JPH10319018A - 流路切断部位を有するクロマトグラフ装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】クロマトグラフ装置に過剰の液体試料または展
開溶媒を供給することによる、検出像の滲み、及び経時
的検出像の変化を防止する装置の提供。 【構成】展開溶媒を用いるクロマトグラフにおいて、分
析物を検出する部位より上流に配置され、分析物が検出
可能となる一定時間後、流路を自動的に切断する部位を
設けたクロマトグラフ装置。 【効果】本発明の切断部位を、クロマトグラフ装置に組
み込むことにより、大過剰の展開溶媒、液体試料に起因
するクロマトグラフの諸問題は、ほとんど解決される。
具体的効果は、検出バンドの滲み防止、検出バンドの経
時的変化の防止、イムノクロマトグラフにおけるプロゾ
ーン現象の回避などである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料適用量の過剰に起
因する測定値異常を回避するクロマトグラフ装置に関わ
るものである。

【０００２】

【従来の技術】クロマトグラフは、様々な物質の分析に
広く利用されている重要な技術である。臨床化学分野に
おいても、高速液体クロマトグラフは尿、血清、血液中
の微量成分分析に極めて有用である。とりわけ試料その
ものを展開溶媒とするイムノクロマトグラフは、その簡
便性から妊娠診断をはじめ種々の項目の測定に利用さ
れ、急速に普及している。その多くはクロマトグラフ媒
体にニトロセルロース等の多孔性フィルムを用い、その
上流部に可動性の標識された第１抗体を配置し、下流に
第２抗体を固定化した装置であって、毛管流で移動して
きた分析物および分析物と標識第１抗体の結合体を固定
した第２抗体で捕捉し、標識量を識別するものである。

【０００３】特公平７−１３６４０においては、第１部
分と第２部分からなるクロマトグラフの第１部分に不溶
性小胞マーカー（金コロイドや着色ラテックス）を標識
した第１抗体を支持し、下流の第２部分に第２抗体を固
定化した装置が開示されている。液体試料を第１部分に
滴下すると毛管流によって、試料と第１部分の成分が第
２部分へ移動し、第２抗体と反応する成分即ち標識され
た第１抗体と試料中の抗原との抗原抗体反応物が捕捉さ
れて固定領域に留まり、抗原量に応じて着色バンドが現
れる。特公平７−４６１０７では、試料受容部以外のク
ロマト媒体を中空ケーシングで保護したイムノクロマト
グラフ装置が開示されている。このケーシングの第２抗
体を固定化した検出部位およびその下流の展開完了確認
部位に観測用の窓が設けられている。

【０００４】

【発明が解決しようとする問題点】上記のクロマトグラ
フへ試料を適用する方法は、スポイト状の試料採取容器
からクロマトグラフの試料適用部へ液体試料を滴下させ
るのが一般的である。滴下量が少なすぎると、検出域ま
で試料が展開されず測定結果は得られない。展開が正常
に終了したことを確認する手段としては、検出域下流に
配置した水溶性色素を溶出させる（特開昭６１−１４２
４６３）、検出域下流に第１抗体に対する抗体を固定化
し展開液とともに移動してきた着色標識した第１抗体を
捕捉する（特公平７−４６１０７）などの技術が開示さ
れている。一方、適用する液体試料が多すぎる場合、ク
ロマトグラフ媒体（以下クロマト媒体という）の末端迄
展開した試料液が検出域へ逆流し、検出すべき着色バン
ドが滲んで識別しにくくなる。さらに液体試料を過剰量
供給すると、測定終了後もクロマト媒体上流に過剰量配
置されている可動性標識第１抗体が、だらだらと検出域
に押し出され、判定後さらに着色が強まってしまう。即
ち陰性と判定されたクロマトグラムを数時間後に観察す
ると擬陽性もしくは陽性と判定せざるを得ない着色を示
してしまうことがある。またイムノクロマトグラフへ過
剰の液体試料を適用することは、抗原過剰によるプロゾ
ーン現象を招き偽陰性を示してしまうこともある。

【０００５】過剰試料の流量を調整する手段として特表
平４−５０７１４６には微孔質材料からなる「シンク」
作用を有する試料適用部が開示されている。「シンク」
とは液体試料を貯留するダムの役割を果たし、過剰の試
料を貯留してクロマトグラフの流速をコントロールでき
る。しかし、ダムの容量以上の大過剰の試料を適用した
場合には役に立たないうえ、判定後も標識抗体がクロマ
ト媒体上に押し出される現象を強めてしまう。特公平６
−２７７３８では、媒体の下流に設けた吸水パッドに液
体試料を吸引することで、毛管流を速めるとともに、過
剰液体試料の逆流を防止している。この装置において
も、適用した液体試料の全てが、抗体を固定した検出液
を通過するため、着色バンドの着色増加およびプロゾー
ンなどの抗原過剰対策には効果がない。特公平６−１４
０３７では２つの流路間に設けられた液体膨潤物質が液
流を吸収して膨潤し、２つの流路と接触する機構および
他方の流路の端部に設けられた液体膨潤物質の圧力によ
り２つの流路の連通を切断するスウィッチ機構が考案さ
れている。巧妙な仕組みであるが、構造が複雑であり、
液体膨潤物質が検出域の下流に設置されているため、特
公平６−２７７３８と同様に抗原過剰対策にはさして有
効ではない。

【０００６】簡便性を特徴とするイムノクロマトグラフ
装置は、妊娠診断に代表されるように、熟練した技術者
ばかりでなく一般家庭において使用されることも多い。
そのため装置に添付される取扱い説明書には、標準的な
使用法および注意点がわかりやすく記載されている。し
かし、その内容を十分に理解したはずのユーザーが、使
用に際して大過剰の試料を適用してしまう例が多々あ
る。適用量が不足すれば、正しい測定値が得られないと
の不安にかられて過剰量を適用してしまうのである。こ
のような心理的要因に基づく誤用を根絶することは大変
難しく、取扱い説明書の注意程度で防ぐことはできな
い。そこで、適用試料量の厳守を使用者に強いる装置で
はなく、ある程度多めの試料を適用すれば、あとは自動
的に必要量の試料を使用して正しい測定値を与える装置
の開発が望まれていた。

【０００７】

【問題点を解決するための手段】この問題を解決する手
段は、クロマトグラフに過剰に適用された液体試料の過
剰分または展開溶媒の過剰分をクロマト媒体に供給しな
い手段を有する装置を提供することである。具体的に
は、クロマト媒体の上流に展開開始の一定時間後流路が
切断される部分（以下流路切断系という）を設けた装置
である。流路を切断する手段には、展開溶媒と接触した
一定時間後、溶解または物理的強度を失う物質によって
なる流路を欠落させる、あるいは流路の毛管作用能を失
わせるなどがある。水系展開溶媒において流路を欠落さ
せる最も適当な物質は、水溶紙である。ここにいう水溶
紙とは、繊維成分とカルボキシメチルセルロースなどの
水溶性バインダーからなる抄造紙あるいはカルボキシメ
チルセルロースそのものを主成分とする抄造紙などであ
る。この水溶紙の片側にポリビニルアルコール樹脂、ポ
リビニルピロリドン樹脂等をコーティングし水溶解速度
を遅らせた製品であってもよい。

【０００８】これらの水溶紙は、ろ紙とほぼ同等な吸水
性を有しており毛管現象を支持する。クロマトグラフの
展開時間は、測定対象物によって異なるが、結果を判定
する少し前に水溶紙が溶け去り流路が切断されれば、受
容部に過剰の試料が適用されてもクロマト媒体上に展開
する液体試料量は一定量を超えない。

【０００９】流路切断系は、切断部位が展開溶媒によっ
て次第に毛管現象の能力を失うことによっても達成され
る。例えば粘着性物質を包含した展開溶媒に可溶のマイ
クロカプセルを含浸させた多孔質ポリエステルシートを
用いれば、展開溶媒との接触により破壊したマイクロカ
プセルから流れ出た粘着物質が多孔質を埋め、展開溶媒
の流れは堰きとめられる。有機溶媒を多用する薄層クロ
マトグラフまたは液体クロマトグフにおいては、有機溶
媒に可溶のマイクロカプセルを、展開溶媒が水溶液なら
ば水に可溶のマイクロカプセルを使用すればよい。展開
溶媒によって固化または硬化する物質を含浸させたろ紙
を用いて切断部とすることもできる。微量のαシアノア
クリレートを含浸させたろ紙は、水分との接触で硬化し
て毛管作用を失う。またビスエポキシ化合物と重合開始
剤である２官能性物質を切断部位の別々の位置に配置す
れば、展開溶媒によって両試薬が接触して硬化すること
で流路を切断できる。これらの流路切断部位をクロマト
媒体の検出域の上流に配置することにより、試料の過剰
供給によって引き起こされる上記のすべての問題を回避
することができる。

【００１０】流路切断部位は、上記クロマト装置の検出
域上流のどの位置へ配置しても目的は達せられる。しか
し、クロマト媒体の中間に切断部位を配置した場合に
は、クロマト液流が乱れて検出域の像がぼやけることが
ある。従って、切断部位は、クロマト媒体上を避け、ク
ロマト媒体より上流、特に試料受容部とクロマト媒体の
間に配置することが好ましい。最も単純な構造は、上記
クロマト装置の試料受容部とクロマト媒体とを５ｍｍ程
度の間隔を設けて配置し、試料受容部とクロマト媒体を
切断部位である水溶紙によって連通させるものである。
試料受容部は、多孔質の樹脂または不織布を素材とした
シートあるいはブロックであって、あらかじめ着色ラテ
ックス等で標識された第１抗体を含有しておいてもよ
い。クロマト媒体は、例えばニトロセルロース膜にポリ
エステルシート等を裏打ちした素材であって検出域に第
２抗体を固定化しておく。標識した第１抗体が試料受容
部に含まれていない場合は、標識した第１抗体をクロマ
ト媒体上の検出域の数ｃｍ上流に可動的に配置してお
く。抗体の標識、クロマト媒体上への可動的配置、固定
化の方法は、特公平７−４６０１７に開示された技術が
利用できる。

【００１１】試料受容部、クロマト媒体等の上記構成要
素を所定の位置に配置し、クロマト媒体とほぼ同じ幅で
かつ長さを約１ｃｍに切断した水溶紙を試料受容部とク
ロマト媒体のそれぞれに重ね合わせる。接触を完全にす
るため水溶紙の両末端の一部を糊付けすればなお良い。
ポリビニルピロリドン樹脂等の疎水性物質を片側にコー
ティングした水溶紙を使用する場合は、コーティングさ
れている面を上向きにして重ね合わさせねばならない。
液体試料の移動が不完全になるばかりでなく接着が困難
なためである。試料受容部とクロマト媒体の間隙は、溶
解後崩落する水溶紙が流路に残らない程度必要である。
クロマト装置を垂直に置き上方に展開した場合には、前
記の間隙が２ｍｍでも完全に流路を遮断できる。クロマ
ト媒体を水平に置いて展開する場合は、間隙は５ｍｍ程
度確保した方が安全である。さらに連通部の直下に崩落
した繊維の塊を受容する空室または吸水パッドを含む空
室を配置しておけばなお良い。

【００１２】水溶紙の一端を試料受容部の下に敷き、他
端をクロマト媒体に重ねてもよい。この場合、液体試料
は表面から裏面へと流れるので、片側をコーティングし
た水溶紙は使用できない。またあらかじめ試料受容部用
ブロックに切り込みを設け、その切り込みに水溶紙の一
端を挟みこみ他端をクロマト媒体に重ねあわせてもよ
い。これら連通部の配置法は、既存のケーシングをその
まま使用できるようケーシングに合わせて選択すればよ
い。

【００１３】クロマト媒体は透明シート（ポリエステル
系）に裏打ちされているため、十分な弾性を有してい
る。この弾性を利用して流路切断系を組むこともでき
る。試料受容部に重なりあう長さのクロマト媒体の下流
端部を固定した後、水溶紙を介してたわますように（物
理的負荷をかけて）試料受容部に接合させる。液体試料
によって水溶紙が溶解すると、たわんでいたクロマト媒
体は弾性によって試料受容部から離れ、流路は切断され
る。ケーシングされたクロマトグラフ装置は厚さに制限
があるため、試料受容部は、クロマト媒体を平行に延長
した高さより低くなるように配置する。あるいは、クロ
マト媒体の裏打ちシートに面する側のケーシングにスペ
ーサーを配置すれば、たわますことが容易になる。スペ
ーサーの位置は、クロマト媒体中央部に相当する部分が
最も効果的である。

【００１４】互いに重なり合う部分のシートを試料受容
部へ押し下げ両端近傍を糊付けした水溶紙で試料受容部
とクロマト媒体を結合する。接着力の強い接着剤を用い
て水溶紙両端より少し離れた位置で接着することによ
り、水溶紙は試料受容部とクロマト媒体に圧着され、接
着剤の影響を受けずに液体試料が移動できる。試料受容
部とクロマト媒体の先端部が十分に離れていれば、水溶
紙溶解後に試料受容部に残る水溶紙の残渣が接触して流
路切断が不十分になることはない。弾性に逆らって試料
受容部に結合するため接着が完全になるまで接合部を圧
着し続ける必要があるが、瞬間接着剤を使用すれば秒単
位で作業は終了する。

【００１５】クロマト媒体の弾性を利用する流路切断系
は、展開溶媒に溶解する物質を使用しなくても実現でき
る。通常の糊など水分の浸透により接着力を失う接着剤
によって、たわませたクロマト媒体のニトロセルロース
側と試料受容部を局部的に直接接着することでも流路切
断系となりうる。ただし、このような接着剤の局部的接
着で、たわんだクロマト媒体を固定化させるには、接着
力が高まるまで圧着を維持し続けねばならない面倒があ
る。市販の接着テープ（セロファンテープ、ガムテー
プ）を使用すば、さらに容易に切断系が得られる。試料
受容部にクロマト媒体の上流末端をたわませながら重ね
あわせ、その上から適当な大きさに切った接着テープを
貼って固定する。接着テープは、展開溶媒の移動を全く
妨げないので、瞬時に十分な接着力が得られるだけの大
きさとすることができる。展開溶媒との接触により、接
着テープは急速に接着力を失い、一定時間後、クロマト
媒体の弾性によって流路が切断する。

【００１６】以下の実施例により、さらに詳細に本発明
を開示するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。

【００１７】

【実施例１】便潜血検査用の市販イムノクロマトグラフ
装置であるＯＣ−ヘモキャッチ’栄研’（栄研化学製、
以下ヘモキャッチという。）に本発明の水溶紙による連
通部を取付け加工した。ヘモキャッチは、中空ケーシン
グ内に試料受容部である0.7ｃｍ×２ｃｍの吸水性シー
ト（厚さ1mm）とクロマト媒体である透明シートで裏打
ちされた厚さ０．８μｍのニトロセルロースフィルム
（0.7ｃｍ×５ｃｍ）がそれぞれ端部を接して収めら
れ、ブロックにはヒトヘモグロビンＡ0に対するマウス
第１抗体を感作した青色着色ラテックスが含まれてい
る。ニトロセルロースの上流端部から下流1.5ｃｍの位
置（検出域）に抗ヒトヘモグロビンＡ0マウス第２抗体
が固定化され、さらに液体試料の展開を確認するためコ
ントロール域として検出域の下流１ｃｍの位置に抗マウ
スIｇＧ抗体が固定化されている。ケーシングの上部に
は、試料受容部の直上に試料適用の為の孔（サンプルウ
ェル）が、検出域、コントロール域の直上には観測窓が
設けられている。

【００１８】測定は、専用の糞便採取器具から糞便懸濁
液の濾過液２滴をサンプルウェルへ滴下することで開始
する。専用の糞便採取器具には２ｍｌの緩衝液が収容さ
れており、同器具付属の採便棒で採取された糞便は１／
２００に希釈され、滴下部に設けられたフィルターで濾
過されて使用に供される。試料受容部に滴下された試料
中にヘモグロビンが存在すれば、マウス第１抗体を感作
した青色ラテックスと結合する。試料液は、毛管現象に
よってクロマト媒体へ展開し、検出域に固定したマウス
第２抗体によりヘモグロビンならびにヘモグロビンと結
合した青色ラテックスが捕捉されて青色のバンドを形成
する。更にクロマト媒体上を展開した試料液は試料液滴
下後５分でコントロール域に青色のラインを出現させる
が、試料液が不足している場合には、コントロール域ま
で試料液が届かないためコントロール域に青色ラインは
出現しない。

【００１９】図１は、ヘモキャッチのケーシングの底蓋
を外し、水溶紙の連通部を取り付けた状態の側面図であ
る。１はケーシングの下半分、２はケーシングに設けら
れた試料適用ウェル、３は検出域観察窓、４はコントロ
ール域観察窓である。、５は青色感作ラテックスを含む
試料受容部のポリエステル製吸水性シート、６は透明シ
ートで裏打ちしたニトロセルロースフィルムであり７は
透明シート、８、９はニトロセルロースフィルムに設け
られた検出域、およびコントロール域であり、１０は連
結部の水溶紙を示している。実際の作業はケーシングの
上ぶたを下にして行った。ヘモキャッチのケーシングの
上ぶたを外し、試料受容部５に重なり合っているクロマ
ト媒体６、７の端部１ｃｍを切り取りとる。この部分に
は測定に関るいかなる成分も含まれていないので切取っ
ても測定に支障を与えない。水溶紙（三島製紙製、坪量
３０ｇ／ｍ₂）を５ｍｍ×１０ｍｍに切断して連通部５
とし、その４隅に化学糊プリット（コクヨ製）を軽く塗
り試料受容部５とニトロセルロースフィルム６に重ねて
貼付した。乾燥デシケータ中に１時間放置し完全に糊を
乾燥させた後、ケーシングの底ぶたをセットした。

【００２０】測定に供する試料は以下のように調製し
た。ヒト新鮮血を溶血させ、その１ｍｌを１００ｍｌの
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に加え高濃度ヘモ
グロビン液を得た。市販のヘモグロビン測定試薬ＯＣ−
ヘモディアオート’栄研’（栄研化学製・商品名）を用
い、上記の高濃度ヘモグロビン液を上記リン酸緩衝液で
1,000倍に希釈した測定試料５０μｌに試薬３００μｌ
を加えて３７℃、３分間反応させた。この間の免疫学的
凝集反応に基づく波長５８５ｎｍにおける吸光度変化量
よりヘモグロビン濃度を決定した。標準としては試薬に
添付のヒト溶血液（２μｇ／ｍｌヒト・ヘモグロビン含
有リン酸緩衝液）を使用した。得られた測定値に準じて
高濃度ヘモグロビン液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で適宜希釈し、ヘモグロビン濃度１００ｎｇ／
ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび５００μｇ／ｍｌの測定用試
料を得た。ヘモキャッチを対照に本実施例で作成した装
置に、各濃度の試料をスポイトを用いて、２滴および５
滴を各装置の試料適用ウェル５に滴下した。装置の下流
側を約２ｃｍ上げた傾けた状態で５分放置後、検出域３
に現れた青色のバンドを目視により判定した。判定基準
は、青色バンドの濃さにより−、±、＋、＋＋とした。
結果を表１に示す。

【００２１】

【表１】

【００２２】ヘモキャッチへの標準的な試料適用量であ
る２滴の場合、本発明と対照のヘモキャッチとの測定値
の乖離は認められない。これは、水溶紙からなる連通部
がクロマトの毛管流に影響を与えないこと示唆してい
る。一方標準適用量の２倍以上の５滴を滴下した結果
は、高濃度検体で乖離が認められた。ヘモキャッチの測
定範囲は、５０ｎｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌであり、
ヘモキャッチによる５００μｇ／ｍｌの試料の測定値が
±となったのは抗原過剰のプロゾーンによるものであ
る。表には示さないものの５滴適用したヘモキャッチの
検出域の青色バンドは滲んで判定しづらいものであっ
た。測定後本発明の装置の上ぶたを外して水溶紙による
連通部を観察したところ、いずれも水溶紙が崩落して流
路は完全に切断されていた。

【００２３】

【実施例２】ヘモキャッチのケーシング１から、クロマ
ト媒体６、７を取り外した。検出域観察窓３とコントロ
ール観察窓の中間部のケーシングに５ｍｍ×５ｍｍ厚さ
２ｍｍのボール紙をスぺーサー１１として貼り付けた。
再びクロマト媒体６、７をケーシング１に戻し下流部末
端を固定した。水溶紙（三島製紙製、坪量６０ｇ／
ｍ₂）を５ｍｍ×１０ｍｍに切断し５ｍｍ分をニトロセ
ルロースフィルム６の上流末端に重ねて一部をアロンア
ルファ（接着剤の商品名・東亜合成）で接着した。２分
後、アロンアルファを連結部１０の未接着部分の四隅に
薄く塗り、スペーサー１１によって試料受容部から離れ
て存在するクロマト媒体６、７を押し下げ、試料受容部
５に手早く圧着した。クロマト媒体６、７は、スぺーサ
ー１１を頂点とする緩やかなカーブを描いて固定され
た。

【００２４】この装置を用いて、実施例１と同様にヒト
ヘモグロビンを測定した後、さらに５時間後それぞれの
装置の着色バンドを観察した。その結果を表２に示す。

【００２５】

【表２】

【００２６】５分後の判定値は、実施例１と同様ヘモキ
ャッチとの差は殆どない。これは実施例２の装置による
水溶紙製連結部もクロマト媒体の毛管流に影響を与えて
いないことを示唆する。しかしながら、５時間後の再判
定では、ヘモキャッチの着色バンドはほぼ１ランク上昇
しているのに対し、本発明の着色バンドには変化が認め
られない。試料適用の約５分後に流路が切断される本発
明の装置では、過剰の液体試料と標識抗体が供給がない
ためであり、水溶紙による連結部の効果が顕著に現れて
いる。

【００２７】

【発明の効果】展開開始の一定時間後に流路を切断する
本発明の切断部位を、クロマトグラフ装置に組み込むこ
とにより、大過剰の展開溶媒、液体試料に起因するクロ
マトグラフの諸問題は解決される。具体的効果は、検出
バンドの滲み防止、検出バンドの経時的変化の防止、イ
ムノクロマトグラフにおけるプロゾーン現象の回避など
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の基本的形態の１例の側面図

【図２】連結部の変形例

【符号の説明】

１．ケーシング上ぶた ７．ポリエステルシ
ート ２．試料適用ウェル ８．検出域 ３．検出域観察窓 ９．コントロール域 ４．コントロール域観察窓 １０．連結部 ５．試料受容部 １１．スペーサー ６．ニトロセルロースフィルム

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】展開溶媒を用いるクロマトグラフにおい
   て、分析物を検出する部位より上流に配置され、分析物
   が検出可能となる一定時間後、流路を自動的に切断する
   部位を有するクロマトグラフ装置
2. 【請求項２】流路切断部位が展開溶媒に溶解するおよび
   ／または物理的強度を失う物質からなる特許請求１の装
   置
3. 【請求項３】展開溶媒に溶解するおよび／または物理的
   強度を失う物質が水溶紙である特許請求２の装置
4. 【請求項４】含水後３０秒から５分の間に溶解する水溶
   紙を使用する特許請求３の装置
5. 【請求項５】展開溶媒によって物理的強度を失う物質に
   よってクロマト媒体が物理的負荷のかかる状態で固定化
   された流路切断系を有する特許請求２の装置
6. 【請求項６】展開溶媒に溶解する物質が展開溶媒に溶解
   後、展開溶媒に溶解する物質の自然落下により流路が遮
   断される特許請求２の装置
7. 【請求項７】展開溶媒に溶解した物質を収容するスペー
   スを有する特許請求６の装置
8. 【請求項８】展開溶媒に溶解する物質を収容するスペー
   スに吸水パッドを備える特許請求７の装置
9. 【請求項９】流路切断部位が展開溶媒によって固化し毛
   管作用を失う物質からなる特許請求１の装置
10. 【請求項１０】測定系がイムノクロマトグラフである特
    許請求１〜９の装置
11. 【請求項１１】不溶性担体をマーカーとするイムノクロ
    マトグラフである特許請求１〜８の装置
12. 【請求項１２】クロマトグラフ媒体の上流に水溶性物質
    からなる連通部を有し、液体試料を含む展開溶媒によ
    り、水溶性物質からなる連通部が溶解し流路が遮断され
    るクロマトグラフ装置を用いる測定法