JPH10311833A

JPH10311833A - Ｌｄｌ−コレステロールの測定方法

Info

Publication number: JPH10311833A
Application number: JP9137714A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Miki; 豊三木; Nobuko Imashiyou; 展子今荘; Isao Koyama; 勲小山; Toshiro Hanada; 寿郎花田
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1997-05-13
Filing date: 1997-05-13
Publication date: 1998-11-24
Also published as: KR19980086568A

Abstract

(57)【要約】【課題】低比重リポタンパク（ＬＤＬ）中のコレステ
ロールを、従来法に於いて必要であった、ＬＤＬとＬＤ
Ｌ以外の不要のリポタンパクとを分離するための煩雑な
前処理操作なしに直接自動分析装置等を用いて測定し得
る方法及びそれに用いられる試薬を提供。【解決手段】両性界面活性剤と、シクロデキストリン
又は／及びその誘導体の共存下で測定を行うことを特徴
とする、低比重リポタンパク中のコレステロールの測定
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【発明の属する技術分野】本発明は、血清、血漿などの
生体試料中に存在する低比重リポタンパク（以下、ＬＤ
Ｌと略記する。）中のコレステロールの測定方法及びこ
れに用いる試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】血清中の脂質の主な成分はコレステロー
ル、トリグリセライド、リン脂質等であり、これら血清
脂質はアポタンパクと結合してリポタンパクを形成し血
中を循環する。該リポタンパクは比重の差により高比重
リポタンパク（ＨＤＬ）、ＬＤＬ、超低比重リポタンパ
ク(ＶＬＤＬ）カイロミクロン（ＣＭ）等に分類され
る。これらリポタンパクのうち、ＨＤＬは組織に沈着し
た過剰なコレステロールを肝臓へ運搬する作用があり、
抗動脈硬化作用を有し、一方、ＬＤＬは肝臓から各組織
へのコレステロールの主たる運搬体であり、ＬＤＬの増
加は動脈硬化発生と密接な関係があると考えられてい
る。従って、ＬＤＬ中のコレステロール（以下、ＬＤＬ
−コレステロールと略記する。）は、動脈硬化症、虚血
性心疾患（冠動脈疾患）の危険因子と考えられ、該ＬＤ
Ｌ−コレステロールの含有量は、これら疾患の診断・治
療および予防の重要な指標となる。

【０００３】従来、ＬＤＬ−コレステロールの測定法と
しては、沈澱法、超遠心法、電気泳動法、算出式による
算出法等が知られている。これら従来法のうち、沈澱
法、超遠心法及び電気泳動法は、沈澱・遠心分離処理、
超遠心分離処理或いは電気泳動処理により、ＬＤＬとＬ
ＤＬ以外の不要のリポタンパクとを分離する前処理工程
が必要であるため、操作が煩雑であり、現在、臨床検査
の分野で広く普及している自動分析装置だけで直接測定
を実施することができないという問題点を有している。
また、フリーデワルド（Friedewald）の式で知られてい
る総コレステロール値、ＨＤＬ−コレステロール値及び
トリグリセライド値から算出する算出法も、トリグリセ
ライドが500mg／dl以上含有する試料を用いた場合に
は、正確なＬＤＬ−コレステロール量を測定することが
できないという問題を有している。

【０００４】近年、従来法に於ける上記の如き問題点を
解消するために、種々の方法が開発されており、例えば
特開平7-280812号公報に開示された方法もその一つであ
る。即ち、ＬＤＬを凝集剤又は／及び抗体を使用して凝
集させた後に、ＬＤＬ以外のリポタンパクに含まれるコ
レステロールを定量反応に関与しない別の反応系に導い
て消去（消費）させた後、界面活性剤又は／及び無機塩
類を使用して、凝集させたＬＤＬを定量反応ができる程
度に溶解させ、ＬＤＬ−コレステロールを定量反応に付
し該溶液の吸光度を測定するという方法がそれである。

【０００５】しかしながら、この方法は、測定時の試薬
の形態が３試薬系又は４試薬系となるため、このような
試薬形態での測定が可能なごく一部の自動分析装置にし
か適用できず、通常の臨床検査に於いて用いられている
２試薬系での測定にしか使用できない自動分析装置を用
いては測定を実施することができないという問題点があ
る。また、この方法では、測定に用いる試薬の数が多く
なるため、測定値の再現性が低下するという問題点もあ
った。

【０００６】更に、煩雑な前処理操作なしでＬＤＬ−コ
レステロールを測定する方法として特開昭５８−１６５
８００号公報に開示されている方法がある。しかしなが
ら、この方法は、試薬中の例えば界面活性剤やコレステ
ロールエステラーゼの使用濃度が限定されるため試薬の
調製が煩雑であり、更に測定時のｐＨや、測定時間間隔
等測定条件を厳密に設定しなくてはならず、しかもＨＤ
Ｌ中のコレステロールもある程度反応することから、動
力学的測定、すなわち、レイト・アッセイでしかＬＤＬ
−コレステロールの測定を行うことができないため、実
用的な測定方法とは言い難い方法であった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記した如き状況に鑑
み、本発明が解決しようとする課題は、生体試料中のＬ
ＤＬ−コレステロールを、従来法に於いて必要であっ
た、ＬＤＬとＬＤＬ以外の不要のリポタンパクとを分離
するための煩雑な前処理操作なしに直接自動分析装置等
を用いて測定することを可能とする方法及びそれに用い
られる試薬の提供にある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、両性界面活性
剤と、シクロデキストリン（以下、ＣＤと略記する。）
又は／及びその誘導体の共存下で測定を行うことを特徴
とする、ＬＤＬ−コレステロールの測定方法の発明であ
る。

【０００９】また、本発明は、コレステロールオキシダ
ーゼ（以下、ＣＯＤと略記する。）又はコレステロール
デヒドロゲナーゼ（以下、ＣＨＤと略記する。）を用い
るＬＤＬ−コレステロールの測定方法であって、試料を
予めＣＤ又は／及びその誘導体を含んでなる試薬で処理
した後、ＣＤ又は／及びその誘導体と両性界面活性剤の
共存下でＣＯＤ又はＣＨＤを反応させることを特徴とす
る、ＬＤＬ−コレステロールの測定方法の発明である。

【００１０】更に、本発明は、両性界面活性剤と、ＣＤ
又は／及びその誘導体とを含有させてなることを特徴と
する、ＬＤＬ−コレステロール測定用試薬の発明であ
る。

【００１１】また、本発明は、ＣＤ又は／及びその誘導
体を含んでなる第一試薬と、ＣＯＤを含んでなる第二試
薬とからなるものであって、カップラー、デベロッパ
ー、ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略記する。）、
両性界面活性剤及びコレステロールエステラーゼ（以
下、ＣＨＥと略記する。）の夫々が少なくとも第一試薬
と第二試薬の何れかに含まれているＬＤＬ−コレステロ
ール測定用試薬の発明である。

【００１２】更にまた、本発明は、ＣＤ又は／及びその
誘導体、両性界面活性剤及びＣＨＥを含んでなる第一試
薬と、ＣＯＤ及びＣＨＥを含んでなる第二試薬とからな
るものであって、カップラー、デベロッパー及びＰＯＤ
の夫々が少なくとも第一試薬と第二試薬の何れかに含ま
れているＬＤＬ−コレステロール測定用試薬の発明であ
る。

【００１３】また、本発明は、ＣＤ又は／及びその誘導
体、両性界面活性剤、ＣＨＥ、及びカップラー（又はデ
ベロッパー）を含んでなる第一試薬と、ＣＯＤ、ＣＨ
Ｅ、ＰＯＤ、及びデベロッパー（又はカップラー）を含
んでなる第二試薬とを組み合わせてなることを特徴とす
る、ＬＤＬ−コレステロール測定用キットの発明であ
る。

【００１４】即ち、本発明者等は、ＬＤＬ−コレステロ
ールを、ＬＤＬ以外の不要なリポタンパクを分離分別す
るための前処理操作なしに直接自動分析装置で測定し得
る方法を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、生体試料中
のＬＤＬ−コレステロールの測定を、両性界面活性剤
と、ＣＤ又は／及びその誘導体の共存下で行えば、ＬＤ
Ｌ以外の不要なリポタンパクを分離分別することなくＬ
ＤＬ中のコレステロールを特異的に測定することが可能
となることを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１５】本発明に於いて用いられる、両性界面活性
剤としては、ＣＤと共存させた場合に、ＬＤＬ以外のリ
ポタンパクに含有されているコレステロールがコレステ
ロール測定反応に関与するのを抑制する作用を有するも
のであればよく、特に限定されない。このような両性界
面活性剤の具体例としては、例えばアルキルベタイン誘
導体（例えばラウリルベタイン、ステアリルベタイン、
ラウリルジメチルアンモニウムベタイン、ココナットベ
タイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリ
ン酸アミドプロピルベタイン等）、イミダゾリニウムベ
タイン誘導体（例えばラウリルカルボキシメチルヒドロ
キシエチルイミダゾリニウムベタイン、２−アルキル−
Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾ
リニウムベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシエチ
ル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、
２−ウンデシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキ
シエチルイミダゾリニウムベタイン等）、スルホベタイ
ン誘導体（例えばＮ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３
−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−デシル−
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスル
ホン酸、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモ
ニオ−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−テトラデシル−
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスル
ホン酸、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ア
ンモニオ−１−プロパンスルホン酸等）等のベタイン誘
導体、例えばアルキルグリシン、アルキルジ（アミノエ
チル）グリシン、ジオクチルポリアミノエチルグリシ
ン、Ｎ−アルキルポリアミノエチルグリシン、β−アラ
ニン誘導体等のアミノカルボン酸誘導体、例えばビス
（２−ウンデシル，Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリ
ン）クロル酢酸錯体、アルキルイミダゾリン誘導体等の
イミダゾリン誘導体、例えばラウリルジメチルアミンオ
キサイド等のアミンオキサイド誘導体等が挙げられる。
尚、これら両性界面活性剤は、市販のものを用いても良
いし、公知の方法に準じて合成したものを用いても良
い。これら両性界面活性剤の使用濃度としては、ＣＤと
共存させた場合に、ＬＤＬ以外のリポタンパクに含有さ
れるコレステロールがコレステロール測定反応に関与す
るのを抑制し得る濃度であればよく、特に限定されない
が、コレステロール測定時の反応液中の濃度、即ち最終
の反応液中の濃度が通常0.0001〜10％（W／V）、好まし
くは0.001〜１％（W／V）となるように添加される。ま
た、例えば、本発明の方法を２試薬系測定法により実施
する場合の各試薬中の両性界面活性剤の使用濃度として
は、試料、第一試薬及び第二試薬の液量比等により異な
るため一概には言えないが、第一試薬のみに両性界面活
性剤を含有させる場合の第一試薬中の両性界面活性剤濃
度としては、通常0.0002〜20％（W／V）、好ましくは0.
002〜２％（W／V）の範囲から適宜選択される。また、
第二試薬のみに両性界面活性剤を含有させる場合の第二
試薬中の両性界面活性剤濃度としては、通常0.0002〜20
％（W／V）、好ましくは0.002〜２％（W／V）の範囲か
ら適宜選択される。更に、第一試薬及び第二試薬の両方
に界面活性剤を含有させる場合の各試薬中の界面活性剤
濃度としては、第一試薬中の濃度が、通常0.0001〜20％
（W／V）、好ましくは0.001〜２％（W／V）、第二試薬
中の濃度が、通常0.0001〜20％（W／V）、好ましくは0.
001〜２％（W／V）となるように夫々添加される。尚、
これら両性界面活性剤は、単独で用いても、或いは二種
以上適宜組み合わせて用いても何れにてもよい。

【００１６】本発明に於いて用いられる、ＣＤ又は／及
びその誘導体としては、両性界面活性剤と共存させた場
合に、ＬＤＬ以外のリポタンパクに含有されているコレ
ステロールがコレステロール測定反応に関与するのを抑
制する作用を有するものであればよく、特に限定されな
いが、例えばα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ及びこれら
ＣＤの誘導体のなかから適宜選択された、前述の如き性
質を有するものが挙げられる。このようなＣＤ誘導体の
具体例としては、例えば２，６−ジ−Ｏ−メチル−α−
シクロデキストリン、２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−
α−シクロデキストリン、２，６−ジ−Ｏ−エチル−α
−シクロデキストリン、２，３，６−トリ−Ｏ−エチル
−α−シクロデキストリン、２，６−ジ−Ｏ−メチル−
β−シクロデキストリン、２，３，６−トリ−Ｏ−メチ
ル−β−シクロデキストリン、２，６−ジ−Ｏ−エチル
−β−シクロデキストリン、２，３，６−トリ−Ｏ−エ
チル−β−シクロデキストリン、２，６−ジ−Ｏ−メチ
ル−γ−シクロデキストリン、２，３，６−トリ−Ｏ−
メチル−γ−シクロデキストリン、２，６−ジ−Ｏ−エ
チル−γ−シクロデキストリン、２，３，６−トリ−Ｏ
−エチル−γ−シクロデキストリン等のアルキル化Ｃ
Ｄ、例えば２−ヒドロキシエチル−α−シクロデキスト
リン、２−ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリ
ン、３−ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリ
ン、２，３−ジヒドロキシプロピル−α−シクロデキス
トリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリ
ン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリ
ン、３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリ
ン、２，３−ジヒドロキシプロピル−β−シクロデキス
トリン、２−ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリ
ン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリ
ン、３−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリ
ン、２，３−ジヒドロキシプロピル−γ−シクロデキス
トリン等のヒドロキシアルキル化ＣＤ、例えば２，３，
６−トリ−Ｏ−アセチル−α−シクロデキストリン、
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−シクロデキスト
リン、２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−γ−シクロデ
キストリン等のアシル化ＣＤ、例えば６−Ｏ−α−Ｄ−
グルコシル−α−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マ
ルトシル−α−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−
グルコシル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マ
ルトシル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−
グルコシル−γ−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マ
ルトシル−γ−シクロデキストリン等の糖修飾ＣＤ、例
えばＯ−カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、
Ｏ−カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、Ｏ−
カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン等のカルボ
キシアルキル化ＣＤ、例えばポリ−α−シクロデキスト
リン、ポリ−β−シクロデキストリン、ポリ−γ−シク
ロデキストリン等のポリマー体等が挙げられる。尚、こ
れらＣＤ及びＣＤ誘導体は、市販のものを用いても良い
し、例えば米国特許第3453258号明細書、米国特許第345
3259号明細書、PolymerJournal, Vol.13, No.8, p.777-
781(1981)、特開昭61-266401号公報、特開昭63-122701
号公報、特開昭62-243602号公報等の自体公知の方法に
準じて合成したものを用いても良い。また、これらＣＤ
又は／及びその誘導体の使用濃度としては、両性界面活
性剤と共存させた場合に、ＬＤＬ以外のリポタンパクに
含まれているコレステロールがコレステロール測定反応
に関与するのを抑制し得る濃度であればよく、特に限定
されないが、コレステロール測定時の反応液中の濃度、
即ち最終の反応液中の濃度が通常0.0001〜10％（W／
V）、好ましくは0.001〜１％（W／V）となるように添加
される。また、例えば、本発明の方法を２試薬系測定法
により実施する場合の第一試薬中のＣＤ又は／及びＣＤ
誘導体の使用濃度としては、試料、第一試薬及び第二試
薬の液量比等により異なるため一概には言えないが、通
常0.0002〜20％（W／V）、好ましくは0.002〜２％（W／
V）となるように添加される。尚、これらＣＤ又はその
誘導体は単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせ
て用いても何れにてもよい。

【００１７】本発明の測定法は、上記した如き両性界面
活性剤と、ＣＤ又は／及びその誘導体とを共存させる以
外は、自体公知のコレステロール測定法に準じて、実施
すれば良く、使用される試薬類もこれら自体公知の方法
に準じて適宜選択すればよい。即ち、血清、血漿等の生
体試料中のＬＤＬ−コレステロールを、両性界面活性剤
と、ＣＤ又は／及びその誘導体の共存下、自体公知のコ
レステロール測定法に準じて測定することにより、生体
試料中のＬＤＬ−コレステロールを特異的に測定するこ
とができる。

【００１８】これら自体公知のコレステロール測定法と
しては、生体試料中のコレステロールを測定し得る自体
公知のコレステロール測定法は全て挙げられるが、酵素
反応を利用する、例えば試料中のコレステロールエステ
ルをＣＨＥによって遊離コレステロールと脂肪酸に分解
し、初めから存在する遊離コレステロールと共に、ＣＯ
Ｄによって酸化して、コレステ−４−エン−３−オンと
過酸化水素にし、ＰＯＤの存在下、生成した過酸化水素
で被酸化性呈色試薬を酸化発色させて、生じた酸化色素
を比色定量する酸化呈色法、例えば試料中のコレステロ
ールエステルをＣＨＥによって遊離コレステロールと脂
肪酸に分解し、初めから存在する遊離コレステロールと
共にＣＨＤの存在下ＮＡＤ（Ｐ）と反応させて、生成す
るＮＡＤ（Ｐ）Ｈを340nmで測定する紫外部測定法等が
好ましく挙げられる。

【００１９】本発明の測定法に用いられるＣＯＤは、そ
の由来は特に限定されず、通常この分野で使用されてい
るもの、例えば、ノカルディア属、シュードモナス属等
の微生物に由来するもの、牛膵臓等動物臓器に由来する
もの等は全て使用可能である。ＣＯＤの使用量として
は、コレステロール測定時の反応液中の濃度として、通
常0.02〜10u／ml、好ましくは0.1〜２u／mlの範囲から
適宜選択される。

【００２０】本発明の測定法に用いられるＣＨＥは、そ
の由来は特に限定されず、通常この分野で使用されてい
るもの、例えば、キャンディダ属、シュードモナス属等
の微生物に由来するもの、牛膵臓等動物臓器に由来する
もの等は全て使用可能である。ＣＨＥの使用量として
は、コレステロール測定時の反応液中の濃度として、通
常0.02〜10u／ml、好ましくは0.1〜２u／mlの範囲から
適宜選択される。

【００２１】本発明の測定法に用いられるＰＯＤは、そ
の由来は特に限定されず、通常この分野で使用されてい
るもの、例えば、西洋ワサビ、大根等の植物に由来する
もの、カビ、酵母等の微生物に由来するもの、動物の白
血球、甲状腺等に由来するもの等は全て使用可能であ
る。ＰＯＤの使用量としては、コレステロール測定時の
反応液中の濃度として、通常0.01〜50u／ml、好ましく
は0.1〜５u／mlの範囲から適宜選択される。

【００２２】本発明の測定法に用いられる被酸化性呈色
試薬としては、ＰＯＤの存在下、過酸化水素と反応して
呈色するものであれば何れにても良いが、４−アミノア
ンチピリン（４−ＡＡ）等のカップラー及び、該カップ
ラーと酸化縮合して色素を生ずるデベロッパーとの組合
せ、即ち、例えば４−ＡＡとフェノール系化合物，ナフ
トール系化合物若しくはアニリン系化合物との組合せ、
３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニ
リン系化合物との組合せ等や、例えば２，２’−アジノ
ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン
酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルア
ミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾー
ル誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、ｏ−フェニレ
ンジアミン誘導体等の酸化によってそれ自体が発色する
発色剤等が挙げられる。デベロッパーとしてのフェノー
ル系化合物の具体例としては、例えばフェノール、ｐ−
クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール等が挙
げられ、ナフトール系化合物の具体例としては、例えば
１−ナフトール、１−ナフトール−２−スルホン酸、１
−ナフトール−２−カルボン酸等が挙げられ、また、ア
ニリン系化合物の具体例としては、例えばＮ，Ｎ−ジエ
チルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチ
ル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニ
リン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フ
ルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン
（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サク
シニル−エチレンジアミン（ＥＭＳＥ）等が挙げられ
る。カップラーとデベロッパーとの組合せを用いる場
合、カップラーの使用量としては、用いるカップラーの
種類や組み合わせるデベロッパーの種類等により異なる
ため一概には言えないが、コレステロール測定時の反応
液中の濃度として、通常0.01〜100mM、好ましくは0.1〜
10mMの範囲から適宜選択され、カップラーとして４−Ａ
Ａを使用する場合の使用量としては、コレステロール測
定時の反応液中の濃度として、通常0.01〜50mM、好まし
くは0.1〜５mMの範囲から適宜選択される。また、デベ
ロッパーの使用量としては、用いるデベロッパーの種類
や組み合わせるカップラーの種類等により異なるため一
概には言えないが、コレステロール測定時の反応液中の
濃度として、通常0.01〜50mM、好ましくは0.1〜５mMの
範囲から適宜選択される。トリフェニルメタン系ロイコ
色素の具体例としては、例えばロイコマラカイトグリー
ン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−２−スルホ
フェニルメタン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）
−３，４−ジスルホプロポキシフェニルメタン・ジナト
リウム塩等が挙げられ、ジフェニルアミン誘導体の具体
例としては、例えばビス〔４−ジ（２−ブトキシエチ
ル）アミノ−２−メチルフェニル〕アミン、Ｎ，Ｎ−ビ
ス（４−ジエチルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ’
−ｐ−トルエンスルホニル尿素等が挙げられ、また、ロ
イコメチレンブルー誘導体の具体例としては、例えば10
−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビ
ス（ジメチルアミノ）フェノチアジン・ナトリウム塩、
10−〔３−（メトキシカルボニルアミノメチル）フェニ
ルメチルアミノカルボニル〕−３，７−ビス（ジメチル
アミノ）フェノチアジン等が挙げられる。更に、ベンジ
ジン誘導体の具体例としては、例えばベンジジン、ｏ−
トリジン、ｏ−ジアニシジン、３，３’−ジアミノベン
ジジン、３，３’，５，５’−テトラアミノベンジジン
等が挙げられ、トリアリルイミダゾール誘導体の具体例
としては、例えば２−（４−カルボキシフェニル）−３
−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（４ージエチ
ルアミノフェニル）イミダゾール、２−（３−メトキシ
−４−ジエチルアミノフェニル）−３−Ｎ−メチルカル
バモイル−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルア
ミノフェニル）イミダゾール等が挙げられる。これら発
色剤の使用量としては、通常この分野で用いられる濃度
範囲から適宜選択される。

【００２３】本発明の測定法に用いられるＣＨＤは、そ
の由来は特に限定されず、通常この分野で使用されてい
るもの、例えば、ノカルディア属に由来するもの等が使
用可能である。ＣＨＤの使用量としては、コレステロー
ル測定時の反応液中の濃度として、通常0.1〜100u／m
l、好ましくは１〜50u／mlの範囲から適宜選択される。

【００２４】本発明の測定法に用いられるＮＡＤ（Ｐ）
は、特に限定されず、通常この分野で使用されているも
のは全て使用可能である。ＮＡＤ（Ｐ）の使用量として
は、コレステロール測定時の反応液中の濃度として、通
常0.02〜50mM、好ましくは0.1〜10mMの範囲から適宜選
択される。

【００２５】本発明のＬＤＬ−コレステロール測定用試
薬は、例えば血清や血漿等の生体由来試料中のＬＤＬ−
コレステロ−ルを測定するために使用されるもので、両
性界面活性剤と、ＣＤ又は／その誘導体とを使用する以
外は、上記した如き自体公知のコレステロール測定法に
使用される試薬類、例えば酸化呈色法に於いて使用され
るＣＯＤ、ＣＨＥ、ＰＯＤ、被酸化性呈色試薬等の試薬
類、例えば紫外部測定法に於いて使用されるＣＨＥ、Ｃ
ＨＤ、ＮＡＤ（Ｐ）等の試薬類を、この分野で使用され
る濃度範囲で含有するように調製されたものであり、構
成要件の好ましい態様や使用濃度等は、上で述べた通り
である。

【００２６】本発明のＬＤＬ−コレステロ−ル測定用試
薬は、１試薬系測定法用として調製されたものでも２試
薬系測定法用として調製されたものでも又それ以上に分
けたものでも何れにてもよく、特に限定されない。尚、
２試薬以上の試薬に分けた場合には、特異性、測定精度
等の点を考慮すると、以下のような組成としておくこと
が望ましい。即ち、先ず、酸化呈色法用の試薬の場合、
第一試薬にＣＤ又は／及びその誘導体を、第二試薬にＣ
ＯＤを含有させておくことが望ましく、これ以外の両性
界面活性剤、ＣＨＥ、ＰＯＤ等の酵素類、カップラー及
びデベロッパー等は少なくとも何れかの試薬に含まれて
いればよい。また、紫外部測定法用の試薬の場合、第一
試薬にＣＤ又は／及びその誘導体を、第二試薬にＣＨＤ
を含有させておくことが望ましく、これ以外のＮＡＤ
（Ｐ）等は少なくとも何れかの試薬に含まれていればよ
い。

【００２７】本発明の方法を、２試薬系測定法により実
施する場合には、試料とＣＯＤ又はＣＨＤを反応させる
前に、試料とＣＤ又は／及びその誘導体を含んでなる第
一試薬とを混合する等して試料を第一試薬で処理した
後、該ＣＤ又は／及びその誘導体の存在下で、第二試薬
に含有させたＣＯＤ又はＣＨＤを反応させる方が、特異
性、測定精度等の点から望ましい。

【００２８】例えば酸化呈色法の場合、上記した如き試
薬の組合せとしては、例えば以下の如きものが挙げられ
る。（ｉ）ＣＤ又は／及びその誘導体、及び両性界面活性剤
を含んでなる第一試薬と、ＣＯＤを含んでなる第二試薬
とからなるものであって、カップラー、デベロッパー、
ＰＯＤ及びＣＨＥの夫々が少なくとも第一試薬と第二試
薬の何れかに含まれている試薬からなるもの。（ii）ＣＤ又は／及びその誘導体、及びＣＨＥを含んで
なる第一試薬と、ＣＯＤを含んでなる第二試薬とからな
るものであって、カップラー、デベロッパー、ＰＯＤ及
び両性界面活性剤の夫々が少なくとも第一試薬と第二試
薬の何れかに含まれている試薬からなるもの。（iii）ＣＤ又は／及びその誘導体、両性界面活性剤、
及びＣＨＥを含んでなる第一試薬と、ＣＯＤを含んでな
る第二試薬とからなるものであって、カップラー、デベ
ロッパー及びＰＯＤの夫々が少なくとも第一試薬と第二
試薬の何れかに含まれている試薬からなるもの。また、
例えば紫外部測定法の場合、上記した如き試薬の組合せ
としては、例えば以下の如きものが挙げられる。（ｉ^'）ＣＤ又は／及びその誘導体、及び両性界面活性
剤を含んでなる第一試薬と、ＣＨＤを含んでなる第二試
薬とからなるものであって、ＮＡＤ（Ｐ）及びＣＨＥの
夫々が少なくとも第一試薬と第二試薬の何れかに含まれ
ている試薬からなるもの。（ii^'）ＣＤ又は／及びその誘導体、及びＣＨＥを含ん
でなる第一試薬と、ＣＨＤを含んでなる第二試薬とから
なるものであって、ＮＡＤ（Ｐ）及び両性界面活性剤の
夫々が少なくとも第一試薬と第二試薬の何れかに含まれ
ている試薬からなるもの。（iii^'）ＣＤ又は／及びその誘導体、両性界面活性剤、
及びＣＨＥを含んでなる第一試薬と、ＣＨＤを含んでな
る第二試薬とからなるものであって、ＮＡＤ（Ｐ）が少
なくとも第一試薬と第二試薬の何れかに含まれている試
薬からなるもの。尚、本発明のＬＤＬ−コレステロール
測定用試薬を２液法用として調製する場合には、両性界
面活性剤又は／及びＣＨＥを、ＣＤ又は／及びその誘導
体と共に第一試薬に含有させて用いる方が、ＬＤＬ−コ
レステロールへの特異性及びＬＤＬ−コレステロールの
測定精度を向上させる上で望ましい。また、上記の如き
本発明の試薬の組合せのうち、両性界面活性剤とＣＨＥ
とを共存させる場合には、両性界面活性剤によりＣＨＥ
活性の安定性が低下する可能性があるので、試薬の保存
安定性等の点から、第一試薬及び第二試薬の両方にＣＨ
Ｅを含有させたもの、即ち、酸化呈色法用試薬の場合に
は、ＣＤ又は／及びその誘導体、両性界面活性剤、及び
ＣＨＥを含んでなる第一試薬と、ＣＯＤ及びＣＨＥを含
んでなる第二試薬とからなるものであって、カップラ
ー、デベロッパー及びＰＯＤの夫々が少なくとも第一試
薬と第二試薬の何れかに含まれている試薬からなるもの
が、また、紫外部測定法用試薬の場合には、ＣＤ又は／
及びその誘導体、両性界面活性剤、及びＣＨＥを含んで
なる第一試薬と、ＣＨＤ及びＣＨＥを含んでなる第二試
薬とからなるものであって、ＮＡＤ（Ｐ）が少なくとも
第一試薬と第二試薬の何れかに含まれている試薬からな
るものが、夫々望ましい。また、上記した如き本発明の
酸化呈色法用試薬の組合せに於いては、試薬の安定性
（試薬盲検の安定性）を考慮すると、カップラーとデベ
ロッパーの一方を第一試薬に含有させ、他方を第二試薬
に含有させることが望ましい。

【００２９】本発明のＬＤＬ−コレステロール測定用試
薬中には、緩衝剤が含まれていても良い。本発明に於い
て使用される緩衝剤としては、用いられる各種酵素類及
び被酸化性呈色試薬等の組合せ等により異なるが、この
分野に於いて通常用いられるものであればよく、pH５〜
11の範囲で緩衝作用を有するものが使用される。また、
これら緩衝剤の使用濃度としては、通常１mM〜５Ｍ、好
ましくは５mM〜１Ｍの範囲から適宜選択される。これら
緩衝剤のうち、特にＬＤＬ−コレステロールへの特異性
の点から、例えばＮ−（２−アセトアミド）−２−アミ
ノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−
ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（Ｂ
ＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホ
ン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピ
ペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（Ｐ
ＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−
２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）等のアミノエタ
ンスルホン酸誘導体、例えばＮ−シクロヘキシル−３−
アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘ
キシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン
酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキ
シエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰ
Ｓ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエ
チル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥ
ＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯ
ＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスル
ホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２
−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳ
Ｏ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−ア
ミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２−ヒドロキシ
−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノ
プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）等のアミノプロパン
スルホン酸誘導体、例えばＮ−（２−アセトアミド）イ
ミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
エチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）
等のグリシン誘導体等のカルボキシル基又はスルホン酸
基を有する脂肪族アミン類を緩衝剤として用いることが
望ましい。

【００３０】また、本発明のＬＤＬ−コレステロ−ル測
定用試薬中には、イオン性化合物、例えばデキストラン
硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、リンタングステン酸等
のポリアニオン等が含まれていても良い。これらは単独
または混合して使用することができる。更に、イオン性
化合物と、Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃａ²⁺等の２価のカチオン
（或いはこれら２価のカチオンを生じさせ得る金属塩）
とを組み合わせて使用してもよい。これらの使用濃度と
しては特に限定されないが、イオン性化合物等の使用濃
度としては、反応液中の濃度が、通常0.01〜10％（w／
v）の範囲で使用され、また、２価カチオンの使用濃度
としては、反応液中の濃度が、通常0.1〜200mMの範囲で
使用される。また、本発明のＬＤＬ−コレステロ−ル測
定用試薬中にはＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステ
ロールがコレステロール測定反応に関与することを防止
するために、ポリクロ−ナル抗体またはモノクロ−ナル
抗体の１種または２種以上を共存させてもよい。このよ
うな目的で使用可能な抗体としては、例えば抗アポリポ
タンパクＡ抗体、抗アポリポタンパクＣ抗体、抗アポリ
ポタンパクＥ抗体、抗αリポタンパク抗体等が挙げられ
る。これら抗体の使用濃度としては、ＬＤＬ以外のリポ
タンパク中に含まれるコレステロールがコレステロール
測定反応に関与するのを防止し得る濃度以上であればよ
く、特に限定されないが、最終の反応液中の濃度が通常
0.001〜10mgAb/ml、好ましくは0.01〜１mgAb/mlとなる
ように反応液中に添加される。また、本発明のＬＤＬ−
コレステロール測定用試薬中には、この分野に於いて通
常用いられる界面活性剤、例えばポリオキシエチレンイ
ソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアル
キルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェ
ニルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポ
リオキシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレングリ
コールモノラウレート、ポリエチレンラウリルエーテル
等の非イオン性界面活性剤、例えば塩化ステアリルトリ
メチルアンモニウム、塩化アルキルベンジルジメチルア
ンモニウム等の陽イオン性界面活性剤、例えばコール
酸、デオキシコール酸、ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル硫酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性
剤等、両性界面活性剤以外の界面活性剤が含まれていて
も良い。これらは単独又は二種以上適宜組み合わせて用
いることができ、その使用濃度としては、特に限定され
ないが、反応液中の濃度が、通常0.0001〜10％（w／
v）、好ましくは0.001〜１％（w／v）の範囲から適宜選
択される。

【００３１】本発明のＬＤＬ−コレステロ−ルの測定法
を、２試薬系測定法により実施するには、例えば以下の
如く行えばよい。即ち、酸化呈色法の場合、例えば血
清、血漿等の生体試料と、例えば両性界面活性剤、ＣＤ
又は／及びその誘導体、ＣＨＥ及びカップラー（又はデ
ベロッパー）、要すれば緩衝剤、抗体、イオン性化合
物、２価のカチオン等を含有する第一試薬とを混合して
生体試料を処理し、２〜40℃で１〜30分間反応させた後
に吸光度（ＯＤ₁）を測定する。次いで、該反応液と、
例えばＣＯＤ、ＣＨＥ、ＰＯＤ及びデベロッパー（又は
カップラー）、要すれば緩衝剤等を含有する第二試薬と
を混合し、２〜40℃で１〜60分反応させた後に吸光度
（ＯＤ₂）を測定する。上記のＯＤ₂からＯＤ₁に由来す
る値（例えばＯＤ₁に補正係数を掛けて求めた値）を差
し引いた吸光度（ＯＤ₃）を求め、得られたＯＤ₃を、例
えば予めＬＤＬ−コレステロール濃度既知の標準液等を
試料として上記と同様にして求めた、ＬＤＬ−コレステ
ロール濃度とＯＤ₃との関係を示す検量線に当てはめる
ことにより、生体試料中のＬＤＬ−コレステロールの値
が求められる。また、紫外部測定法の場合、例えば血
清、血漿等の生体試料と、例えば両性界面活性剤、ＣＤ
又は／及びその誘導体及びＣＨＥ、要すれば緩衝剤、抗
体、イオン性化合物、２価のカチオン等を含有する第一
試薬とを混合して生体試料を処理し、２〜40℃で１〜30
分間反応させた後に340nmに於ける吸光度（ＯＤ_1'）を
測定する。次いで、該反応液と、例えばＣＨＤ、ＣＨＥ
及びＮＡＤ（Ｐ）、要すれば緩衝剤等を含有する第二試
薬とを混合し、２〜40℃で１〜60分反応させた後に340n
mに於ける吸光度（ＯＤ_2'）を測定する。上記のＯＤ_2'
からＯＤ_1'に由来する値（例えばＯＤ_1'に補正係数を掛
けて求めた値）を差し引いた吸光度（ＯＤ_3'）を求め、
得られたＯＤ_3'を、例えば予めＬＤＬ−コレステロール
濃度既知の標準液等を試料として上記と同様にして求め
た、ＬＤＬ−コレステロール濃度とＯＤ₃との関係を示
す検量線に当てはめることにより、生体試料中のＬＤＬ
−コレステロールの値が求められる。

【００３２】また、本発明のＬＤＬ−コレステロ−ルの
測定法は、１試薬系測定法により実施しても良く、この
場合は、例えば以下の如く行えばよい。即ち、酸化呈色
法の場合、例えば血清, 血漿等の生体試料と、例えばＣ
ＨＥ、ＣＯＤ、ＰＯＤ、被酸化性呈色試薬、両性界面活
性剤及び、ＣＤ又は／及びその誘導体、要すれば緩衝
剤、抗体、イオン性化合物、２価のカチオン等を含有す
る試液とを混合し、２〜40℃で１〜30分間反応させた後
に吸光度（ＯＤ_S）を測定する。また、生体試料の代わ
りに生理食塩水等を使用し、上記と同じ試薬を用い上記
と同様の操作を行って盲検値（ＯＤ_Bl）を求める。次い
で、ＯＤ_SからＯＤ_B _lを差し引いた吸光度（ＯＤ_R）を求
め、これを、例えば予めＬＤＬ−コレステロール濃度既
知の標準液等を試料として上記と同様にして求めた、Ｌ
ＤＬ−コレステロール濃度とＯＤ_Rとの関係を示す検量
線に当てはめることにより、生体試料中のＬＤＬ−コレ
ステロールの値が求められる。また、紫外部測定法の場
合、例えば血清, 血漿等の生体試料と、例えばＣＨＥ、
ＣＨＤ、ＮＡＤ（Ｐ）、両性界面活性剤及び、ＣＤ又は
／及びその誘導体、要すれば緩衝剤、抗体、イオン性化
合物、２価のカチオン等を含有する試液とを混合し、２
〜40℃で１〜30分間反応させた後に340nmに於ける吸光
度（ＯＤ_S'）を測定する。また、生体試料の代わりに生
理食塩水等を使用し、上記と同じ試薬を用い上記と同様
の操作を行って盲検値（ＯＤ_Bl'）を求める。次いで、
ＯＤ_S'からＯＤ_Bl'を差し引いた吸光度（ＯＤ_R'）を求
め、これを、例えば予めＬＤＬ−コレステロール濃度既
知の標準液等を試料として上記と同様にして求めた、Ｌ
ＤＬ−コレステロール濃度とＯＤ_R'との関係を示す検量
線に当てはめることにより、生体試料中のＬＤＬ−コレ
ステロールの値が求められる。

【００３３】本発明のＬＤＬ−コレステロール測定用キ
ットは、例えば血清や血漿等の生体由来試料中のＬＤＬ
−コレステロ−ルを測定するために使用されるもので、
このようなキットとしては以下の如きものが望ましい。
即ち、酸化呈色法用の場合、ＣＤ又は／及びその誘導
体、両性界面活性剤、ＣＨＥ、及びカップラー（又はデ
ベロッパー）を含んでなる第一試薬と、ＣＯＤ、ＣＨ
Ｅ、ＰＯＤ、及びデベロッパー（カップラー）を含んで
なる第二試薬とを含んでなるものが挙げられる。また、
紫外部測定法用の場合、ＣＤ又は／及びその誘導体、両
性界面活性剤、及びＣＨＥを含んでなる第一試薬と、Ｃ
ＨＤ、ＮＡＤ（Ｐ）、及びＣＨＥを含んでなる第二試薬
とを含んでなるものが挙げられる。尚、夫々の構成要素
の好ましい態様、具体例については上で述べた通りであ
る。また、当該キットには、必要に応じて、ＬＤＬ−コ
レステロール標準品等が組み合わされていても良いこと
は言うまでもない。

【００３４】本発明のＬＤＬ−コレステロールの測定法
は、両性界面活性剤、及びＣＤ又は／及びその誘導体の
共存下で、コレステロールの測定を行わせるために、Ｈ
ＤＬのみならずＶＬＤＬ、カイロミクロン等のＬＤＬ以
外のリポタンパク中のコレステロールとも実質的に反応
せず、ＬＤＬ−コレステロールのみと特異的に反応する
ので、従来法では困難であったエンドポイント・アッセ
イでのＬＤＬ−コレステロール測定を可能ならしめるも
のである。また、標準品についてもＬＤＬ−コレステロ
ールの純品を用いる必要はなく、コレステロールを含
む、標準液あるいは粘度、比重等が正常血清と同様の物
性を持つ標準血清を使用することができる。

【００３５】以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細
に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。

【００３６】

【実施例】

実施例１日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を
使用して、本発明の測定法により、超遠心法で分画した
各種リポタンパク中のコレステロールを測定し、その反
応性を検討した。〔試料〕自体公知の超遠心法で血清より分画して得たＬ
ＤＬ画分、ＨＤＬ画分、ＶＬＤＬ画分及びＣＭ画分を試
料とした。尚、各試料中のコレステロールを、予め、市
販の総コレステロール測定用試薬キットＬタイプワコ
ーＣＨＯ・Ｈ（和光純薬工業(株)製）を用いて、同キッ
トの現品説明書の標準操作法に従い測定した。〔試薬〕（試薬１）Ｒ−１；２，６−ジ−Ｏ−メチル−α−シクロデキスト
リン（和光純薬工業(株)製。：以下、ＤＭ−α−ＣＤと
略記する。） 0.06％（w／v）、N-（2-ヒドロキシ-3-
スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリンＮａ塩
（ＨＤＡＯＳ：(株)同仁化学研究所製。） 0.6mM、及
びＮａＳＯ₄ 0.4Mを含有する50mM ピペラジン-1,4-ビ
ス（2-エタンスルホン酸）（PIPES）−ＮａＯＨ緩衝液
（pH7.0）をＲ−１とした。Ｒ−２；ＣＯＤ（天野製薬(株)製。）４U／ml、ＣＨ
Ｅ（旭化成工業(株)製）４U／ml、ＰＯＤ（東洋紡(株)
製。）６U／ml、４−ＡＡ３mM及び所定の両性界面
活性剤 0.01％（w／v）を含有する50mM ＰＩＰＥＳ−
ＮａＯＨ緩衝液（pH7.0）をＲ−２とした。（両性界面活性剤）以下に挙げる両性界面活性剤を夫々使用した。・リポミンＬＡ（ライオン(株)、商品名）；アミノカル
ボン酸誘導体・ソフタゾリンＬＰＢ−Ｒ（川研ファインケミカル
(株)、商品名）；ラウリン酸アミドプロピルベタイン・ソフタゾリンＣＬ（川研ファインケミカル(株)、商品
名）；２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒド
ロキシエチルイミダゾリニウムベタイン・アンヒトール２４Ｂ（花王(株)、商品名）；ラウリル
ベタイン・エナジコールＬ−３０ＡＮ（ライオン(株)、商品
名）；Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナト
リウム・Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８（和光純薬工業
(株)、商品名）；Ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３
−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（試薬２）Ｒ−１；試薬１と同じ。Ｒ−２；両性界面活性剤の代わりに、下記の界面活性剤
を使用した以外は、試薬１と同じ。（界面活性剤）・エマルゲンＡ−９０（花王(株)、商品名）；ポリオキ
シエチレン誘導体・エマルゲン７０９（花王(株)、商品名）；ポリオキシ
エチレン高級アルコールエーテル・トリトンＸ−１００（ロームアンドハース社、商
品名）；ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（試薬３）Ｒ−１；ＨＤＡＯＳ 0.6mM、及びＮａＳＯ₄ 0.4Mを含
有する50mM ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（pH7.0）を
Ｒ−１とした。Ｒ−２；ＣＯＤ（天野製薬(株)製。）４U／ml、ＣＨ
Ｅ（旭化成工業(株)製）４U／ml、ＰＯＤ（東洋紡(株)
製。）６U／ml及び４−ＡＡ３mMを含有する50mM
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（pH7.0）をＲ−２とし
た。〔測定条件〕測定パラメータを以下のように設定して、
各試料中のコレステロールを測定した。測定方法；２ポイントエンド[１６]−[３４] 試料量；３μｌＲ−１；２７０μｌＲ−２；９０μｌ測定波長；７００／６００ｎｍ測定温度；３７℃ 標準品濃度；１００ｍｇ／ｄｌ〔結果〕各種試料について得られたコレステロール値
と、市販のキットを用いて測定した各種試料中のコレス
テロール値とを、下記式に当てはめて、各リポタンパク
の反応率を求めた。その結果を表１に示す。

【００３７】

【表１】

【００３８】

【００３９】表１の測定結果から明らかな如く、試薬１
を用いた場合、即ち、両性界面活性剤とＤＭ−α−ＣＤ
との共存下でコレステロールの測定を行った場合には、
ＬＤＬ以外のリポタンパクは殆ど反応せず、ＬＤＬ中の
コレステロールを特異的に測定し得ることが判る。これ
に対して、非イオン性界面活性剤とＤＭ−α−ＣＤとの
共存下で測定を行った場合（試薬２）、及び界面活性剤
とＤＭ−α−ＣＤの何れも非共存下で測定を行った場合
（試薬３）には、ＬＤＬ以外のリポタンパクとも反応し
てしまい、ＬＤＬ−コレステロールを特異的に測定する
ことは不可能であることが判る。以上のことから、ＬＤ
Ｌ中のコレステロールを特異的に測定するためには、両
性界面活性剤と、ＣＤ又は／及びその誘導体との共存下
でリポタンパク中のコレステロールの測定を行う必要が
あることが判る。

【００４０】実施例２血清、血漿等生体試料中のＬＤＬ−コレステロールの測
定を実施するために使用される、測定用キットの代表的
な例としては、以下のようなものが挙げられる。（１）第一試薬（pH６〜８）：ＣＤ又は／及びその誘導
体、両性界面活性剤、ＣＨＥ、カップラー（又はデベロ
ッパー）。（２）第二試薬（pH６〜８）：ＣＯＤ、ＣＨＥ、ＰＯ
Ｄ、デベロッパー（又はカップラー）。

【００４１】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は試料中のＬＤ
Ｌ−コレステロ−ルを特異的に且つ精度良く測定し得る
方法並びにそれに用いられる試薬を提供するものであ
り、本発明を利用することにより、従来の方法では不可
能であったＬＤＬ−コレステロ−ルを直接、しかも汎用
の自動分析装置を用いて測定し得るという効果を奏する
ものであるので、斯業に貢献するところ大なる発明であ
る。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年７月３０日

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３０】また、本発明のＬＤＬ−コレステロール測
定用試薬中には、イオン性化合物、例えばデキストラン
硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、リンタングステン酸等
のポリアニオン等が含まれていても良い。これらは単独
または混合して使用することができる。更に、イオン性
化合物と、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃａ^２＋等の２価のカ
チオン（或いはこれら２価のカチオンを生じさせ得る金
属塩）とを組み合わせて使用してもよい。これらの使用
濃度としては特に限定されないが、イオン性化合物等の
使用濃度としては、反応液中の濃度が、通常０．０１〜
１０％（ｗ／ｖ）の範囲で使用され、また、２価カチオ
ンの使用濃度としては、反応液中の濃度が、通常０．１
〜２００ｍＭの範囲で使用される。また、本発明のＬＤ
Ｌ−コレステロール測定用試薬中にはＬＤＬ以外のリポ
タンパク中のコレステロールがコレステロール測定反応
に関与することを防止するために、ポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体の１種または２種以上を共存
させてもよい。このような目的で使用可能な抗体として
は、例えば抗アポリポタンパクＡ抗体、抗アポリポタン
パクＣ抗体、抗アポリポタンパクＥ抗体、抗αリポタン
パク抗体等が挙げられる。これら抗体の使用濃度として
は、ＬＤＬ以外のリポタンパク中に含まれるコレステロ
ールがコレステロール測定反応に関与するのを防止し得
る濃度以上であればよく、特に限定されないが、最終の
反応液中の濃度が通常０．００１〜１０ｍｇＡｂ／ｍ
ｌ、好ましくは０．０１〜１ｍｇＡｂ／ｍｌとなるよう
に反応液中に添加される。また、本発明のＬＤＬ−コレ
ステロール測定用試薬中には、この分野に於いて通常用
いられる界面活性剤、例えばポリオキシエチレンイソオ
クチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキル
フェニルエーテル、ポリオキソエチレンノニルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオ
キシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレングリコー
ルモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル等の非イオン性界面活性剤、例えば塩化ステアリルト
リメチルアンモニウム、塩化アルキルベンジルジメチル
アンモニウム等の陽イオン性界面活性剤、例えばコール
酸、デオキシコール酸、ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル硫酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性
剤等、両性界面活性剤以外の界面活性剤が含まれていて
も良い。これらは単独又は二種以上適宜組み合わせて用
いることができ、その使用濃度としては、特に限定され
ないが、反応液中の濃度が、通常０．０００１〜１０％
（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００１〜１％（ｗ／ｖ）の
範囲から適宜選択される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者花田寿郎兵庫県尼崎市高田町６番１号和光純薬工業株式会社大阪研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】両性界面活性剤と、シクロデキストリン
又は／及びその誘導体の共存下で測定を行うことを特徴
とする、低比重リポタンパク中のコレステロールの測定
方法。
【請求項２】コレステロールオキシダーゼ又はコレス
テロールデヒドロゲナーゼを用いる低比重リポタンパク
中のコレステロールの測定方法であって、試料を予めシ
クロデキストリン又は／及びその誘導体を含んでなる試
薬で処理した後、シクロデキストリン又は／及びその誘
導体と両性界面活性剤の共存下でコレステロールオキシ
ダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを反応させ
ることを特徴とする、低比重リポタンパク中のコレステ
ロールの測定方法。
【請求項３】シクロデキストリン又は／及びその誘導
体のコレステロール測定時の反応液中の濃度が、0.0001
〜10％（W／V）である、請求項１又は２に記載の低比重
リポタンパク中のコレステロールの測定方法。
【請求項４】コレステロール測定時の反応液中の両性
界面活性剤濃度が、0.0001〜10％（W／V）である、請求
項１〜３に記載の低比重リポタンパク中のコレステロー
ルの測定方法。
【請求項５】両性界面活性剤と、シクロデキストリン
又は／及びその誘導体とを含有させてなることを特徴と
する、低比重リポタンパク中のコレステロール測定用試
薬。
【請求項６】シクロデキストリン又は／及びその誘導
体を含んでなる第一試薬と、コレステロールオキシダー
ゼを含んでなる第二試薬とからなるものであって、カッ
プラー、デベロッパー、ペルオキシダーゼ、両性界面活
性剤及びコレステロールエステラーゼの夫々が少なくと
も第一試薬と第二試薬の何れかに含まれている低比重リ
ポタンパク中のコレステロール測定用試薬。
【請求項７】両性界面活性剤が第一試薬に含まれてい
る、請求項６に記載の低比重リポタンパク中のコレステ
ロール測定用試薬。
【請求項８】両性界面活性剤が第二試薬に含まれてい
る、請求項６に記載の低比重リポタンパク中のコレステ
ロール測定用試薬。
【請求項９】コレステロールエステラーゼが第一試薬
に含まれている、請求項６〜８に記載の低比重リポタン
パク中のコレステロール測定用試薬。
【請求項１０】コレステロールエステラーゼが第二試
薬に含まれている、請求項６〜８に記載の低比重リポタ
ンパク中のコレステロール測定用試薬。
【請求項１１】コレステロールエステラーゼが第一試
薬及び第二試薬の両方に含まれている、請求項６〜８に
記載の低比重リポタンパク中のコレステロール測定用試
薬。
【請求項１２】シクロデキストリン又は／及びその誘
導体、両性界面活性剤及びコレステロールエステラーゼ
を含んでなる第一試薬と、コレステロールオキシダーゼ
及びコレステロールエステラーゼを含んでなる第二試薬
とからなるものであって、カップラー、デベロッパー及
びペルオキシダーゼの夫々が少なくとも第一試薬と第二
試薬の何れかに含まれている低比重リポタンパク中のコ
レステロール測定用試薬。
【請求項１３】カップラーとデベロッパーの一方が第
一試薬に含まれ、他方が第二試薬に含まれている、請求
項６〜１２に記載の低比重リポタンパク中のコレステロ
ール測定用試薬。
【請求項１４】シクロデキストリン又は／及びその誘
導体、両性界面活性剤、コレステロールエステラーゼ、
及びカップラー（又はデベロッパー）を含んでなる第一
試薬と、コレステロールオキシダーゼ、コレステロール
エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、及びデベロッパー
（又はカップラー）を含んでなる第二試薬とを組み合わ
せてなることを特徴とする、低比重リポタンパク中のコ
レステロール測定用キット。【０００１】