JPH10316582A - 血管細胞調節剤 - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 血管細胞に作用する分子を提供し、血管細胞
の異常などによって引き起こされる各種疾患の治療硬化
を有する薬剤を得るものである。 【解決手段】 少なくとも配列表の配列番号２に記載の
アミノ酸配列を含有するポリペプチドを有してなる血管
細胞調節剤である。 【効果】 ヒトノッチリガンド分子部分アミノ酸配列か
ら構成されるポリペプチドを含有する薬剤が血管細胞の
増殖調節作用を有することから医薬品として利用でき
る。
の異常などによって引き起こされる各種疾患の治療硬化
を有する薬剤を得るものである。 【解決手段】 少なくとも配列表の配列番号２に記載の
アミノ酸配列を含有するポリペプチドを有してなる血管
細胞調節剤である。 【効果】 ヒトノッチリガンド分子部分アミノ酸配列か
ら構成されるポリペプチドを含有する薬剤が血管細胞の
増殖調節作用を有することから医薬品として利用でき
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血管細胞の増殖を
調節するための薬剤に関するものである。
調節するための薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】生物個体が成長し生きて行くためのには
それぞれの臓器や組織に酸素や栄養を供給することが必
要不可欠である。酸素や栄養分の運搬は血球成分と血漿
からなる血液によって行われ、この血液の流れる道が血
管である。血管は血管内皮細胞、平滑筋細胞、ペリサイ
ト、線維芽細胞などから構成される。血管新生とは既存
の血管から新しい血管ネットワークが形成される現象の
ことである。林と井藤の総説（「血管研究の最前線」実
験医学増刊、２１−２４、１９９５、羊土社）によると
血管新生の過程は次のような段階を経て行われると考え
られる。
それぞれの臓器や組織に酸素や栄養を供給することが必
要不可欠である。酸素や栄養分の運搬は血球成分と血漿
からなる血液によって行われ、この血液の流れる道が血
管である。血管は血管内皮細胞、平滑筋細胞、ペリサイ
ト、線維芽細胞などから構成される。血管新生とは既存
の血管から新しい血管ネットワークが形成される現象の
ことである。林と井藤の総説（「血管研究の最前線」実
験医学増刊、２１−２４、１９９５、羊土社）によると
血管新生の過程は次のような段階を経て行われると考え
られる。
【０００３】１．何らかの血管新生刺激により血管新生
因子が放出される。 ２．血管新生因子は近傍の血管内皮細胞からプラスミノ
ーゲンアクチベーター、コラゲナーゼなどの蛋白分解酵
素の分泌を刺激し、内皮細胞外の基底膜が分解される。 ３．破壊された基底膜より内皮細胞は血管新生刺激の存
在する場所に向かって遊走し、さらに増殖をする。 ４．遊走、増殖した内皮細胞は分化して管腔を形成し、
さらに基底膜構成物質を分泌し管腔外側に基底膜を形成
する。 ５．基底膜にそって周細胞が遊走し、３層の血管壁構造
が完成する。 ６．最終的には近隣の新生血管の吻合が生じ、新たな血
管網が形成される。
因子が放出される。 ２．血管新生因子は近傍の血管内皮細胞からプラスミノ
ーゲンアクチベーター、コラゲナーゼなどの蛋白分解酵
素の分泌を刺激し、内皮細胞外の基底膜が分解される。 ３．破壊された基底膜より内皮細胞は血管新生刺激の存
在する場所に向かって遊走し、さらに増殖をする。 ４．遊走、増殖した内皮細胞は分化して管腔を形成し、
さらに基底膜構成物質を分泌し管腔外側に基底膜を形成
する。 ５．基底膜にそって周細胞が遊走し、３層の血管壁構造
が完成する。 ６．最終的には近隣の新生血管の吻合が生じ、新たな血
管網が形成される。
【０００４】１９７１年に、Ｆｏｌｋｍａｎ（Ｎ．Ｅｎ
ｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５，１１８２−１１８６）が固
形腫瘍の発育が腫瘍血管新生に依存しているという仮説
を提唱し、血管新生が様々な病態と密接に関連している
ことが認識されたことから、血管新生を抑制すること
で、ＦｏｌｋｍａｎとＫｌａｇｓｂｒｕｎ（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３５，４４２−４４７、１９８７）により示さ
れた下記表１に示した種々の病態に対する新しい治療法
が考えられる。
ｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５，１１８２−１１８６）が固
形腫瘍の発育が腫瘍血管新生に依存しているという仮説
を提唱し、血管新生が様々な病態と密接に関連している
ことが認識されたことから、血管新生を抑制すること
で、ＦｏｌｋｍａｎとＫｌａｇｓｂｒｕｎ（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３５，４４２−４４７、１９８７）により示さ
れた下記表１に示した種々の病態に対する新しい治療法
が考えられる。
【０００５】
【表１】
【０００６】この他に、外科的な手術や外傷後の創傷治
癒過程、あるいは心筋梗塞、脳梗塞などで血管が閉塞
し、その後、側副血行路が作られる場合には、血管新生
はダメージを受けた組織の治癒を促進するため、血管新
生を促すことがそれらの治療につながると考えられる。
癒過程、あるいは心筋梗塞、脳梗塞などで血管が閉塞
し、その後、側副血行路が作られる場合には、血管新生
はダメージを受けた組織の治癒を促進するため、血管新
生を促すことがそれらの治療につながると考えられる。
【０００７】現在までに、血管新生を制御する分子とし
て、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ
ｔｏｒ）、ＦＧＦｓ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗ
ｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）、ＴＧＦ−α（ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−α）、ＴＧＦ
−β、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌ
ｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＰＩＧＦ（ｐ
ｌａｃｅｎｔａｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧ
Ｆ−Ｃ、ＰＤＧＦｓ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅ
ｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）、また炎症性のサ
イトカインとして知られているＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ
ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）、ＩＬ−８
（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）などが誘導因子として知ら
れ、ＩＦＮ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）−α、とＩＦＮ−
β、ＰＦ−４（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ−４）
などが抑制因子として知られている。これらは佐藤靖史
著「血管新生学」（メディカルレビュー社）に詳細に記
載されている。さらに、血管新生を抑制する活性を有す
る体内の腫瘍由来分子としてはＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ
（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７９，
３１５−３２９，１９９４）が同定されている。
て、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ
ｔｏｒ）、ＦＧＦｓ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗ
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ｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）、また炎症性のサ
イトカインとして知られているＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ
ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）、ＩＬ−８
（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）などが誘導因子として知ら
れ、ＩＦＮ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）−α、とＩＦＮ−
β、ＰＦ−４（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ−４）
などが抑制因子として知られている。これらは佐藤靖史
著「血管新生学」（メディカルレビュー社）に詳細に記
載されている。さらに、血管新生を抑制する活性を有す
る体内の腫瘍由来分子としてはＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ
（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７９，
３１５−３２９，１９９４）が同定されている。
【０００８】また、同様に及川の総説（血管と内皮、
２、４７０−４７８、１９９２）によると、血管新生抑
制作用を有する低分子の薬剤としてコルチゾン、ＭＰＡ
（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ａｃｅｔ
ａｔｅ）、ハービマイシンＡ、１５−デオキシスパガリ
ン、エポネマイシン、スタウロスポリン、レチノイン酸
などが一般の細胞増殖抑制活性を主な薬効として血管内
皮細胞の増殖抑制作用を基とした血管新生抑制作用物質
として挙げられている。
２、４７０−４７８、１９９２）によると、血管新生抑
制作用を有する低分子の薬剤としてコルチゾン、ＭＰＡ
（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ａｃｅｔ
ａｔｅ）、ハービマイシンＡ、１５−デオキシスパガリ
ン、エポネマイシン、スタウロスポリン、レチノイン酸
などが一般の細胞増殖抑制活性を主な薬効として血管内
皮細胞の増殖抑制作用を基とした血管新生抑制作用物質
として挙げられている。
【０００９】ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）とはショウジョウバ
エで発見された神経細胞の分化制御に関わるリセプター
型膜蛋白質であり、ノッチのホモログは線虫（Ｌｉｎ−
１２）、アフリカツメガエル（Ｘｏｔｃｈ）、マウス
（Ｍｏｔｃｈ）、ヒト（ＴＡＮ−１）などの無脊椎動
物、脊椎動物の分類を越えた広い動物種から見いだされ
ている。一方、ショウジョウバエノッチのリガンドとし
てショウジョウバエデルタ（Ｄｅｌｔａ）およびショウ
ジョウバエセレイト（Ｓｅｒｒａｔｅ）の２つが見いだ
されており、リセプターのノッチと同様に広い動物種か
らノッチリガンドホモログが見いだされている（Ａｒｔ
ａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６８，２２５−２３２，１９９５）。
エで発見された神経細胞の分化制御に関わるリセプター
型膜蛋白質であり、ノッチのホモログは線虫（Ｌｉｎ−
１２）、アフリカツメガエル（Ｘｏｔｃｈ）、マウス
（Ｍｏｔｃｈ）、ヒト（ＴＡＮ−１）などの無脊椎動
物、脊椎動物の分類を越えた広い動物種から見いだされ
ている。一方、ショウジョウバエノッチのリガンドとし
てショウジョウバエデルタ（Ｄｅｌｔａ）およびショウ
ジョウバエセレイト（Ｓｅｒｒａｔｅ）の２つが見いだ
されており、リセプターのノッチと同様に広い動物種か
らノッチリガンドホモログが見いだされている（Ａｒｔ
ａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６８，２２５−２３２，１９９５）。
【００１０】特にヒトに関して、ヒトノッチホモログで
あるＴＡＮ−１は、幅広く体中の組織に発現されており
（Ｅｌｌｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６，６
４９−６６１，１９９１）、またＴＡＮ−１以外に３つ
のノッチ類縁分子が存在することが報告されている（Ａ
ｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，２２５−２３２，１９９
５）。血液細胞においては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法にてＣＤ３４
陽性細胞にＴＡＮ−１の発現が認められている（Ｍｉｌ
ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３，２０５７−
２０６２，１９９４）。また、マウスの乳ガンを引き起
こすウイルスがコードしていた遺伝子から見いだされた
マウスノッチホモログであるＮｏｔｃｈ−４／ｉｎｔ−
３は、血管内皮細胞に特異的に発現が認められている
（Ｈｅｎｄｒｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ １２２，２２５１−２２５９，１９９６）。
あるＴＡＮ−１は、幅広く体中の組織に発現されており
（Ｅｌｌｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６，６
４９−６６１，１９９１）、またＴＡＮ−１以外に３つ
のノッチ類縁分子が存在することが報告されている（Ａ
ｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，２２５−２３２，１９９
５）。血液細胞においては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法にてＣＤ３４
陽性細胞にＴＡＮ−１の発現が認められている（Ｍｉｌ
ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３，２０５７−
２０６２，１９９４）。また、マウスの乳ガンを引き起
こすウイルスがコードしていた遺伝子から見いだされた
マウスノッチホモログであるＮｏｔｃｈ−４／ｉｎｔ−
３は、血管内皮細胞に特異的に発現が認められている
（Ｈｅｎｄｒｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ １２２，２２５１−２２５９，１９９６）。
【００１１】近年クローニングされたショウジョウバエ
デルタの脊椎動物のホモログはニワトリ（Ｃ−デルタ−
１）とアフリカツメガエル（Ｘ−デルタ−１）が見いだ
されており、Ｘ−デルタ−１は原始ニューロンの発生に
Ｘｏｔｃｈを介して作用することが報告されている（Ｈ
ｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７
５，７８７−７９０，１９９５およびＣｈｉｔｎｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７５，７６１−７６
６，１９９５）。一方、ショウジョウバエセレイトの脊
椎動物のホモログはラットジャグド（Ｊａｇｇｅｄ）が
見いだされている（Ｃｌａｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅ
ｌｌ ８０，９０９−９１７，１９９５）。
デルタの脊椎動物のホモログはニワトリ（Ｃ−デルタ−
１）とアフリカツメガエル（Ｘ−デルタ−１）が見いだ
されており、Ｘ−デルタ−１は原始ニューロンの発生に
Ｘｏｔｃｈを介して作用することが報告されている（Ｈ
ｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７
５，７８７−７９０，１９９５およびＣｈｉｔｎｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７５，７６１−７６
６，１９９５）。一方、ショウジョウバエセレイトの脊
椎動物のホモログはラットジャグド（Ｊａｇｇｅｄ）が
見いだされている（Ｃｌａｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅ
ｌｌ ８０，９０９−９１７，１９９５）。
【００１２】この報告によれば、ラットジャグドのｍＲ
ＮＡは胎仔ラットの脊髄に検出される。また、ラットノ
ッチを強制的に過剰発現させた筋芽細胞株とラットジャ
グド発現細胞株の共培養により、この筋芽細胞株の分化
が抑制されることが見いだされているが、ラットノッチ
を強制発現させていない筋芽細胞株に対してはラットジ
ャグドが作用しないことが見いだされている。しかしな
がら、これらいずれの実験結果も本願で使用したリガン
ドタンパク質を用いた実験では行われてはいない。ま
た、下記に示した本発明者らによりリガンド血液細胞に
おける作用も示されているが、神経細胞、筋肉系細胞、
血液細胞以外に対するノッチリガンドタンパクの作用は
不明であった。
ＮＡは胎仔ラットの脊髄に検出される。また、ラットノ
ッチを強制的に過剰発現させた筋芽細胞株とラットジャ
グド発現細胞株の共培養により、この筋芽細胞株の分化
が抑制されることが見いだされているが、ラットノッチ
を強制発現させていない筋芽細胞株に対してはラットジ
ャグドが作用しないことが見いだされている。しかしな
がら、これらいずれの実験結果も本願で使用したリガン
ドタンパク質を用いた実験では行われてはいない。ま
た、下記に示した本発明者らによりリガンド血液細胞に
おける作用も示されているが、神経細胞、筋肉系細胞、
血液細胞以外に対するノッチリガンドタンパクの作用は
不明であった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】いままで知られていな
かった血管細胞に作用する分子を提供し、血管細胞の異
常などによって引き起こされる各種疾患の治療効果を有
する薬剤を提供することにある。
かった血管細胞に作用する分子を提供し、血管細胞の異
常などによって引き起こされる各種疾患の治療効果を有
する薬剤を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らはノッチリガ
ンドをヒトに臨床応用する際、既知のニワトリ型，アフ
リカツメガエル型などの異種の動物種のものでは、種特
異性や抗原性の問題が生じるため、未だ報告のないヒト
型のノッチリガンドを取得することは不可欠であると考
え、ヒトデルタ−１の分子の遺伝子クローニング、リコ
ンビナントタンパク質製造方法並びに精製方法を確立
し、ついで血液未分化細胞に対する作用を解明し既に国
際特許出願を行った。（ＰＣＴ／ＪＰ９６／０３３５
６）これらの分子の遺伝子取得並びにリコンビナントタ
ンパクの作製は上記の出願及び参考例に従って得ること
ができる。
ンドをヒトに臨床応用する際、既知のニワトリ型，アフ
リカツメガエル型などの異種の動物種のものでは、種特
異性や抗原性の問題が生じるため、未だ報告のないヒト
型のノッチリガンドを取得することは不可欠であると考
え、ヒトデルタ−１の分子の遺伝子クローニング、リコ
ンビナントタンパク質製造方法並びに精製方法を確立
し、ついで血液未分化細胞に対する作用を解明し既に国
際特許出願を行った。（ＰＣＴ／ＪＰ９６／０３３５
６）これらの分子の遺伝子取得並びにリコンビナントタ
ンパクの作製は上記の出願及び参考例に従って得ること
ができる。
【００１５】さらに本発明者らは、ノッチリガンドが神
経芽細胞、筋芽細胞、血液細胞の分化制御のみならず他
の細胞の増殖・分化を制御するとの仮説を立て、数多く
の細胞に対するノッチリガンドポリペプチドの作用を細
胞の増殖並びに分化に対する作用を解析した。その結
果、血管細胞の増殖に対して抑制的な作用を有すること
を発見し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は
少なくとも配列表の配列番号１、２、および３からなる
群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを
有してなる血管細胞調節剤に関し、さらに血管細胞が血
管内皮細胞であるこれら血管細胞調節剤に関するもので
あり、また前述の血管新生に関係した各種疾患に治療効
果を有した薬剤に関するものである。
経芽細胞、筋芽細胞、血液細胞の分化制御のみならず他
の細胞の増殖・分化を制御するとの仮説を立て、数多く
の細胞に対するノッチリガンドポリペプチドの作用を細
胞の増殖並びに分化に対する作用を解析した。その結
果、血管細胞の増殖に対して抑制的な作用を有すること
を発見し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は
少なくとも配列表の配列番号１、２、および３からなる
群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを
有してなる血管細胞調節剤に関し、さらに血管細胞が血
管内皮細胞であるこれら血管細胞調節剤に関するもので
あり、また前述の血管新生に関係した各種疾患に治療効
果を有した薬剤に関するものである。
【００１６】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
において血管細胞とは血管を構成する細胞である血管内
皮細胞、血管平滑筋細胞を意味する。また、血管細胞調
節剤とは血管細胞の増殖並びに分化を抑制もしくは促進
する作用を有する薬剤を意味する。この中には血管細胞
増殖抑制剤、分化抑制剤、増殖促進剤、分化促進剤など
が含まれる。
において血管細胞とは血管を構成する細胞である血管内
皮細胞、血管平滑筋細胞を意味する。また、血管細胞調
節剤とは血管細胞の増殖並びに分化を抑制もしくは促進
する作用を有する薬剤を意味する。この中には血管細胞
増殖抑制剤、分化抑制剤、増殖促進剤、分化促進剤など
が含まれる。
【００１７】遺伝子操作に必要なｃＤＮＡの作製、ノー
ザンブロットによる発現の検討、ハイブリダイゼーショ
ンによるスクリーニング、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡ
の塩基配列の決定、ｃＤＮＡライブラリーの作製等の一
連の分子生物学的な実験は通常の実験書に記載の方法に
よって行うことができる。前記の通常の実験書として
は、たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの編集した Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｒｔ
ｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ
Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを挙げ
ることができる。
ザンブロットによる発現の検討、ハイブリダイゼーショ
ンによるスクリーニング、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡ
の塩基配列の決定、ｃＤＮＡライブラリーの作製等の一
連の分子生物学的な実験は通常の実験書に記載の方法に
よって行うことができる。前記の通常の実験書として
は、たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの編集した Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｒｔ
ｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ
Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを挙げ
ることができる。
【００１８】本発明のポリペプチドは少なくとも配列表
の配列番号１、２、および３からのアミノ酸配列からな
るポリペプチドを有するが、自然界で生じることが知ら
れている生物種内変異、アレル変異等の突然変異及び人
為的に作製可能な点変異による変異によって生じる改変
体も、配列表の配列番号１、２、および３からのポリペ
プチドがそれらの性質を失わない限り本発明の新規化合
物に含まれる。そのアミノ酸の改変、置換に関しては例
えばＢｅｎｎｅｔｔらの出願（国際公開番号ＷＯ９６／
２６４５）などに詳しく記載されており、これらを参考
にして作製することができる。
の配列番号１、２、および３からのアミノ酸配列からな
るポリペプチドを有するが、自然界で生じることが知ら
れている生物種内変異、アレル変異等の突然変異及び人
為的に作製可能な点変異による変異によって生じる改変
体も、配列表の配列番号１、２、および３からのポリペ
プチドがそれらの性質を失わない限り本発明の新規化合
物に含まれる。そのアミノ酸の改変、置換に関しては例
えばＢｅｎｎｅｔｔらの出願（国際公開番号ＷＯ９６／
２６４５）などに詳しく記載されており、これらを参考
にして作製することができる。
【００１９】配列表の配列番号１のアミノ酸配列は本発
明のヒトデルター１のシグナルペプチドを除いた活性中
心の配列、すなわちアミノ末端からＤＳＬドメインまで
のアミノ酸配列であり、配列番号３に示した本発明のヒ
トデルター１の成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号
１番から２００番に相当している。配列番号２のアミノ
酸配列は、本発明のヒトデルター１のシグナルペプチド
を除いた細胞外ドメインの配列であり、配列番号３に示
した本発明のヒトデルター１成熟型全長アミノ酸配列の
アミノ酸番号１番から５２０番に相当している。配列番
号３のアミノ酸配列は、本発明のヒトデルター１の成熟
型全長アミノ酸配列である。
明のヒトデルター１のシグナルペプチドを除いた活性中
心の配列、すなわちアミノ末端からＤＳＬドメインまで
のアミノ酸配列であり、配列番号３に示した本発明のヒ
トデルター１の成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号
１番から２００番に相当している。配列番号２のアミノ
酸配列は、本発明のヒトデルター１のシグナルペプチド
を除いた細胞外ドメインの配列であり、配列番号３に示
した本発明のヒトデルター１成熟型全長アミノ酸配列の
アミノ酸番号１番から５２０番に相当している。配列番
号３のアミノ酸配列は、本発明のヒトデルター１の成熟
型全長アミノ酸配列である。
【００２０】また、配列番号４の配列は本発明のヒトデ
ルター１の全アミノ酸配列及びそれをコードしているｃ
ＤＮＡ配列である。なお、配列表に記載されたアミノ酸
配列の左端及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下Ｎ末
と呼称する）及びカルボキシル基末端（以下Ｃ末と呼称
する）であり、また塩基配列の左端及び右端はそれぞれ
５’末端及び３’末端である。ヒトデルター１のアミノ
酸配列の解析によれば、ヒトデルター１の前駆体のアミ
ノ酸配列は配列表の配列番号４のアミノ酸配列に示す７
２３アミノ酸残基からなり、シグナルペプチド領域は同
配列表のアミノ酸配列の−２１番のメチオニンから−１
番のセリンにあたる２１アミノ酸残基、細胞外領域は同
配列表の１番のセリンから５２０番グリシンにあたる５
２０アミノ酸残基、細胞膜通過領域は同配列表のアミノ
酸配列の５２１番のプロリンから５５２番のロイシンに
あたる３２アミノ酸残基、細胞内領域は同配列表の５５
３番のグルタミンから７０２番のバリンにあたる１５０
アミノ酸残基が該当することが推定された。ただし、こ
れらの各部分は、あくまでもアミノ酸配列から予測され
たドメイン構成であり、実際に細胞上および溶液中での
存在形態は、上記の構成と若干異なることも十分考えら
れ、上記に一応規定された各ドメインの構成アミノ酸
が、５から１０アミノ酸配列前後することも考えられ
る。
ルター１の全アミノ酸配列及びそれをコードしているｃ
ＤＮＡ配列である。なお、配列表に記載されたアミノ酸
配列の左端及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下Ｎ末
と呼称する）及びカルボキシル基末端（以下Ｃ末と呼称
する）であり、また塩基配列の左端及び右端はそれぞれ
５’末端及び３’末端である。ヒトデルター１のアミノ
酸配列の解析によれば、ヒトデルター１の前駆体のアミ
ノ酸配列は配列表の配列番号４のアミノ酸配列に示す７
２３アミノ酸残基からなり、シグナルペプチド領域は同
配列表のアミノ酸配列の−２１番のメチオニンから−１
番のセリンにあたる２１アミノ酸残基、細胞外領域は同
配列表の１番のセリンから５２０番グリシンにあたる５
２０アミノ酸残基、細胞膜通過領域は同配列表のアミノ
酸配列の５２１番のプロリンから５５２番のロイシンに
あたる３２アミノ酸残基、細胞内領域は同配列表の５５
３番のグルタミンから７０２番のバリンにあたる１５０
アミノ酸残基が該当することが推定された。ただし、こ
れらの各部分は、あくまでもアミノ酸配列から予測され
たドメイン構成であり、実際に細胞上および溶液中での
存在形態は、上記の構成と若干異なることも十分考えら
れ、上記に一応規定された各ドメインの構成アミノ酸
が、５から１０アミノ酸配列前後することも考えられ
る。
【００２１】ノッチのリガンドホモログは進化論的に保
存された共通の配列を有している。すなわちＤＳＬ配列
と繰り返して存在するＥＧＦ様配列である。ヒトデルタ
ー１とヒト以外の種のデルタホモログとの比較により、
ヒトデルター１のアミノ酸配列からこれらの保存された
配列を推定した。すなわち、ＤＳＬ配列は配列表の配列
番号４のアミノ酸配列の１５８番のシステインから２０
０番のシステインにあたる４３アミノ酸残基に相当し
た。ＥＧＦ様配列は８回繰り返して存在し、配列表の配
列番号４のアミノ酸配列のうち、第１ＥＧＦ様配列は２
０５番システインから２３３番システインまで、第２Ｅ
ＧＦ様配列は２３６番システインから２６４番システイ
ンまで、第３ＥＧＦ様配列は２７１番システインから３
０４番システインまで、第４ＥＧＦ様配列は３１１番シ
ステインから３４２番システインまで、第５ＥＧＦ様配
列は３４９番システインから３８１番システインまで、
第６ＥＧＦ様配列は３８８番システインから４１９番シ
ステインまで、第７ＥＧＦ様配列は４２６番システイン
から４５７番システインまで、第８ＥＧＦ様配列は４６
４番システインから４９５番システインに該当した。
存された共通の配列を有している。すなわちＤＳＬ配列
と繰り返して存在するＥＧＦ様配列である。ヒトデルタ
ー１とヒト以外の種のデルタホモログとの比較により、
ヒトデルター１のアミノ酸配列からこれらの保存された
配列を推定した。すなわち、ＤＳＬ配列は配列表の配列
番号４のアミノ酸配列の１５８番のシステインから２０
０番のシステインにあたる４３アミノ酸残基に相当し
た。ＥＧＦ様配列は８回繰り返して存在し、配列表の配
列番号４のアミノ酸配列のうち、第１ＥＧＦ様配列は２
０５番システインから２３３番システインまで、第２Ｅ
ＧＦ様配列は２３６番システインから２６４番システイ
ンまで、第３ＥＧＦ様配列は２７１番システインから３
０４番システインまで、第４ＥＧＦ様配列は３１１番シ
ステインから３４２番システインまで、第５ＥＧＦ様配
列は３４９番システインから３８１番システインまで、
第６ＥＧＦ様配列は３８８番システインから４１９番シ
ステインまで、第７ＥＧＦ様配列は４２６番システイン
から４５７番システインまで、第８ＥＧＦ様配列は４６
４番システインから４９５番システインに該当した。
【００２２】ヒトデルター１のアミノ酸配列から予想さ
れることとして、糖鎖が付加される部分はＮ−アセチル
−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシド結合可能な部分と
して、配列表の配列番号３のアミノ酸配列の４５６番の
アスパラギン残基が挙がられる。また、Ｎ−アセチル−
Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部
分として、セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分
が考えられる。これらの糖鎖が付加されたタンパクの方
がポリペプチドそのものよりも一般に生体内での分解に
対して安定であり、また強い生理活性を有していると考
えられる。したがって、配列表の配列番号１、２または
３の配列を含有するポリペプチドのアミノ酸配列の中に
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシドやＮ
−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖がＮ−グル
コシドあるいはＯ−グルコシド結合してなるポリペプチ
ドも本発明に含まれる。
れることとして、糖鎖が付加される部分はＮ−アセチル
−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシド結合可能な部分と
して、配列表の配列番号３のアミノ酸配列の４５６番の
アスパラギン残基が挙がられる。また、Ｎ−アセチル−
Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部
分として、セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分
が考えられる。これらの糖鎖が付加されたタンパクの方
がポリペプチドそのものよりも一般に生体内での分解に
対して安定であり、また強い生理活性を有していると考
えられる。したがって、配列表の配列番号１、２または
３の配列を含有するポリペプチドのアミノ酸配列の中に
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシドやＮ
−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖がＮ−グル
コシドあるいはＯ−グルコシド結合してなるポリペプチ
ドも本発明に含まれる。
【００２３】ショウジョウバエノッチおよびそのリガン
ドの結合に関する研究により、ショウジョウバエノッチ
のリガンドがノッチに結合するために必要なアミノ酸領
域は、シグナルペプチドが切断された成熟体蛋白質のＮ
末からＤＳＬ配列までであることが明らかにされている
（特表平７−５０３１２１号公報）。このことから、少
なくともヒトデルター１のリガンド作用の発現に必要な
領域は配列表の配列番号１に示した新規アミノ酸配列で
あることがわかる。
ドの結合に関する研究により、ショウジョウバエノッチ
のリガンドがノッチに結合するために必要なアミノ酸領
域は、シグナルペプチドが切断された成熟体蛋白質のＮ
末からＤＳＬ配列までであることが明らかにされている
（特表平７−５０３１２１号公報）。このことから、少
なくともヒトデルター１のリガンド作用の発現に必要な
領域は配列表の配列番号１に示した新規アミノ酸配列で
あることがわかる。
【００２４】尚、本発明のヒトデルター１の全アミノ酸
配列をコードするｃＤＮＡを含むベクターｐＵＣＤＬ−
１Ｆを大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した形質転換細胞
は、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＪＭ１０９−ｐＵＣＤＬ−１Ｆとし
て日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる。寄託日は平成８年１０月２８日であり、寄託番号
はＦＥＲＭ ＢＰ−５７２８。
配列をコードするｃＤＮＡを含むベクターｐＵＣＤＬ−
１Ｆを大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した形質転換細胞
は、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＪＭ１０９−ｐＵＣＤＬ−１Ｆとし
て日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる。寄託日は平成８年１０月２８日であり、寄託番号
はＦＥＲＭ ＢＰ−５７２８。
【００２５】上記のヒトデルター１のアミノ酸配列をコ
ードするｃＤＮＡを用いた色々な形態を有したヒトデル
ター１の発現、精製には多数の方法が成書によって知ら
れている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒ
ｅｓ，１９９０．および横田ら、バイオマニュアルシリ
ーズ４, 遺伝子導入と発現・解析法, 羊土社、１９９
４）。すなわち、分離した該ヒトデルター１のアミノ酸
配列をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターにつな
ぎ、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞、バクテリアな
どの原核細胞を宿主として生産させることができる。
ードするｃＤＮＡを用いた色々な形態を有したヒトデル
ター１の発現、精製には多数の方法が成書によって知ら
れている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒ
ｅｓ，１９９０．および横田ら、バイオマニュアルシリ
ーズ４, 遺伝子導入と発現・解析法, 羊土社、１９９
４）。すなわち、分離した該ヒトデルター１のアミノ酸
配列をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターにつな
ぎ、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞、バクテリアな
どの原核細胞を宿主として生産させることができる。
【００２６】本発明のヒトデルター１を発現させる際
に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはその
５’末端に翻訳開始コドンを有し、また、３’末端には
翻訳終止コドンを有してもよい。これらの翻訳開始コド
ンや翻訳終止コドンは適当な合成ＤＮＡアダプターを用
いて付加することもできる。更に該ＤＮＡを発現させる
には上流にプロモーターを接続する。ベクターとしては
上記の大腸菌由来プラスミド、枯草菌由来プラスミド、
酵母由来プラスミド、あるいはλファージなどのバクテ
リオファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィル
スなどの動物ウィルスなどが挙げられる。
に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはその
５’末端に翻訳開始コドンを有し、また、３’末端には
翻訳終止コドンを有してもよい。これらの翻訳開始コド
ンや翻訳終止コドンは適当な合成ＤＮＡアダプターを用
いて付加することもできる。更に該ＤＮＡを発現させる
には上流にプロモーターを接続する。ベクターとしては
上記の大腸菌由来プラスミド、枯草菌由来プラスミド、
酵母由来プラスミド、あるいはλファージなどのバクテ
リオファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィル
スなどの動物ウィルスなどが挙げられる。
【００２７】本発明に用いられるプロモーターとして
は、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー
ターであればいかなるものでもよい。形質転換する際の
宿主がエシェリヒア属菌である場合はｔａｃプロモータ
ー、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが好
ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１プ
ロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、宿
主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプ
ロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主
が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモータ
ー、レトロウィルスのプロモーター、メタルチオネイン
プロモーター、ヒートショックプロモーターなどが利用
できる。
は、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー
ターであればいかなるものでもよい。形質転換する際の
宿主がエシェリヒア属菌である場合はｔａｃプロモータ
ー、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが好
ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１プ
ロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、宿
主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプ
ロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主
が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモータ
ー、レトロウィルスのプロモーター、メタルチオネイン
プロモーター、ヒートショックプロモーターなどが利用
できる。
【００２８】本発明のポリペプチドを発現させるとき、
配列表の配列番号１、２、もしくは３のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡのみでもかまわないが、産生されたポ
リペプチドの検出を容易にするための既知抗原エピトー
プをコードするｃＤＮＡを付加したり、多量体構造を形
成させるためにイムノグロブリンＦｃをコードするｃＤ
ＮＡを付加することで、特別の機能を付加した蛋白質を
生産させることもできる。
配列表の配列番号１、２、もしくは３のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡのみでもかまわないが、産生されたポ
リペプチドの検出を容易にするための既知抗原エピトー
プをコードするｃＤＮＡを付加したり、多量体構造を形
成させるためにイムノグロブリンＦｃをコードするｃＤ
ＮＡを付加することで、特別の機能を付加した蛋白質を
生産させることもできる。
【００２９】ヒトデルター１に関して本発明者らは参考
例３に示したごとく、細胞外タンパク質を発現する発現
ベクターとして、１）配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列の１番から５２０番のアミノ酸をコードするＤ
ＮＡ、２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の
１番から５２０番のアミノ酸のＣ末側に８アミノ酸、す
なわち Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysのアミノ酸配
列（以下ＦＬＡＧ配列、配列表の配列番号５）を持つポ
リペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤ
ＮＡ、および３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸
配列の１番から５２０番のアミノ酸のＣ末側にヒトＩｇ
Ｇ１のヒンジ部分以下のＦｃ配列（国際公開番号ＷＯ９
４／０２０３５に記載されている）を付加し、ヒンジ部
分のジスルフィド結合により２量体構造を有するキメラ
タンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩ
ＴＮｅｏ（丸山ら、９１年度日本分子生物学会予稿集、
日本国東京医科歯科大学丸山より入手可能）に各々別々
につなぎ、ヒトデルター１の細胞外部分発現ベクターを
作製した。
例３に示したごとく、細胞外タンパク質を発現する発現
ベクターとして、１）配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列の１番から５２０番のアミノ酸をコードするＤ
ＮＡ、２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の
１番から５２０番のアミノ酸のＣ末側に８アミノ酸、す
なわち Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysのアミノ酸配
列（以下ＦＬＡＧ配列、配列表の配列番号５）を持つポ
リペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤ
ＮＡ、および３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸
配列の１番から５２０番のアミノ酸のＣ末側にヒトＩｇ
Ｇ１のヒンジ部分以下のＦｃ配列（国際公開番号ＷＯ９
４／０２０３５に記載されている）を付加し、ヒンジ部
分のジスルフィド結合により２量体構造を有するキメラ
タンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩ
ＴＮｅｏ（丸山ら、９１年度日本分子生物学会予稿集、
日本国東京医科歯科大学丸山より入手可能）に各々別々
につなぎ、ヒトデルター１の細胞外部分発現ベクターを
作製した。
【００３０】また、ヒトデルター１の全長タンパク質を
発現する発現ベクターとして、４）配列表の配列番号３
の１番から７０２番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、お
よび５）配列表の配列番号３の１番から７０２番のアミ
ノ酸のＣ末端側にＦＬＡＧ配列を持つポリペプチドを付
加したキメラタンパク質コードするＤＮＡを発現ベクタ
ーｐＭＫＩＴＮｅｏに各々別々につなぎ、ヒトデルター
１の全長発現ベクターを作製した。このようにして構築
された該ヒトデルター１をコードするＤＮＡを含有する
発現プラスミドを用いて、形質転換体を製造する。
発現する発現ベクターとして、４）配列表の配列番号３
の１番から７０２番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、お
よび５）配列表の配列番号３の１番から７０２番のアミ
ノ酸のＣ末端側にＦＬＡＧ配列を持つポリペプチドを付
加したキメラタンパク質コードするＤＮＡを発現ベクタ
ーｐＭＫＩＴＮｅｏに各々別々につなぎ、ヒトデルター
１の全長発現ベクターを作製した。このようにして構築
された該ヒトデルター１をコードするＤＮＡを含有する
発現プラスミドを用いて、形質転換体を製造する。
【００３１】宿主としては例えばエシェリヒア属菌、バ
チルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。動物細
胞としては、例えばサル細胞であるＣＯＳ−７、Ｖｅｒ
ｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、カイコ細胞Ｓ
Ｆ９などが挙げられる。参考例４に示したごとく、上記
の１）〜５）の発現ベクターをそれぞれ別々に遺伝子導
入し、ヒトデルター１をＣＯＳ−７細胞（理化学研究
所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）で発
現させ、これら発現プラスミドで形質転換された形質転
換体が得られる。さらに、各形質転換体をそれぞれ公知
の方法により、適当な培地中で適当な培養条件により培
養することによって各種ヒトデルター１ポリペプチドを
製造することができる。
チルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。動物細
胞としては、例えばサル細胞であるＣＯＳ−７、Ｖｅｒ
ｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、カイコ細胞Ｓ
Ｆ９などが挙げられる。参考例４に示したごとく、上記
の１）〜５）の発現ベクターをそれぞれ別々に遺伝子導
入し、ヒトデルター１をＣＯＳ−７細胞（理化学研究
所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）で発
現させ、これら発現プラスミドで形質転換された形質転
換体が得られる。さらに、各形質転換体をそれぞれ公知
の方法により、適当な培地中で適当な培養条件により培
養することによって各種ヒトデルター１ポリペプチドを
製造することができる。
【００３２】参考例５に示したごとく、上記の様な培養
物からヒトデルター１ポリペプチドを分離精製すること
ができる。また、一般的には下記の方法により行うこと
ができる。すなわち、培養菌体あるいは細胞から抽出す
るに際しては、培養後、公知の方法、たとえば遠心分離
法などで菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液
に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解な
どによって菌体あるいは細胞を破砕した後、遠心分離や
濾過により粗抽出液を得る方法などを適宜用いることが
できる。緩衝液の中に尿素、塩酸グアニジンなどのタン
パク変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が
含まれていてもよい。培養溶液中に分泌される場合に
は、培養液を公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌
体あるいは細胞と分離し、上清を集める。
物からヒトデルター１ポリペプチドを分離精製すること
ができる。また、一般的には下記の方法により行うこと
ができる。すなわち、培養菌体あるいは細胞から抽出す
るに際しては、培養後、公知の方法、たとえば遠心分離
法などで菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液
に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解な
どによって菌体あるいは細胞を破砕した後、遠心分離や
濾過により粗抽出液を得る方法などを適宜用いることが
できる。緩衝液の中に尿素、塩酸グアニジンなどのタン
パク変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が
含まれていてもよい。培養溶液中に分泌される場合に
は、培養液を公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌
体あるいは細胞と分離し、上清を集める。
【００３３】このようにして得られた細胞抽出液あるい
は細胞上清に含まれるヒトデルター１は公知のタンパク
質精製法を用いることで、精製できる。その精製の過程
でタンパク質の存在を確認するために、上記に示したＦ
ＬＡＧ、ヒトＩｇＧＦｃなどの融合タンパクの場合に
は、それら機知抗原エピトープに対する抗体を用いたイ
ムノアッセイで検出して精製を進めることができる。ま
た、このような融合タンパク質として発現させない場合
には、参考例６に記載した抗体を用いて検出することが
できる。ヒトデルター１を特異的に認識する抗体は参考
例６に示したように作製することができる。また成書
（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニン
グ法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用
いて、細胞に発現させた遺伝子組換え体抗体によっても
作製することができる。このように作製された抗体はヒ
トデルター１の精製に利用できる。
は細胞上清に含まれるヒトデルター１は公知のタンパク
質精製法を用いることで、精製できる。その精製の過程
でタンパク質の存在を確認するために、上記に示したＦ
ＬＡＧ、ヒトＩｇＧＦｃなどの融合タンパクの場合に
は、それら機知抗原エピトープに対する抗体を用いたイ
ムノアッセイで検出して精製を進めることができる。ま
た、このような融合タンパク質として発現させない場合
には、参考例６に記載した抗体を用いて検出することが
できる。ヒトデルター１を特異的に認識する抗体は参考
例６に示したように作製することができる。また成書
（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニン
グ法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用
いて、細胞に発現させた遺伝子組換え体抗体によっても
作製することができる。このように作製された抗体はヒ
トデルター１の精製に利用できる。
【００３４】精製方法としてより有効な方法としては抗
体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げら
れる。この際に用いる抗体としては参考例６に記載した
抗体を用いることができる。また、融合タンパクの場合
には、参考例５に示したように、ＦＬＡＧであればＦＬ
ＡＧに対する抗体、ヒトＩｇＧＦｃであればＰｒｏｔｅ
ｉｎ Ｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いることができる。
このようにして作製されたヒト型ノッチリガンド蛋白質
の生理作用について、増殖・分化に関わる細胞、すなわ
ち神経未分化細胞、前脂肪細胞、肝細胞、筋芽細胞、皮
膚未分化細胞、血管細胞、血液未分化細胞、免疫未分化
細胞など、多数の細胞を用いて探索した結果、実施例１
に示したように、増殖因子存在下での培養へのヒトデル
ター１のＩｇＧキメラ蛋白質の添加により、ヒト血管内
皮細胞の増殖を有意に抑制する活性を有していることを
見いだし、本発明に到達した。
体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げら
れる。この際に用いる抗体としては参考例６に記載した
抗体を用いることができる。また、融合タンパクの場合
には、参考例５に示したように、ＦＬＡＧであればＦＬ
ＡＧに対する抗体、ヒトＩｇＧＦｃであればＰｒｏｔｅ
ｉｎ Ｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いることができる。
このようにして作製されたヒト型ノッチリガンド蛋白質
の生理作用について、増殖・分化に関わる細胞、すなわ
ち神経未分化細胞、前脂肪細胞、肝細胞、筋芽細胞、皮
膚未分化細胞、血管細胞、血液未分化細胞、免疫未分化
細胞など、多数の細胞を用いて探索した結果、実施例１
に示したように、増殖因子存在下での培養へのヒトデル
ター１のＩｇＧキメラ蛋白質の添加により、ヒト血管内
皮細胞の増殖を有意に抑制する活性を有していることを
見いだし、本発明に到達した。
【００３５】またさらに、ヒトデルター１に関しては血
管内皮細胞に対する作用は全く知られておらず、本発明
者らによって初めて明らかにされた知見である。さらに
本発明のポリペプチドの毒性については、いずれも１０
ｍｇ／Ｋｇをマウスに腹腔内投与したが、マウスの死亡
例は確認されず、本発明が有効な医薬品となることを明
らかにし、実施例２において薬剤の具体的な作製を行っ
た。したがって本発明分子を含む薬剤は、血管新生に関
係した病態の治療および予防剤として、そのままもしく
は自体公知の薬学的に許容される担体、賦形剤などと混
合した医薬組成物〔例えば、錠剤、カプセル剤（ソフト
カプセル，マイクロカプセルを含む）、液剤、注射剤、
坐剤〕として経口的もしくは非経口的に投与することが
できる。投与量は投与対象、投与ルート、症状などによ
っても異なるが、たとえば、成人には、１日あたり通常
０．０１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好まし
くは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度であ
る。
管内皮細胞に対する作用は全く知られておらず、本発明
者らによって初めて明らかにされた知見である。さらに
本発明のポリペプチドの毒性については、いずれも１０
ｍｇ／Ｋｇをマウスに腹腔内投与したが、マウスの死亡
例は確認されず、本発明が有効な医薬品となることを明
らかにし、実施例２において薬剤の具体的な作製を行っ
た。したがって本発明分子を含む薬剤は、血管新生に関
係した病態の治療および予防剤として、そのままもしく
は自体公知の薬学的に許容される担体、賦形剤などと混
合した医薬組成物〔例えば、錠剤、カプセル剤（ソフト
カプセル，マイクロカプセルを含む）、液剤、注射剤、
坐剤〕として経口的もしくは非経口的に投与することが
できる。投与量は投与対象、投与ルート、症状などによ
っても異なるが、たとえば、成人には、１日あたり通常
０．０１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好まし
くは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度であ
る。
【００３６】以上の結果から本発明の血管細胞調節剤は
表１に示した各種疾患にとって有効な薬剤と成る。した
がって、本発明には表１に示した各種疾患を対象とした
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、更に配列番号２、３に示したアミノ酸配列を
有するポリペプチドを含有して成る血管細胞調節剤も含
まれる。
表１に示した各種疾患にとって有効な薬剤と成る。した
がって、本発明には表１に示した各種疾患を対象とした
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、更に配列番号２、３に示したアミノ酸配列を
有するポリペプチドを含有して成る血管細胞調節剤も含
まれる。
【００３７】
【発明の実施の形態】本発明をより詳細に記述するため
に、参考例並びに実施例により説明するが、本発明の範
囲はこれらの例のみに限定されるものではない。 参考例１ ヒトデルター１プライマーによるＰＣＲ産物のクローニ
ングおよび塩基配列の決定 Ｃ−デルター１およびＸ−デルター１に保存されたアミ
ノ酸配列に対応した混合プライマー、すなわちセンスプ
ライマーＤＬＴＳ１（配列表の配列番号６に記載）及び
アンチセンスプライマーＤＬＴＡ２（配列表の配列番号
７に記載）を用いた。合成オリゴヌクレオチドは固相法
を原理とする全自動ＤＮＡ合成機を使用して作成した。
全自動ＤＮＡ合成機としては米国アプライドバイオシス
テム社３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥを使用した。ヌクレオチ
ド、３'-ヌクレオチドを固定した担体、溶液、および試
薬は同社の指示に従って使用した。所定のカップリング
反応を終了し、トリクロロ酢酸で５’末端の保護基を除
去したオリゴヌクレオチド担体を濃アンモニア中にて室
温で１時間放置することにより担体からオリゴヌクレオ
チドを遊離させた。
に、参考例並びに実施例により説明するが、本発明の範
囲はこれらの例のみに限定されるものではない。 参考例１ ヒトデルター１プライマーによるＰＣＲ産物のクローニ
ングおよび塩基配列の決定 Ｃ−デルター１およびＸ−デルター１に保存されたアミ
ノ酸配列に対応した混合プライマー、すなわちセンスプ
ライマーＤＬＴＳ１（配列表の配列番号６に記載）及び
アンチセンスプライマーＤＬＴＡ２（配列表の配列番号
７に記載）を用いた。合成オリゴヌクレオチドは固相法
を原理とする全自動ＤＮＡ合成機を使用して作成した。
全自動ＤＮＡ合成機としては米国アプライドバイオシス
テム社３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥを使用した。ヌクレオチ
ド、３'-ヌクレオチドを固定した担体、溶液、および試
薬は同社の指示に従って使用した。所定のカップリング
反応を終了し、トリクロロ酢酸で５’末端の保護基を除
去したオリゴヌクレオチド担体を濃アンモニア中にて室
温で１時間放置することにより担体からオリゴヌクレオ
チドを遊離させた。
【００３８】次に、核酸及びりん酸の保護基を遊離させ
るために、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル内に
おいて濃アンモニア溶液中で５５℃にて１４時間以上放
置した。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレ
オチドの精製をアプライドバイオシステム社のＯＰＣカ
ートリッジを使用して行い、２％トリフルオロ酢酸で脱
トリチル化した。精製後のプライマーは最終濃度が１０
０ｐｍｏｌ／μｌとなるように脱イオン水に溶解してＰ
ＣＲに使用した。
るために、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル内に
おいて濃アンモニア溶液中で５５℃にて１４時間以上放
置した。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレ
オチドの精製をアプライドバイオシステム社のＯＰＣカ
ートリッジを使用して行い、２％トリフルオロ酢酸で脱
トリチル化した。精製後のプライマーは最終濃度が１０
０ｐｍｏｌ／μｌとなるように脱イオン水に溶解してＰ
ＣＲに使用した。
【００３９】これらプライマーを用いたＰＣＲによる増
幅は以下のように行った。ヒト胎児脳由来ｃＤＮＡ混合
溶液（ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ、米国ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ社）１μｌを使用し、１０×緩衝液（５００
ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ゼラチン）５
μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（日本国宝酒造社製）
４μｌ、前述の脊椎動物デルタホモログに特異的なセン
スプライマーＤＬＴＳ１（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μ
ｌおよびアンチセンスプライマーＤＬＴＡ２（１００ｐ
ｍｏｌ／μｌ）５μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（ＡｍｐｌｉＴａｑ：日本国宝酒造社製、５Ｕ／μｌ）
０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量を５
０μｌとして、９５℃で４５秒間、４２℃で４５秒間、
７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この
行程を５サイクル行い、さらに９５℃で４５秒間、５０
℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイク
ルとして、この行程を３５サイクル行い最後に７２℃に
て７分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一
部を２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブ
ロマイド（日本国日本ジーン社製）にて染色後、紫外線
下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されている
ことを確認した。
幅は以下のように行った。ヒト胎児脳由来ｃＤＮＡ混合
溶液（ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ、米国ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ社）１μｌを使用し、１０×緩衝液（５００
ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ゼラチン）５
μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（日本国宝酒造社製）
４μｌ、前述の脊椎動物デルタホモログに特異的なセン
スプライマーＤＬＴＳ１（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μ
ｌおよびアンチセンスプライマーＤＬＴＡ２（１００ｐ
ｍｏｌ／μｌ）５μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（ＡｍｐｌｉＴａｑ：日本国宝酒造社製、５Ｕ／μｌ）
０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量を５
０μｌとして、９５℃で４５秒間、４２℃で４５秒間、
７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この
行程を５サイクル行い、さらに９５℃で４５秒間、５０
℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイク
ルとして、この行程を３５サイクル行い最後に７２℃に
て７分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一
部を２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブ
ロマイド（日本国日本ジーン社製）にて染色後、紫外線
下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されている
ことを確認した。
【００４０】ＰＣＲ産物の全量を低融点アガロース（米
国ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）にて作成した２％アガロー
スゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色
後、紫外線照射下にてデルタプライマーによるＰＣＲ産
物の約４００ｂｐのバンドを切り出し、ゲルと同体積の
蒸留水を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完全
に溶かしたのち、等量のＴＥ飽和フェノール（日本国日
本ジーン社製）を加えて、１５０００ｒｐｍ５分間遠心
分離後上清を分離し、さらに同様な分離作業をＴＥ飽和
フェノール：クロロフォルム（１：１）溶液、さらにク
ロロフォルムにて行った。最終的に得られた溶液からＤ
ＮＡをエタノール沈澱して回収した。
国ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）にて作成した２％アガロー
スゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色
後、紫外線照射下にてデルタプライマーによるＰＣＲ産
物の約４００ｂｐのバンドを切り出し、ゲルと同体積の
蒸留水を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完全
に溶かしたのち、等量のＴＥ飽和フェノール（日本国日
本ジーン社製）を加えて、１５０００ｒｐｍ５分間遠心
分離後上清を分離し、さらに同様な分離作業をＴＥ飽和
フェノール：クロロフォルム（１：１）溶液、さらにク
ロロフォルムにて行った。最終的に得られた溶液からＤ
ＮＡをエタノール沈澱して回収した。
【００４１】ベクターとしてｐＣＲＩＩ Ｖｅｃｔｏｒ
（米国Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製、以下ｐＣＲＩＩと
示す）を用い、ベクターと先のＤＮＡのモル比が１：３
となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（米
国Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡ
を組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたｐＣＲＩＩを大腸
菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ
（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に遺伝子導入し、アン
ピシリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含む
Ｌ−Ｂｒｏｔｈ（日本国宝酒造社製）半固型培地のプレ
ートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきた
コロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含む
Ｌ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、１８時間程
度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニ
プレップ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説
明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制
限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、約４００ｂｐのＤＮＡ
が切れ出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれて
いることを確認し、確認されたクローンについて、組み
込まれているＤＮＡの塩基配列を米国アプライドバイオ
システム社の螢光ＤＮＡシークエンサー（モデル３７３
Ｓ）にて決定した。
（米国Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製、以下ｐＣＲＩＩと
示す）を用い、ベクターと先のＤＮＡのモル比が１：３
となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（米
国Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡ
を組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたｐＣＲＩＩを大腸
菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ
（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に遺伝子導入し、アン
ピシリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含む
Ｌ−Ｂｒｏｔｈ（日本国宝酒造社製）半固型培地のプレ
ートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきた
コロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含む
Ｌ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、１８時間程
度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニ
プレップ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説
明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制
限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、約４００ｂｐのＤＮＡ
が切れ出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれて
いることを確認し、確認されたクローンについて、組み
込まれているＤＮＡの塩基配列を米国アプライドバイオ
システム社の螢光ＤＮＡシークエンサー（モデル３７３
Ｓ）にて決定した。
【００４２】参考例２ 新規ヒトデルター１遺伝子の全長クローニングおよびそ
の解析 ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ−１１に
ｃＤＮＡが挿入されたもの、米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社
製）からプラークハイブリダイゼ−ションにて全長ｃＤ
ＮＡを持ったクローンの検索を１×１０6 相当のプラー
クから行った。出現したプラークをナイロンフィルター
（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ+ ：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に
転写し、転写したナイロンフィルターをアルカリ処理
（１．５ＭＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨを染み込ませ
たろ紙上に７分間放置）し、次いで中和処理（１．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
２）、１ｍＭ ＥＤＴＡを染み込ませたろ紙上に３分間
放置）を２回行い、次にＳＳＰＥ溶液（０．３６Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０２Ｍ りん酸ナトリウム（ｐＨ７．
７）、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間振とう
後洗浄し、風乾した。その後、０．４Ｍ ＮａＯＨを染
み込ませたろ紙上に２０分間放置し、５倍濃度のＳＳＰ
Ｅ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。このフ
ィルターを用いて放射性同位元素32Ｐにて標識されたヒ
トデルター１プローブにてスクリーニングを行った。
の解析 ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ−１１に
ｃＤＮＡが挿入されたもの、米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社
製）からプラークハイブリダイゼ−ションにて全長ｃＤ
ＮＡを持ったクローンの検索を１×１０6 相当のプラー
クから行った。出現したプラークをナイロンフィルター
（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ+ ：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に
転写し、転写したナイロンフィルターをアルカリ処理
（１．５ＭＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨを染み込ませ
たろ紙上に７分間放置）し、次いで中和処理（１．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
２）、１ｍＭ ＥＤＴＡを染み込ませたろ紙上に３分間
放置）を２回行い、次にＳＳＰＥ溶液（０．３６Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０２Ｍ りん酸ナトリウム（ｐＨ７．
７）、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間振とう
後洗浄し、風乾した。その後、０．４Ｍ ＮａＯＨを染
み込ませたろ紙上に２０分間放置し、５倍濃度のＳＳＰ
Ｅ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。このフ
ィルターを用いて放射性同位元素32Ｐにて標識されたヒ
トデルター１プローブにてスクリーニングを行った。
【００４３】放射性同位元素32Ｐにて標識された参考例
１で作製されたＤＮＡプローブは以下のように作成し
た。すなわち、遺伝子配列が決定されたヒトデルター１
プライマーによる精製ＰＣＲ産物（約４００ｂｐ）が組
み込まれたｐＣＲＩＩより、ＥｃｏＲＩにてベクターよ
り切り出し、低融点アガロースゲルからＤＮＡ断片を精
製回収した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラベリングキ
ット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ
ｓｙｓｔｅｍ：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて
標識した。すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液５
μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸騰
水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液
１０μｌ、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮ
Ａポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７
℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカラ
ム（Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−５０：独逸国ベーリンガーマンハイム社
製）で精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷
後使用した。
１で作製されたＤＮＡプローブは以下のように作成し
た。すなわち、遺伝子配列が決定されたヒトデルター１
プライマーによる精製ＰＣＲ産物（約４００ｂｐ）が組
み込まれたｐＣＲＩＩより、ＥｃｏＲＩにてベクターよ
り切り出し、低融点アガロースゲルからＤＮＡ断片を精
製回収した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラベリングキ
ット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ
ｓｙｓｔｅｍ：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて
標識した。すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液５
μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸騰
水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液
１０μｌ、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮ
Ａポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７
℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカラ
ム（Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−５０：独逸国ベーリンガーマンハイム社
製）で精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷
後使用した。
【００４４】前述の方法にて作成したフィルターを、各
々の成分の最終濃度が５倍濃度のＳＳＰＥ溶液、５倍濃
度のデンハルト液（日本国和光純薬社製）、０．５％Ｓ
ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、日本国和光純薬社
製）、及び１０μｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサ
ケ精子ＤＮＡ（米国Ｓｉｇｍａ社製）であるプレハイブ
リダイゼーション液中に浸し、６５℃にて２時間振とう
した後、前述の方法で32Ｐ標識されたプローブを含むプ
レハイブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダイ
ゼーション液に浸し、５５℃にて１６時間振盪し、ハイ
ブリダイゼーションを行った。
々の成分の最終濃度が５倍濃度のＳＳＰＥ溶液、５倍濃
度のデンハルト液（日本国和光純薬社製）、０．５％Ｓ
ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、日本国和光純薬社
製）、及び１０μｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサ
ケ精子ＤＮＡ（米国Ｓｉｇｍａ社製）であるプレハイブ
リダイゼーション液中に浸し、６５℃にて２時間振とう
した後、前述の方法で32Ｐ標識されたプローブを含むプ
レハイブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダイ
ゼーション液に浸し、５５℃にて１６時間振盪し、ハイ
ブリダイゼーションを行った。
【００４５】次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む
ＳＳＰＥ溶液に浸し、５５℃にて振盪し２回洗浄後、さ
らに０．１％ＳＤＳを含む１０倍希釈したＳＳＰＥ溶液
に浸し、５５℃にて４回洗浄した。洗浄を終了したフィ
ルターを増感スクリーンを使用して、オートラジオグラ
フィーを行った。その結果、強く露光された部分のクロ
ーンを拾い、再度プラークを蒔き直し前述の方法にてス
クリーニングを行い、完全に単独のクローンを分離し
た。
ＳＳＰＥ溶液に浸し、５５℃にて振盪し２回洗浄後、さ
らに０．１％ＳＤＳを含む１０倍希釈したＳＳＰＥ溶液
に浸し、５５℃にて４回洗浄した。洗浄を終了したフィ
ルターを増感スクリーンを使用して、オートラジオグラ
フィーを行った。その結果、強く露光された部分のクロ
ーンを拾い、再度プラークを蒔き直し前述の方法にてス
クリーニングを行い、完全に単独のクローンを分離し
た。
【００４６】単離されたファージクローンは７クローン
であった。成書の方法に従い、これらのすべてのクロー
ンのファージを約１×１０9 ｐｆｕ調製し、ファージＤ
ＮＡを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様に
ＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（米国Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込んだ。これらのクロ
ーンの両端のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサーにより
解析したところ、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７の３クローンは共に
配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１番から２２４４番
の配列を含むクローンであり、Ｄ４のクローンは配列表
の配列番号４のＤＮＡ配列の９９９番から２６６３番を
含むクローンであった。Ｄ５とＤ４の２クローンはキロ
シークエンス用デリションキット（日本国宝酒造社製）
を用いて添付の説明書に従ってデリションミュータント
を作製し、該ＤＮＡシークエンサーを用いて５’方向、
３’方向の両方向から、本発明の全長のｃＤＮＡ塩基配
列を決定した。さらに配列表の配列番号４のＤＮＡ配列
の１２１４番にあるＸｈｏＩサイトを利用し、Ｄ４とＤ
５を制限酵素ＸｈｏＩによって消化して、配列表の配列
番号４のＤＮＡ配列全長を含むプラスミドｐＢＳＤｅｌ
−１を作製した。
であった。成書の方法に従い、これらのすべてのクロー
ンのファージを約１×１０9 ｐｆｕ調製し、ファージＤ
ＮＡを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様に
ＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（米国Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込んだ。これらのクロ
ーンの両端のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサーにより
解析したところ、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７の３クローンは共に
配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１番から２２４４番
の配列を含むクローンであり、Ｄ４のクローンは配列表
の配列番号４のＤＮＡ配列の９９９番から２６６３番を
含むクローンであった。Ｄ５とＤ４の２クローンはキロ
シークエンス用デリションキット（日本国宝酒造社製）
を用いて添付の説明書に従ってデリションミュータント
を作製し、該ＤＮＡシークエンサーを用いて５’方向、
３’方向の両方向から、本発明の全長のｃＤＮＡ塩基配
列を決定した。さらに配列表の配列番号４のＤＮＡ配列
の１２１４番にあるＸｈｏＩサイトを利用し、Ｄ４とＤ
５を制限酵素ＸｈｏＩによって消化して、配列表の配列
番号４のＤＮＡ配列全長を含むプラスミドｐＢＳＤｅｌ
−１を作製した。
【００４７】参考例３ ヒトデルター１発現ベクターの作製 配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子
を用いて、次の１）から５）に挙げるヒトデルター１蛋
白質の発現ベクターを作製した。制限酵素サイトの付
加、短い遺伝子配列の挿入は全て米国Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ社製ＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ
−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ
を用い、添付の取扱い説明書に従って行った。 １）分泌型ヒトデルター１蛋白質（ＨＤＥＸ）発現ベク
ター 配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１番から５２０番
のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロ
モーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクター
ｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
を用いて、次の１）から５）に挙げるヒトデルター１蛋
白質の発現ベクターを作製した。制限酵素サイトの付
加、短い遺伝子配列の挿入は全て米国Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ社製ＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ
−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ
を用い、添付の取扱い説明書に従って行った。 １）分泌型ヒトデルター１蛋白質（ＨＤＥＸ）発現ベク
ター 配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１番から５２０番
のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロ
モーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクター
ｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
【００４８】ヒトデルター１の発現ベクターを作製する
にあたって、遺伝子産物のより安定的に発現させるため
に、開始コドン（配列表の配列番号４の遺伝子配列の１
７９番）の５’方向に２０ｂｐ上流の部分にＥｃｏＲＩ
サイトを付加した。すなわち、上記のＭｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号４に記載のＤ
ＮＡ配列、ヒトデルター１の全長のｃＤＮＡを含むプラ
スミドｐＢＳＤｅｌー１をテンプレートとし、配列表の
配列番号８及び配列番号９の遺伝子配列を有するをオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして、５’方向に２０ｂ
ｐ上流の部分にＥｃｏＲＩサイトを付加したＤＮＡを作
成した。以下このプラスミドをｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌ
ｔａと示す。
にあたって、遺伝子産物のより安定的に発現させるため
に、開始コドン（配列表の配列番号４の遺伝子配列の１
７９番）の５’方向に２０ｂｐ上流の部分にＥｃｏＲＩ
サイトを付加した。すなわち、上記のＭｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号４に記載のＤ
ＮＡ配列、ヒトデルター１の全長のｃＤＮＡを含むプラ
スミドｐＢＳＤｅｌー１をテンプレートとし、配列表の
配列番号８及び配列番号９の遺伝子配列を有するをオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして、５’方向に２０ｂ
ｐ上流の部分にＥｃｏＲＩサイトを付加したＤＮＡを作
成した。以下このプラスミドをｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌ
ｔａと示す。
【００４９】次に、このｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａを
テンプレートとして、カルボキシル末端部分に終止コド
ン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため、同様
にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配
列番号１０及び配列番号１１の遺伝子配列を有するをオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして、終止コドン、さ
らにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクタ
ーをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出され
てくる約１６００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処
理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築
した。このベクターをｐＨＤＥＸと命名した。
テンプレートとして、カルボキシル末端部分に終止コド
ン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため、同様
にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配
列番号１０及び配列番号１１の遺伝子配列を有するをオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして、終止コドン、さ
らにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクタ
ーをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出され
てくる約１６００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処
理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築
した。このベクターをｐＨＤＥＸと命名した。
【００５０】２）分泌型ヒトデルター１のＦＬＡＧキメ
ラ蛋白質（ＨＤＥＸＦＬＡＧ）発現ベクター 配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１番から５２０番
のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃ
ＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡ
を、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を
含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベク
ターを作製した。
ラ蛋白質（ＨＤＥＸＦＬＡＧ）発現ベクター 配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１番から５２０番
のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃ
ＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡ
を、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を
含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベク
ターを作製した。
【００５１】ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレー
トとして用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、す
なわち配列表の配列番号２の５２０番目のＧｌｙの後に
ＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵
素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号１２及び配
列番号１１の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチド
をプライマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードす
る遺伝子並びに終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付
加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭ
ｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約１７００ｂｐの
遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏ
につないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐ
ＨＤＥＸＦＬＡＧと命名した。
トとして用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、す
なわち配列表の配列番号２の５２０番目のＧｌｙの後に
ＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵
素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号１２及び配
列番号１１の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチド
をプライマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードす
る遺伝子並びに終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付
加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭ
ｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約１７００ｂｐの
遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏ
につないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐ
ＨＤＥＸＦＬＡＧと命名した。
【００５２】３）分泌型ヒトデルター１のＩｇＧ１Ｆｃ
キメラ蛋白質（ＨＤＥＸＩｇ）発現ベクター 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドのＣ末にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ
部分のアミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードす
る遺伝子配列をｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクタ
ーを作製した。イムノグロブリンＦｃタンパクとの融合
タンパクの作製はＺｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌらの方法（Ｚ
ｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．，９，３４７−３５４，１９９０）にし
たがって、イントロンを含むゲノムＤＮＡを用いた遺伝
子を利用し、その遺伝子をＰＣＲ法を用いて作製した。
すなわち、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用
して、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ部分をコードする遺伝子配列を
制限酵素ＢａｍＨＩサイトのついた配列表の配列番号１
３の配列を有するオリゴヌクレオチド、制限酵素Ｘｂａ
Ｉサイトのついた配列表の配列番号１４の配列を有する
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを
行い、およそ１．４ｋｂｐのバンドを精製し、制限酵素
ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（宝酒造社製）で処理をして、
同様の制限酵素処理をしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＴ
４ ＤＮＡリガーゼにて遺伝子をつないでサブクローニ
ングした。
キメラ蛋白質（ＨＤＥＸＩｇ）発現ベクター 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドのＣ末にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ
部分のアミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードす
る遺伝子配列をｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクタ
ーを作製した。イムノグロブリンＦｃタンパクとの融合
タンパクの作製はＺｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌらの方法（Ｚ
ｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．，９，３４７−３５４，１９９０）にし
たがって、イントロンを含むゲノムＤＮＡを用いた遺伝
子を利用し、その遺伝子をＰＣＲ法を用いて作製した。
すなわち、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用
して、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ部分をコードする遺伝子配列を
制限酵素ＢａｍＨＩサイトのついた配列表の配列番号１
３の配列を有するオリゴヌクレオチド、制限酵素Ｘｂａ
Ｉサイトのついた配列表の配列番号１４の配列を有する
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを
行い、およそ１．４ｋｂｐのバンドを精製し、制限酵素
ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（宝酒造社製）で処理をして、
同様の制限酵素処理をしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＴ
４ ＤＮＡリガーゼにて遺伝子をつないでサブクローニ
ングした。
【００５３】その後、このプラスミドＤＮＡを精製し
て、シークエンスをして遺伝子配列を確認し、遺伝子配
列が確かにヒトＩｇＧ１の重鎖のヒンジ部分にあたるゲ
ノムＤＮＡであることを確認した（その配列はＫａｂａ
ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ ｐｕ
ｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ９１−３２４２，１９９１を
参照のこと）。以下、このプラスミドをｐＢＳｈＩｇＦ
ｃとする。次に、該ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテン
プレートとして用い、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｋｉｔを用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、す
なわち配列表の配列番号２の５２０番目のＧｌｙの後
に、制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加し、さらにその下
流に制限酵素ＸｂａＩおよびＭｌｕＩサイトを付加する
ために、配列表の配列番号１５と配列番号１６のオリゴ
ヌクレオチドにて、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋ
ｉｔを用い、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＭｌｕＩのサイト
の付加を行った。
て、シークエンスをして遺伝子配列を確認し、遺伝子配
列が確かにヒトＩｇＧ１の重鎖のヒンジ部分にあたるゲ
ノムＤＮＡであることを確認した（その配列はＫａｂａ
ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ ｐｕ
ｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ９１−３２４２，１９９１を
参照のこと）。以下、このプラスミドをｐＢＳｈＩｇＦ
ｃとする。次に、該ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテン
プレートとして用い、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｋｉｔを用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、す
なわち配列表の配列番号２の５２０番目のＧｌｙの後
に、制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加し、さらにその下
流に制限酵素ＸｂａＩおよびＭｌｕＩサイトを付加する
ために、配列表の配列番号１５と配列番号１６のオリゴ
ヌクレオチドにて、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋ
ｉｔを用い、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＭｌｕＩのサイト
の付加を行った。
【００５４】このベクターをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて
消化し、上記のｐＢＳｈＩｇＦｃをＸｂａＩ、ＢａｍＨ
Ｉにて消化し切り出されてくる約１２００ｂｐの遺伝子
断片をつないで最終的に目的の分泌型ヒトデルター１の
ＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質をコードする遺伝子断片を含
むベクターを作成した。最後に、このベクターをＥｃｏ
ＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３
０００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭ
ＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。この
ベクターをｐＨＤＥＸＩｇと命名した。
消化し、上記のｐＢＳｈＩｇＦｃをＸｂａＩ、ＢａｍＨ
Ｉにて消化し切り出されてくる約１２００ｂｐの遺伝子
断片をつないで最終的に目的の分泌型ヒトデルター１の
ＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質をコードする遺伝子断片を含
むベクターを作成した。最後に、このベクターをＥｃｏ
ＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３
０００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭ
ＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。この
ベクターをｐＨＤＥＸＩｇと命名した。
【００５５】４）全長型ヒトデルター１の蛋白質（ＨＤ
Ｆ）発現ベクター 配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１番から７０２番
のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロ
モーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクター
ｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして用
い、全長のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配
列番号３の７０２番目のＶａｌの後に終止コドン、更に
制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔを用い、配列表の配列番号１７及
び配列番号１８の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして、Ｃ末端に終止コドン、さらに
ＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターを
ＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてく
る約２２００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理し
たｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築し
た。このベクターをｐＨＤＦと命名した。
Ｆ）発現ベクター 配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１番から７０２番
のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロ
モーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクター
ｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして用
い、全長のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配
列番号３の７０２番目のＶａｌの後に終止コドン、更に
制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔを用い、配列表の配列番号１７及
び配列番号１８の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして、Ｃ末端に終止コドン、さらに
ＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターを
ＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてく
る約２２００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理し
たｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築し
た。このベクターをｐＨＤＦと命名した。
【００５６】５）全長型ヒトデルター１のＦＬＡＧキメ
ラ蛋白質（ＨＤＦＬＡＧ）発現ベクター 配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１番から７０２番
のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃ
ＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡ
を、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を
含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベク
ターを作製した。
ラ蛋白質（ＨＤＦＬＡＧ）発現ベクター 配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１番から７０２番
のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃ
ＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡ
を、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を
含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベク
ターを作製した。
【００５７】ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレー
トとして、カルボキシル末端部分にＦＬＡＧ配列を付加
し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを
付加するため同様に配列表の配列番号１９及び配列番号
１８の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝
子並びに終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行
った。このベクターからヒトデルター１の全長をコード
するＤＮＡを大腸菌ベクターｐＵＣ１９にクローニング
して全長ヒトデルター１をコードするベクターｐＵＣＤ
Ｌ−１Ｆを作製した。次に、このベクターをＥｃｏＲＩ
およびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約２２０
０ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩ
ＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベク
ターをｐＨＤＦＬＡＧと命名した。
トとして、カルボキシル末端部分にＦＬＡＧ配列を付加
し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを
付加するため同様に配列表の配列番号１９及び配列番号
１８の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝
子並びに終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行
った。このベクターからヒトデルター１の全長をコード
するＤＮＡを大腸菌ベクターｐＵＣ１９にクローニング
して全長ヒトデルター１をコードするベクターｐＵＣＤ
Ｌ−１Ｆを作製した。次に、このベクターをＥｃｏＲＩ
およびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約２２０
０ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩ
ＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベク
ターをｐＨＤＦＬＡＧと命名した。
【００５８】参考例４ 各種発現ベクターの細胞への遺伝子導入と発現 参考例３で作製した発現ベクターはＣＯＳ−７細胞（理
化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３
９）に遺伝子導入した。遺伝子導入前の細胞の培養はＤ
−ＭＥＭ（ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、米国ＧＩＢＣＯ
−ＢＲＬ社製）１０％ＦＣＳにて培養した。遺伝子導入
の前日に細胞の培地を交換し、細胞数を５×１０5 ｃｅ
ｌｌｓ／ｍｌにして一晩培養した。遺伝子導入の当日、
遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢＳ（−）にて２回遠
心洗浄後、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ＰＢＳ（−）に１×１
０7 ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにして細胞を調製し
た。遺伝子導入は米国Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製遺伝子導入装
置ジーンパルサーを用いたエレクトロポレーション法で
行った。上記の細胞懸濁液を５００μｌエレクトロポレ
ーション専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現ベクター
を２０μｇ加え、氷中で５分間放置した。その後、３μ
Ｆ，４５０Ｖの条件で２回電圧をかけ、その２回の間は
１分間室温で放置した。その後、氷中で５分間放置後、
上記の培地１０ｍｌをあらかじめ分注した直径１０ｃｍ
細胞培養用ディシュに細胞を播種し、３７℃、５％炭酸
ガスインキュベーターで培養した。
化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３
９）に遺伝子導入した。遺伝子導入前の細胞の培養はＤ
−ＭＥＭ（ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、米国ＧＩＢＣＯ
−ＢＲＬ社製）１０％ＦＣＳにて培養した。遺伝子導入
の前日に細胞の培地を交換し、細胞数を５×１０5 ｃｅ
ｌｌｓ／ｍｌにして一晩培養した。遺伝子導入の当日、
遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢＳ（−）にて２回遠
心洗浄後、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ＰＢＳ（−）に１×１
０7 ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにして細胞を調製し
た。遺伝子導入は米国Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製遺伝子導入装
置ジーンパルサーを用いたエレクトロポレーション法で
行った。上記の細胞懸濁液を５００μｌエレクトロポレ
ーション専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現ベクター
を２０μｇ加え、氷中で５分間放置した。その後、３μ
Ｆ，４５０Ｖの条件で２回電圧をかけ、その２回の間は
１分間室温で放置した。その後、氷中で５分間放置後、
上記の培地１０ｍｌをあらかじめ分注した直径１０ｃｍ
細胞培養用ディシュに細胞を播種し、３７℃、５％炭酸
ガスインキュベーターで培養した。
【００５９】その翌日、培養上清を除去し、ディッシュ
に付着した細胞をＰＢＳ（−）１０ｍｌで２回洗浄し、
発現ベクターｐＨＤＥＸ、ｐＨＤＥＸＦＬＡＧ、ｐＨＤ
ＥＸＩｇ、ｐＨＳＥＸの場合は無血清のＤ−ＭＥＭ１０
ｍｌを加えてさらに７日間培養し、培養上清を回収し、
セントリコン３０（米国アミコン社製）にてバッファー
をＰＢＳ（−）に置換すると同時に１０倍濃縮を行い、
細胞培養上清を得た。
に付着した細胞をＰＢＳ（−）１０ｍｌで２回洗浄し、
発現ベクターｐＨＤＥＸ、ｐＨＤＥＸＦＬＡＧ、ｐＨＤ
ＥＸＩｇ、ｐＨＳＥＸの場合は無血清のＤ−ＭＥＭ１０
ｍｌを加えてさらに７日間培養し、培養上清を回収し、
セントリコン３０（米国アミコン社製）にてバッファー
をＰＢＳ（−）に置換すると同時に１０倍濃縮を行い、
細胞培養上清を得た。
【００６０】また、ｐＨＤＦおよびｐＨＤＦＬＡＧの場
合は、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭに培地を交換し、
さらに３日間培養し、細胞破砕物を調製した。すなわ
ち、２×１０６個の細胞をセルリシスバッファー（５０
ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１％ Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ１００、１０％ グリセロール、４ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、５０μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１００μＭ
Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、２５μＭ Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ
Ａ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）２００μｌに懸濁し、氷中に２
０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍで２０分間遠心
し上清を取り細胞破砕物を得た。こうして得られたサン
プルを用いてウェスタンブロッティング法にて蛋白の発
現を確認した。
合は、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭに培地を交換し、
さらに３日間培養し、細胞破砕物を調製した。すなわ
ち、２×１０６個の細胞をセルリシスバッファー（５０
ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１％ Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ１００、１０％ グリセロール、４ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、５０μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１００μＭ
Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、２５μＭ Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ
Ａ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）２００μｌに懸濁し、氷中に２
０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍで２０分間遠心
し上清を取り細胞破砕物を得た。こうして得られたサン
プルを用いてウェスタンブロッティング法にて蛋白の発
現を確認した。
【００６１】すなわち、濃縮した培養上清もしくは細胞
破砕物を日本国ＡＣＩジャパン社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
用電気泳動槽及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミ
ドゲル（グラジエントゲル５〜１５％）を用い、添付の
取扱い説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった。
サンプルは２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を加
えて５分間の沸騰水浴加熱処理により還元処理を行った
ものと、この処理を行わない非還元状態のものを用い、
マーカーとしてはＡｍｅｒｓｈａｍ社製レインボーマー
カー（高分子量用）を用い、サンプルバッファー、泳動
バッファーについては添付の取扱い説明書に従って作製
した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、アクリルアミドゲルを
ＰＶＤＦメンブランフィルター（米国ＢｉｏＲａｄ社
製）に同社製ミニトランスブロットセルにより転写し
た。
破砕物を日本国ＡＣＩジャパン社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
用電気泳動槽及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミ
ドゲル（グラジエントゲル５〜１５％）を用い、添付の
取扱い説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった。
サンプルは２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を加
えて５分間の沸騰水浴加熱処理により還元処理を行った
ものと、この処理を行わない非還元状態のものを用い、
マーカーとしてはＡｍｅｒｓｈａｍ社製レインボーマー
カー（高分子量用）を用い、サンプルバッファー、泳動
バッファーについては添付の取扱い説明書に従って作製
した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、アクリルアミドゲルを
ＰＶＤＦメンブランフィルター（米国ＢｉｏＲａｄ社
製）に同社製ミニトランスブロットセルにより転写し
た。
【００６２】このように作製されたフィルターをブロッ
クエース（日本国大日本製薬社製）、ＴＢＳ−Ｔ（２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．
６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）に４℃一晩振盪して
ブロッキングした。ＥＣＬウェスタンブロッティング検
出システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に添付の説明書
に従い、目的の蛋白質がヒトデルター１由来の場合には
１次抗体として参考例６に記載した抗ヒトデルター１マ
ウスモノクローナル抗体を用い、ＦＬＡＧキメラの場合
は一次抗体としてマウスモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−
ＦＬＡＧ Ｍ２（米国コダック社製）を用い、二次抗体
としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（米国
Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。また、ＩｇＧキ
メラの場合は、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇヒツジ
抗体（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。
クエース（日本国大日本製薬社製）、ＴＢＳ−Ｔ（２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．
６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）に４℃一晩振盪して
ブロッキングした。ＥＣＬウェスタンブロッティング検
出システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に添付の説明書
に従い、目的の蛋白質がヒトデルター１由来の場合には
１次抗体として参考例６に記載した抗ヒトデルター１マ
ウスモノクローナル抗体を用い、ＦＬＡＧキメラの場合
は一次抗体としてマウスモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−
ＦＬＡＧ Ｍ２（米国コダック社製）を用い、二次抗体
としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（米国
Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。また、ＩｇＧキ
メラの場合は、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇヒツジ
抗体（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。
【００６３】抗体の反応時間は各々室温で一時間反応さ
せ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて１０分間室温で振盪洗浄
する操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィル
ターをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム
（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）の反応液に５分間浸し、
ポリ塩化ビニリデンラップに包んでＸ線フィルムに感光
させた。その結果、還元処理を行ったサンプルはｐＨＤ
ＥＸとｐＨＤＥＸＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白
質は約６５ｋダルトン、ｐＨＤＥＸＩｇの導入によって
得られた蛋白質は約９５ｋダルトン、ｐＨＤＦ、ｐＨＤ
ＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約８５ｋダル
トンのバンドを検出した。一方、非還元状態のサンプル
はｐＨＤＥＸＩｇを導入した場合、１２０ｋから２００
ｋダルトンの若干スメア状のバンドで主に約１８０ｋダ
ルトンのバンドを検出し、還元条件のほぼ２倍の分子量
であることから、２量体が形成されていることを確認し
た。
せ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて１０分間室温で振盪洗浄
する操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィル
ターをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム
（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）の反応液に５分間浸し、
ポリ塩化ビニリデンラップに包んでＸ線フィルムに感光
させた。その結果、還元処理を行ったサンプルはｐＨＤ
ＥＸとｐＨＤＥＸＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白
質は約６５ｋダルトン、ｐＨＤＥＸＩｇの導入によって
得られた蛋白質は約９５ｋダルトン、ｐＨＤＦ、ｐＨＤ
ＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約８５ｋダル
トンのバンドを検出した。一方、非還元状態のサンプル
はｐＨＤＥＸＩｇを導入した場合、１２０ｋから２００
ｋダルトンの若干スメア状のバンドで主に約１８０ｋダ
ルトンのバンドを検出し、還元条件のほぼ２倍の分子量
であることから、２量体が形成されていることを確認し
た。
【００６４】この実験では、コントロールとしてｐＭＫ
ＩＴＮｅｏベクターを導入したＣＯＳ−７細胞の細胞破
砕物および培養上清を同様に試験したが、抗ヒトデルタ
ー１マウスモノクローナル抗体、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ヒ
トＩｇ抗体に反応するバンドは検出されなかった。以上
の結果から、これら５種の発現ベクターはいずれも目的
のポリペプチドを生産することができた。
ＩＴＮｅｏベクターを導入したＣＯＳ−７細胞の細胞破
砕物および培養上清を同様に試験したが、抗ヒトデルタ
ー１マウスモノクローナル抗体、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ヒ
トＩｇ抗体に反応するバンドは検出されなかった。以上
の結果から、これら５種の発現ベクターはいずれも目的
のポリペプチドを生産することができた。
【００６５】参考例５ 遺伝子導入細胞による分泌型ヒトデルター１蛋白質の精
製 参考例４の方法で発現が検出されたＨＤＥＸＦＬＡＧお
よびＨＤＥＸＩｇを含むＣＯＳ−７細胞培養上清を大量
調製し、アフィニティーカラムによって各々のキメラ蛋
白質を精製した。ＨＤＥＸＦＬＡＧに関しては、参考例
４に記載した方法によって取得した２リットルの培養上
清をＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇ
ｅｌ（米国コダック社製）を充填したカラムに通して、
キメラ蛋白質が有するＦＬＡＧ配列とゲルのＡｎｔｉ−
ＦＬＡＧ抗体のアフィニティーによりキメラ蛋白質をカ
ラムに吸着させた。カラムは内径１０ｍｍのディスポカ
ラム（米国ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、上記ゲルを５ｍ
ｌ充填した。吸着は培地ボトル→カラム→ペリスターポ
ンプ→培地ボトルの環流式回路を組み立て、流速１ｍｌ
／分で７２時間循環させた。その後、カラムをＰＢＳ
（−）３５ｍｌで洗浄し、０．５ＭＴｒｉｓ−グリシン
（ｐＨ３．０）５０ｍｌで溶出した。あらかじめ小チュ
ーブ（米国ファルコン社製２０６３）に０．５ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌ分注しておき、
溶出液は２ｍｌずつ２５画分をそのチューブに分取し、
各々の画分を中和した。
製 参考例４の方法で発現が検出されたＨＤＥＸＦＬＡＧお
よびＨＤＥＸＩｇを含むＣＯＳ−７細胞培養上清を大量
調製し、アフィニティーカラムによって各々のキメラ蛋
白質を精製した。ＨＤＥＸＦＬＡＧに関しては、参考例
４に記載した方法によって取得した２リットルの培養上
清をＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇ
ｅｌ（米国コダック社製）を充填したカラムに通して、
キメラ蛋白質が有するＦＬＡＧ配列とゲルのＡｎｔｉ−
ＦＬＡＧ抗体のアフィニティーによりキメラ蛋白質をカ
ラムに吸着させた。カラムは内径１０ｍｍのディスポカ
ラム（米国ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、上記ゲルを５ｍ
ｌ充填した。吸着は培地ボトル→カラム→ペリスターポ
ンプ→培地ボトルの環流式回路を組み立て、流速１ｍｌ
／分で７２時間循環させた。その後、カラムをＰＢＳ
（−）３５ｍｌで洗浄し、０．５ＭＴｒｉｓ−グリシン
（ｐＨ３．０）５０ｍｌで溶出した。あらかじめ小チュ
ーブ（米国ファルコン社製２０６３）に０．５ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌ分注しておき、
溶出液は２ｍｌずつ２５画分をそのチューブに分取し、
各々の画分を中和した。
【００６６】上記の方法で精製された分泌型ＦＬＡＧキ
メラ蛋白質の溶出画分の各１０μｌは参考例４に記載の
還元処理を行い、５−１５％濃度勾配ポリアクリルアミ
ドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、電気泳
動終了後、日本国和光純薬社製ワコー銀染キットＩＩを
用いて、添付の説明書に従って銀染色を行った。結果と
して、ＨＳＦＬＡＧは第４番から第８番の溶出画分にバ
ンドが検出され、この分子量は抗ＦＬＡＧ抗体によるウ
ェスタンブロッティングの結果とＨＤＥＸＦＬＡＧとも
一致した。この結果からＨＤＥＸＦＬＡＧの純品が精製
された。
メラ蛋白質の溶出画分の各１０μｌは参考例４に記載の
還元処理を行い、５−１５％濃度勾配ポリアクリルアミ
ドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、電気泳
動終了後、日本国和光純薬社製ワコー銀染キットＩＩを
用いて、添付の説明書に従って銀染色を行った。結果と
して、ＨＳＦＬＡＧは第４番から第８番の溶出画分にバ
ンドが検出され、この分子量は抗ＦＬＡＧ抗体によるウ
ェスタンブロッティングの結果とＨＤＥＸＦＬＡＧとも
一致した。この結果からＨＤＥＸＦＬＡＧの純品が精製
された。
【００６７】ＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質、すなわちＨＤ
ＥＸＩｇに関しては、ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様の操
作で培養上清の２リットルをスウェーデン国ファルマシ
ア社製Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセファロースカラムに吸着さ
せ、溶出画分を分取した。ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様
に溶出液の一部を用いて、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動および銀染色により溶出画分の決定、サイズ
の確認、純度検定を行った。結果として、溶出画分の第
４番から第１５番にバンドが検出され、サイズは抗ヒト
Ｉｇ抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果とＨ
ＤＥＸＩｇとも一致した。この結果からＨＤＥＸＩｇの
純品が精製された。
ＥＸＩｇに関しては、ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様の操
作で培養上清の２リットルをスウェーデン国ファルマシ
ア社製Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセファロースカラムに吸着さ
せ、溶出画分を分取した。ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様
に溶出液の一部を用いて、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動および銀染色により溶出画分の決定、サイズ
の確認、純度検定を行った。結果として、溶出画分の第
４番から第１５番にバンドが検出され、サイズは抗ヒト
Ｉｇ抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果とＨ
ＤＥＸＩｇとも一致した。この結果からＨＤＥＸＩｇの
純品が精製された。
【００６８】参考例６ ヒトデルター１を認識する抗体作成 参考例５に記載の方法で精製されたＨＤＥＸＦＬＡＧを
免疫原としてウサギに免疫して、抗体価の測定後、全血
の採血を行い、血清を採取して、米国ＢｉｏＲａｄ社製
のエコノパック血清ＩｇＧ精製キットを用いて、添付の
取扱い説明書に従って、抗ヒトデルター１ウサギポリク
ローナル抗体を精製して作製した。また、参考例５に記
載した方法で精製されたＨＤＥＸＦＬＡＧを免疫原とし
て、成書の方法に従いマウスモノクローナル抗体を作成
した。すなわち、上記のように精製されたＨＤＥＸＦＬ
ＡＧを各々にＢａｌｂ／ｃマウス（日本国日本エスエル
シー社製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免疫し
た。２回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上
昇を認めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓
細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａ
ｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）とポリエチレングリコール
法にて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（日本国免疫生物
研究所製）にてハイブリドーマを選択し、酵素抗体法に
てヒトデルター１の細胞外部分を認識する抗体を培地中
に産生しているハイブリドーマ株を分離し、ヒトデルタ
ー１を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ産生株が樹立された。
免疫原としてウサギに免疫して、抗体価の測定後、全血
の採血を行い、血清を採取して、米国ＢｉｏＲａｄ社製
のエコノパック血清ＩｇＧ精製キットを用いて、添付の
取扱い説明書に従って、抗ヒトデルター１ウサギポリク
ローナル抗体を精製して作製した。また、参考例５に記
載した方法で精製されたＨＤＥＸＦＬＡＧを免疫原とし
て、成書の方法に従いマウスモノクローナル抗体を作成
した。すなわち、上記のように精製されたＨＤＥＸＦＬ
ＡＧを各々にＢａｌｂ／ｃマウス（日本国日本エスエル
シー社製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免疫し
た。２回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上
昇を認めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓
細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａ
ｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）とポリエチレングリコール
法にて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（日本国免疫生物
研究所製）にてハイブリドーマを選択し、酵素抗体法に
てヒトデルター１の細胞外部分を認識する抗体を培地中
に産生しているハイブリドーマ株を分離し、ヒトデルタ
ー１を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ産生株が樹立された。
【００６９】このようにして樹立されたハイブリドーマ
の培養上清をスウェーデン国ファルマシア社製Ｍａｂ
ＴｒａｐＧ ＩＩを用いて、添付の取扱い説明書に従っ
て、抗ヒトデルター１モノクローナル抗体を精製し作製
した。このモノクローナル抗体を用いてアフィニティー
カラムを作製した。アフィニティーカラムの作製はスウ
ェーデン国ファルマシア社製ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ４Ｂにて添付の取扱い説明書に従い行った。こ
のゲルの２ｍｌを２ｃｍ×１ｃｍのサイズのカラムを作
製した。
の培養上清をスウェーデン国ファルマシア社製Ｍａｂ
ＴｒａｐＧ ＩＩを用いて、添付の取扱い説明書に従っ
て、抗ヒトデルター１モノクローナル抗体を精製し作製
した。このモノクローナル抗体を用いてアフィニティー
カラムを作製した。アフィニティーカラムの作製はスウ
ェーデン国ファルマシア社製ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ４Ｂにて添付の取扱い説明書に従い行った。こ
のゲルの２ｍｌを２ｃｍ×１ｃｍのサイズのカラムを作
製した。
【００７０】抗ヒトデルター１モノクローナル抗体を結
合させたカラムに対してはｐＨＤＥＸを遺伝子導入した
ＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液を２０ｍｌ／ｈｒの速度
で流し、その後同一速度でＰＢＳ（−）を１５ｍｌ流し
て洗浄し、最終的に０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ
ＮａＣｌ（ＰＨ４．０）にて溶出した。この溶離液を１
ｍｌづつ分取し、各画分に１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
９．５）を２００μｌづつ加えて、中和した。さらに参
考例５に記載の方法に従って、精製蛋白質を還元条件下
でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色、及びウエスタンブ
ロッティングを行ない、分子量の推定を行った。この結
果、ｐＨＤＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上
清濃縮液からは約６５ｋダルトンのＨＤＥＸが精製され
ていることが確認され、アフィニティーカラムでヒトデ
ルター１が精製可能であることが明らかとなった。
合させたカラムに対してはｐＨＤＥＸを遺伝子導入した
ＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液を２０ｍｌ／ｈｒの速度
で流し、その後同一速度でＰＢＳ（−）を１５ｍｌ流し
て洗浄し、最終的に０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ
ＮａＣｌ（ＰＨ４．０）にて溶出した。この溶離液を１
ｍｌづつ分取し、各画分に１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
９．５）を２００μｌづつ加えて、中和した。さらに参
考例５に記載の方法に従って、精製蛋白質を還元条件下
でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色、及びウエスタンブ
ロッティングを行ない、分子量の推定を行った。この結
果、ｐＨＤＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上
清濃縮液からは約６５ｋダルトンのＨＤＥＸが精製され
ていることが確認され、アフィニティーカラムでヒトデ
ルター１が精製可能であることが明らかとなった。
【００７１】実施例１ ヒトノッチリガンドの血管内皮細胞増殖に及ぼす変化 血管内皮細胞は、日本国クラボウ社製の正常ヒト大動脈
血管内皮細胞と正常ヒト肺動脈血管内皮細胞のそれぞれ
４次継代培養細胞を用いた。細胞は、３次培養の継代時
に組織培養用９６ウェルプレート（米国ファルコン社
製）に５０００細胞数／ウェルずつ蒔き、日本国クラボ
ウ社製のヒトリコンビナントＥＧＦを１０ｎｇ／ｍｌ，
ヒトリコンビナントＦＧＦ−Ｂを５ｎｇ／ｍｌ各々含有
する低血清血管内皮細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ−
ＥＧ２、日本国クラボウ社製）中で培養し、その際、最
終的に１μｇ／ｍｌの濃度となるようにヒトノッチリガ
ンドのヒトデルター１細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＤＥ
ＸＩｇ）を加え、比較区にはＩｇＧＦｃ部分の影響を見
るため、ヒトＩｇＧ１（米国Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を同濃度
加えた。尚、対照はＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２以外の添加
蛋白質無しの条件で培養を行った。培養は３７℃，５％
炭酸ガス，１００％湿度雰囲気下で３日間行った後、細
胞を計数した。
血管内皮細胞と正常ヒト肺動脈血管内皮細胞のそれぞれ
４次継代培養細胞を用いた。細胞は、３次培養の継代時
に組織培養用９６ウェルプレート（米国ファルコン社
製）に５０００細胞数／ウェルずつ蒔き、日本国クラボ
ウ社製のヒトリコンビナントＥＧＦを１０ｎｇ／ｍｌ，
ヒトリコンビナントＦＧＦ−Ｂを５ｎｇ／ｍｌ各々含有
する低血清血管内皮細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ−
ＥＧ２、日本国クラボウ社製）中で培養し、その際、最
終的に１μｇ／ｍｌの濃度となるようにヒトノッチリガ
ンドのヒトデルター１細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＤＥ
ＸＩｇ）を加え、比較区にはＩｇＧＦｃ部分の影響を見
るため、ヒトＩｇＧ１（米国Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を同濃度
加えた。尚、対照はＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２以外の添加
蛋白質無しの条件で培養を行った。培養は３７℃，５％
炭酸ガス，１００％湿度雰囲気下で３日間行った後、細
胞を計数した。
【００７２】血管内皮細胞の計数は、Ｂｏｒｅｎｆｒｅ
ｕｎｄとＰｕｅｒｎｅｒ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｉ
ｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９
（１），７−９，１９８４）によって開発された方法、
すなわち、生体染色色素のｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ（３
−ａｍｉｎｏ−７−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−
ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ）が生きている細胞においてのみ原形質膜を通
りリソソームに蓄積されることを利用したニューラルレ
ッド法を原理とした日本国クラボウ社製のＮＲ試薬セッ
トを用い、５４０ｎｍの吸光度は日本国日本インターメ
ッド社製イムノリーダー（ＮＪ−２０００）で測定し
た。その結果を図１に示す。図１の（ａ）は大動脈血管
内皮細胞の場合であり、（ｂ）は肺動脈血管内皮細胞の
場合である。縦軸には添加した蛋白質別に各カラムの種
類を示し、横軸は５４０ｎｍの吸光度の値を示す。これ
らの結果から、ＨＤＥＸＩｇは、比較区に対して有意に
血管内皮細胞の増殖を抑制することがわかった。
ｕｎｄとＰｕｅｒｎｅｒ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｉ
ｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９
（１），７−９，１９８４）によって開発された方法、
すなわち、生体染色色素のｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ（３
−ａｍｉｎｏ−７−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−
ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ）が生きている細胞においてのみ原形質膜を通
りリソソームに蓄積されることを利用したニューラルレ
ッド法を原理とした日本国クラボウ社製のＮＲ試薬セッ
トを用い、５４０ｎｍの吸光度は日本国日本インターメ
ッド社製イムノリーダー（ＮＪ−２０００）で測定し
た。その結果を図１に示す。図１の（ａ）は大動脈血管
内皮細胞の場合であり、（ｂ）は肺動脈血管内皮細胞の
場合である。縦軸には添加した蛋白質別に各カラムの種
類を示し、横軸は５４０ｎｍの吸光度の値を示す。これ
らの結果から、ＨＤＥＸＩｇは、比較区に対して有意に
血管内皮細胞の増殖を抑制することがわかった。
【００７３】実施例２ 薬剤の作製 参考例５及び６において作製した各種ポリペプチド１ｍ
ｇに対して人血清アルブミン（ミドリ十字社製）５ｍｇ
となるように１ｍｌの蒸留水に溶解し、０．２２μｍの
滅菌フィルターにて濾過滅菌後、バイアル瓶に分注して
凍結乾燥して作製した。
ｇに対して人血清アルブミン（ミドリ十字社製）５ｍｇ
となるように１ｍｌの蒸留水に溶解し、０．２２μｍの
滅菌フィルターにて濾過滅菌後、バイアル瓶に分注して
凍結乾燥して作製した。
【００７４】
【発明の効果】本発明のノッチリガンド分子は血管細胞
にとって有効な化学品となり、医薬品、医療品として使
用が可能である。
にとって有効な化学品となり、医薬品、医療品として使
用が可能である。
【００７５】配列番号：１ 配列の長さ：２００ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe Val Asn Lys Lys Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Pro 20 25 30 Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His Tyr Gln Ala 35 40 45 Ser Val Ser Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly Ser Ala Val Thr Pro 50 55 60 Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp Gly Gly Gly Ala Asp 65 70 75 80 Ser Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe Gly Phe Thr Trp Pro 85 90 95 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His Thr Asp Ser Pro Asp 100 105 110 Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile Ser Arg Leu Ala Thr 115 120 125 Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser Gln Asp Leu His Ser 130 135 140 Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg Phe Val Cys Asp Glu 145 150 155 160 His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys Arg Pro Arg Asp Asp 165 170 175 Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Val Cys Asn 180 185 190 Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys 195 200
【００７６】配列番号：２ 配列の長さ：５２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe Val Asn Lys Lys Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Pro 20 25 30 Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His Tyr Gln Ala 35 40 45 Ser Val Ser Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly Ser Ala Val Thr Pro 50 55 60 Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp Gly Gly Gly Ala Asp 65 70 75 80 Ser Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe Gly Phe Thr Trp Pro 85 90 95 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His Thr Asp Ser Pro Asp 100 105 110 Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile Ser Arg Leu Ala Thr 115 120 125 Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser Gln Asp Leu His Ser 130 135 140 Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg Phe Val Cys Asp Glu 145 150 155 160 His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys Arg Pro Arg Asp Asp 165 170 175 Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Val Cys Asn 180 185 190 Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro Ile Cys Leu Pro Gly 195 200 205 Cys Asp Glu Gln His Gly Phe Cys Asp Lys Pro Gly Glu Cys Lys Cys 210 215 220 Arg Val Gly Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu Cys Ile Arg Tyr Pro 225 230 235 240 Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp Gln Cys Asn Cys Gln 245 250 255 Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp Leu Asn Tyr Cys Thr 260 265 270 His His Lys Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Thr Asn Thr Gly Gln 275 280 285 Gly Ser Tyr Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Ala Thr Cys 290 295 300 Glu Leu Gly Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro Cys Lys Asn Gly Gly 305 310 315 320 Ser Cys Thr Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly 325 330 335 Phe Tyr Gly Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met Thr Cys Ala Asp Gly 340 345 350 Pro Cys Phe Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser Pro Asp Gly Gly Tyr 355 360 365 Ser Cys Arg Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Phe Asn Cys Glu Lys Lys 370 375 380 Ile Asp Tyr Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn Gly Ala Lys Cys Val 385 390 395 400 Asp Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gln Ala Gly Phe Ser Gly 405 410 415 Arg His Cys Asp Asp Asn Val Asp Asp Cys Ala Ser Ser Pro Cys Ala 420 425 430 Asn Gly Gly Thr Cys Arg Asp Gly Val Asn Asp Phe Ser Cys Thr Cys 435 440 445 Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Ser Ala Pro Val Ser Arg Cys 450 455 460 Glu His Ala Pro Cys His Asn Gly Ala Thr Cys His Glu Arg Gly His 465 470 475 480 Arg Tyr Val Cys Glu Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Gly Pro Asn Cys Gln 485 490 495 Phe Leu Leu Pro Glu Leu Pro Pro Gly Pro Ala Val Val Asp Leu Thr 500 505 510 515 520
【００７７】配列番号：３ 配列の長さ：７０２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe Val Asn Lys Lys Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Pro 20 25 30 Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His Tyr Gln Ala 35 40 45 Ser Val Ser Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly Ser Ala Val Thr Pro 50 55 60 Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp Gly Gly Gly Ala Asp 65 70 75 80 Ser Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe Gly Phe Thr Trp Pro 85 90 95 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His Thr Asp Ser Pro Asp 100 105 110 Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile Ser Arg Leu Ala Thr 115 120 125 Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser Gln Asp Leu His Ser 130 135 140 Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg Phe Val Cys Asp Glu 145 150 155 160 His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys Arg Pro Arg Asp Asp 165 170 175 Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Val Cys Asn 180 185 190 Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro Ile Cys Leu Pro Gly 195 200 205 Cys Asp Glu Gln His Gly Phe Cys Asp Lys Pro Gly Glu Cys Lys Cys 210 215 220 Arg Val Gly Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu Cys Ile Arg Tyr Pro 225 230 235 240 Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp Gln Cys Asn Cys Gln 245 250 255 Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp Leu Asn Tyr Cys Thr 260 265 270 His His Lys Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Thr Asn Thr Gly Gln 275 280 285 Gly Ser Tyr Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Ala Thr Cys 290 295 300 Glu Leu Gly Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro Cys Lys Asn Gly Gly 305 310 315 320 Ser Cys Thr Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly 325 330 335 Phe Tyr Gly Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met Thr Cys Ala Asp Gly 340 345 350 Pro Cys Phe Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser Pro Asp Gly Gly Tyr 355 360 365 Ser Cys Arg Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Phe Asn Cys Glu Lys Lys 370 375 380 Ile Asp Tyr Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn Gly Ala Lys Cys Val 385 390 395 400 Asp Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gln Ala Gly Phe Ser Gly 405 410 415 Arg His Cys Asp Asp Asn Val Asp Asp Cys Ala Ser Ser Pro Cys Ala 420 425 430 Asn Gly Gly Thr Cys Arg Asp Gly Val Asn Asp Phe Ser Cys Thr Cys 435 440 445 Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Ser Ala Pro Val Ser Arg Cys 450 455 460 Glu His Ala Pro Cys His Asn Gly Ala Thr Cys His Glu Arg Gly His 465 470 475 480 Arg Tyr Val Cys Glu Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Gly Pro Asn Cys Gln 485 490 495 Phe Leu Leu Pro Glu Leu Pro Pro Gly Pro Ala Val Val Asp Leu Thr 500 505 510 Glu Lys Leu Glu Gly Gln Gly Gly Pro Phe Pro Trp Val Ala Val Cys 515 520 525 Ala Gly Val Ile Leu Val Leu Met Leu Leu Leu Gly Cys Ala Ala Val 530 535 540 Val Val Cys Val Arg Leu Arg Leu Gln Lys His Arg Pro Pro Ala Asp 545 550 555 560 Pro Cys Arg Gly Glu Thr Glu Thr Met Asn Asn Leu Ala Asn Cys Gln 565 570 575 Arg Glu Lys Asp Ile Ser Val Ser Ile Ile Gly Ala Thr Gln Ile Lys 580 585 590 Asn Thr Asn Lys Lys Ala Asp Phe His Gly Asp His Ser Ala Asp Lys 595 600 605 Asn Gly Phe Lys Ala Arg Tyr Pro Ala Val Asp Tyr Asn Leu Val Gln 610 615 620 Asp Leu Lys Gly Asp Asp Thr Ala Val Arg Asp Ala His Ser Lys Arg 625 630 635 640 Asp Thr Lys Cys Gln Pro Gln Gly Ser Ser Gly Glu Glu Lys Gly Thr 645 650 655 Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Glu Ala Ser Glu Arg Lys Arg Pro Asp 660 665 670 Ser Gly Cys Ser Thr Ser Lys Asp Thr Lys Tyr Gln Ser Val Tyr Val 675 680 685 Ile Ser Glu Glu Lys Asp Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val 690 695 700
【００７８】配列番号：４ 配列の長さ：２６６３及び７２３ 配列の型：核酸及びアミノ酸 鎖の数：二本鎖及び一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ、及びアミノ酸 起源 生物名：ヒト 配列 CTTGGGAA GAGGCGGAGA CCGGCTTTTA AAGAAAGAAG TCCTGGGTCC TGCGGTCTGG 58 GGCGAGGCAA GGGCGCTTTT CTGCCCACGC TCCCCGTGGC CCATCGATCC CCCGCGCGTC 118 CGCCGCTGTT CTAAGGAGAG AAGTGGGGGC CCCCCAGGCT CGCGCGTGGA GCGAAGCAGC 178 ATG GGC AGT CGG TGC GCG CTG GCC CTG GCG GTG CTC TCG GCC TTG CTG 226 Met Gly Ser Arg Cys Ala Leu Ala Leu Ala Val Leu Ser Ala Leu Leu -20 -15 -10 TGT CAG GTC TGG AGC TCT GGG GTG TTC GAA CTG AAG CTG CAG GAG TTC 274 Cys Gln Val Trp Ser Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe -5 -1 1 5 10 GTC AAC AAG AAG GGG CTG CTG GGG AAC CGC AAC TGC TGC CGC GGG GGC 322 Val Asn Lys Lys Gly Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly 15 20 25 GCG GGG CCA CCG CCG TGC GCC TGC CGG ACC TTC TTC CGC GTG TGC CTC 370 Ala Gly Pro Pro Pro Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu 30 35 40 AAG CAC TAC CAG GCC AGC GTG TCC CCC GAG CCG CCC TGC ACC TAC GGC 418 Lys His Tyr Gln Ala Ser Val Ser Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly 45 50 55 AGC GCC GTC ACC CCC GTG CTG GGC GTC GAC TCC TTC AGT CTG CCC GAC 466 Ser Ala Val Thr Pro Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp 60 65 70 75 GGC GGG GGC GCC GAC TCC GCG TTC AGC AAC CCC ATC CGC TTC CCC TTC 514 Gly Gly Gly Ala Asp Ser Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe 80 85 90 GGC TTC ACC TGG CCG GGC ACC TTC TCT CTG ATT ATT GAA GCT CTC CAC 562 Gly Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His 95 100 105 ACA GAT TCT CCT GAT GAC CTC GCA ACA GAA AAC CCA GAA AGA CTC ATC 610 Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile 110 115 120 AGC CGC CTG GCC ACC CAG AGG CAC CTG ACG GTG GGC GAG GAG TGG TCC 658 Ser Arg Leu Ala Thr Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser 125 130 135 CAG GAC CTG CAC AGC AGC GGC CGC ACG GAC CTC AAG TAC TCC TAC CGC 706 Gln Asp Leu His Ser Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg 140 145 150 155 TTC GTG TGT GAC GAA CAC TAC TAC GGA GAG GGC TGC TCC GTT TTC TGC 754 Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys 160 165 170 CGT CCC CGG GAC GAT GCC TTC GGC CAC TTC ACC TGT GGG GAG CGT GGG 802 Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly 175 180 185 GAG AAA GTG TGC AAC CCT GGC TGG AAA GGG CCC TAC TGC ACA GAG CCG 850 Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro 190 195 200 ATC TGC CTG CCT GGA TGT GAT GAG CAG CAT GGA TTT TGT GAC AAA CCA 898 Ile Cys Leu Pro Gly Cys Asp Glu Gln His Gly Phe Cys Asp Lys Pro 205 210 215 GGG GAA TGC AAG TGC AGA GTG GGC TGG CAG GGC CGG TAC TGT GAC GAG 946 Gly Glu Cys Lys Cys Arg Val Gly Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu 220 225 230 235 TGT ATC CGC TAT CCA GGC TGT CTC CAT GGC ACC TGC CAG CAG CCC TGG 994 Cys Ile Arg Tyr Pro Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp 240 245 250 CAG TGC AAC TGC CAG GAA GGC TGG GGG GGC CTT TTC TGC AAC CAG GAC 1042 Gln Cys Asn Cys Gln Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp 255 260 265 CTG AAC TAC TGC ACA CAC CAT AAG CCC TGC AAG AAT GGA GCC ACC TGC 1090 Leu Asn Tyr Cys Thr His His Lys Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys 270 275 280 ACC AAC ACG GGC CAG GGG AGC TAC ACT TGC TCT TGC CGG CCT GGG TAC 1138 Thr Asn Thr Gly Gln Gly Ser Tyr Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr 285 290 295 ACA GGT GCC ACC TGC GAG CTG GGG ATT GAC GAG TGT GAC CCC AGC CCT 1186 Thr Gly Ala Thr Cys Glu Leu Gly Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro 300 305 310 315 TGT AAG AAC GGA GGG AGC TGC ACG GAT CTC GAG AAC AGC TAC TCC TGT 1234 Cys Lys Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys 320 325 330 ACC TGC CCA CCC GGC TTC TAC GGC AAA ATC TGT GAA TTG AGT GCC ATG 1282 Thr Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Gly Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met 335 340 345 ACC TGT GCG GAC GGC CCT TGC TTT AAC GGG GGT CGG TGC TCA GAC AGC 1330 Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser 350 355 360 CCC GAT GGA GGG TAC AGC TGC CGC TGC CCC GTG GGC TAC TCC GGC TTC 1378 Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Cys Arg Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Phe 365 370 375 AAC TGT GAG AAG AAA ATT GAC TAC TGC AGC TCT TCA CCC TGT TCT AAT 1426 Asn Cys Glu Lys Lys Ile Asp Tyr Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn 380 385 390 395 GGT GCC AAG TGT GTG GAC CTC GGT GAT GCC TAC CTG TGC CGC TGC CAG 1474 Gly Ala Lys Cys Val Asp Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gln 400 405 410 GCC GGC TTC TCG GGG AGG CAC TGT GAC GAC AAC GTG GAC GAC TGC GCC 1522 Ala Gly Phe Ser Gly Arg His Cys Asp Asp Asn Val Asp Asp Cys Ala 415 420 425 TCC TCC CCG TGC GCC AAC GGG GGC ACC TGC CGG GAT GGC GTG AAC GAC 1570 Ser Ser Pro Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Arg Asp Gly Val Asn Asp 430 435 440 TTC TCC TGC ACC TGC CCG CCT GGC TAC ACG GGC AGG AAC TGC AGT GCC 1618 Phe Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Ser Ala 445 450 455 CCC GTC AGC AGG TGC GAG CAC GCA CCC TGC CAC AAT GGG GCC ACC TGC 1666 Pro Val Ser Arg Cys Glu His Ala Pro Cys His Asn Gly Ala Thr Cys 460 465 470 475 CAC GAG AGG GGC CAC CGC TAT GTG TGC GAG TGT GCC CGA GGC TAC GGG 1714 His Glu Arg Gly His Arg Tyr Val Cys Glu Cys Ala Arg Gly Tyr Gly 480 485 490 GGT CCC AAC TGC CAG TTC CTG CTC CCC GAG CTG CCC CCG GGC CCA GCG 1762 Gly Pro Asn Cys Gln Phe Leu Leu Pro Glu Leu Pro Pro Gly Pro Ala 495 500 505 GTG GTG GAC CTC ACT GAG AAG CTA GAG GGC CAG GGC GGG CCA TTC CCC 1810 Val Val Asp Leu Thr Glu Lys Leu Glu Gly Gln Gly Gly Pro Phe Pro 510 515 520 TGG GTG GCC GTG TGC GCC GGG GTC ATC CTT GTC CTC ATG CTG CTG CTG 1858 Trp Val Ala Val Cys Ala Gly Val Ile Leu Val Leu Met Leu Leu Leu 525 530 535 GGC TGT GCC GCT GTG GTG GTC TGC GTC CGG CTG AGG CTG CAG AAG CAC 1906 Gly Cys Ala Ala Val Val Val Cys Val Arg Leu Arg Leu Gln Lys His 540 545 550 555 CGG CCC CCA GCC GAC CCC TGC CGG GGG GAG ACG GAG ACC ATG AAC AAC 1954 Arg Pro Pro Ala Asp Pro Cys Arg Gly Glu Thr Glu Thr Met Asn Asn 560 565 570 CTG GCC AAC TGC CAG CGT GAG AAG GAC ATC TCA GTC AGC ATC ATC GGG 2002 Leu Ala Asn Cys Gln Arg Glu Lys Asp Ile Ser Val Ser Ile Ile Gly 575 580 585 GCC ACG CAG ATC AAG AAC ACC AAC AAG AAG GCG GAC TTC CAC GGG GAC 2050 Ala Thr Gln Ile Lys Asn Thr Asn Lys Lys Ala Asp Phe His Gly Asp 590 595 600 CAC AGC GCC GAC AAG AAT GGC TTC AAG GCC CGC TAC CCA GCG GTG GAC 2098 His Ser Ala Asp Lys Asn Gly Phe Lys Ala Arg Tyr Pro Ala Val Asp 605 610 615 TAT AAC CTC GTG CAG GAC CTC AAG GGT GAC GAC ACC GCC GTC AGG GAC 2146 Tyr Asn Leu Val Gln Asp Leu Lys Gly Asp Asp Thr Ala Val Arg Asp 620 625 630 635 GCG CAC AGC AAG CGT GAC ACC AAG TGC CAG CCC CAG GGC TCC TCA GGG 2194 Ala His Ser Lys Arg Asp Thr Lys Cys Gln Pro Gln Gly Ser Ser Gly 640 645 650 GAG GAG AAG GGG ACC CCG ACC ACA CTC AGG GGT GGA GAA GCA TCT GAA 2242 Glu Glu Lys Gly Thr Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Glu Ala Ser Glu 655 660 665 AGA AAA AGG CCG GAC TCG GGC TGT TCA ACT TCA AAA GAC ACC AAG TAC 2290 Arg Lys Arg Pro Asp Ser Gly Cys Ser Thr Ser Lys Asp Thr Lys Tyr 670 675 680 CAG TCG GTG TAC GTC ATA TCC GAG GAG AAG GAT GAG TGC GTC ATA GCA 2338 Gln Ser Val Tyr Val Ile Ser Glu Glu Lys Asp Glu Cys Val Ile Ala 685 690 695 ACT GAG GTG 2347 Thr Glu Val 700 TAAAATGGAA GTGAGATGGC AAGACTCCCG TTTCTCTTAA AATAAGTAAA ATTCCAAGGA 2407 TATATGCCCC AACGAATGCT GCTGAAGAGG AGGGAGGCCT CGTGGACTGC TGCTGAGAAA 2467 CCGAGTTCAG ACCGAGCAGG TTCTCCTCCT GAGGTCCTCG ACGCCTGCCG ACAGCCTGTC 2527 GCGGCCCGGC CGCCTGCGGC ACTGCCTTCC GTGACGTCGC CGTTGCACTA TGGACAGTTG 2587 CTCTTAAGAG AATATATATT TAAATGGGTG AACTGAATTA CGCATAAGAA GCATGCACTG 2647 CCTGAGTGTA TATTTT 2663
【００７９】配列番号：５ 配列の長さ：２７及び８ 配列の型：核酸及びアミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ及びアミノ酸 起源：化学合成法による
【００８０】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 TGGCARTGYA AYTGYCARGA
【００８１】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 ATYTTYTTYT CRCARTTRAA
【００８２】配列番号：８ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 TCGCGCGTGG AGCGAAGCAG CATGG
【００８３】配列番号：９ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 GGAATTCGAT ATCAAGCTTA TCGAT
【００８４】配列番号：１０ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 TCACCCGCCC TGGCCCTCTA GCTTCTCA
【００８５】配列番号：１１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 GGACGCGTGG ATCCACTAGT TCTAGAGC
【００８６】配列番号：１２ 配列の長さ：５５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 TCATTTATCA TCATCATCTT TATAATCCCC GCCCTGGCCC TCTAGCTTCT CAGTG
【００８７】配列番号：１３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 AAGGATCCCG AGGGTGTCTG CTGGAAGCCA GGCTCA
【００８８】配列番号：１４ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 CCTCTAGAGT CGCGGCCGTC GCACTCATTT ACC
【００８９】配列番号：１５ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 AAGGATCCCC GCCCTGGCCC TCTAGCTTC
【００９０】配列番号：１６ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 CCTCTAGACG CGTAGAGCGG CCGCCACCGC GGTGGA
【００９１】配列番号：１７ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 TCACACCTCA GTTGCTATGA CGCAC
【００９２】配列番号：１８ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 GGACGCGTGG ATCCACTAGT TCTAGAGC
【００９３】配列番号：１９ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：化学合成法による 配列 TCATTTATCA TCATCATCTT TATAATCCAC CTCAGTTGCT ATGACGCACT C
【図１】本発明分子の血管内皮細胞の増殖抑制を示すヒ
ストグラムである。
ストグラムである。
Claims (3)
- 【請求項１】 少なくとも配列表の配列番号１に記載の
アミノ酸配列を含有するポリペプチドを有してなる血管
細胞調節剤。 - 【請求項２】 少なくとも配列表の配列番号２、及び３
からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドを有してなる請求項１の血管細胞調節剤。 - 【請求項３】 血管細胞が血管内皮細胞である請求項１
の血管細胞調節剤。
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|---|---|---|---|
| JP12406297A JP3989589B2 (ja) | 1997-05-14 | 1997-05-14 | 血管細胞調節剤 |
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|---|---|---|---|
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ID=14876022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP12406297A Expired - Fee Related JP3989589B2 (ja) | 1997-05-14 | 1997-05-14 | 血管細胞調節剤 |
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|---|---|
| JP (1) | JP3989589B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000053753A3 (en) * | 1999-03-08 | 2001-04-19 | Genentech Inc | Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization |
| EP1518930A3 (en) * | 1998-10-13 | 2005-05-04 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth |
| JP2008260772A (ja) * | 1997-05-14 | 2008-10-30 | Asahi Kasei Corp | 新規な分化抑制剤 |
-
1997
- 1997-05-14 JP JP12406297A patent/JP3989589B2/ja not_active Expired - Fee Related
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