JPH10318929A - 発光反応測定方法 - Google Patents
発光反応測定方法Info
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- JPH10318929A JPH10318929A JP12846697A JP12846697A JPH10318929A JP H10318929 A JPH10318929 A JP H10318929A JP 12846697 A JP12846697 A JP 12846697A JP 12846697 A JP12846697 A JP 12846697A JP H10318929 A JPH10318929 A JP H10318929A
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 クロストークを解消する簡便な方法を提供す
ることによって、発光量を効率よく測定できるような反
応容器の採用を可能にし、検出感度を向上させることを
目的とする。 【解決手段】 複数の測定用試料を個別に収容する反応
容器を用いて、各測定用試料の目的成分を発光反応によ
り順次検出する方法において、測定の終わった容器に発
行停止剤を添加して発光を停止させた後に、次の容器の
発光を測定することを特徴とする発光反応測定法。
ることによって、発光量を効率よく測定できるような反
応容器の採用を可能にし、検出感度を向上させることを
目的とする。 【解決手段】 複数の測定用試料を個別に収容する反応
容器を用いて、各測定用試料の目的成分を発光反応によ
り順次検出する方法において、測定の終わった容器に発
行停止剤を添加して発光を停止させた後に、次の容器の
発光を測定することを特徴とする発光反応測定法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発光反応を利用し
て試料中の成分を検出する系において、クロストークを
解消する技術に関する。
て試料中の成分を検出する系において、クロストークを
解消する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体中に徴量に存在する生理活性物質を
測定する方法として、抗原抗体反応を利用したイムノア
ッセイが広く採用されている。特にラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）は高感度で特異性が高く、また操作も簡便
であることから急速に発展してきた。しかし、標識に用
いる放射性物質の取り扱いに関して、装置や設備、また
使用後の廃棄の問題といった様々な制約があるために、
放射性物質の代わりに酵素、蛍光色素や化学発光物質等
の非放射性物質を標識に用いる種々の非放射性イムノア
ッセイが開発され、実用化されている。その中で、化学
発光イムノアッセイは、その検出感度がＲＩＡに匹敵す
るものとして特に注目されている。
測定する方法として、抗原抗体反応を利用したイムノア
ッセイが広く採用されている。特にラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）は高感度で特異性が高く、また操作も簡便
であることから急速に発展してきた。しかし、標識に用
いる放射性物質の取り扱いに関して、装置や設備、また
使用後の廃棄の問題といった様々な制約があるために、
放射性物質の代わりに酵素、蛍光色素や化学発光物質等
の非放射性物質を標識に用いる種々の非放射性イムノア
ッセイが開発され、実用化されている。その中で、化学
発光イムノアッセイは、その検出感度がＲＩＡに匹敵す
るものとして特に注目されている。
【０００３】現在では、全自動化による再現性の向上
や、微弱な発光をも効率良く検出するための様々な工夫
がなされ、また、発光反応の増強剤や安定化剤、さらに
は長時間安定に発光する試薬も開発され、市販されるよ
うになった。
や、微弱な発光をも効率良く検出するための様々な工夫
がなされ、また、発光反応の増強剤や安定化剤、さらに
は長時間安定に発光する試薬も開発され、市販されるよ
うになった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところで、複数の試料
を効率よく分析するために、一つ一つの測定用試料を収
容する容器を複数個用意し、反応後それぞれの容器につ
いて発光量を時間差で測定する方法が広く用いられてい
る。一般的に用手法の測定では、反応容器を縦８列×横
１２列に並べた形状の９６穴マイクロプレートが、全自
動測定機器では個別の反応容器が用いられている。
を効率よく分析するために、一つ一つの測定用試料を収
容する容器を複数個用意し、反応後それぞれの容器につ
いて発光量を時間差で測定する方法が広く用いられてい
る。一般的に用手法の測定では、反応容器を縦８列×横
１２列に並べた形状の９６穴マイクロプレートが、全自
動測定機器では個別の反応容器が用いられている。
【０００５】発光定量の性能向上のためには、僅かな発
光を検出できるような測定系を構築する必要がある。こ
のために反応容器にも様々な工夫が考案されている。
光を検出できるような測定系を構築する必要がある。こ
のために反応容器にも様々な工夫が考案されている。
【０００６】例えば前述した９６穴マイクロプレートで
微弱な光を効率よく検出する方法として、従来の黒色プ
レートから白色プレートに変更する方法が挙げられる。
これによって今までウェルに吸収されていた光が反射し
て検出器まで届くようになるため、微弱な発光を効率良
く測定できるようになる。しかし白色のウェルでは光が
透過しやすいため、隣のウエルの試料が強く発光してい
る状態でその隣のウエルの試料の発光量を測定すると、
光漏れの影響を受けて発光量が上乗せされる（クロスト
ーク）ことがあり、発光測定の正確度に問題が生じるこ
とになる。これは発光寿命が長い発光系で特に問題とな
る。これを解決するためにはウェルの壁を厚くする、ウ
ェルの側部を遮光性塗料や金属材料などの遮光性材料で
被覆する、構造を工夫するなどの対策が必要であり、対
策を施した商品も市販されているが、いずれも完全では
ないため、依然として黒色プレートもよく使用されてい
る。
微弱な光を効率よく検出する方法として、従来の黒色プ
レートから白色プレートに変更する方法が挙げられる。
これによって今までウェルに吸収されていた光が反射し
て検出器まで届くようになるため、微弱な発光を効率良
く測定できるようになる。しかし白色のウェルでは光が
透過しやすいため、隣のウエルの試料が強く発光してい
る状態でその隣のウエルの試料の発光量を測定すると、
光漏れの影響を受けて発光量が上乗せされる（クロスト
ーク）ことがあり、発光測定の正確度に問題が生じるこ
とになる。これは発光寿命が長い発光系で特に問題とな
る。これを解決するためにはウェルの壁を厚くする、ウ
ェルの側部を遮光性塗料や金属材料などの遮光性材料で
被覆する、構造を工夫するなどの対策が必要であり、対
策を施した商品も市販されているが、いずれも完全では
ないため、依然として黒色プレートもよく使用されてい
る。
【０００７】また、個別の反応容器を使用する場合でも
容器の材質・構造により同様の問題が生じるので、上記
対策の他に、測定する試料を他の試料から隔離する、光
を遮蔽するように検出器周辺を設計する、という対策が
考えられる。しかしこの場合には設計に手間が掛かり、
開発が困難になるものと予想される。
容器の材質・構造により同様の問題が生じるので、上記
対策の他に、測定する試料を他の試料から隔離する、光
を遮蔽するように検出器周辺を設計する、という対策が
考えられる。しかしこの場合には設計に手間が掛かり、
開発が困難になるものと予想される。
【０００８】本発明は上記の事情をかんがみてなされた
もので、クロストークを解消する簡便な方法を提供する
ことによって、発光量を効率よく測定できるような反応
容器の採用を可能にし、検出感度を向上させることを目
的とする。
もので、クロストークを解消する簡便な方法を提供する
ことによって、発光量を効率よく測定できるような反応
容器の採用を可能にし、検出感度を向上させることを目
的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の発光反応測定方
法は、複数の測定用試料を個別に収容する反応容器を用
いて、測定用試料中の目的成分を発光反応により順次検
出する方法において、測定の終わった容器に発光停止剤
を添加して発光を停止させた後に、次の容器の発光を測
定することを特徴とする。
法は、複数の測定用試料を個別に収容する反応容器を用
いて、測定用試料中の目的成分を発光反応により順次検
出する方法において、測定の終わった容器に発光停止剤
を添加して発光を停止させた後に、次の容器の発光を測
定することを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明は、特に化学発光イムノア
ッセイにおいて有用である。検出に用いられる化学発光
反応としては、ルミノールまたはイソルミノール誘導体
−過酸化水素、アクリジニウムエステル誘導体−過酸化
水素、ＮＡＤＨ−電子伝達体−イソルミノール−マイク
ロペルオキシダーゼ（ｍ−ＰＯＤ）、ルシゲニン−還元
性化合物、アダマンチルジオキセタン誘導体によるもの
などがある。
ッセイにおいて有用である。検出に用いられる化学発光
反応としては、ルミノールまたはイソルミノール誘導体
−過酸化水素、アクリジニウムエステル誘導体−過酸化
水素、ＮＡＤＨ−電子伝達体−イソルミノール−マイク
ロペルオキシダーゼ（ｍ−ＰＯＤ）、ルシゲニン−還元
性化合物、アダマンチルジオキセタン誘導体によるもの
などがある。
【００１１】この他にも、任意に発光反応を停止させる
ことができる反応系であればとくに制限されない。
ことができる反応系であればとくに制限されない。
【００１２】発光停止剤は、反応を行う系にあわせて適
宜選択することができる。例えば、ルシゲニンのように
アルカリ性で発光するようなものについては、酸例えば
硫酸等を添加することによってほぼ瞬時に発光を停止さ
せることができる。
宜選択することができる。例えば、ルシゲニンのように
アルカリ性で発光するようなものについては、酸例えば
硫酸等を添加することによってほぼ瞬時に発光を停止さ
せることができる。
【００１３】化学発光イムノアッセイにおいて本発明を
実施するには、まず化学発光性の化合物で直接標識され
た抗体または抗原を用い、競合法またはサンドイッチ法
により抗原抗体反応させる。次にＢ／Ｆ分離を行い、固
相に残った化学発光性化合物を上記に例示したそれぞれ
の化学発光反応で検出する。また、標識として酵素を使
用することもでき、その場合には、固相に残った酵素に
基質を添加して化学発光させる。標識として用いられる
酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、デヒドロ
ゲナーゼ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ等
がある。
実施するには、まず化学発光性の化合物で直接標識され
た抗体または抗原を用い、競合法またはサンドイッチ法
により抗原抗体反応させる。次にＢ／Ｆ分離を行い、固
相に残った化学発光性化合物を上記に例示したそれぞれ
の化学発光反応で検出する。また、標識として酵素を使
用することもでき、その場合には、固相に残った酵素に
基質を添加して化学発光させる。標識として用いられる
酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、デヒドロ
ゲナーゼ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ等
がある。
【００１４】これらの発光反応をそれぞれの容器につい
て行い、その発光量を測定するが、本発明においては、
容器からの発光を所定時間測定した後に容器に反応停止
剤を加えて発光を停止させ、次の容器に移って発光開始
剤を加え、発光量を所定時間測定する。こうすることに
よって隣接するウエルの発光自体がなくなるので、光が
漏れてくることがなくなり、クロストークなしに発光量
の測定が可能となる。
て行い、その発光量を測定するが、本発明においては、
容器からの発光を所定時間測定した後に容器に反応停止
剤を加えて発光を停止させ、次の容器に移って発光開始
剤を加え、発光量を所定時間測定する。こうすることに
よって隣接するウエルの発光自体がなくなるので、光が
漏れてくることがなくなり、クロストークなしに発光量
の測定が可能となる。
【００１５】本発明の測定法を実施するには例えば図１
に示すような装置を用いることができる。マイクロプレ
ート６上の測定しようとする試料ウエル上に検出器５を
移動し（あるいはマイクロプレート６を検出器５の下に
移動し）、発光開始剤を収容した容器１からチューブ４
を通して一定量の発光開始剤を試料ウエル中に導入して
発光反応を開始し、所定時間の発光量を測定する。測定
後、発行停止剤を収容した容器２からチューブ４を通し
て一定量の発行停止剤を試料ウエルに導入して、発光を
停止する。その後、次の試料ウエルの測定に移る。チュ
ーブ４には一定量の発光開始剤又は発光停止剤をウエル
に導入するためのポンプ３を含んでいてもよい。また、
検出器５には図２に示すように、ウエル内の発光を集光
するためのレンズ８、光電子倍増管７、ウエル蓋９、な
らびに発光開始剤及び発行停止剤などの試薬をウエル中
に導入するための試薬分注口１０などを含んでいてもよ
い。
に示すような装置を用いることができる。マイクロプレ
ート６上の測定しようとする試料ウエル上に検出器５を
移動し（あるいはマイクロプレート６を検出器５の下に
移動し）、発光開始剤を収容した容器１からチューブ４
を通して一定量の発光開始剤を試料ウエル中に導入して
発光反応を開始し、所定時間の発光量を測定する。測定
後、発行停止剤を収容した容器２からチューブ４を通し
て一定量の発行停止剤を試料ウエルに導入して、発光を
停止する。その後、次の試料ウエルの測定に移る。チュ
ーブ４には一定量の発光開始剤又は発光停止剤をウエル
に導入するためのポンプ３を含んでいてもよい。また、
検出器５には図２に示すように、ウエル内の発光を集光
するためのレンズ８、光電子倍増管７、ウエル蓋９、な
らびに発光開始剤及び発行停止剤などの試薬をウエル中
に導入するための試薬分注口１０などを含んでいてもよ
い。
【００１６】次に本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されな
い。。
明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されな
い。。
【００１７】ルシゲニン（硝酸ビス−Ｎ−メチルアクリ
ジニウム）は、アルカリ性で発光し、また適当な酸化剤
・還元剤の存在によってその発光は著しく増強される。
測定試料としてコルチゾールによってルシゲニンの発光
を増強させた強発光試料を用い、その発光が隣の（本来
発光しないはずの）ウェルにどれだけ漏れてくるかを調
べ、さらに本発明の実施によって発光の漏れがなくなる
効果を確認することにした。
ジニウム）は、アルカリ性で発光し、また適当な酸化剤
・還元剤の存在によってその発光は著しく増強される。
測定試料としてコルチゾールによってルシゲニンの発光
を増強させた強発光試料を用い、その発光が隣の（本来
発光しないはずの）ウェルにどれだけ漏れてくるかを調
べ、さらに本発明の実施によって発光の漏れがなくなる
効果を確認することにした。
【００１８】具体的には以下のように実施した。
【００１９】実施例 クロストークがある白色プレート（Labsystems社LUMINO
PLATE FB, EM）とクロストークがない黒色プレート（La
bsystems社FLUOROPLATE FB, EB）を使用した。連続した
５つのウェルの中央に強発光試料（1.0 x 10-4 Mコルチ
ゾール ５０μｌ＋8.0 x 10-4 ％ ルシゲニン ５０
μｌ）を入れ、それ以外の４つのウェルには無発光試料
（水 １００μｌ）を入れて、化学発光測定機器（Labs
ystems社LUMINOSKAN）で、次のように測定した。
PLATE FB, EM）とクロストークがない黒色プレート（La
bsystems社FLUOROPLATE FB, EB）を使用した。連続した
５つのウェルの中央に強発光試料（1.0 x 10-4 Mコルチ
ゾール ５０μｌ＋8.0 x 10-4 ％ ルシゲニン ５０
μｌ）を入れ、それ以外の４つのウェルには無発光試料
（水 １００μｌ）を入れて、化学発光測定機器（Labs
ystems社LUMINOSKAN）で、次のように測定した。
【００２０】まず、白色及び黒色プレートにおいて、発
光開始剤として用いるＨ2ＳＯ4無添加の場合について測
定した。検出器を１番目のウェルに移動し、１Ｎ ＫＯ
Ｈを５０μｌ分注してアルカリ性にして発光を開始さ
せ、分注後２０秒後から５秒間の発光量の総和を求め
た。この後検出器を隣のウェルに移動し、２〜５番目の
ウェルも同様に順次測定した。
光開始剤として用いるＨ2ＳＯ4無添加の場合について測
定した。検出器を１番目のウェルに移動し、１Ｎ ＫＯ
Ｈを５０μｌ分注してアルカリ性にして発光を開始さ
せ、分注後２０秒後から５秒間の発光量の総和を求め
た。この後検出器を隣のウェルに移動し、２〜５番目の
ウェルも同様に順次測定した。
【００２１】次に、白色及び黒色プレートにおいて、Ｈ
2ＳＯ4添加の場合について測定した。検出器を１番目の
ウェルに移動し、１Ｎ ＫＯＨを５０μｌ分注してアル
カリ性にして発光を開始させ、分注後２０秒後から５秒
間の発光量の総和を求めた。次に１Ｎ Ｈ2ＳＯ4を５０
μｌ分注して中和させ、発光を停止させた。この後検出
器を隣のウェルに移動し、２〜５番目のウェルも同様に
順次測定した。
2ＳＯ4添加の場合について測定した。検出器を１番目の
ウェルに移動し、１Ｎ ＫＯＨを５０μｌ分注してアル
カリ性にして発光を開始させ、分注後２０秒後から５秒
間の発光量の総和を求めた。次に１Ｎ Ｈ2ＳＯ4を５０
μｌ分注して中和させ、発光を停止させた。この後検出
器を隣のウェルに移動し、２〜５番目のウェルも同様に
順次測定した。
【００２２】なお、３番目に強発光試料を測定している
ので、クロストークは４番目に検出されるはずである。
１、２、５番目の試料はブランクレベルを調べるために
測定した。
ので、クロストークは４番目に検出されるはずである。
１、２、５番目の試料はブランクレベルを調べるために
測定した。
【００２３】結果 結果を以下に示す。なお、表１は３回の試験の平均であ
る。
る。
【００２４】
【表１】
【００２５】FLUOROPLATE（黒色プレート）を使った場
合には、発光停止剤（Ｈ2ＳＯ4）の有無に関わらず４番
目の試料についてクロストークが見られない。
合には、発光停止剤（Ｈ2ＳＯ4）の有無に関わらず４番
目の試料についてクロストークが見られない。
【００２６】LUMINOPLATE（白色プレート）を使った場
合には、FLUOEOPLATEに比べて発光量が高く、光を集め
る効果が高いことがわかる。しかし発光停止剤なしの場
合、４番目の試料の発光量が２．８８であり、１、２、
５番目の無発光試料の発光量に比べて明らかに高く、ク
ロストークがあることがわかる。
合には、FLUOEOPLATEに比べて発光量が高く、光を集め
る効果が高いことがわかる。しかし発光停止剤なしの場
合、４番目の試料の発光量が２．８８であり、１、２、
５番目の無発光試料の発光量に比べて明らかに高く、ク
ロストークがあることがわかる。
【００２７】ここで発光停止剤を加えて強発光試料の発
光を停止させる処理をする測定を行ったところ、４番目
の試料の発光量は１．０６であり、他の無発光試料の発
光量と変わらない値になった。
光を停止させる処理をする測定を行ったところ、４番目
の試料の発光量は１．０６であり、他の無発光試料の発
光量と変わらない値になった。
【００２８】このように、発光停止剤を加えることによ
って、光を集める効果の高い白色プレートを使って、ク
ロストークなく発光量の測定ができることが確認され
た。
って、光を集める効果の高い白色プレートを使って、ク
ロストークなく発光量の測定ができることが確認され
た。
【００２９】
【発明の効果】本発明によれば、隣り合ったサンプル間
のクロストークを解消できるので、集光効率がよい反応
容器を採用することができるようになる。これにより正
確さはそのままに高感度化が可能になる。
のクロストークを解消できるので、集光効率がよい反応
容器を採用することができるようになる。これにより正
確さはそのままに高感度化が可能になる。
【図１】 本発明の測定法に用いる測定装置の一例を示
す。
す。
【図２】 本発明の測定法に用いる測定装置の一部断面
図を示す。
図を示す。
１：発光開始剤 ２：発光停止剤 ３：ポンプ ４：チューブ ５：検出器 ６：マイクロプレートのウェル ７：光電子倍増管 ８：レンズ ９：ウェル蓋 １０：試薬分注口 １１：試料 １２：マイクロプレートの壁／底
Claims (1)
- 【請求項１】 複数の測定用試料を個別に収容する反応
容器を用いて、各測定用試料中の目的成分を発光反応に
より順次検出する方法において、測定の終わった容器に
発光停止剤を添加して発光を停止させた後に、次の容器
の発光を測定することを特徴とする発光反応測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12846697A JPH10318929A (ja) | 1997-05-19 | 1997-05-19 | 発光反応測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12846697A JPH10318929A (ja) | 1997-05-19 | 1997-05-19 | 発光反応測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10318929A true JPH10318929A (ja) | 1998-12-04 |
Family
ID=14985430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12846697A Pending JPH10318929A (ja) | 1997-05-19 | 1997-05-19 | 発光反応測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10318929A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012514747A (ja) * | 2009-01-08 | 2012-06-28 | アイティ−アイエス インターナショナル リミテッド | 化学および／または生化学反応のための光学システム |
| JP2017510810A (ja) * | 2014-04-09 | 2017-04-13 | バイオ−ラッド・イノベーションズＢｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ | 分析方法でシグナル検出を改善する吸収性粒子の使用 |
| JP2017219394A (ja) * | 2016-06-07 | 2017-12-14 | Ｎｉｓｓｈａ株式会社 | 測定方法とそれに用いる反応容器 |
| DE102023204533A1 (de) * | 2023-05-15 | 2024-11-21 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein | Vorrichtung für die Durchführung von biochemischen Untersuchungen an Proben |
-
1997
- 1997-05-19 JP JP12846697A patent/JPH10318929A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012514747A (ja) * | 2009-01-08 | 2012-06-28 | アイティ−アイエス インターナショナル リミテッド | 化学および／または生化学反応のための光学システム |
| US9089828B2 (en) | 2009-01-08 | 2015-07-28 | It-Is International Limited | Optical system for chemical and/or biochemical reactions |
| US10029227B2 (en) | 2009-01-08 | 2018-07-24 | It-Is International Limited | Optical system for chemical and/or biochemical reactions |
| JP2017510810A (ja) * | 2014-04-09 | 2017-04-13 | バイオ−ラッド・イノベーションズＢｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ | 分析方法でシグナル検出を改善する吸収性粒子の使用 |
| US11268955B2 (en) | 2014-04-09 | 2022-03-08 | Bio-Rad Europe Gmbh | Use of absorbent particles to improve signal detection in an analysis method |
| JP2017219394A (ja) * | 2016-06-07 | 2017-12-14 | Ｎｉｓｓｈａ株式会社 | 測定方法とそれに用いる反応容器 |
| DE102023204533A1 (de) * | 2023-05-15 | 2024-11-21 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein | Vorrichtung für die Durchführung von biochemischen Untersuchungen an Proben |
| DE102023204533B4 (de) * | 2023-05-15 | 2025-03-27 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein | Verfahren für die Durchführung von biochemischen Untersuchungen an Proben |
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