５ｍｌ、２５ｍｇのM．t
uberculosis懸濁液及び２．５ｍｌのFreundアジュバン
トから一次接種物を調製した。混合物を、粘稠でクリー
ム状になるまでホモジナイズした。

【００６６】ニュージーランド白ウサギ（５）を用いて
抗体を製造した。ウサギは、４．７５〜５．５ポンドの
重量の疾病のないメスのウサギであった。ウサギを、ま
ず、Bordetella pertussis（０．６ｍｌの食塩水中に懸
濁した６×１０¹⁰個の細胞を含むように調製したB．per
tussis接種物）に対して筋肉内接種して、採血してバッ
クグラウンド滴定濃度を得た。

【００６７】ウサギあたりの一次接種物の投与量は、皮
下注射によって１．０ｍｌであった。ウサギに接種し、
２１日毎にブースター免疫処理を受容させた。４回目の
ブースター注射の８日後に、ウサギを採血して抗体を採
取した。更なる時間の後、ブースター注射を再び開始し
て、４回目のブースター注射の後に生成物の採血を再び
行なった。

【００６８】実施例５ウサギ抗血清のアッセイ被覆抗原を、被覆バッファー（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）中
に戻して、約１０μｇ／ｍｌの開始濃縮物を得た。９６
ウェルマイクロタイタープレートのカラム１及び２のウ
ェルは対照試料用とした。カラム３におけるウェルから
はじめて、被覆抗原２００μｌを開始濃縮物に加えた。
カラム４〜１２におけるウェルに、被覆バッファー１０
０μｌを含ませた。カラム３のウェル中の被覆抗原の一
部（１００μｌ）を移して、カラム４のウェル中の被覆
バッファーと混合し、この方法で、被覆抗原を、被覆バ
ッファーで１：２に階段希釈され、それぞれ次のカラム
のウエルに入れた。希釈プロセスを、被覆抗原の１：２
５６希釈であるカラム１１まで続けた。最後の１００μ
ｌは廃棄した。カラム１２におけるウェルは、陰性の対
照試料として、被覆バッファーのみを含み抗原を含まな
いものであった。ウェルＡ１及びＡ２は、空気ブランク
であり、試薬を入れなかった。ウェルＢ１及びＢ２は、
被覆抗原で被覆し、これはバックグラウンドウェルであ
った。ウェルＣ１及びＣ２は、陽性対照試料として、被
覆バッファー中のＫＬＨ（約１０μｇ／ｍｌ）１００μ
ｌで被覆した。残りのウェルであるＤ１〜Ｈ２は未処理
のものであった。かくして調製されたプレートを、封止
テープで封止し、カバーし、プラスチックラップで被包
して、冷蔵庫内に配置して４℃で一晩インキュベートし
た。

【００６９】一晩のインキュベーションの後、プレート
を冷蔵庫から取り出し、他の容器に移した。ウェル中の
未結合結合部位（Ａ１及びＡ２を除く）を、ＢＳＡブロ
ッキング溶液（１％ＢＳＡ、ｐＨ７．２、１００ｍｌの
ＰＢＳ中に溶解した１．０ｇのＢＳＡから調製した）３
００μｌでブロッキングした。溶液を室温で少なくとも
１０分間インキュベートした。

【００７０】試験試料を、ブロッキング溶液で１：１０
００に希釈し、２００μｌを、ウェルＡ３からはじめて
Ａ列のウェルに施した。Ｂ３〜Ｈ３列のウェルは１００
μｌのブロッキング溶液を含んでいた。Ａ列のウェルの
試験試料（１００μｌ）をＢ列のウェルに移し、十分に
混合した。この方法で、試料をＧ３列のウェル（１：６
４０００）まで１：２に階段希釈し、最後の１００μｌ
を廃棄した。Ｈ３列のウェルは抗体を含んでおらず、陰
性の対照試料であった。バックグラウンドウェルＢ１及
びＢ２を、ブロッキング溶液で１：５００に希釈した予
め採血した血清１００μｌを用いてインキュベートし
た。陽性対照試料ウェルＣ１及びＣ２を、試験試料の
１：１０００希釈液を用いてインキュベートした。プレ
ートを、試験試料を用いて約１時間インキュベートし
た。

【００７１】インキュベーションの後、試験試料を取り
出し、ウェルを洗浄バッファーで洗浄した。ウェルにバ
ッファーを４〜５回満たした。３回目〜４回目の洗浄中
に、廃棄前にバッファーをウェル中に３〜５分間保持し
て浸漬した。アルカリ性ホスファターゼ（Pierce Chemi
cal Co．）に結合したヤギの抗ウサギＩｇＧ０．６ｍ
ｇを、５０％グリセロールで戻して、ブロッキング溶液
で１：５０００に希釈した。この溶液１００μｌを、そ
れぞれのウェルに加え、プレートを室温で少なくとも１
時間インキュベートした。過剰の抗ウサギ抗体を洗浄除
去し、ＰＮＰＰ溶液（脱イオン水８ｍｌ及びＤＥＡバッ
ファー２ｍｌ中に溶解したＰＮＰＰ５ｍｇ）１００μ
ｌをそれぞれのウェルに加えた。プレートを室温で３０
分間インキュベートした。次に、２Ｎ−ＮａＯＨ５０
μｌを加えて酵素反応を停止させた。Ｄｙｎａｔｅｃｈ
ＭＲ５０００マイクロタイタープレートリーダーを用
いて、４１０ｎｍにおけるそれぞれのウェルにおける吸
光度を測定した。結果を表３に示す。

【００７２】

【表３】免疫原ウサギ＃試験採血試験採血生成物採血生成物採血＃１＃２＃１＃２ RH2651-KLH 1331 1/32000 1/64000 1/64000 1/128000 RH2651-KLH 1332 1/32000 1/128000 1/64000 1/128000 RH2651-KLH 1333 1/32000 採血なし⁽²⁾ 1/64000 1/128000 RH2651-KLH 1334 1/32000 1/64000 1/128000 1/128000 RH2651-KLH 1335 1/32000 1/32000 1/128000 1/128000 RH2703-KLH 1336 1/16000 1/64000 1/64000 1/128000 RH2703-KLH 1337 1/16000 1/64000 1/64000 1/128000 RH2703-KLH 1338 1/16000 1/64000 1/64000 1/128000 RH2703-KLH 1339 1/32000 1/64000 1/64000 1/128000 RH2703-KLH 1340 nd⁽¹⁾ 1/64000 1/64000 1/128000 (1)抗体滴定量は測定しなかった (2)耳のキズのため、この動物における試験採血の採取が阻害された

【００７３】実施例６抗体の単離及び精製実施例３における注射の過程で採取された免疫血清をプ
ールし、ＢＣＡ法によって全タンパク質に関してアッセ
イして、６６ｍｇ／ｍｌであることが分かった。免疫血
清の容量を測定し、それぞれ９０ｍｌの二つの等量のア
リコートに分割した。一つのアリコートを２倍量の脱イ
オン水で希釈した。得られた溶液容量を、続けて、等容
量の４Ｍ硫酸アンモニウムで希釈して、最終の２Ｍ硫酸
アンモニウム溶液を得た。懸濁液を室温で一晩攪拌し
た。１０，０００ｇ−ａｖで３０分間の遠心分離によっ
てタンパク質沈殿物を採取した。０．１Ｍのリン酸ナト
リウムバッファーの希釈から調製された０．０２Ｍのリ
ン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）の最小容量中
にタンパク質ペレットを溶解した。

【００７４】戻したタンパク質溶液を、室温において
０．０２Ｍのリン酸ナトリウムバッファー２リットルに
対して４時間、その後４℃で４リットルに対して一晩、
最後に室温において４リットルに対して４時間、透析し
た。

【００７５】２．６ｃｍ（ｉｄ）カラム中の約２６ｃｍ
の床高に充填した湿潤容量１５０ｍｌのＤＥＡＥセルロ
ース（DE52、Whatman，Inc．）を用い、二つの別々のア
リコートを用いて、プールされた抗血清からのＩｇＧの
イオン交換精製を行なった。カラムを、０．０２Ｍリン
酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）に平衡化した。
カラムは、約１．５ｇ（湿潤容量１ｍｌあたり１０ｍ
ｇ）のタンパク質容量を有していた。透析されたタンパ
ク質溶液の全容量を、カラム上にポンプで送り、０．０
２Ｍのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０を用い
て溶出を開始した。流速を約５ｍｌ／分に調節し、５ｍ
ｌのフラクションを採取した。最初の１５０ｍｌの溶出
液は、すべての未固定タンパク質を含んでいた。

【００７６】最初の１５０ｍｌの後、モル濃度は直線状
勾配で０．３Ｍに連続的に変化させた。勾配は、第１室
内に０．０２Ｍバッファー２５０ｍｌ及び第２室内に
０．３ｍｌバッファー２５０ｍｌを含む二室勾配形成器
中で形成された。第１室は溶出中連続的に攪拌した。次
の５００ｍｌの溶出液を５ｍｌフラクションで採取し
た。２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、これを溶出容
量（フラクション＃）に対してプロットしてクロマトグ
ラムを得ることによって、タンパク質の溶出を監視し
た。

【００７７】ここに記載する間接法によって、それぞれ
のフラクションのアリコートをＩｇＧに関してアッセイ
した。ＩｇＧを含むフラクションをプールし、Ａｍｉｃ
ｏｎフィルター（分子量排除限界：１０，０００ダルト
ン）を備えた攪拌セル濃縮器を用いて容量を減少させ
た。プールし、濃縮したＩｇＧフラクションのタンパク
質濃縮物を、標準ＢＣＡ法によってアッセイした。ナト
リウムアジドをタンパク質溶液に加え（０．０２％ｗ／
ｖ）、滅菌濾過し、−２０℃で冷凍保存した。ＤＥＡＥ
イオン交換カラムからのタンパク質溶出曲線を図１に示
す。白丸記号は２８０ｎｍにおける吸光度から測定した
全タンパク質を示す。黒丸記号は、４１０ｎｍにおける
間接アッセイによって測定したそれぞれのフラクション
に関する抗体滴定量を示す。タンパク質親和クロマトグ
ラフィーによる更なる精製のために、フラクション５１
〜８０をプールした。

【００７８】タンパク質−Ａ AffinityPakカラム及びI
mmunPure IgGバッファー（ImmunoPure IgG精製キット，
Pierce Chemical Co．）を用いて、ＤＥＡＥ精製ＩｇＧ
（１ｍｇ／ｍｌ）を親和精製した。タンパク質−Ａカラ
ム及びバッファーを室温にし、カラムを結合バッファー
５ｍｌで洗浄した。ＤＥＡＥ精製ＩｇＧを１：９に希釈
して６ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得て、１ｍｌのア
リコートをカラムに施した。カラムを別の１５ｍｌの結
合バッファーで洗浄した。

【００７９】ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅＩｇＧ溶出バッフ
ァー５ｍｌを用いてＩｇＧの溶出を行ない、１ｍｌのフ
ラクションを採取した。それぞれのフラクションの吸光
度を２８０ｎｍにおいて測定し、０．０２ＭのＰＢＳ
（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ−ＮａＣｌ、
ｐＨ７．４）１０ｍｌを用いて予めコンディショニング
したＥｘｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム５ｍｌを用いて、大
きな吸光度を有するフラクション（フラクション３）を
脱塩した。溶出のために０．０２Ｍ−ＰＢＳの１０個の
１ｍｌアリコートを用いて、１ｍｌフラクションを採取
した。ＢＣＡ法によって、それぞれのフラクションの吸
光度を全タンパク質に関してアッセイした。

【００８０】タンパク質−Ａ親和クロマトグラフィーで
精製したＩｇＧを１：５に希釈して、１ｍｇ／ｍｌのタ
ンパク質濃度を得た。６６ｍｇ／ｍｌの平均全血清タン
パク質から９ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度が見積もられ、Ｉ
ｇＧの見積もられた回収率は６７％であった。

【００８１】実施例７間接アッセイの最適化ＲＨ２７０３−ＢＳＡを被覆抗原として用いた。最小量
の抗原（ＲＨ２７０３）の存在下で読み取り可能な応答
（４１０ｎｍにおいて０．３〜０．５吸光度単位）を与
えるのに必要な濃度を、チェッカーボードタイプのアッ
セイ（Vollerら、Bull of World Health Organizatio
n，53，35（1976）を参照）によって、一定量のタンパ
ク質Ａ精製ＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ溶液１０μｌ、１０
０ｎｇ／ウェル）の存在下で最適化した。タンパク質Ａ
精製ＩｇＧの濃度を、一定量の被覆抗原（ＲＨ２７０３
−ＢＳＡ，１０μｇ／ｍｌ溶液１００μｌ）の存在下で
予め最適化して、最小量のＲＨ５９９２に対する読み取
り可能な応答を得た。

【００８２】抗体濃度は、約２０μｇ／ｍｌ（マイクロ
ウェルあたり１００ｎｇ）に最適化され、被覆抗原は、
２５ｎｇ／ｍｌ又はマイクロウェルあたり２．５ｎｇに
最適化された。モル基準に変換し、ハプテン／タンパク
質結合比を５５と仮定すると、ハプテンは、加えたＩｇ
Ｇの３倍モル過剰である。

【００８３】ＲＨ２７０３、ＲＨ２６５１、ＲＨ５９９
２、ＲＨ０３４５及びＲＨ２４８５に関する抑制％を、
最適化濃度のＲＨ２７０３−ＢＳＡ被覆抗原の存在下で
タンパク質ＩｇＧに対して測定した。それぞれの試験物
質を、試験物質が存在しない０ｎｇ／ｍｌから１０００
ｎｇ／ｍｌの範囲の７つの濃度でアッセイした。それぞ
れの濃度におけるアッセイを７回繰り返した。抗原陰性
及び抗体陰性ウェルにより陰性対照試料が与えられ、一
方、ＫＬＨ／抗ＫＬＨウェルを陽性対照試料として用い
た。

【００８４】０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む被覆バッ
ファーを用いて試験物質保存溶液の階段希釈を行なっ
て、１０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ
／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ及び０．０１
ｎｇ／ｍｌのアッセイ濃度を得た。被覆バッファーｗ／
０．１％のＴｗｅｅｎ２０を、０ｎｇ／ｍｌアッセイ濃
度として用いた。試験物質アッセイ濃縮物（それぞれ１
９０μｌ）を、タンパク質ＡＩｇＧ（２０μｌ／ｍ
ｌ）と共に、室温で１時間インキュベートした。インキ
ュベーション時間の後、試験物質−ＩｇＧ混合物１００
μｌを、適当なマイクロタイターウェルに移した。マイ
クロタイターウェルを、最適化濃度のＲＨ２７０３−Ｂ
ＳＡで予め被覆し、過剰のタンパク質結合部位を、被覆
バッファー中の１％ＢＳＡ溶液０．３ｍｌでブロッキン
グした。プレートを室温で更に１時間インキュベートし
た。

【００８５】第２のインキュベーションの後、プレート
を洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ（０．６ｍｇ、５
０％グリセロール１ｍｌで戻し、続いてブロッキング溶
液で１：５０００に希釈した−ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ
ｉｃａｌＣｏ．）に結合したヤギ抗ウサギ免疫グロブ
リンを加えた。プレートをインキュベートし、洗浄し、
実施例５に記載のようにしてＰＮＰＰ基質を加えた。Ｎ
ａＯＨ停止溶液は加えず、プレート中で２時間進行（de
velop）させた後に４１０ｎｍにおける吸光度を読ん
だ。抑制曲線を図２〜６に示す。精製抗体特性に関する
具体的なデータは表４に示す。

【００８６】ＩＣ₅₀を上記記載のようにして測定した。
活性％対抑制剤濃度のプロットを、Microsoft Excel An
alysis ToolPak（Microsoft Corporation，著作権１９
９３年）の指数曲線最適化によって分析した。次に、Ｉ
Ｃ₅₀を算出するために、ｙ＝ｂｍⁿｘの形態の指数等式
を、ｙが５０に等しい、即ち５０％活性残留又は５０％
抑制と設定した場合のｘに関して解いた。Microsoft Ex
cel，バージョン５．０グラフィックス（Microsoft Cor
poration，著作権１９９３年）を用いて描画を行なっ
た。

【００８７】交叉反応性％を、上記記載のようにＩＣ₅₀
値から算出した。Microsoft Excel，バージョン５．０
グラフィックス（Microsoft Corporation，著作権１９
９３年）を用いて、７つの濃度の抑制剤から得られた７
つの反復分析の平均吸光度のプロットを行なった。直線
的変動範囲を、種々の抑制剤濃度からの４１０ｎｍにお
ける吸光度のプロットから得られた曲線の直線状部分と
して視覚化した。感受性を上記記載のように算出した。

【００８８】検出限界を、測定バックグラウンドノイズ
の３倍として定義した。バックグラウンドノイズを査定
するために、それぞれの抑制剤濃度における反復分析の
標準偏差を算出し、回帰分析の最小二乗法を行なった。
回帰線のｙ切片を、ノイズから得られたバックグラウン
ド吸光度として採った。バックグラウンド吸光度に３の
ファクターをかけて、直線状範囲に亙って得られた標準
曲線の傾斜で除した抑制剤の濃度に変換した。得られた
濃度を抑制剤の検出限界として定義した。

【００８９】

【表４】試験物質ＩＣ₅₀ 感受性検出限界交叉反応性 ng/ml ng ng/ml % RH5992 0.61 0.07 0.66 100 RH2703 1.13 0.19 1.7 54 RH2651 1.59 0.22 1.9 38 RH0345 6.5 0.08 0.75 9 RH2485 0.05 0.08 1.8 NA

【００９０】実施例８〜１９間接アッセイマイクロタイタープレートを、１００μｌ／ウェルのＲ
Ｈ２７０３−ＢＳＡ被覆抗原（１０μｇ／ｍｌ）で被覆
して、ウェルあたり１μｇの被覆を得た。プレートを４
℃で一晩インキュベートした。未結合タンパク質結合部
位をブロッキングした後、被覆バッファー中の１％ＢＳ
Ａ溶液３００μｌ／ウェルと共に用いた。

【００９１】ブロッコリ及び土壌の試料の約１ｇアリコ
ートを採取した。ブロッコリ試料＃３（１．０１９１
ｇ）及び土壌試料＃４９（１．０１８０ｇ）を対照試料
として、５０ｎｇ又は５００ｎｇのＲＨ５９９２を加え
て、回収率を測定した。用いた試料の同定及び試料質量
を下表６に示す。

【００９２】試料アリコートを、２５ｍｌの円錐形遠心
分離管内に配置し、回収試料に、ＰＢＳＴで希釈したＲ
Ｈ５９９２保存溶液（アセトニトリル中１ｍｇ／ｍｌ）
から調製したＲＨ５９９２５０ｎｇ又は５００ｎｇを
加えた。

【００９３】試料を、超音波セル処理器（Sonicator，H
eat Systems，Inc．モデルＷ−２２５Ｒ，モデルＨ−１
マイクロチッププローブを具備）を用いて出力８０％で
３分間の超音波処理によって、ＰＢＳＴの５ｍｌアリコ
ートで抽出した。抽出混合物を４，０００ｇにおいて５
分間遠心分離し、ＰＢＳＴ層をデカントした。それぞれ
の試料のアリコートをＰＢＳＴで希釈して、元の試料抽
出物の１：１００希釈液（ブロッコリ試料）及び１：５
００希釈液（土壌試料）を得た。

【００９４】希釈試料のアリコート（１８０μｌ）を、
ＲＨ５９９２標準試料（２、１０、２０、１００、２０
０及び２０００ｎｇ／ｍｌ）のそれぞれ１０μｌ、及び
ＩｇＧ（１０μｌ）と混合して、それぞれ、０．１、
０．５、１、５、１０及び１００ｎｇ／ｍｌの最終ＲＨ
５９９２濃度を有する試料を得た。試料を、１２×８の
９６ウェルフォーマット中に配列したホウ珪酸塩ガラス
管中で完全に混合した。抗原陰性ウェルに対応する管は
１０μｌのバッファーを含んでいた。抗体陰性ウェルに
対応する管には、ＩｇＧを加えず、ＰＢＳＴ中１００ｐ
ｐｂのＲＨ５９９２を含んでいた。ＫＬＨ陽性対照試料
に対応する管は、空のままにした。

【００９５】１時間のインキュベーション時間の後、処
理（spiked）試料１００μｌをマイクロタイタープレー
トに移し、更に１時間インキュベーションを継続した。

【００９６】インキュベーションの後、プレートを上述
のように洗浄し、アルカリ性ホスファターゼに結合させ
たヤギ抗ウサギＩｇＧ１００μｌを加え、室温で１時
間インキュベートした。インキュベートの後、プレート
を再び洗浄し、ＰＮＰＰ基質１００μｌを加えた。基質
と共にインキュベートを１〜２時間継続し、Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを用い
て４１０ｎｍにおいて吸光度を測定した。抗原陰性ウェ
ルにおいて測定した吸光度を平均化し、試験ウェルから
自動的に差し引いた。この方法で、抗体の特定結合以外
の結合から得られた吸光度を除去した。

【００９７】試料中の残留物レベルを、標準添加法によ
って定量した。ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ、バージ
ョン５．０グラフィクスを用いて、同一の試料の特定結
合以外の結合からの吸光度を減じた吸光度の平均の逆数
から、吸光度の逆数対加えた抑制剤の濃度のプロットを
得た。得られたデータを、Microsoft Excel Analysis T
oolPakを用いて、ｙ＝ｍｘ＋ｂの形態の方程式に当ては
めた。この関係式において、ｙは実験的に測定された吸
光度の逆数であり、ｂは定数であり、ｍは算出された傾
斜であり、ｘは加えた抑制剤の濃度であった。一次方程
式に対して見積もられた解からの計算値に対するそれぞ
れのデータ点の標準誤差を算出し、域外の値を最終の解
から除外した。

【００９８】ｙを、抑制剤を加えないで測定された吸光
度の逆数に等しいと設定した場合のｘに関して一次方程
式を解くことによって試料濃度を得た。結果を、対応す
る希釈ファクターを乗ずることによって全ｎｇに変換し
た。全ｎｇを採取した試料の質量で割ることによって、
ｎｇ／ｇでの最終結果を算出した。

【００９９】外部標準法（external standard method）
によって、試料残渣の定量のための標準曲線を作成し
た。Microsoft Excel Analysis ToolPakを用いて指数曲
線最適化及び線形回帰分析を行なった。回収率％を上記
記載のように算出した。

【０１００】５０ｎｇ／ｇ及び５００ｎｇ／ｇで添加
（spike）された回収試料を、外部標準法及び内部標準
法（添加法）分析によって分析した。表５において、回
収率％をカッコ内に示す。ＰＢＳＴ及びマトリクスブラ
ンク試料（ブロッコリ試料＃０３及び土壌試料＃４９）
において得られた標準曲線のプロットを図７に示す。

【０１０１】

【表５】試料内部標準Ｃｎｇ／ｇ外部標準Ｃｎｇ／ｇブロッコリＲ₁ 52(104%) 53(106%) ブロッコリＲ₂ 471(94%) 426(85%) 土壌Ｒ₁ 55(110%) 55(110%) 土壌Ｒ₂ 511(102%) 514(103%)

【０１０２】ブロッコリ及び土壌試料の内部標準分析か
らの結果を表６に示す。二つのブロッコリ及び土壌抽出
物を１週間後に再分析して、試料マトリクスの安定性を
評価した。結果をカッコ内に示す。それぞれの試料に関
して算出された線形回帰線を図８〜１５に示す。

【０１０３】

【表６】試料ＩＤＣμｇ／ｇ試料ＩＤＣμｇ／ｇブロッコリ土壌 20139-01 1.75(1.41) 92-0017-151 41.4 20139-02 2.41 92-0017-157 20.0 20139-04 5.92 92-0017-175 18.4 20139-05 13.2(12.9) 92-0017-187 28

【０１０４】実施例２０標識化抗原の合成４．６ｍｇ（１０．５マイクロモル）量のＲＨ２６５１
を、５ｍｌの西洋ナシ形フラスコ中に配置し、１００ｍ
ｌのＤＭＦ中に溶解した。別の試験管内において、４．
６ｍｇのＮＨＳ及び８．８μｌのＤＣＣを、それぞれ、
１００μｌのＤＭＦ中に溶解した。ＮＨＳ及びＤＣＣを
ＲＨ２６５１に加え、室温で約１時間攪拌した。攪拌を
４℃で一晩継続した。次の日、１０ｍｇのＨＲＰを２．
７ｍｌの０．０１ＭＰＢＳ、ｐＨ７．２中に溶解し
た。ＲＨ２６５１／ＮＨＳ／ＤＣＣ反応混合物を、Beck
man Microfuge E（Beckman Instruments）において３分
間遠心分離した。上澄み液を攪拌しながらＨＲＰに滴下
した。混合物を室温で４時間攪拌した後、微量遠心分離
器で３分間遠心分離した。結合タンパク質を含む上澄み
液を、ＰＢＳで平衡化したＳｗｉｆｔ脱塩カラム（Pier
ce Chemical Co．）で脱塩した。タンパク質をＰＢＳで
溶出し、３ｍｌのフラクションを採取した。２８０ｎｍ
における吸光度によって測定したタンパク質結合体を含
むフラクションをプールし、タンパク質濃度をＢＣＡタ
ンパク質アッセイ（Pierce Chemical Co．）によって測
定した。

【０１０５】ＨＲＰに対するＲＨ２６５１の結合を以下
のようにして確認した。マイクロプレートウェルを１０
μｇ／ｍｌの２６５１−ＨＲＰの１００μｌで被覆し、
４℃で一晩保存した。プレートを空にした後、ウェル
を、ＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロッキングした。ブロッキ
ングの後、実施例６に従って調製したタンパク質−Ａ精
製２６５１ＩｇＧの１：２階段希釈液（１：５００で開
始）をウェルに加えて、ＲＨ２６５１を分析した。室温
で１時間インキュベートした後、プレートを０．０１％
Ｔｗｅｅｎ２０ＰＢＳで洗浄した。アルカリ性ホスファ
ターゼで標識化したヤギ抗ウサギＩｇＧを加え、室温で
更に１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ｐ
−ニトロフェニルホスフェート基質を加えた。１５分の
進行時間の後、ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ５０００マイク
ロプレートリーダーを用いて４１０ｎｍにおいて吸光度
を測定した。

【０１０６】ＲＨ２６５１のホースラディッシュペルオ
キシダーゼに対する結合の評価により、１μｇの２６５
１−ＨＲＰに対する²⁶⁵¹ＩｇＧの１：３２０００の滴定
値が示された。これは、十分な結合反応を示していた。

【０１０７】実施例２１被覆抗体の最適化マイクロプレートを²⁶⁵¹ＩｇＧで被覆した。カラム１か
ら開始して、１０μｇ／ｍｌの²⁶⁵¹ＩｇＧの１００μｌ
をそれぞれのウェルに加え、プレートに亙って１：２階
段希釈を行なった。プレートを密閉し、使用準備が整う
まで４℃で保存した。空にした後、プレートをＰＢＳ中
０．０１％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＰＢＳ中１％Ｂ
ＳＡで、室温において約１時間ブロッキングした。ブロ
ッキングの後、プレートを空にし、１５０μｌのＰＢＳ
をそれぞれのウェルに加えた。次に、５０μｌの２６５
１−ＨＲＰ希釈液を、１０μｇ／ｍｌから開始してプレ
ートに加えて、１：２希釈を継続し、プレートに加え
た。室温で１時間のインキュベーションの後、プレート
を上記に記載のように洗浄し、１５０μｌの１−Ｓｔｅ
ｐＳｌｏｗ−ＴＭＢ（Pierce Chemical Co．からのペ
ルオキシダーゼ基質）をそれぞれのウェルに加えた。１
時間の進行の後、１５０μｌの１Ｎ−Ｈ₂ＳＯ₄を加えて
反応を停止し、それぞれのウェルの吸光度を、Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈＭＲ５０００マイクロプレートリーダーで４
５０ｎｍにおいて測定した。被覆抗体を含まないウェル
及び２６５１−ＨＲＰを加えないウェルを含む対照試料
を加えた。０．６２５μｇ／ｍｌの²⁶⁵¹ＩｇＧ被覆抗体
濃度及び１．２５μｇ／ｍｌの２６５１−ＨＲＰ濃度
が、１−ＳｔｅｐＳｌｏｗ−ＴＭＢ基質と共に用いる
のに最適な濃度であると測定された。

【０１０８】実施例２２直接アッセイマイクロプレートのウェルを、それぞれ１００μｌの
０．６２５μｇ／ｍｌの²⁶⁵¹ＩｇＧで被覆した。一つの
列は対照試料として未被覆のままにした。プレートを４
℃で一晩保持した。次の日、プレートをＰＢＳ中０．０
１％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで
少なくとも３０分間ブロッキングした。ＲＨ５９９２、
ＲＨ２６５１、ＲＨ２７０３及びＲＨ２４８５の標準溶
液を、１ｍｇ／ｍｌの保存溶液から調製した。ＲＨ０３
４５の標準溶液を、０．１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍ
ｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５
０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌで調製した。ブロッ
キング溶液を空にした後、１５０μｌの標準試料を適当
なウェルに加えた。ゼロ対照試料のために１５０μｌの
ＰＢＳを加えた。室温において４５分のインキュベーシ
ョンの後、５０μｌの１．２５μｇ／ｍｌの２６５１−
ＨＲＰをそれぞれのウェルに加え、プレートを振盪し
て、内容物を混合した。抗体及び標準試料を含む一つの
カラムは、２６５１−ＨＲＰを加えず、代わりに５０μ
ｌのＰＢＳを加え、陰性対照試料とした。室温で４５分
のインキュベーションの後、プレートを上記記載のよう
に洗浄し、１５０μｌの２６５１−ＨＲＰをそれぞれの
ウェルに加え、プレートを振盪して内容物を混合した。
抗体及び標準試料を含む一つのカラムには、２６５１−
ＨＲＰを入れず、代わりに５０μｌのＰＢＳを加え、陰
性対照試料とした。室温で４５分のインキュベーション
の後、プレートを上記記載のように洗浄し、１５０μｌ
のＳｔｅｐ−１Ｓｌｏｗ−ＴＭＢをそれぞれのウェル
に加えた。室温で２時間後、１５０μｌの１Ｎ−Ｈ₂Ｓ
Ｏ₄をそれぞれのウェルに加え、ＤｙｎａｔｅｃｈＭ
Ｒ５０００マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにお
ける吸光度を読んだ。

【０１０９】図１６ａに、アッセイから作成された典型
的な曲線を示す。曲線の直線状部分を、０．０１ｎｇ／
ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌの間で視認化した。アッセイの直
線状範囲での典型的な標準曲線を、吸光度の逆数を用い
て図１６ｂに示して、傾きを正の値とした。検出限界は
０．０９６ｎｇ／ｍｌと算出され、感受性はＲＨ５９９
２に関して０．００５ｎｇと算出された。ＲＨ５９９２
及び類縁体に関するデータを表７に示す。

【０１１０】

【表７】試験物質ＩＣ₅₀ 感受性検出限界交叉反応性％ ng/ml ng ng/ml RH2651 RH5992 RH5992 3.64 0.005 0.106 32 100 RH2703 2.10 0.002 0.031 56 173 RH2651 1.17 0.001 0.013 100 311 RH0345 16.94 0.255 5.10 6.9 21.5 RH2485 4.64 0.024 0.482 25 78.4

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＥＡＥイオン交換カラムからのタンパク質溶
出特性を示す図である。

【図２】ＲＨ２７０３に関する抑制曲線を示す図であ
る。

【図３】ＲＨ２６５１に関する抑制曲線を示す図であ
る。

【図４】ＲＨ５９９２に関する抑制曲線を示す図であ
る。

【図５】ＲＨ０３４５に関する抑制曲線を示す図であ
る。

【図６】ＲＨ２４８５に関する抑制曲線を示す図であ
る。

【図７】ＯＢＳＴ及びマトリクスブランク試料において
得られた外部標準曲線を示す図である。

【図８】ブロッコリ試料２０１３９−０１に関する算出
直線状回帰線を示す図である。

【図９】ブロッコリ試料２０１３９−０２に関する算出
直線状回帰線を示す図である。

【図１０】ブロッコリ試料２０１３９−０４に関する算
出直線状回帰線を示す図である。

【図１１】ブロッコリ試料２０１３９−０５に関する算
出直線状回帰線を示す図である。

【図１２】土壌試料１５１に関する算出直線状回帰線を
示す図である。

【図１３】土壌試料１５７に関する算出直線状回帰線を
示す図である。

【図１４】土壌試料１７５に関する算出直線状回帰線を
示す図である。

【図１５】土壌試料１８７に関する算出直線状回帰線を
示す図である。

【図１６】図１６ａ及びｂは、直接アッセイ曲線及び直
接アッセイ標準曲線を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者エレン・シャルク・カーサルアメリカ合衆国バージニア州20147、アッシュバーン、ブルーストン・ミルズ・サークル 43988 (72)発明者スタンリー・ステファン・スタビンスキーアメリカ合衆国ペンシルバニア州18969、テルフォード、ライジング・サン・ロード 729 (72)発明者シャガング・ウーアメリカ合衆国ペンシルバニア州19454、ノース・ウェールズ、マラード・ドライブ・イースト 252

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】キャリア材料に結合した次式：【化１】（式中、Ｒ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³及びＲ⁴は、それぞれ独立し
て、水素、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル及び置換（Ｃ₁〜Ｃ₆）
アルキル、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルケニル及び置換（Ｃ₂〜
Ｃ₆）アルケニル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁〜Ｃ
₆）アルキルオキシ及びハライドである）の化合物を含
む免疫原。
【請求項２】キャリア材料が、タンパク質、多糖類、
合成ポリマー又はコポリマーからなる群から選択される
請求項１に記載の免疫原。
【請求項３】Ｒが−ＣＯＯＨであり、Ｒ¹及びＲ²がメ
チルであり、Ｒ³及びＲ⁴が水素である請求項１に記載の
免疫原。
【請求項４】Ｒが−ＣＨ₃ＣＯＯＨであり、Ｒ¹及びＲ
²がメチルであり、Ｒ³及びＲ⁴が水素である請求項１に
記載の免疫原。
【請求項５】請求項１に記載の免疫原に対して産生さ
れた抗体。
【請求項６】請求項３に記載の免疫原に対して産生さ
れた抗体。
【請求項７】請求項４に記載の免疫原に対して産生さ
れた抗体。
【請求項８】以下の工程：（Ａ）未知量のジアシルヒドラジンを含む試料を提供
し；（Ｂ）試料を、固定化されたジアシルヒドラジン抗原の
存在下でジアシルヒドラジン抗原に対する結合親和性を
有する抗体と接触させて、結合及び未結合の抗体−抗原
コンプレックスを形成し；（Ｃ）未結合の抗体−抗原コンプレックスを結合抗体−
抗原コンプレックスから分離し；（Ｄ）結合抗体コンプレックスを検出可能な標識で標識
化し；（Ｅ）標識中において測定可能な変化を起こさせ；（Ｆ）試料中のジアシルヒドラジンを測定する；工程を
含む、ジアシルヒドラジン又はその誘導体を測定する方
法。
【請求項９】検出可能な標識が、酵素、着色染料、ケ
イ光材料、化学ルミネセンス材料、バイオルミネセンス
材料及び放射性同位元素から選択される請求項８に記載
の方法。
【請求項１０】検出可能な標識が、抗体に結合するこ
とのできる酵素−抗体複合体である請求項８に記載の方
法。
【請求項１１】以下の工程：（Ａ）未知量のジアシルヒドラジンを含む試料を提供
し；（Ｂ）試料を、ジアシルヒドラジン抗原に対する結合親
和性を有する固定化抗体と接触させて、固定化抗体−抗
原コンプレックスを形成し；（Ｃ）検出可能な標識で標識化されたジアシルヒドラジ
ン抗原を、未コンプレックス化固定化抗体と接触させ
て、標識化抗体−抗原コンプレックスを形成し；（Ｄ）標識中において測定可能な変化を起こさせ；（Ｅ）試料中のジアシルヒドラジンを測定する；工程を
含む、ジアシルヒドラジン又はその誘導体を測定する方
法。
【請求項１２】検出可能な標識が、酵素、着色染料、
ケイ光材料、化学ルミネセンス材料、生物ルミネセンス
材料及び放射性同位元素から選択される請求項１１に記
載の方法。
【請求項１３】標識が、抗体に結合することのできる
酵素−抗原複合体である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】以下の成分：（Ａ）ジアシルヒドラジンに対する結合親和性を有する
抗体；（Ｂ）抗体に結合することのできる標識；及び（Ｃ）標識の存在下で測定可能な変化を生起させること
のできる基質；を含む、ジアシルヒドラジンを測定する
ためのキット。
【請求項１５】ジアシルヒドラジン抗原を更に含む請
求項１４に記載のキット。
【請求項１６】標識が、抗体に対する結合親和性を有
する抗体に結合した酵素である請求項１４に記載のキッ
ト。
【請求項１７】標識が、抗体に対する結合親和性を有
するジアシルヒドラジン抗原に結合した酵素である請求
項１４に記載のキット。