JPH10323189A - 抗酸菌属細菌の検出または菌種同定用オリゴヌクレオチドおよびその用途 - Google Patents
抗酸菌属細菌の検出または菌種同定用オリゴヌクレオチドおよびその用途Info
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- JPH10323189A JPH10323189A JP9133553A JP13355397A JPH10323189A JP H10323189 A JPH10323189 A JP H10323189A JP 9133553 A JP9133553 A JP 9133553A JP 13355397 A JP13355397 A JP 13355397A JP H10323189 A JPH10323189 A JP H10323189A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 直接的で簡便、迅速かつ確実な抗酸菌属細菌
の検出または菌種同定のための新規なオリゴヌクレオチ
ドを提供する。 【解決手段】 配列表・配列番号１〜１１に記載の核酸
配列の一部または全部、または、その相補配列の一部ま
たは全部を含有する抗酸菌属細菌の検出または菌種同定
用オリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドを
標識化した標識オリゴヌクレオチド、および該オリゴヌ
クレオチドまたは該標識オリゴヌクレオチドを使用する
抗酸菌属細菌の検出または菌種同定の方法およびそのた
めの試薬キット。
の検出または菌種同定のための新規なオリゴヌクレオチ
ドを提供する。 【解決手段】 配列表・配列番号１〜１１に記載の核酸
配列の一部または全部、または、その相補配列の一部ま
たは全部を含有する抗酸菌属細菌の検出または菌種同定
用オリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドを
標識化した標識オリゴヌクレオチド、および該オリゴヌ
クレオチドまたは該標識オリゴヌクレオチドを使用する
抗酸菌属細菌の検出または菌種同定の方法およびそのた
めの試薬キット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は臨床診断上、ヒト型
結核菌（Mycobacterium tuberculosis）をはじめとする
抗酸菌属（Mycobacterium 属）細菌を迅速、確実かつ簡
便に検出または菌種同定するためのオリゴヌクレオチ
ド、該オリゴヌクレオチドを利用する抗酸菌属細菌の検
出または菌種同定方法ならびにそれらの試薬に関する。
結核菌（Mycobacterium tuberculosis）をはじめとする
抗酸菌属（Mycobacterium 属）細菌を迅速、確実かつ簡
便に検出または菌種同定するためのオリゴヌクレオチ
ド、該オリゴヌクレオチドを利用する抗酸菌属細菌の検
出または菌種同定方法ならびにそれらの試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗酸菌属は抗酸性の性質をもつグラム陽
性桿菌であり、結核菌やらい菌など、重篤な病変を引き
起こす病原菌が多い。一般に抗酸菌は発育が遅く、培養
にはかなりの時間を要する。
性桿菌であり、結核菌やらい菌など、重篤な病変を引き
起こす病原菌が多い。一般に抗酸菌は発育が遅く、培養
にはかなりの時間を要する。
【０００３】この中でもヒト型結核菌はヒトに結核を起
こす病原体であり、その検査は臨床上、極めて重要であ
る。ヒト型結核菌が起因となる病変には肺結核が圧倒的
に多いが、ほとんど全ての臓器に結核性病変を起こし、
結核性胸膜炎、結核性髄膜炎、カリエス、腸結核、腎結
核、関節結核などを起こす。感染源は患者であり、飛沫
感染などによって経気道的に感染する。
こす病原体であり、その検査は臨床上、極めて重要であ
る。ヒト型結核菌が起因となる病変には肺結核が圧倒的
に多いが、ほとんど全ての臓器に結核性病変を起こし、
結核性胸膜炎、結核性髄膜炎、カリエス、腸結核、腎結
核、関節結核などを起こす。感染源は患者であり、飛沫
感染などによって経気道的に感染する。
【０００４】従来、結核菌の検査は培養法によって行っ
ていた。一般的には小川培地上で結核菌を分離培養し、
培地上の性状（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素
産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱カ
タラーゼ試験、ツイーン８０水解試験などの結果から菌
種を同定する。しかし、ヒト型結核菌は増殖が遅く、分
離培養だけで約３〜４週間を要し、その後の各種試験
で、さらに約２〜３週間を要する。そのため、ヒト型結
核菌の検出または同定検査は、その臨床上の重要性・緊
急性にもかかわらず、約１カ月以上を要し、機動的な診
断や投薬に大きな制約となっていた。ヒト型結核菌が産
生するタンパク質を抗原抗体反応で検出する方法などが
開発されてきたが、未だ十分な菌種同定を行うまでに至
っておらず、しかも、感度的に問題があるため分離培養
が必要なことは変わりがなかった。
ていた。一般的には小川培地上で結核菌を分離培養し、
培地上の性状（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素
産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱カ
タラーゼ試験、ツイーン８０水解試験などの結果から菌
種を同定する。しかし、ヒト型結核菌は増殖が遅く、分
離培養だけで約３〜４週間を要し、その後の各種試験
で、さらに約２〜３週間を要する。そのため、ヒト型結
核菌の検出または同定検査は、その臨床上の重要性・緊
急性にもかかわらず、約１カ月以上を要し、機動的な診
断や投薬に大きな制約となっていた。ヒト型結核菌が産
生するタンパク質を抗原抗体反応で検出する方法などが
開発されてきたが、未だ十分な菌種同定を行うまでに至
っておらず、しかも、感度的に問題があるため分離培養
が必要なことは変わりがなかった。
【０００５】ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculos
is）の他にも、トリ型結核菌（Mycobacterium avium)、
マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacter
iumintracellulare）、マイコバクテリウム・カンサシ
イ（Mycobacterium kansasii）、マイコバクテリウム・
スクロフラセウム（Mycobacterium scrofulaceum）、マ
イコバクテリウム・フォーチュイタム（Mycobacterium
fortuitum)などの非定型抗酸菌が、ヒトに病原性を示す
ことが知られている。症状は結核に比べて軽く、感染力
も弱いが、抗結核剤に耐性であり、有効な薬剤はない。
これらは結核菌と同様に、ヒトの肺、リンパ節、皮膚な
どを冒し、特に肺感染症が多い。
is）の他にも、トリ型結核菌（Mycobacterium avium)、
マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacter
iumintracellulare）、マイコバクテリウム・カンサシ
イ（Mycobacterium kansasii）、マイコバクテリウム・
スクロフラセウム（Mycobacterium scrofulaceum）、マ
イコバクテリウム・フォーチュイタム（Mycobacterium
fortuitum)などの非定型抗酸菌が、ヒトに病原性を示す
ことが知られている。症状は結核に比べて軽く、感染力
も弱いが、抗結核剤に耐性であり、有効な薬剤はない。
これらは結核菌と同様に、ヒトの肺、リンパ節、皮膚な
どを冒し、特に肺感染症が多い。
【０００６】一般に、肺結核の鑑別は、臨床症状、病理
組織学的所見からは極めて困難であるため、菌の同定に
よってなされなければならない。病原性はマイコバクテ
リウム・カンサシイ（Mycobacterium kansasii）＞トリ
型結核菌（Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム
・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellular
e）＞その他の順で大きく、上位３菌種は特に重要であ
る。
組織学的所見からは極めて困難であるため、菌の同定に
よってなされなければならない。病原性はマイコバクテ
リウム・カンサシイ（Mycobacterium kansasii）＞トリ
型結核菌（Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム
・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellular
e）＞その他の順で大きく、上位３菌種は特に重要であ
る。
【０００７】従来から、これらの非定型抗酸菌をヒト結
核菌と同様、小川培地上で分離培養し、培地上の性状
（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素産生など）、
ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱カタラーゼ試
験、ツイーン８０水解試験、光発光テストなどの結果か
ら菌種を同定している。しかし、これらも一般的に増殖
が遅く、菌種の同定までに約１カ月以上を要することが
多い。
核菌と同様、小川培地上で分離培養し、培地上の性状
（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素産生など）、
ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱カタラーゼ試
験、ツイーン８０水解試験、光発光テストなどの結果か
ら菌種を同定している。しかし、これらも一般的に増殖
が遅く、菌種の同定までに約１カ月以上を要することが
多い。
【０００８】ヒト型結核菌と非定型抗酸菌の同定は、臨
床上、極めて重要である。ヒト型結核菌は病状が重篤で
あるが、ストレプトマイシン、リファンピシン、エタン
ブトール、イソニコチン酸ヒドラジドなどの抗結核剤投
与が有効なため、早期に治療を開始する必要がある。一
方、非定型抗酸菌は一般にこれらの薬剤に対して耐性で
ある。菌種の同定は、その後の治療方針を大きく左右す
るのである。しかしながら前述したように、これらの菌
は増殖が遅く、菌種同定には数週間を要する。また、マ
イコバクテリウム・スメグマ菌（Mycobacterium smegma
tis)など、類似の非病原性菌が検出されることもある。
迅速で確実な検出及び菌種同定法が望まれるのはこのた
めである。
床上、極めて重要である。ヒト型結核菌は病状が重篤で
あるが、ストレプトマイシン、リファンピシン、エタン
ブトール、イソニコチン酸ヒドラジドなどの抗結核剤投
与が有効なため、早期に治療を開始する必要がある。一
方、非定型抗酸菌は一般にこれらの薬剤に対して耐性で
ある。菌種の同定は、その後の治療方針を大きく左右す
るのである。しかしながら前述したように、これらの菌
は増殖が遅く、菌種同定には数週間を要する。また、マ
イコバクテリウム・スメグマ菌（Mycobacterium smegma
tis)など、類似の非病原性菌が検出されることもある。
迅速で確実な検出及び菌種同定法が望まれるのはこのた
めである。
【０００９】最近、ＤＮＡやＲＮＡを人為的に増幅（例
えばＰＣＲ；特開昭60-281号公報参照）し、増幅後の核
酸を検出することによって、高感度に病原体を検出する
方法が開発されてきた。ヒト型結核菌をはじめとする抗
酸菌の検出にも、これらの技術が応用され、「ＤＮＡプ
ローブ『中外』−ＭＴＤ」（中外製薬）や「アンプリコ
ア マイコバクテリウム」（日本ロシュ）など、いくつ
かの試薬キットが開発されている。これらを用いれば、
喀痰などの臨床検体から、培養などの操作を経ることな
く、ヒト型結核菌を検出することが出来る。従来は約５
〜６週間かかっていたヒト型結核菌の検出が、最短で約
１日以内に終了する、これらの手法は画期的であった。
えばＰＣＲ；特開昭60-281号公報参照）し、増幅後の核
酸を検出することによって、高感度に病原体を検出する
方法が開発されてきた。ヒト型結核菌をはじめとする抗
酸菌の検出にも、これらの技術が応用され、「ＤＮＡプ
ローブ『中外』−ＭＴＤ」（中外製薬）や「アンプリコ
ア マイコバクテリウム」（日本ロシュ）など、いくつ
かの試薬キットが開発されている。これらを用いれば、
喀痰などの臨床検体から、培養などの操作を経ることな
く、ヒト型結核菌を検出することが出来る。従来は約５
〜６週間かかっていたヒト型結核菌の検出が、最短で約
１日以内に終了する、これらの手法は画期的であった。
【００１０】しかし、これらの遺伝子診断法にも、さら
に改良すべき問題点が存在する。まず、これらのキット
はすべての工程において、ほとんど用手法で操作を行
う。そのため、非常に手間がかかり、操作の失敗、結果
のばらつきが起こりやすい。
に改良すべき問題点が存在する。まず、これらのキット
はすべての工程において、ほとんど用手法で操作を行
う。そのため、非常に手間がかかり、操作の失敗、結果
のばらつきが起こりやすい。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、直接
的で簡便、迅速かつ確実な抗酸菌属細菌の検出または菌
種同定のための新規なオリゴヌクレオチド、ならびに該
オリゴヌクレオチドを利用する抗酸菌属細菌の検出また
は菌種同定方法ならびにそれらの試薬を提供するもので
ある。
的で簡便、迅速かつ確実な抗酸菌属細菌の検出または菌
種同定のための新規なオリゴヌクレオチド、ならびに該
オリゴヌクレオチドを利用する抗酸菌属細菌の検出また
は菌種同定方法ならびにそれらの試薬を提供するもので
ある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗酸菌属
細菌とその他の生物の１６ＳｒＲＮＡ（リボゾーマルＲ
ＮＡ）遺伝子に関して、種々の検討を重ねた結果、抗酸
菌属細菌の検出または菌種同定に適した核酸配列を得、
それを用いた該菌の検出を確立し、本発明を完成させる
に至った。
細菌とその他の生物の１６ＳｒＲＮＡ（リボゾーマルＲ
ＮＡ）遺伝子に関して、種々の検討を重ねた結果、抗酸
菌属細菌の検出または菌種同定に適した核酸配列を得、
それを用いた該菌の検出を確立し、本発明を完成させる
に至った。
【００１３】すなわち、本発明は、配列表・配列番号１
〜１１に記載の核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシ
トシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意
の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよ
い。）の一部または全部、または、それらの相補配列の
一部または全部を含有することを特徴とするオリゴヌク
レオチドである。
〜１１に記載の核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシ
トシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意
の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよ
い。）の一部または全部、または、それらの相補配列の
一部または全部を含有することを特徴とするオリゴヌク
レオチドである。
【００１４】また、本発明は配列表・配列番号１〜３に
記載の核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、
Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置の
Ｔはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の一部
または全部、または、それらの相補配列の一部または全
部を含有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とす
る核酸増幅用プライマーである。
記載の核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、
Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置の
Ｔはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の一部
または全部、または、それらの相補配列の一部または全
部を含有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とす
る核酸増幅用プライマーである。
【００１５】さらに、本発明は配列表・配列番号４〜１
１に記載の核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシ
ン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位
置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の
一部または全部、または、それらの相補配列の一部また
は全部を含有するオリゴクレオチドであり、標識を有す
ることを特徴とする核酸検出用プローブである。
１に記載の核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシ
ン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位
置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の
一部または全部、または、それらの相補配列の一部また
は全部を含有するオリゴクレオチドであり、標識を有す
ることを特徴とする核酸検出用プローブである。
【００１６】本発明は配列表・配列番号１〜３に記載の
核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグ
アニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウ
ラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の一部または
全部、または、それらの相補配列の一部または全部を含
有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする核酸
増幅用プライマーを含むことを特徴とする抗酸菌属細菌
の検出または菌種同定用試薬キットである。
核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグ
アニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウ
ラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の一部または
全部、または、それらの相補配列の一部または全部を含
有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする核酸
増幅用プライマーを含むことを特徴とする抗酸菌属細菌
の検出または菌種同定用試薬キットである。
【００１７】本発明は配列表・配列番号４〜１１に記載
の核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇは
グアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴは
ウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の一部また
は全部、または、それらの相補配列の一部または全部を
含有するオリゴクレオチドであり、標識を有することを
特徴とする核酸検出用プローブを含むことを特徴とする
抗酸菌属細菌の検出または菌種同定用試薬キットであ
る。
の核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇは
グアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴは
ウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の一部また
は全部、または、それらの相補配列の一部または全部を
含有するオリゴクレオチドであり、標識を有することを
特徴とする核酸検出用プローブを含むことを特徴とする
抗酸菌属細菌の検出または菌種同定用試薬キットであ
る。
【００１８】本発明は配列表・配列番号１〜３に記載の
核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグ
アニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウ
ラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の一部または
全部、または、それらの相補配列の一部または全部を含
有するオリゴヌクレオチドである核酸増幅用プライマー
と配列表・配列番号４〜１１に記載の核酸配列（但し、
Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミ
ンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置
換されていてもよい。）の一部または全部、または、そ
れらの相補配列の一部または全部を含有するオリゴクレ
オチドであり、標識を有する核酸検出用プローブを含む
ことを特徴とする抗酸菌属細菌の検出または菌種同定用
試薬キットである。
核酸配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグ
アニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウ
ラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の一部または
全部、または、それらの相補配列の一部または全部を含
有するオリゴヌクレオチドである核酸増幅用プライマー
と配列表・配列番号４〜１１に記載の核酸配列（但し、
Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミ
ンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置
換されていてもよい。）の一部または全部、または、そ
れらの相補配列の一部または全部を含有するオリゴクレ
オチドであり、標識を有する核酸検出用プローブを含む
ことを特徴とする抗酸菌属細菌の検出または菌種同定用
試薬キットである。
【００１９】本発明は上記核酸増幅用プライマーを用い
て増幅した核酸を上記核酸検出用プローブを用いて、抗
酸菌属細菌を検出または同定することを特徴とする抗酸
菌属細菌の検出または菌種同定方法である。
て増幅した核酸を上記核酸検出用プローブを用いて、抗
酸菌属細菌を検出または同定することを特徴とする抗酸
菌属細菌の検出または菌種同定方法である。
【００２０】本発明は試料中のＲＮＡを少なくとも２種
の核酸増幅用プライマー、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）
およびリボ核酸（ＲＮＡ）の存在下に、逆転写酵素、Ｒ
ＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラ
ーゼを作用させて、試料中のＲＮＡと相補的な配列を有
するＲＮＡを増幅し、該ＲＮＡを核酸検出用プローブに
より、抗酸菌属細菌を検出または菌種同定する方法であ
って、該少なくとも２種の核酸増幅用プライマーが配列
表・配列番号１〜３に記載の核酸配列（但し、Ａはアデ
ニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
ていてもよい。）の一部または全部、または、それらの
相補配列の一部または全部を含有するオリゴヌクレオチ
ドであって、該オリゴヌクレチドの少なくとも１種のオ
リゴヌクレオチドが５’末端にＴ７プロモーターを有す
るオリゴヌクレオチドであり、該核酸検出用プローブが
配列表・配列番号４〜１１に記載の核酸配列（但し、Ａ
はアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン
を表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換
されていてもよい。）の一部または全部、または、それ
らの相補配列の一部または全部を含有するオリゴクレオ
チドであって、標識を有するオリゴヌレオチドであるこ
とを特徴とする抗酸菌属細菌の検出または菌種同定方法
である。
の核酸増幅用プライマー、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）
およびリボ核酸（ＲＮＡ）の存在下に、逆転写酵素、Ｒ
ＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラ
ーゼを作用させて、試料中のＲＮＡと相補的な配列を有
するＲＮＡを増幅し、該ＲＮＡを核酸検出用プローブに
より、抗酸菌属細菌を検出または菌種同定する方法であ
って、該少なくとも２種の核酸増幅用プライマーが配列
表・配列番号１〜３に記載の核酸配列（但し、Ａはアデ
ニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
ていてもよい。）の一部または全部、または、それらの
相補配列の一部または全部を含有するオリゴヌクレオチ
ドであって、該オリゴヌクレチドの少なくとも１種のオ
リゴヌクレオチドが５’末端にＴ７プロモーターを有す
るオリゴヌクレオチドであり、該核酸検出用プローブが
配列表・配列番号４〜１１に記載の核酸配列（但し、Ａ
はアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン
を表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換
されていてもよい。）の一部または全部、または、それ
らの相補配列の一部または全部を含有するオリゴクレオ
チドであって、標識を有するオリゴヌレオチドであるこ
とを特徴とする抗酸菌属細菌の検出または菌種同定方法
である。
【００２１】
【発明の実施態様】本発明の一実施態様は、配列表・配
列番号１記載の配列を有するフォワードプライマー（Ｆ
１プライマー）と、配列表・配列番号３記載の配列の相
補配列を有するリバースプライマー（Ｒ１プライマー）
を含む抗酸菌属細菌核酸増幅用プライマーである。
列番号１記載の配列を有するフォワードプライマー（Ｆ
１プライマー）と、配列表・配列番号３記載の配列の相
補配列を有するリバースプライマー（Ｒ１プライマー）
を含む抗酸菌属細菌核酸増幅用プライマーである。
【００２２】本発明の別な実施態様は、５’末端にＴ７
プロモーター配列（AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAG)を
結合させたオリゴヌクレオチド（配列表・配列番号１
２）である抗酸菌属細菌増幅用プライマーである。
プロモーター配列（AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAG)を
結合させたオリゴヌクレオチド（配列表・配列番号１
２）である抗酸菌属細菌増幅用プライマーである。
【００２３】本発明の一実施態様は、配列表・配列番号
４記載の配列を有するプローブ（Ｍ１プローブ）と配列
表・配列番号５記載の配列を有するプローブ（Ｍ２プロ
ーブ）からなる抗酸菌属検出用プローブである。
４記載の配列を有するプローブ（Ｍ１プローブ）と配列
表・配列番号５記載の配列を有するプローブ（Ｍ２プロ
ーブ）からなる抗酸菌属検出用プローブである。
【００２４】本発明の一実施態様は、配列表・配列番号
６記載の配列を有するプローブ（Ｔ１プローブ）と配列
表・配列番号１０記載の配列を有するプローブ（Ｔ２プ
ローブ）からなるヒト型結核菌菌種同定用プローブであ
る。
６記載の配列を有するプローブ（Ｔ１プローブ）と配列
表・配列番号１０記載の配列を有するプローブ（Ｔ２プ
ローブ）からなるヒト型結核菌菌種同定用プローブであ
る。
【００２５】本発明の一実施態様は、配列表・配列番号
７記載の配列を有するプローブ（Ａ１プローブ）と配列
表・配列番号１１記載の配列を有するプローブ（Ａ２プ
ローブ）からなるトリ型結核菌菌種同定用プローブであ
る。
７記載の配列を有するプローブ（Ａ１プローブ）と配列
表・配列番号１１記載の配列を有するプローブ（Ａ２プ
ローブ）からなるトリ型結核菌菌種同定用プローブであ
る。
【００２６】本発明の一実施態様は、配列表・配列番号
８記載の配列を有するプローブ（Ｉ１プローブ）からな
るマイコバクテリウム・イントラセルラーレ菌種同定用
プローブである。
８記載の配列を有するプローブ（Ｉ１プローブ）からな
るマイコバクテリウム・イントラセルラーレ菌種同定用
プローブである。
【００２７】本発明の一実施態様は、配列表・配列番号
９記載の配列を有するプローブ（Ｋ１プローブ）からな
るマイコバクテリウム・カンサシイ菌種同定用プローブ
である。
９記載の配列を有するプローブ（Ｋ１プローブ）からな
るマイコバクテリウム・カンサシイ菌種同定用プローブ
である。
【００２８】本発明のオリゴヌクレオチドを用いて核酸
を増幅する一手段として、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid s
equense-based amplification)法という核酸増幅技術
（Nature;350巻、91頁、1991年）があり、該方法とマイ
クロプレート中でのサンドイッチハイブリダイゼーショ
ン法を自動化したＤＮＡプローブ自動測定システム（日
本臨床検査自動化学会会誌; 20巻、728 頁、1995年）を
組み合わせたＲＮＡ検出システムが既に開発されてい
る。
を増幅する一手段として、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid s
equense-based amplification)法という核酸増幅技術
（Nature;350巻、91頁、1991年）があり、該方法とマイ
クロプレート中でのサンドイッチハイブリダイゼーショ
ン法を自動化したＤＮＡプローブ自動測定システム（日
本臨床検査自動化学会会誌; 20巻、728 頁、1995年）を
組み合わせたＲＮＡ検出システムが既に開発されてい
る。
【００２９】ＮＡＳＢＡ法とは、標的ＲＮＡと同じ配列
を有するフォワードプライマーと、標的ＲＮＡと相補的
な配列を有し、かつ、Ｔ７プロモーターを５’末端に付
加したリバースプライマーを組合せて使用し、逆転写酵
素、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼを作用させて、フォワードプライマーと
リバースプライマーの間の核酸配列を有するＲＮＡを増
幅する技術である。該方法で増幅される核酸は、標的Ｒ
ＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡである。一段階の酵
素反応でＲＮＡを増幅することが可能なＮＡＳＢＡ法の
導入により、核酸増幅工程は操作上、極めて簡素化さ
れ、また、ＤＮＡプローブ自動測定システムの導入によ
り、増幅後の検出工程はほぼ自動化されている。本発明
における抗酸菌属細菌の検出または菌種同定には、上記
ＲＮＡ検出システムを使用することが好ましい。
を有するフォワードプライマーと、標的ＲＮＡと相補的
な配列を有し、かつ、Ｔ７プロモーターを５’末端に付
加したリバースプライマーを組合せて使用し、逆転写酵
素、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼを作用させて、フォワードプライマーと
リバースプライマーの間の核酸配列を有するＲＮＡを増
幅する技術である。該方法で増幅される核酸は、標的Ｒ
ＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡである。一段階の酵
素反応でＲＮＡを増幅することが可能なＮＡＳＢＡ法の
導入により、核酸増幅工程は操作上、極めて簡素化さ
れ、また、ＤＮＡプローブ自動測定システムの導入によ
り、増幅後の検出工程はほぼ自動化されている。本発明
における抗酸菌属細菌の検出または菌種同定には、上記
ＲＮＡ検出システムを使用することが好ましい。
【００３０】ＲＮＡは遺伝子ＤＮＡの転写産物であり、
細菌内での存在数はＤＮＡよりもはるかに多い。その中
でも特に存在数が多く、しかも菌種内あるいは菌種間で
配列が良く保存されている１６ＳｒＲＮＡが着目されて
いるが、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の説明す
るように、これらの配列の中から選択的に優れた性質を
有する配列である。
細菌内での存在数はＤＮＡよりもはるかに多い。その中
でも特に存在数が多く、しかも菌種内あるいは菌種間で
配列が良く保存されている１６ＳｒＲＮＡが着目されて
いるが、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の説明す
るように、これらの配列の中から選択的に優れた性質を
有する配列である。
【００３１】本発明のオリゴヌクレオチドは、現在まで
に決定された抗酸菌属（Mycobacterium 属）細菌とその
他の生物の１６ＳｒＲＮＡ（リボゾーマルＲＮＡ）遺伝
子配列（J.Bacteriol.;172巻、 116頁、1989年、Int.J.
Syst.Bacteriol.;40巻、 217頁、1990年、Int.J.Syst.B
acteriol.;40巻、 323頁、1990年、Nucleic Acids Re
s.; 17巻、7843頁、1989年、Nucleic Acids Res.; 18
巻、5558頁、1990年など）を参考にして、各種間の遺伝
子配列の相同性の理論的検証と実験的検証を重ねた結
果、見い出されたヒト型結核菌（Mycobacterium tuberc
ulosis）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子における、およそ１番
目から２５０番目までの２５０塩基対の領域に当たる部
分、すなわち、図１に表示している配列に相当する部分
である。
に決定された抗酸菌属（Mycobacterium 属）細菌とその
他の生物の１６ＳｒＲＮＡ（リボゾーマルＲＮＡ）遺伝
子配列（J.Bacteriol.;172巻、 116頁、1989年、Int.J.
Syst.Bacteriol.;40巻、 217頁、1990年、Int.J.Syst.B
acteriol.;40巻、 323頁、1990年、Nucleic Acids Re
s.; 17巻、7843頁、1989年、Nucleic Acids Res.; 18
巻、5558頁、1990年など）を参考にして、各種間の遺伝
子配列の相同性の理論的検証と実験的検証を重ねた結
果、見い出されたヒト型結核菌（Mycobacterium tuberc
ulosis）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子における、およそ１番
目から２５０番目までの２５０塩基対の領域に当たる部
分、すなわち、図１に表示している配列に相当する部分
である。
【００３２】図１は、各種抗酸菌属細菌の１６ＳｒＲＮ
Ａ遺伝子配列を並列に表記した図である。１行目のヒト
型結核菌（M.tuberculosis）のみ、全配列を表示し、以
下の細菌については、ヒト型結核菌と異なる塩基のみ表
示し、同じ塩基はドットで表示している。つまり、この
ヒト型結核菌の２５０塩基対の領域に相当する部分（ヒ
ト型結核菌では２５０塩基対であるが、他の種では長さ
が異なる場合がある）は、抗酸菌属細菌種間で保存され
ている相同性の高い部分（以下、抗酸菌属共通領域と呼
ぶ）と、抗酸菌属内でも種によって配列が大きく異なる
部分（以下、種特異的領域と呼ぶ）から成る。
Ａ遺伝子配列を並列に表記した図である。１行目のヒト
型結核菌（M.tuberculosis）のみ、全配列を表示し、以
下の細菌については、ヒト型結核菌と異なる塩基のみ表
示し、同じ塩基はドットで表示している。つまり、この
ヒト型結核菌の２５０塩基対の領域に相当する部分（ヒ
ト型結核菌では２５０塩基対であるが、他の種では長さ
が異なる場合がある）は、抗酸菌属細菌種間で保存され
ている相同性の高い部分（以下、抗酸菌属共通領域と呼
ぶ）と、抗酸菌属内でも種によって配列が大きく異なる
部分（以下、種特異的領域と呼ぶ）から成る。
【００３３】本発明では、上記の抗酸菌属共通領域を増
幅プライマーとして利用し、種特異的領域を挟む形でＲ
ＮＡ増幅を行い、理論的には１回の増幅で複数菌種を増
幅し、次いで検出用プローブにより検出及び菌種同定を
行なう。しかし、どのような配列の核酸増幅用プライマ
ーでもＮＡＳＢＡ法に利用できるわけではない。ＮＡＳ
ＢＡ法の核酸増幅用プライマーは、理論的に設計し、実
験的にその性能を確認して選択したものである。このよ
うにして、複数の候補の中から、特に、本発明の増幅用
プライマーは、配列表・配列番号１記載の配列を有する
フォワードプライマー（以降Ｆ１プライマーと呼ぶ、図
１にも表示）と、配列表・配列番号３記載の配列の相補
配列を有するリバースプライマー（以降Ｒ１プライマー
と呼ぶ、図１にも表示）が好ましい。
幅プライマーとして利用し、種特異的領域を挟む形でＲ
ＮＡ増幅を行い、理論的には１回の増幅で複数菌種を増
幅し、次いで検出用プローブにより検出及び菌種同定を
行なう。しかし、どのような配列の核酸増幅用プライマ
ーでもＮＡＳＢＡ法に利用できるわけではない。ＮＡＳ
ＢＡ法の核酸増幅用プライマーは、理論的に設計し、実
験的にその性能を確認して選択したものである。このよ
うにして、複数の候補の中から、特に、本発明の増幅用
プライマーは、配列表・配列番号１記載の配列を有する
フォワードプライマー（以降Ｆ１プライマーと呼ぶ、図
１にも表示）と、配列表・配列番号３記載の配列の相補
配列を有するリバースプライマー（以降Ｒ１プライマー
と呼ぶ、図１にも表示）が好ましい。
【００３４】本発明のこれらの配列はＮＡＳＢＡ法以外
の核酸増幅技術、例えばＰＣＲ（特開昭60-281号公報参
照）でも所期の性能を発揮することは可能であり、本発
明はＮＡＳＢＡ法の増幅用に限定されるものではない。
の核酸増幅技術、例えばＰＣＲ（特開昭60-281号公報参
照）でも所期の性能を発揮することは可能であり、本発
明はＮＡＳＢＡ法の増幅用に限定されるものではない。
【００３５】ＮＡＳＢＡ法に用いるＲ２プライマーに
は、ＮＡＳＢＡ法の必要上、プロモーター配列、例えば
Ｔ７プロモーター配列（AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGA
G)を5'末端に結合させる必要があり、その一例の全配列
は、配列表・配列番号１２に記載される。
は、ＮＡＳＢＡ法の必要上、プロモーター配列、例えば
Ｔ７プロモーター配列（AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGA
G)を5'末端に結合させる必要があり、その一例の全配列
は、配列表・配列番号１２に記載される。
【００３６】本発明の核酸増幅用プライマーにより、抗
酸菌属細菌に共通して増幅されたＲＮＡは、菌種別に識
別する必要がある。本発明においては、増幅領域に含ま
れる種特異的領域を利用した下記プローブが好適であ
る。例えば、ヒト型結核菌菌種同定用として、配列表・
配列番号６記載の配列を有するプローブ（以降Ｔ１プロ
ーブと呼ぶ、図１にも表示）と配列表・配列番号１０記
載の配列を有するプローブ（以降Ｔ２プローブと呼ぶ、
図１にも表示）が例示され、トリ型結核菌菌種同定用と
して、配列表・配列番号７記載の配列を有するプローブ
（以降Ａ１プローブと呼ぶ、図１にも表示）と配列表・
配列番号１１記載の配列を有するプローブ（以降Ａ２プ
ローブと呼ぶ、図１にも表示）が例示され、マイコバク
テリウム・イントラセルラーレ菌種同定用として、配列
表・配列番号８記載の配列を有するプローブ（以降Ｉ１
プローブと呼ぶ、図１にも表示）が提供例示、マイコバ
クテリウム・カンサシイ菌種同定用として、配列表・配
列番号９記載の配列を有するプローブ（以降Ｋ１プロー
ブと呼ぶ、図１にも表示）が例示される。
酸菌属細菌に共通して増幅されたＲＮＡは、菌種別に識
別する必要がある。本発明においては、増幅領域に含ま
れる種特異的領域を利用した下記プローブが好適であ
る。例えば、ヒト型結核菌菌種同定用として、配列表・
配列番号６記載の配列を有するプローブ（以降Ｔ１プロ
ーブと呼ぶ、図１にも表示）と配列表・配列番号１０記
載の配列を有するプローブ（以降Ｔ２プローブと呼ぶ、
図１にも表示）が例示され、トリ型結核菌菌種同定用と
して、配列表・配列番号７記載の配列を有するプローブ
（以降Ａ１プローブと呼ぶ、図１にも表示）と配列表・
配列番号１１記載の配列を有するプローブ（以降Ａ２プ
ローブと呼ぶ、図１にも表示）が例示され、マイコバク
テリウム・イントラセルラーレ菌種同定用として、配列
表・配列番号８記載の配列を有するプローブ（以降Ｉ１
プローブと呼ぶ、図１にも表示）が提供例示、マイコバ
クテリウム・カンサシイ菌種同定用として、配列表・配
列番号９記載の配列を有するプローブ（以降Ｋ１プロー
ブと呼ぶ、図１にも表示）が例示される。
【００３７】トリ型結核菌菌種同定用プローブであるＡ
２プローブは、ヒト型結核菌とマイコバクテリウム・ボ
ビス以外の多くの抗酸菌に共通の配列を有しているの
で、これらの検出にも利用される。Ｔ１プローブ、Ｔ２
プローブ、Ａ１プローブ、Ｉ１プローブ、Ｋ１プローブ
などは菌種特異性が高いので、単独でドットブロットハ
イブリダイゼーション法などに使用可能である。
２プローブは、ヒト型結核菌とマイコバクテリウム・ボ
ビス以外の多くの抗酸菌に共通の配列を有しているの
で、これらの検出にも利用される。Ｔ１プローブ、Ｔ２
プローブ、Ａ１プローブ、Ｉ１プローブ、Ｋ１プローブ
などは菌種特異性が高いので、単独でドットブロットハ
イブリダイゼーション法などに使用可能である。
【００３８】一方、菌種同定せずに、抗酸菌属として検
出するために、配列表・配列番号４記載の配列を有する
プローブ（以降Ｍ１プローブと呼ぶ、図１にも表示）と
配列表・配列番号５記載の配列を有するプローブ（以降
Ｍ２プローブと呼ぶ、図１にも表示）が例示される。
出するために、配列表・配列番号４記載の配列を有する
プローブ（以降Ｍ１プローブと呼ぶ、図１にも表示）と
配列表・配列番号５記載の配列を有するプローブ（以降
Ｍ２プローブと呼ぶ、図１にも表示）が例示される。
【００３９】これらの核酸増幅用プライマーおよび核酸
検出用プローブを利用した抗酸菌属細菌の検出または菌
種同定法を次に説明する。まず、未知の抗酸菌属細菌を
含むと考えられる臨床検体からＲＮＡを取り出し、例え
ばＦ１プライマーとＲ１プライマーの組合せによって、
ＮＡＳＢＡ法により増幅する。増幅後のＲＮＡ産物を分
取し、上記の核酸検出用プローブを組み込んだＤＮＡプ
ローブ自動測定システムで測定することによって、各種
の菌種を同定する。
検出用プローブを利用した抗酸菌属細菌の検出または菌
種同定法を次に説明する。まず、未知の抗酸菌属細菌を
含むと考えられる臨床検体からＲＮＡを取り出し、例え
ばＦ１プライマーとＲ１プライマーの組合せによって、
ＮＡＳＢＡ法により増幅する。増幅後のＲＮＡ産物を分
取し、上記の核酸検出用プローブを組み込んだＤＮＡプ
ローブ自動測定システムで測定することによって、各種
の菌種を同定する。
【００４０】本発明において使用するＤＮＡプローブ自
動測定システムは、自動化への対応とより厳密な菌種特
異性の確保の観点から、サンドイッチハイブリダイゼー
ション法を採用し、１種類の測定に２種のプローブを使
用することが好ましい。例えば、Ｔ１プローブとＴ２プ
ローブを使用すれば、ヒト型結核菌が検出され、Ａ１プ
ローブとＡ２プローブを使用すれば、トリ型結核菌が検
出され、Ｉ１プローブとＡ２プローブを使用すれば、マ
イコバクテリウム・イントラセルラーレが検出され、Ｋ
１プローブとＡ２プローブマイコバクテリウム・カンサ
シイが検出される。
動測定システムは、自動化への対応とより厳密な菌種特
異性の確保の観点から、サンドイッチハイブリダイゼー
ション法を採用し、１種類の測定に２種のプローブを使
用することが好ましい。例えば、Ｔ１プローブとＴ２プ
ローブを使用すれば、ヒト型結核菌が検出され、Ａ１プ
ローブとＡ２プローブを使用すれば、トリ型結核菌が検
出され、Ｉ１プローブとＡ２プローブを使用すれば、マ
イコバクテリウム・イントラセルラーレが検出され、Ｋ
１プローブとＡ２プローブマイコバクテリウム・カンサ
シイが検出される。
【００４１】図１に記載の配列をもとに、他の菌種に対
応したプローブを作成すれば、更に多くの菌種同定が１
回の核酸増幅で可能となる。ただし、ヒト型結核菌を検
出する際に、マイコバクテリウム・ボビスも検出される
など、類縁菌種の識別はできないが、これらの類縁性は
医師などには周知であり、出現頻度も希であるため、影
響は少ない。
応したプローブを作成すれば、更に多くの菌種同定が１
回の核酸増幅で可能となる。ただし、ヒト型結核菌を検
出する際に、マイコバクテリウム・ボビスも検出される
など、類縁菌種の識別はできないが、これらの類縁性は
医師などには周知であり、出現頻度も希であるため、影
響は少ない。
【００４２】各種抗酸菌属細菌を同時に検出または菌種
同定するよりも、最も重要なヒト型結核菌のみ高感度で
検出したい場合には、抗酸菌属細菌の１６ＳｒＲＮＡを
広く共通に増幅する方法が、検体中の他の抗酸菌属細菌
のＲＮＡの存在により感度的に不利になる可能性があ
る。本発明では、このような場合には、ヒト型結核菌の
配列に特異的な配列表・配列番号２記載の配列を有する
プライマー（以降Ｆ２プライマーと呼ぶ、図１に表示）
を使用する。Ｆ２プライマーとＲ１プライマーを組み合
わせてＲＮＡを増幅すれば、より高感度の検出が可能と
なる。増幅後は、上記と同じく、Ｔ１プローブとＴ２プ
ローブを検出に使用すればよい。
同定するよりも、最も重要なヒト型結核菌のみ高感度で
検出したい場合には、抗酸菌属細菌の１６ＳｒＲＮＡを
広く共通に増幅する方法が、検体中の他の抗酸菌属細菌
のＲＮＡの存在により感度的に不利になる可能性があ
る。本発明では、このような場合には、ヒト型結核菌の
配列に特異的な配列表・配列番号２記載の配列を有する
プライマー（以降Ｆ２プライマーと呼ぶ、図１に表示）
を使用する。Ｆ２プライマーとＲ１プライマーを組み合
わせてＲＮＡを増幅すれば、より高感度の検出が可能と
なる。増幅後は、上記と同じく、Ｔ１プローブとＴ２プ
ローブを検出に使用すればよい。
【００４３】本発明における検出とは、それぞれの菌の
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を検出することにより、喀
痰、血液などの各種臨床材料中の抗酸菌属細菌全体およ
び各種抗酸菌を検出することである。単離、培養された
菌体の菌種を判定することなども包含される。また、本
発明における試料には、上記の各種臨床材料や培養菌体
の他、これらより単離、精製された核酸なども含まれ
る。
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を検出することにより、喀
痰、血液などの各種臨床材料中の抗酸菌属細菌全体およ
び各種抗酸菌を検出することである。単離、培養された
菌体の菌種を判定することなども包含される。また、本
発明における試料には、上記の各種臨床材料や培養菌体
の他、これらより単離、精製された核酸なども含まれ
る。
【００４４】本発明における核酸プローブに使用するオ
リゴヌクレオチドは、配列表４〜１１に記載の配列また
はその相補配列の全域を使用する必要はなく、使用する
核酸ハイブリダイゼーション条件に合わせて、解離温度
（Ｔｍ値）などを計算し、適当な領域を適当な長さで使
用すればよい。しかし、プローブに十分な特異性をもた
せたい場合には、望ましくは１０塩基以上、さらに望ま
しくは２０塩基程度以上の長さが必要となる。
リゴヌクレオチドは、配列表４〜１１に記載の配列また
はその相補配列の全域を使用する必要はなく、使用する
核酸ハイブリダイゼーション条件に合わせて、解離温度
（Ｔｍ値）などを計算し、適当な領域を適当な長さで使
用すればよい。しかし、プローブに十分な特異性をもた
せたい場合には、望ましくは１０塩基以上、さらに望ま
しくは２０塩基程度以上の長さが必要となる。
【００４５】本発明における核酸増幅用プライマーに使
用するオリゴヌクレオチドも、増幅条件などにより、配
列表１〜３の配列とその相補配列から、適当な長さの配
列を使用して作製すればよい。また、使用する条件、目
的などに応じて、オリゴヌクレオチド中にある程度の置
換を行ってもよい。
用するオリゴヌクレオチドも、増幅条件などにより、配
列表１〜３の配列とその相補配列から、適当な長さの配
列を使用して作製すればよい。また、使用する条件、目
的などに応じて、オリゴヌクレオチド中にある程度の置
換を行ってもよい。
【００４６】本発明のオリゴヌクレオチドは化学合成に
より調製できるので、クローン化したオリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドに比べ、容易、大量且つ安価
に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能であ
る。本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸
の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読
み替える。また、合成に際して任意の位置のＴをＵに変
えて合成を行ない、ウリジン残基を含むＤＮＡであって
もよい。同様に、任意の位置のＵをＴに変えたチミジン
残基を含むＲＮＡであってもよい。また、オリゴヌクレ
オチド中に欠失、挿入あるいは置換などの点突然変異
や、修飾ヌクレオチドがあってもよい。
より調製できるので、クローン化したオリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドに比べ、容易、大量且つ安価
に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能であ
る。本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸
の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読
み替える。また、合成に際して任意の位置のＴをＵに変
えて合成を行ない、ウリジン残基を含むＤＮＡであって
もよい。同様に、任意の位置のＵをＴに変えたチミジン
残基を含むＲＮＡであってもよい。また、オリゴヌクレ
オチド中に欠失、挿入あるいは置換などの点突然変異
や、修飾ヌクレオチドがあってもよい。
【００４７】本発明の核酸検出用プローブには、標識物
また該標識物に結合可能な物質が結合していることが好
ましい。標識物としては、放射性物質や酵素、蛍光物
質、発光物質など公知の標識を用いることができる。ま
た、該標識物と結合可能な物質としてはビオチンなどが
例示される。標識化はオリゴヌクレオチドの末端でも、
また該配列の途中でもよい。さらに、糖、リン酸基また
は塩基部分への標識化であってもよい。例えば、リンカ
ーアームを有するヌクレオチドを核酸配列のオリゴヌク
レオチドの一員として置換することにより、酵素標識化
することができる（Nucleic Acids Res.; 14巻6115頁19
86年）。その一例として、５位にリンカーアームを有す
るウリジンを特開昭60-500717 号公報に開示された合成
法により、デオキシウリジンから化学合成し、上記オリ
ゴヌクレオチドに導入することもできる。
また該標識物に結合可能な物質が結合していることが好
ましい。標識物としては、放射性物質や酵素、蛍光物
質、発光物質など公知の標識を用いることができる。ま
た、該標識物と結合可能な物質としてはビオチンなどが
例示される。標識化はオリゴヌクレオチドの末端でも、
また該配列の途中でもよい。さらに、糖、リン酸基また
は塩基部分への標識化であってもよい。例えば、リンカ
ーアームを有するヌクレオチドを核酸配列のオリゴヌク
レオチドの一員として置換することにより、酵素標識化
することができる（Nucleic Acids Res.; 14巻6115頁19
86年）。その一例として、５位にリンカーアームを有す
るウリジンを特開昭60-500717 号公報に開示された合成
法により、デオキシウリジンから化学合成し、上記オリ
ゴヌクレオチドに導入することもできる。
【００４８】本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの組合せでサンド
イッチアッセイ（特開昭58-40099号公報参照）を行って
もよいし、標的核酸を標識して捕捉する方法（特開昭62
-265999 号公報参照）もある。また、オリゴヌクレオチ
ドをビオチンで標識し、ハイブリダイゼーション後、ア
ビジン結合担体で捕捉する方法もある。
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの組合せでサンド
イッチアッセイ（特開昭58-40099号公報参照）を行って
もよいし、標的核酸を標識して捕捉する方法（特開昭62
-265999 号公報参照）もある。また、オリゴヌクレオチ
ドをビオチンで標識し、ハイブリダイゼーション後、ア
ビジン結合担体で捕捉する方法もある。
【００４９】
【実施例】以下に、実施例を用いて、本発明を説明す
る。
る。
【００５０】実施例１ 培養菌株を用いた性能確認 （１）抗酸菌属細菌検出用ＮＡＳＢＡプライマーの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて、配列表・配列番号１に示される配
列を有するオリゴヌクレオチド（Ｆ１プライマー）、配
列表・配列番号２に示される配列を有するオリゴヌクレ
オチド（Ｆ２プライマー）および配列表・配列番号１２
に示される配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｒ１プラ
イマー）を合成した。手法はＡＢＩ社マニュアルに従
い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で
５５℃一夜実施した。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣ
で陰イオン交換カラムにて実施した。
ホアミダイト法にて、配列表・配列番号１に示される配
列を有するオリゴヌクレオチド（Ｆ１プライマー）、配
列表・配列番号２に示される配列を有するオリゴヌクレ
オチド（Ｆ２プライマー）および配列表・配列番号１２
に示される配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｒ１プラ
イマー）を合成した。手法はＡＢＩ社マニュアルに従
い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で
５５℃一夜実施した。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣ
で陰イオン交換カラムにて実施した。
【００５１】（２）リンカーアームを有するオリゴヌク
レオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて、配列表・配列番号４に示される配
列を有するオリゴヌクレオチド（Ｍ１プローブ）、配列
表・配列番号５に示される配列を有するオリゴヌクレオ
チド（Ｍ２プローブ）、配列表・配列番号６に示される
配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｔ１プローブ）、配
列表・配列番号７に示される配列を有するオリゴヌクレ
オチド（Ａ１プローブ）、配列表・配列番号８に示され
る配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｉ１プローブ）、
配列表・配列番号９に示される配列を有するオリゴヌク
レオチド（Ｋ１プローブ）、配列表・配列番号１０に示
される配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｔ２プロー
ブ）、配列表・配列番号１１に示される配列を有するオ
リゴヌクレオチド（Ａ２プローブ）を合成した。この
際、特表昭60-500717 号公報に開示された合成法により
デオキシウリジンから化学合成により調製した、５位に
リンカーアームを有するウリジンを、上記オリゴヌクレ
オチドに導入した。このウリジンはオリゴヌクレオチド
内の任意のＴを置換しうるが、ここでは、５’末端のＴ
を置換、５’末端にＴがないものは５’末端に付加し
た。合成されたリンカーオリゴヌクレオチドはアンモニ
ア水で５０℃、一夜脱保護処理を施した後、ファルマシ
ア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを用いて精製し
た。
レオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて、配列表・配列番号４に示される配
列を有するオリゴヌクレオチド（Ｍ１プローブ）、配列
表・配列番号５に示される配列を有するオリゴヌクレオ
チド（Ｍ２プローブ）、配列表・配列番号６に示される
配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｔ１プローブ）、配
列表・配列番号７に示される配列を有するオリゴヌクレ
オチド（Ａ１プローブ）、配列表・配列番号８に示され
る配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｉ１プローブ）、
配列表・配列番号９に示される配列を有するオリゴヌク
レオチド（Ｋ１プローブ）、配列表・配列番号１０に示
される配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｔ２プロー
ブ）、配列表・配列番号１１に示される配列を有するオ
リゴヌクレオチド（Ａ２プローブ）を合成した。この
際、特表昭60-500717 号公報に開示された合成法により
デオキシウリジンから化学合成により調製した、５位に
リンカーアームを有するウリジンを、上記オリゴヌクレ
オチドに導入した。このウリジンはオリゴヌクレオチド
内の任意のＴを置換しうるが、ここでは、５’末端のＴ
を置換、５’末端にＴがないものは５’末端に付加し
た。合成されたリンカーオリゴヌクレオチドはアンモニ
ア水で５０℃、一夜脱保護処理を施した後、ファルマシ
ア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを用いて精製し
た。
【００５２】（３）リンカーオリゴヌクレオチドの酵素
・アルカリ性ホスファターゼによる標識 上記（２）にて得たリンカーオリゴヌクレオチドの内、
Ｍ２、Ｔ２、Ａ２について、そのリンカーアームを介し
て、アルカリ性ホスファターゼを結合した。その手法
は、文献 (Nucleic Acids Res.; 14巻6115頁1986年）に
従って行なった。リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260
を 0.2M NaHCO3 12.5 μl に溶解し、ここへ10mg/ml ス
ベリン酸ジスクシニミジル（ＤＳＳ）25μl を加えて、
室温で、２分間反応させた。反応液を1mM CH3COONa（pH
5.0)で平衡化したSephadex G-25 （ファルマシア社）カ
ラム（1cm φx30cm)でゲル濾過して、過剰のＤＳＳを除
去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴ
ヌクレオチドを、更にモル比で２倍量のアルカリ性ホス
ファターゼ（ベーリンガーマンハイム社、(100mM NaHCO
3 、3M NaCl)に溶解したもの）と室温で、１６時間反応
させることでアルカリ性ホスファターゼ標識核酸プロー
ブを得た。得られた標識プローブは、ファルマシア社製
ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを用いて精製した。標識
プローブを含む画分を集め、セントリコン３０Ｋ（アミ
コン社）を用いて限外濾過法により濃縮した。
・アルカリ性ホスファターゼによる標識 上記（２）にて得たリンカーオリゴヌクレオチドの内、
Ｍ２、Ｔ２、Ａ２について、そのリンカーアームを介し
て、アルカリ性ホスファターゼを結合した。その手法
は、文献 (Nucleic Acids Res.; 14巻6115頁1986年）に
従って行なった。リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260
を 0.2M NaHCO3 12.5 μl に溶解し、ここへ10mg/ml ス
ベリン酸ジスクシニミジル（ＤＳＳ）25μl を加えて、
室温で、２分間反応させた。反応液を1mM CH3COONa（pH
5.0)で平衡化したSephadex G-25 （ファルマシア社）カ
ラム（1cm φx30cm)でゲル濾過して、過剰のＤＳＳを除
去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴ
ヌクレオチドを、更にモル比で２倍量のアルカリ性ホス
ファターゼ（ベーリンガーマンハイム社、(100mM NaHCO
3 、3M NaCl)に溶解したもの）と室温で、１６時間反応
させることでアルカリ性ホスファターゼ標識核酸プロー
ブを得た。得られた標識プローブは、ファルマシア社製
ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを用いて精製した。標識
プローブを含む画分を集め、セントリコン３０Ｋ（アミ
コン社）を用いて限外濾過法により濃縮した。
【００５３】（４）リンカーオリゴヌクレオチドのマイ
クロタイタープレートへの結合 上記（２）にて得たリンカーオリゴヌクレオチドの内、
Ｍ１、Ｔ１、Ａ１、Ｉ１、Ｋ１について、そのリンカー
アームを介してのマイクロタイタープレート内面への結
合を行った。リンカーオリゴヌクレオチドを50mMほう酸
バッファー（pH10）・100mM MgCl2 の溶液に0.05pmol/
μl になるように希釈し、マイクロタイタープレート
（マイクロライト２、ダイナテック社）に各 100μl ず
つ分注し、１５時間程度、室温に放置することで、プロ
ーブ２のリンカーオリゴヌクレオチドをマイクロタイタ
ープレート内面に結合させた。その後、0.1pmol dNTP・
0.5%PVP・5xSSC に置換して、非特異反応を抑えるため
のブロッキングを室温で２時間程度行った。最後に1xSS
C で洗浄して乾燥させた。
クロタイタープレートへの結合 上記（２）にて得たリンカーオリゴヌクレオチドの内、
Ｍ１、Ｔ１、Ａ１、Ｉ１、Ｋ１について、そのリンカー
アームを介してのマイクロタイタープレート内面への結
合を行った。リンカーオリゴヌクレオチドを50mMほう酸
バッファー（pH10）・100mM MgCl2 の溶液に0.05pmol/
μl になるように希釈し、マイクロタイタープレート
（マイクロライト２、ダイナテック社）に各 100μl ず
つ分注し、１５時間程度、室温に放置することで、プロ
ーブ２のリンカーオリゴヌクレオチドをマイクロタイタ
ープレート内面に結合させた。その後、0.1pmol dNTP・
0.5%PVP・5xSSC に置換して、非特異反応を抑えるため
のブロッキングを室温で２時間程度行った。最後に1xSS
C で洗浄して乾燥させた。
【００５４】（５）試料の調製 図２に列挙した菌種と既に同定されている培養菌サンプ
ル２９検体を用意し、集菌洗浄後、R.Boomらの方法（Jo
urnal of Clinical Microbiology28巻３号495頁1990
年）に従ってＲＮＡを抽出した。この技術は、ＲＮＡな
どの核酸をシリカ粒子に結合させ、洗浄を繰り返すこと
によって精製・単離する方法である。
ル２９検体を用意し、集菌洗浄後、R.Boomらの方法（Jo
urnal of Clinical Microbiology28巻３号495頁1990
年）に従ってＲＮＡを抽出した。この技術は、ＲＮＡな
どの核酸をシリカ粒子に結合させ、洗浄を繰り返すこと
によって精製・単離する方法である。
【００５５】（６）ＮＡＳＢＡ法によるサンプルＲＮＡ
の増幅 上記（５）にて調製したＲＮＡ溶液を使用して、ＮＡＳ
ＢＡ法により（Nature;350巻91頁1991年）１６ＳｒＲＮ
ＡからＲＮＡを複製・増幅した。フォワードプライマー
としてＦ１プライマーを、リバースプライマーとしてＲ
１プライマーを使用した。増幅方法およびその条件は、
基本的には、Nature;350巻91頁1991年に従った。まず、
サンプルＲＮＡ５μｌを酵素以外の組成物（プライマー
も含む）を含む溶液１０μｌと混合し、６５℃で５分間
インキュベートし、ＲＮＡを変性させた。その後、酵素
混合液５μｌを加えて、４１℃で９０分反応させ、ＮＡ
ＳＢＡ工程を終了した。
の増幅 上記（５）にて調製したＲＮＡ溶液を使用して、ＮＡＳ
ＢＡ法により（Nature;350巻91頁1991年）１６ＳｒＲＮ
ＡからＲＮＡを複製・増幅した。フォワードプライマー
としてＦ１プライマーを、リバースプライマーとしてＲ
１プライマーを使用した。増幅方法およびその条件は、
基本的には、Nature;350巻91頁1991年に従った。まず、
サンプルＲＮＡ５μｌを酵素以外の組成物（プライマー
も含む）を含む溶液１０μｌと混合し、６５℃で５分間
インキュベートし、ＲＮＡを変性させた。その後、酵素
混合液５μｌを加えて、４１℃で９０分反応させ、ＮＡ
ＳＢＡ工程を終了した。
【００５６】（７）マイクロタイタープレート中でのサ
ンドイッチハイブリダイゼーション 上記（６）にて増幅させたＮＡＳＢＡ反応液を１０倍に
希釈し、0.3N NaOH 中で変性させ、各検査ごとに20μl
を 200mMクエン酸リン酸バッファー（pH6.0 ）・2%スク
ラーフＡＧ（日本精化株式会社）、750mM NaCl 、0.1%
NaN3 の溶液100 μl に加えて、上記（４）にて調製し
た捕捉プローブが結合したマイクロタイタープレートに
投入した。蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、
５０℃で１時間振盪させた。これによって、サンプルＤ
ＮＡが固定化されたプローブによって、特異的にマイク
ロタイタープレートに捕捉された。次に、上記（３）に
て調製したアルカリ性ホスファターゼ標識した検出プロ
ーブを2fmol/μl の濃度で含む5xSSC （pH7.0 ）、0.1%
スクラーフＡＧ、0.5% PVP、10mM MgCl2、1mM ZnCl 2 、
0.1% NaN3 の溶液 100μl と置換し、同様に蒸発を防ぐ
ため、流動パラフィンを重層し、５０℃で１時間振盪さ
せた。これによって、捕捉されたサンプルＤＮＡにアル
カリ性ホスファターゼ標識したプローブが特異的に結合
した。
ンドイッチハイブリダイゼーション 上記（６）にて増幅させたＮＡＳＢＡ反応液を１０倍に
希釈し、0.3N NaOH 中で変性させ、各検査ごとに20μl
を 200mMクエン酸リン酸バッファー（pH6.0 ）・2%スク
ラーフＡＧ（日本精化株式会社）、750mM NaCl 、0.1%
NaN3 の溶液100 μl に加えて、上記（４）にて調製し
た捕捉プローブが結合したマイクロタイタープレートに
投入した。蒸発を防ぐため、流動パラフィンを重層し、
５０℃で１時間振盪させた。これによって、サンプルＤ
ＮＡが固定化されたプローブによって、特異的にマイク
ロタイタープレートに捕捉された。次に、上記（３）に
て調製したアルカリ性ホスファターゼ標識した検出プロ
ーブを2fmol/μl の濃度で含む5xSSC （pH7.0 ）、0.1%
スクラーフＡＧ、0.5% PVP、10mM MgCl2、1mM ZnCl 2 、
0.1% NaN3 の溶液 100μl と置換し、同様に蒸発を防ぐ
ため、流動パラフィンを重層し、５０℃で１時間振盪さ
せた。これによって、捕捉されたサンプルＤＮＡにアル
カリ性ホスファターゼ標識したプローブが特異的に結合
した。
【００５７】その後、上記プローブ液を2xSSC （pH7.
0)、0.1%スクラーフＡＧに置換し、５０℃で１０分保
温、さらに、1xSSC に置換し、洗浄した。洗浄液排出
後、アルカリ性ホスファターゼの発光基質であるLumiph
os 480（Lumigen 社）100 μl を注入し、３７℃で１５
分保温後に暗室中でホトンカウンター（浜松ホトニクス
社）で発光量を測定した。これらの工程はすべて、ＤＮ
Ａプローブ自動測定システム（日本臨床検査自動化学会
会誌; 20巻728 頁1995年）により自動的に行われ、所要
時間は約２時間である。
0)、0.1%スクラーフＡＧに置換し、５０℃で１０分保
温、さらに、1xSSC に置換し、洗浄した。洗浄液排出
後、アルカリ性ホスファターゼの発光基質であるLumiph
os 480（Lumigen 社）100 μl を注入し、３７℃で１５
分保温後に暗室中でホトンカウンター（浜松ホトニクス
社）で発光量を測定した。これらの工程はすべて、ＤＮ
Ａプローブ自動測定システム（日本臨床検査自動化学会
会誌; 20巻728 頁1995年）により自動的に行われ、所要
時間は約２時間である。
【００５８】今回は、(1) 捕捉プローブ：Ｍ１−検出プ
ローブ：Ｍ２（抗酸菌(Mycobacterium) 属共通検出）、
(2) 捕捉プローブ：Ｔ１−検出プローブ：Ｔ２（ヒト型
結核菌(M.tuberculosis)検出）、(3) 捕捉プローブ：Ａ
１−検出プローブ：Ａ２（トリ型結核菌(M.avium) 検
出）、(4) 捕捉プローブ：Ｉ１−検出プローブ：Ａ２
（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(M.intrace
llulare)検出）、(5) 捕捉プローブ：Ｋ１−検出プロー
ブ：Ａ２（マイコバクテリウム・カンサシイ(M.kansasi
i)検出）の５種類のサンドイッチハイブリダイゼーショ
ン法で検出した。
ローブ：Ｍ２（抗酸菌(Mycobacterium) 属共通検出）、
(2) 捕捉プローブ：Ｔ１−検出プローブ：Ｔ２（ヒト型
結核菌(M.tuberculosis)検出）、(3) 捕捉プローブ：Ａ
１−検出プローブ：Ａ２（トリ型結核菌(M.avium) 検
出）、(4) 捕捉プローブ：Ｉ１−検出プローブ：Ａ２
（マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(M.intrace
llulare)検出）、(5) 捕捉プローブ：Ｋ１−検出プロー
ブ：Ａ２（マイコバクテリウム・カンサシイ(M.kansasi
i)検出）の５種類のサンドイッチハイブリダイゼーショ
ン法で検出した。
【００５９】（８）結果 その結果を表１に示す。数値は発光量（cps 、count/se
cond）で表示され、暫定的に5000cps 以上を陽性、それ
以下を陰性とする。(1) ではすべて陽性となり、今回検
査したすべての抗酸菌属細菌が検出できた。(2) では、
ヒト型結核菌(M.tuberculosis)のみが陽性となった。
(3) では、トリ型結核菌(M.avium) のみが陽性となっ
た。(4) では、マイコバクテリウム・イントラセルラー
レ(M.intracellulare)のみが陽性となった。(5) では、
マイコバクテリウム・カンサシイ(M.kansasii)と、類縁
菌のマイコバクテリウム・スクロフラセウム(M.scroful
aceum)、マイコバクテリウム・ガストリ(M.gastri)、マ
イコバクテリウム・シミエイ(M.simiae)が陽性となっ
た。ＲＮＡのかわりに蒸留水(water) を用いた場合は当
然、陰性であった。
cond）で表示され、暫定的に5000cps 以上を陽性、それ
以下を陰性とする。(1) ではすべて陽性となり、今回検
査したすべての抗酸菌属細菌が検出できた。(2) では、
ヒト型結核菌(M.tuberculosis)のみが陽性となった。
(3) では、トリ型結核菌(M.avium) のみが陽性となっ
た。(4) では、マイコバクテリウム・イントラセルラー
レ(M.intracellulare)のみが陽性となった。(5) では、
マイコバクテリウム・カンサシイ(M.kansasii)と、類縁
菌のマイコバクテリウム・スクロフラセウム(M.scroful
aceum)、マイコバクテリウム・ガストリ(M.gastri)、マ
イコバクテリウム・シミエイ(M.simiae)が陽性となっ
た。ＲＮＡのかわりに蒸留水(water) を用いた場合は当
然、陰性であった。
【００６０】
【表１】
【００６１】以上のことから、ヒト型結核菌、トリ型結
核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイ
コバクテリウム・カンサシイの４菌種を迅速（１日以
内）に検出、または菌種同定が可能であることが示され
た。
核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイ
コバクテリウム・カンサシイの４菌種を迅速（１日以
内）に検出、または菌種同定が可能であることが示され
た。
【００６２】実施例２ 臨床検体（喀痰）を用いた性能
確認（その１） （１）試料の調製 表２に列挙した臨床検体７件について、集菌洗浄後、実
施例１（５）と全く同様に、R.Boomらの方法（Journal
of Clinical Microbiology28巻３号495 頁1990年）に従
ってＲＮＡを抽出した。
確認（その１） （１）試料の調製 表２に列挙した臨床検体７件について、集菌洗浄後、実
施例１（５）と全く同様に、R.Boomらの方法（Journal
of Clinical Microbiology28巻３号495 頁1990年）に従
ってＲＮＡを抽出した。
【００６３】（２）ＮＡＳＢＡ法によるサンプルＲＮＡ
の増幅 上記（１）のＲＮＡ溶液を使用して、実施例１（６）と
全く同様に、ＮＡＳＢＡ法により（Nature;350巻91頁19
91年）１６ＳｒＲＮＡからＲＮＡを複製・増幅した。用
いたプライマーも実施例１（６）と同じ、Ｆ１−Ｒ１で
ある。
の増幅 上記（１）のＲＮＡ溶液を使用して、実施例１（６）と
全く同様に、ＮＡＳＢＡ法により（Nature;350巻91頁19
91年）１６ＳｒＲＮＡからＲＮＡを複製・増幅した。用
いたプライマーも実施例１（６）と同じ、Ｆ１−Ｒ１で
ある。
【００６４】（３）マイクロタイタープレート中でのサ
ンドイッチハイブリダイゼーション 上記（２）のＮＡＳＢＡ反応液を１０倍に希釈し、実施
例１（７）と同様に各種のサンドイッチハイブリダイゼ
ーションで検出した。今回は、(1) 捕捉プローブ：Ｔ１
−検出プローブ：Ｔ２（ヒト型結核菌(M.tuberculosis)
検出）、(2) 捕捉プローブ：Ａ１−検出プローブ：Ａ２
（トリ型結核菌(M.avium) 検出）、(3)捕捉プローブ：
Ｉ１−検出プローブ：Ａ２（マイコバクテリウム・イン
トラセルラーレ(M.intracellulare)検出）、(4) 捕捉プ
ローブ：Ｋ１−検出プローブ：Ａ２（マイコバクテリウ
ム・カンサシイ(M.kansasii)検出）の４種類のサンドイ
ッチハイブリダイゼーション法で検出した。
ンドイッチハイブリダイゼーション 上記（２）のＮＡＳＢＡ反応液を１０倍に希釈し、実施
例１（７）と同様に各種のサンドイッチハイブリダイゼ
ーションで検出した。今回は、(1) 捕捉プローブ：Ｔ１
−検出プローブ：Ｔ２（ヒト型結核菌(M.tuberculosis)
検出）、(2) 捕捉プローブ：Ａ１−検出プローブ：Ａ２
（トリ型結核菌(M.avium) 検出）、(3)捕捉プローブ：
Ｉ１−検出プローブ：Ａ２（マイコバクテリウム・イン
トラセルラーレ(M.intracellulare)検出）、(4) 捕捉プ
ローブ：Ｋ１−検出プローブ：Ａ２（マイコバクテリウ
ム・カンサシイ(M.kansasii)検出）の４種類のサンドイ
ッチハイブリダイゼーション法で検出した。
【００６５】（４）結果 その結果を表２に示す。数値は発光量（cps 、count/se
cond）で表示され、暫定的に5000cps 以上を陽性、それ
以下を陰性とする。喀痰１・喀痰２・喀痰３は(1) で陽
性となり、ヒト型結核菌の存在が検出された。喀痰４・
喀痰５は(3) でで陽性となり、マイコバクテリウム・イ
ントラセルラーレの存在が検出された。喀痰６・喀痰７
は何れの検出系も陰性となった。
cond）で表示され、暫定的に5000cps 以上を陽性、それ
以下を陰性とする。喀痰１・喀痰２・喀痰３は(1) で陽
性となり、ヒト型結核菌の存在が検出された。喀痰４・
喀痰５は(3) でで陽性となり、マイコバクテリウム・イ
ントラセルラーレの存在が検出された。喀痰６・喀痰７
は何れの検出系も陰性となった。
【００６６】後の培養と菌種同定試験の結果から、喀痰
１・喀痰２・喀痰３からはヒト型結核菌が、喀痰４・喀
痰５からはマイコバクテリウム・イントラセルラーレが
検出され、本願発明の方法の結果と全く一致した。喀痰
６・喀痰７は液体培地（バクテックシステム、ベクトン
・ディッキンソン社製）では陽性であったが、小川培地
で陰性であったため、菌種同定はされていない。
１・喀痰２・喀痰３からはヒト型結核菌が、喀痰４・喀
痰５からはマイコバクテリウム・イントラセルラーレが
検出され、本願発明の方法の結果と全く一致した。喀痰
６・喀痰７は液体培地（バクテックシステム、ベクトン
・ディッキンソン社製）では陽性であったが、小川培地
で陰性であったため、菌種同定はされていない。
【００６７】
【表２】
【００６８】以上のことから、実際の臨床検体に対して
も、本願発明の方法は有効であることが示された。感度
としては、塗抹染色法を上回り、小川培地による培養法
と同等程度ではないかと考えられた。
も、本願発明の方法は有効であることが示された。感度
としては、塗抹染色法を上回り、小川培地による培養法
と同等程度ではないかと考えられた。
【００６９】実施例３ 臨床検体（喀痰）を用いた性能
確認（その２） （１）試料の調製 図４に列挙した臨床検体１２件について、集菌洗浄後、
実施例１（５）と全く同様に、R.Boomらの方法（Journa
l of Clinical Microbiology28巻３号495 頁1990年）に
従ってＲＮＡを抽出した。
確認（その２） （１）試料の調製 図４に列挙した臨床検体１２件について、集菌洗浄後、
実施例１（５）と全く同様に、R.Boomらの方法（Journa
l of Clinical Microbiology28巻３号495 頁1990年）に
従ってＲＮＡを抽出した。
【００７０】（２）ＮＡＳＢＡ法によるサンプルＲＮＡ
の増幅 上記（１）にて調製したＲＮＡ溶液を使用して、実施例
１（６）と同様に、ＮＡＳＢＡ法により（Nature;350巻
91頁1991年）１６ＳｒＲＮＡからＲＮＡを複製・増幅し
た。用いたプライマーは実施例１・実施例２と同じ(A)
Ｆ１−Ｒ１と、ヒト型結核菌に特異的な(B) Ｆ２−Ｒ１
の２通りである。
の増幅 上記（１）にて調製したＲＮＡ溶液を使用して、実施例
１（６）と同様に、ＮＡＳＢＡ法により（Nature;350巻
91頁1991年）１６ＳｒＲＮＡからＲＮＡを複製・増幅し
た。用いたプライマーは実施例１・実施例２と同じ(A)
Ｆ１−Ｒ１と、ヒト型結核菌に特異的な(B) Ｆ２−Ｒ１
の２通りである。
【００７１】（３）マイクロタイタープレート中でのサ
ンドイッチハイブリダイゼーション 上記（２）にて増幅したＮＡＳＢＡ反応液を１０倍に希
釈し、実施例１（７）と同様に各種のサンドイッチハイ
ブリダイゼーションで検出する。今回は、捕捉プロー
ブ：Ｔ１−検出プローブ：Ｔ２（ヒト型結核菌(M.tuber
culosis)検出）のサンドイッチハイブリダイゼーション
法のみで検出した。
ンドイッチハイブリダイゼーション 上記（２）にて増幅したＮＡＳＢＡ反応液を１０倍に希
釈し、実施例１（７）と同様に各種のサンドイッチハイ
ブリダイゼーションで検出する。今回は、捕捉プロー
ブ：Ｔ１−検出プローブ：Ｔ２（ヒト型結核菌(M.tuber
culosis)検出）のサンドイッチハイブリダイゼーション
法のみで検出した。
【００７２】（４）結果 その結果を表３に示す。数値は発光量（cps 、count/se
cond）で表示され、暫定的に5000cps 以上を陽性、それ
以下を陰性とする。(A) では喀痰８・喀痰１２・喀痰１
４・喀痰１５で陽性となり、ヒト型結核菌の存在が検出
された。(B) では喀痰８・喀痰１２・喀痰１４・喀痰１
５に加え、喀痰１３と喀痰１８でも陽性となった。
cond）で表示され、暫定的に5000cps 以上を陽性、それ
以下を陰性とする。(A) では喀痰８・喀痰１２・喀痰１
４・喀痰１５で陽性となり、ヒト型結核菌の存在が検出
された。(B) では喀痰８・喀痰１２・喀痰１４・喀痰１
５に加え、喀痰１３と喀痰１８でも陽性となった。
【００７３】同様の遺伝子診断キットであるアンプリコ
ア・マイコバクテリウム（日本ロシュ）の結果と比較し
た場合、本願発明(A) では若干の感度不足が考えられる
が、(B) では同様の結果が得られた。しかも、アンプリ
コアに比べてより明確な判定が下せる結果となった。更
には、本願発明は検出が自動化されており、操作性では
アンプリコアよりも優れている。その他の従来技術では
満足な結果は得られておらず、小川培地の結果は時間的
にこの段階ではまだ得られていない。結論として、ヒト
型結核菌に絞ってより高感度を求める場合は、(B) Ｆ２
−Ｒ１のプライマーを使用した方がよいということが示
された。
ア・マイコバクテリウム（日本ロシュ）の結果と比較し
た場合、本願発明(A) では若干の感度不足が考えられる
が、(B) では同様の結果が得られた。しかも、アンプリ
コアに比べてより明確な判定が下せる結果となった。更
には、本願発明は検出が自動化されており、操作性では
アンプリコアよりも優れている。その他の従来技術では
満足な結果は得られておらず、小川培地の結果は時間的
にこの段階ではまだ得られていない。結論として、ヒト
型結核菌に絞ってより高感度を求める場合は、(B) Ｆ２
−Ｒ１のプライマーを使用した方がよいということが示
された。
【００７４】
【表３】
【００７５】
【発明の効果】本発明により、直接的で簡便、迅速かつ
確実な抗酸菌属細菌の検出及び菌種同定が可能となる。
また、本発明の配列またはその相補配列の一部または全
部を有するオリゴヌクレオチドは、ＮＡＳＢＡ法をはじ
めとする核酸増幅用プライマーとして好適であり、ま
た、増幅反応後の検出プローブとしても好適である。本
発明のオリゴヌクレオチドを利用した、これらの方法に
よって、従来、数週間もかかった結核菌の培養とその後
の生化学的試験などに比べて、時間を大幅に短縮するこ
とができ、簡便で、且つ再現性のある確実な結果が得ら
れる。しかも、喀痰や血液などの臨床材料から直接検出
することが可能となるので、その臨床的意義は大きい。
また、本発明記載の方法は、従来の遺伝子診断法に比べ
てもより短時間に完了し、習熟を要さず、簡便である。
確実な抗酸菌属細菌の検出及び菌種同定が可能となる。
また、本発明の配列またはその相補配列の一部または全
部を有するオリゴヌクレオチドは、ＮＡＳＢＡ法をはじ
めとする核酸増幅用プライマーとして好適であり、ま
た、増幅反応後の検出プローブとしても好適である。本
発明のオリゴヌクレオチドを利用した、これらの方法に
よって、従来、数週間もかかった結核菌の培養とその後
の生化学的試験などに比べて、時間を大幅に短縮するこ
とができ、簡便で、且つ再現性のある確実な結果が得ら
れる。しかも、喀痰や血液などの臨床材料から直接検出
することが可能となるので、その臨床的意義は大きい。
また、本発明記載の方法は、従来の遺伝子診断法に比べ
てもより短時間に完了し、習熟を要さず、簡便である。
【００７６】
配列番号：１ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：抗酸菌属（Mycobacterium 属）細菌１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 GGCGTGCTTA ACACATGCAA 20
ＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 GGCGTGCTTA ACACATGCAA 20
【００７７】配列番号：２ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosi
s）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有す
る。 配列 GGAAAGGTCT CTTCGGAGATA 21
s）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有す
る。 配列 GGAAAGGTCT CTTCGGAGATA 21
【００７８】配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：抗酸菌属（Mycobacterium 属）細菌１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 CTACCCGTCG TCGCCTTGGT 20
ＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 CTACCCGTCG TCGCCTTGGT 20
【００７９】配列番号：４ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..22 特徴を決定した方法：S 他の特徴：抗酸菌属（Mycobacterium 属）細菌１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 AGTGGCGAAC GGGTGAGTAA CA 22
ＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 AGTGGCGAAC GGGTGAGTAA CA 22
【００８０】配列番号：５ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..22 特徴を決定した方法：S 他の特徴：抗酸菌属（Mycobacterium 属）細菌１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 TAAGCCTGGG AAACTGGGTC TA 22
ＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 TAAGCCTGGG AAACTGGGTC TA 22
【００８１】配列番号：６ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosi
s）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有す
る。 配列 TAGGACCACG GGATGCATGT 20
s）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有す
る。 配列 TAGGACCACG GGATGCATGT 20
【００８２】配列番号：７ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：トリ型結核菌（Mycobacterium avium)１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 TAGGACCTCA AGACGCATGT 20
ｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 TAGGACCTCA AGACGCATGT 20
【００８３】配列番号：８ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：マイコバクテリウム・イントラセルラーレ
（Mycobacterium intracellulare）１６ＳｒＲＮＡ遺伝
子の配列と相補的な配列を有する。 配列 TAGGACCTTT AGGCGCATGT 20
（Mycobacterium intracellulare）１６ＳｒＲＮＡ遺伝
子の配列と相補的な配列を有する。 配列 TAGGACCTTT AGGCGCATGT 20
【００８４】配列番号：９ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：マイコバクテリウム・カンサシイ（Mycobact
erium kansasii）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的
な配列を有する。 配列 TAGGACCACT TGGCGCATGC 20
erium kansasii）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的
な配列を有する。 配列 TAGGACCACT TGGCGCATGC 20
【００８５】配列番号：10 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..18 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosi
s）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有す
る。 配列 GCGCTTTAGC GGTGTGGG 18
s）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有す
る。 配列 GCGCTTTAGC GGTGTGGG 18
【００８６】配列番号：11 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：トリ型結核菌（Mycobacterium avium)１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 AAAGCTTTTG CGGTGTGGGA 20
ｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有する。 配列 AAAGCTTTTG CGGTGTGGGA 20
【００８７】配列番号：12 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..47 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosi
s）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有す
る。 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGCTA CCCGTCGTCG CCTTGGT 47
s）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列と相補的な配列を有す
る。 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGCTA CCCGTCGTCG CCTTGGT 47
【図１】各種抗酸菌属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列
（およそ１〜２５０塩基）を並列に表記した図である。
（およそ１〜２５０塩基）を並列に表記した図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:325） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:33） (72)発明者 大門 克哉 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内
Claims (15)
- 【請求項１】 配列表・配列番号１〜１１に記載の核酸
配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニ
ン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシ
ル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の一部または全
部、または、それらの相補配列の一部または全部を含有
することを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 配列表・配列番号１〜３に記載の核酸配
列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニ
ン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシ
ル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の一部または全
部、または、それらの相補配列の一部または全部を含有
するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする核酸増
幅用プライマー。 - 【請求項３】 配列表・配列番号４〜１１に記載の核酸
配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニ
ン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシ
ル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の一部または全
部、または、それらの相補配列の一部または全部を含有
するオリゴヌクレオチドであり、標識を有することを特
徴とする核酸検出用プローブ。 - 【請求項４】 配列表・配列番号１記載の配列を有する
フォワードプライマー（Ｆ１プライマー）と、配列表・
配列番号３記載の配列の相補配列を有するリバースプラ
イマー（Ｒ１プライマー）を含む核酸増幅用プライマ
ー。 - 【請求項５】 ５’末端にＴ７プロモーター配列（AATT
CTAATA CGACTCACTATAGGGAG)を結合させたオリゴヌクレ
オチド（配列表・配列番号１２）である核酸増幅用プラ
イマー。 - 【請求項６】 配列表・配列番号４記載の配列を有する
プローブ（Ｍ１プローブ）と配列表・配列番号５記載の
配列を有するプローブ（Ｍ２プローブ）からなる抗酸菌
属細菌核酸検出用プローブ。 - 【請求項７】 配列表・配列番号６記載の配列を有する
プローブ（Ｔ１プローブ）と配列表・配列番号１０記載
の配列を有するプローブ（Ｔ２プローブ）からなるヒト
型結核菌菌種同定用プローブ。 - 【請求項８】 配列表・配列番号７記載の配列を有する
プローブ（Ａ１プローブ）と配列表・配列番号１１記載
の配列を有するプローブ（Ａ２プローブ）からなるトリ
型結核菌菌種同定用プローブ。 - 【請求項９】 配列表・配列番号８記載の配列を有する
プローブ（Ｉ１プローブ）からなるマイコバクテリウム
・イントラセルラーレ菌種同定用プローブ。 - 【請求項１０】、配列表・配列番号９記載の配列を有す
るプローブ（Ｋ１プローブ）からなるマイコバクテリウ
ム・カンサシイ菌種同定用プローブ。 - 【請求項１１】 請求項２に記載される核酸増幅用プラ
イマーを含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の検出また
は菌種同定用試薬キット。 - 【請求項１２】 請求項３に記載される核酸検出用プロ
ーブを含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の検出または
菌種同定用試薬キット。 - 【請求項１３】 請求項２記載の核酸増幅用プライマー
と請求項３記載の核酸検出用プローブを含むことを特徴
とする抗酸菌属細菌の検出または菌種同定用試薬キッ
ト。 - 【請求項１４】 請求項２に記載された核酸増幅用プラ
イマーを用いて増幅した核酸を請求項３に記載される核
酸検出用プローブを用いて、抗酸菌属細菌を検出または
同定することを特徴とする抗酸菌属細菌の検出または菌
種同定方法。 - 【請求項１５】 試料中のＲＮＡを少なくとも２種の核
酸増幅用プライマー、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およ
びリボ核酸（ＲＮＡ）の存在下に、逆転写酵素、ＲＮａ
ｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ
を作用させて、試料中のＲＮＡと相補的な配列を有する
ＲＮＡを増幅し、該ＲＮＡを核酸検出用プローブによ
り、抗酸菌属細菌を検出または菌種同定する方法であっ
て、該少なくとも２種の核酸増幅用プライマーが配列表
・配列番号１〜３に記載の核酸配列（但し、Ａはアデニ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。
また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されてい
てもよい。）の一部または全部、または、それらの相補
配列の一部または全部を含有するオリゴヌクレオチドで
あって、該オリゴヌクレチドの少なくとも１種のオリゴ
ヌクレオチドが５’末端にＴ７プロモーターを有するオ
リゴヌクレオチドであり、該核酸検出用プローブが配列
表・配列番号４〜１１に記載の核酸配列（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
ていてもよい。）の一部または全部、または、それらの
相補配列の一部または全部を含有するオリゴクレオチド
であって、標識を有するオリゴヌレオチドであることを
特徴とする抗酸菌属細菌の検出または菌種同定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9133553A JPH10323189A (ja) | 1997-05-23 | 1997-05-23 | 抗酸菌属細菌の検出または菌種同定用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9133553A JPH10323189A (ja) | 1997-05-23 | 1997-05-23 | 抗酸菌属細菌の検出または菌種同定用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10323189A true JPH10323189A (ja) | 1998-12-08 |
Family
ID=15107511
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9133553A Pending JPH10323189A (ja) | 1997-05-23 | 1997-05-23 | 抗酸菌属細菌の検出または菌種同定用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10323189A (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003516764A (ja) * | 1999-12-17 | 2003-05-20 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の核酸増幅および検出 |
| EP1431400A3 (en) * | 2002-12-19 | 2004-07-07 | Tosoh Corporation | Method of detecting acid-fast bacteria using ribosomal RNA as target |
| JP2006061155A (ja) * | 2004-07-28 | 2006-03-09 | Bml Inc | 抗酸菌属細菌同定キット |
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| CN107190087A (zh) * | 2017-07-18 | 2017-09-22 | 武汉大学 | 基于TaqMan‑MGB探针检测人非结合分枝杆菌和结合分枝杆菌的试剂盒及方法 |
| WO2025108481A1 (zh) * | 2023-11-24 | 2025-05-30 | 上海科技大学 | 快速检测分枝杆菌的方法 |
-
1997
- 1997-05-23 JP JP9133553A patent/JPH10323189A/ja active Pending
Cited By (15)
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