JPH10323199A - 腫瘍診断のためのミクロサテライト不安定性の検出方法 - Google Patents
腫瘍診断のためのミクロサテライト不安定性の検出方法Info
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- JPH10323199A JPH10323199A JP10076321A JP7632198A JPH10323199A JP H10323199 A JPH10323199 A JP H10323199A JP 10076321 A JP10076321 A JP 10076321A JP 7632198 A JP7632198 A JP 7632198A JP H10323199 A JPH10323199 A JP H10323199A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】腫瘍診断のためのミクロサテライト不安定性の
分析方法及び腫瘍診断のためのミクロサテライトの不安
定性によって腫瘍診断の分析をするためのキットを提供
すること。 【解決手段】ａ）ヒト生体物質からゲノムＤＮＡを単離
し、ｂ）５つの異なるプライマー対を用いて前記ＤＮＡ
の５つの異なるミクロサテライト座のＤＮＡを増幅し、
ここで、増幅対象のミクロサテライト座は、２つのモノ
ヌクレオチドリピート座、クラス２ａの１または２つの
ジヌクレオチドリピート座、クラス２ｂの１または２つ
のジヌクレオチドリピート座、任意に１つのペンタヌク
レオチドリピート座から選択され、ｃ）増幅産物の大き
さを決定する工程を含むミクロサテライト座の分析方
法、該分析方法を用いて診断を行なう方法及びキット。
分析方法及び腫瘍診断のためのミクロサテライトの不安
定性によって腫瘍診断の分析をするためのキットを提供
すること。 【解決手段】ａ）ヒト生体物質からゲノムＤＮＡを単離
し、ｂ）５つの異なるプライマー対を用いて前記ＤＮＡ
の５つの異なるミクロサテライト座のＤＮＡを増幅し、
ここで、増幅対象のミクロサテライト座は、２つのモノ
ヌクレオチドリピート座、クラス２ａの１または２つの
ジヌクレオチドリピート座、クラス２ｂの１または２つ
のジヌクレオチドリピート座、任意に１つのペンタヌク
レオチドリピート座から選択され、ｃ）増幅産物の大き
さを決定する工程を含むミクロサテライト座の分析方
法、該分析方法を用いて診断を行なう方法及びキット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、胃腸系の腫瘍、好
ましくは結腸直腸の腫瘍の予後診断、疾病素質診断およ
び早期認識のための方法ならびにキットに関する。本発
明は、ＰＣＲの助けで、いわゆるミクロサテライトのゲ
ノム不安定性の検出に基づく。
ましくは結腸直腸の腫瘍の予後診断、疾病素質診断およ
び早期認識のための方法ならびにキットに関する。本発
明は、ＰＣＲの助けで、いわゆるミクロサテライトのゲ
ノム不安定性の検出に基づく。
【０００２】
【従来の技術】ミクロサテライト（以下、ＭＩＳ）は、
全ヒトゲノムにわたって分布しているショートタンデム
リピートである。ＭＩＳは、統計的に１００，０００ｂ
ｐ毎に約１つ生じる。現在までに、モノ−、ジ−、トリ
−、テトラ−または、ペンタヌクレオチドリピートの最
小の繰り返し単位の長さで他と区別化される５つのクラ
スのＭＩＳがことが述べられている。決まったこれらの
繰り返し単位は、タンデム配列中に１０〜４０回繰り返
し生じる。同一個人の腫瘍試料由来のＤＮＡと正常ＤＮ
Ａとを比較した場合、小さい欠失または挿入の形のミク
ロサテライト不安定性（以下、ＭＩＮという）は、多く
の腫瘍患者に検出される〔ティボドー(Thibodeau) ら、
(1993)、サイエンス、260 、816-819 〕（国際公開94/1
9492号パンフレット）。これは、ＰＣＲの助けでＤＮＡ
を増幅し、続いてゲル電気泳動により増幅産物を分離す
ることにより達成される。腫瘍細胞の永続する複製の欠
陥がＭＩＮの原因であると考えられている〔パーソンズ
(Parsons) ら、(1993)、セル、75、1227-1236 ；シバタ
ら、(1994)、Nat. Genet. 6 、273-281 〕。かかる腫瘍
は、「複製エラー−陽性」（以下、ＲＥＲ＋という）と
して分類される。ＲＥＲ＋表現型は、ＨＮＰＣＣ（遺伝
性の非ポリープ性の直腸癌）を有する家族性の結腸直腸
腫瘍に特徴的である〔アールトネン(Aaltonen)ら、(199
3)、サイエンス、260 、812-816 〕。
全ヒトゲノムにわたって分布しているショートタンデム
リピートである。ＭＩＳは、統計的に１００，０００ｂ
ｐ毎に約１つ生じる。現在までに、モノ−、ジ−、トリ
−、テトラ−または、ペンタヌクレオチドリピートの最
小の繰り返し単位の長さで他と区別化される５つのクラ
スのＭＩＳがことが述べられている。決まったこれらの
繰り返し単位は、タンデム配列中に１０〜４０回繰り返
し生じる。同一個人の腫瘍試料由来のＤＮＡと正常ＤＮ
Ａとを比較した場合、小さい欠失または挿入の形のミク
ロサテライト不安定性（以下、ＭＩＮという）は、多く
の腫瘍患者に検出される〔ティボドー(Thibodeau) ら、
(1993)、サイエンス、260 、816-819 〕（国際公開94/1
9492号パンフレット）。これは、ＰＣＲの助けでＤＮＡ
を増幅し、続いてゲル電気泳動により増幅産物を分離す
ることにより達成される。腫瘍細胞の永続する複製の欠
陥がＭＩＮの原因であると考えられている〔パーソンズ
(Parsons) ら、(1993)、セル、75、1227-1236 ；シバタ
ら、(1994)、Nat. Genet. 6 、273-281 〕。かかる腫瘍
は、「複製エラー−陽性」（以下、ＲＥＲ＋という）と
して分類される。ＲＥＲ＋表現型は、ＨＮＰＣＣ（遺伝
性の非ポリープ性の直腸癌）を有する家族性の結腸直腸
腫瘍に特徴的である〔アールトネン(Aaltonen)ら、(199
3)、サイエンス、260 、812-816 〕。
【０００３】ミクロサテライトの分析は、ＲＥＲ＋腫瘍
の腫瘍形成の試験のためと同様に診断適用のためのかな
り魅力的な方法である。シークエンスする前にＭＩＮの
決定を行なうことが簡単であるため、ＨＮＰＣＣファミ
リーのミスマッチ修復遺伝子は、潜在的なＲＥＲ＋患者
を同定する適切な助けである。ＭＩＮ分析は、さらによ
り良い予後に関連するＭＩＮの発生のため、散発性の結
腸直腸の癌の予後診断に重要である〔ロセら、(1993)、
Cancer Res. 、53、5849-5852 ；ティボドー(Thibodea
u) ら、(1993)、サイエンス、260 、816-819 、バッブ
(Bubb)ら、(1996)、オンコジーン、12、2641-2649 〕。
の腫瘍形成の試験のためと同様に診断適用のためのかな
り魅力的な方法である。シークエンスする前にＭＩＮの
決定を行なうことが簡単であるため、ＨＮＰＣＣファミ
リーのミスマッチ修復遺伝子は、潜在的なＲＥＲ＋患者
を同定する適切な助けである。ＭＩＮ分析は、さらによ
り良い予後に関連するＭＩＮの発生のため、散発性の結
腸直腸の癌の予後診断に重要である〔ロセら、(1993)、
Cancer Res. 、53、5849-5852 ；ティボドー(Thibodea
u) ら、(1993)、サイエンス、260 、816-819 、バッブ
(Bubb)ら、(1996)、オンコジーン、12、2641-2649 〕。
【０００４】ＭＩＮは、散発性の結腸直腸の腫瘍中に１
０−２０％の割合で生じるだけであるが〔ティボドー(T
hibodeau) ら、(1993)、サイエンス、260 、816-819 ；
イオノフ(Ionov) ら、(1993)、ネーチャー、363 、558-
561 ；アールトネンら、(1993)、サイエンス、260 、81
2-816 ；ロセら、(1993)、Cancer Res. 、53、5849-585
2 〕、全ＨＮＰＣＣ腫瘍〔リウ(Liu) ら、(1996)、Natu
re Med. 、2 、169-174 〕の９０％よりも多くにＭＩＮ
を検出することができる。しかしながら、ＭＩＮは、結
腸直腸の腫瘍に限定されることなく、他の腫瘍にも検出
される。これらは、他の膵臓癌（ハン(Han) ら、(1993)
Cancer Res. 、53、5087-5089 ）、胃癌〔ハンら、(199
3)、Cancer Res. 、53、5087-5089 ；ペルトマキ(Pelto
maki) ら、(1993) Cancer Res.、53、5853-5855 ；ミロ
ノフ(Mironov) ら、(1994)、Cancer Res. 、54、41-44
；リュウ(Rhyu)ら、(1994)、オンコジーン、9 、29-32
；チョング(Chong) ら、(1994)、Cancer Res. 、54、4
595-4597 〕、前立腺癌〔ガオ(Gao) ら、(1994)、オン
コジーン、9 、2999-3003 〕、子宮内膜癌〔リシンガー
(Risinger)ら、(1993)、Cancer Res. 、53、5100-5103
；ペルトマキ(Peltomaki) ら、(1993) Cancer Res.、5
3、5853-5855 〕および乳癌（パテル(Patel) ら、(199
4)、オンコジーン、9 、3695-3700 〕をも含む。
０−２０％の割合で生じるだけであるが〔ティボドー(T
hibodeau) ら、(1993)、サイエンス、260 、816-819 ；
イオノフ(Ionov) ら、(1993)、ネーチャー、363 、558-
561 ；アールトネンら、(1993)、サイエンス、260 、81
2-816 ；ロセら、(1993)、Cancer Res. 、53、5849-585
2 〕、全ＨＮＰＣＣ腫瘍〔リウ(Liu) ら、(1996)、Natu
re Med. 、2 、169-174 〕の９０％よりも多くにＭＩＮ
を検出することができる。しかしながら、ＭＩＮは、結
腸直腸の腫瘍に限定されることなく、他の腫瘍にも検出
される。これらは、他の膵臓癌（ハン(Han) ら、(1993)
Cancer Res. 、53、5087-5089 ）、胃癌〔ハンら、(199
3)、Cancer Res. 、53、5087-5089 ；ペルトマキ(Pelto
maki) ら、(1993) Cancer Res.、53、5853-5855 ；ミロ
ノフ(Mironov) ら、(1994)、Cancer Res. 、54、41-44
；リュウ(Rhyu)ら、(1994)、オンコジーン、9 、29-32
；チョング(Chong) ら、(1994)、Cancer Res. 、54、4
595-4597 〕、前立腺癌〔ガオ(Gao) ら、(1994)、オン
コジーン、9 、2999-3003 〕、子宮内膜癌〔リシンガー
(Risinger)ら、(1993)、Cancer Res. 、53、5100-5103
；ペルトマキ(Peltomaki) ら、(1993) Cancer Res.、5
3、5853-5855 〕および乳癌（パテル(Patel) ら、(199
4)、オンコジーン、9 、3695-3700 〕をも含む。
【０００５】ＲＥＲ＋腫瘍の腫瘍形成の機構は、詳細に
は知られていない。現在まで、遺伝子の欠陥がＲＥＲ＋
表現型の発生へ導くものである５つの遺伝子が同定され
た。ｈＭＬＨ１（ブロンナー(Bronner) ら、(1994)、ネ
ーチャー、368 、258-261 ）および、さらに、ｈＭＳＨ
２（フィッシェル(Fishel)ら、(1993)、セル、75、1027
-1038 ；リーチ(Leach) ら、(1993)、セル、75、1215-1
225 ）の遺伝的多様性がＨＮＰＣＣファミリーで３０％
以上の頻度で検出されているので、これらの２つの遺伝
子はＭＩＮの発現に重要な役割を明らかに果たす。２つ
の他のミスマッチ修復遺伝子、ｈＰＭＳ１およびｈＰＭ
Ｓ２は、全ＨＮＰＣＣ患者の５％未満が変異しており、
そのためこれらの遺伝子は、ＲＥＲ＋腫瘍において相関
的で二次的な役割を有する。しかしながら、さらに以前
に知られていない遺伝子が効果的なミスマッチ修復に関
与することが推定される。
は知られていない。現在まで、遺伝子の欠陥がＲＥＲ＋
表現型の発生へ導くものである５つの遺伝子が同定され
た。ｈＭＬＨ１（ブロンナー(Bronner) ら、(1994)、ネ
ーチャー、368 、258-261 ）および、さらに、ｈＭＳＨ
２（フィッシェル(Fishel)ら、(1993)、セル、75、1027
-1038 ；リーチ(Leach) ら、(1993)、セル、75、1215-1
225 ）の遺伝的多様性がＨＮＰＣＣファミリーで３０％
以上の頻度で検出されているので、これらの２つの遺伝
子はＭＩＮの発現に重要な役割を明らかに果たす。２つ
の他のミスマッチ修復遺伝子、ｈＰＭＳ１およびｈＰＭ
Ｓ２は、全ＨＮＰＣＣ患者の５％未満が変異しており、
そのためこれらの遺伝子は、ＲＥＲ＋腫瘍において相関
的で二次的な役割を有する。しかしながら、さらに以前
に知られていない遺伝子が効果的なミスマッチ修復に関
与することが推定される。
【０００６】ＭＩＮは、細胞増殖の制御に重要である遺
伝子のコード領域におけるミクロサテライトの変異を生
じるミスマッチ修復系の欠損のため、腫瘍形成に直接の
役割を果たすことを推定する理由がある。例えば、ＴＧ
Ｆベータ１レセプター遺伝子のコード領域における１０
個のデオキシアデノシンの繰り返しがＭＩＮの標的とし
て同定されている〔マルコビッツ(Markowitz) ら、(199
5)、サイエンス、268、1336-1338 〕。さらなるＭＩＮ
標的であるＩＧＦ（II）Ｒ遺伝子は、胃腫瘍におけるコ
ード領域内の（Ｇ）8 リピートで変異される〔ソウザ(S
ouza) ら、(1996)、Nat. Genet. 、14、255-257 〕。興
味深いことに、試験されたＭＩＮを有する全ての腫瘍の
10％のみが両方の遺伝子で変異されていた。ヒストン遺
伝子内の他の（Ｇ）8 ＭＩＳは、試験された腫瘍のいず
れにおいても変異されていなかった〔ソウザ(Souza)
ら、(1996)、Nat. Genet. 、14、255-257 〕。さらに、
現在まで、試験された座の幾つかのみでＭＩＮを検出す
ることができた。不安定であることをすでに示されてい
るミクロサテライトがＭＩＮの発生の頻度に関して異な
っているかどうか、さらにどの程度異なっているかは、
本発明の時点で知られていなかった。
伝子のコード領域におけるミクロサテライトの変異を生
じるミスマッチ修復系の欠損のため、腫瘍形成に直接の
役割を果たすことを推定する理由がある。例えば、ＴＧ
Ｆベータ１レセプター遺伝子のコード領域における１０
個のデオキシアデノシンの繰り返しがＭＩＮの標的とし
て同定されている〔マルコビッツ(Markowitz) ら、(199
5)、サイエンス、268、1336-1338 〕。さらなるＭＩＮ
標的であるＩＧＦ（II）Ｒ遺伝子は、胃腫瘍におけるコ
ード領域内の（Ｇ）8 リピートで変異される〔ソウザ(S
ouza) ら、(1996)、Nat. Genet. 、14、255-257 〕。興
味深いことに、試験されたＭＩＮを有する全ての腫瘍の
10％のみが両方の遺伝子で変異されていた。ヒストン遺
伝子内の他の（Ｇ）8 ＭＩＳは、試験された腫瘍のいず
れにおいても変異されていなかった〔ソウザ(Souza)
ら、(1996)、Nat. Genet. 、14、255-257 〕。さらに、
現在まで、試験された座の幾つかのみでＭＩＮを検出す
ることができた。不安定であることをすでに示されてい
るミクロサテライトがＭＩＮの発生の頻度に関して異な
っているかどうか、さらにどの程度異なっているかは、
本発明の時点で知られていなかった。
【０００７】これに反して、ＭＩＮを解析するための適
切な座の選抜のさらなる基礎はなかった。ＲＥＲ＋表現
型の多様な決定に最も適する座であるかどうか、もしそ
うであればどの座が最も適するかは知られていない。比
べて、現状は、例えば、結腸直腸癌におけるＭＩＮ標準
を分類するための４〜７の任意に選択された座を解析す
ることである〔例えば、アールトネン(Aaltonen)ら、(1
993)、サイエンス、260 、812-816 ；ティボドー(Thibo
deau) ら、(1993)、サイエンス260 、816-816; ロセ(Lo
the) ら、(1993)、Cancer Res. 、53、5849-5851 ；キ
ム(Kim) ら、(1994)、Am. J. Path.、145 、148-156 ；
バッブ(Bubb)ら、(1996)、オンコジーン、12、2641-264
9 ；プルンマー(Plummer) およびカゼイ(Casey) 、(199
6)、Nat.Med. 、2 、156-158 〕。
切な座の選抜のさらなる基礎はなかった。ＲＥＲ＋表現
型の多様な決定に最も適する座であるかどうか、もしそ
うであればどの座が最も適するかは知られていない。比
べて、現状は、例えば、結腸直腸癌におけるＭＩＮ標準
を分類するための４〜７の任意に選択された座を解析す
ることである〔例えば、アールトネン(Aaltonen)ら、(1
993)、サイエンス、260 、812-816 ；ティボドー(Thibo
deau) ら、(1993)、サイエンス260 、816-816; ロセ(Lo
the) ら、(1993)、Cancer Res. 、53、5849-5851 ；キ
ム(Kim) ら、(1994)、Am. J. Path.、145 、148-156 ；
バッブ(Bubb)ら、(1996)、オンコジーン、12、2641-264
9 ；プルンマー(Plummer) およびカゼイ(Casey) 、(199
6)、Nat.Med. 、2 、156-158 〕。
【０００８】これらの方法において、モノヌクレオチド
およびジヌクレオチド座が最も頻繁に解析される。これ
に関して、ジヌクレオチドリピート座を２つの異なるク
ラスに分けることができる。 −増幅される領域内にジヌクレオチドリピートから離れ
てさらにリピート因子を持たない非複合座（以下、クラ
ス２ａという）。これらの座としては、ＡＰＣ、Ｄ１３
Ｓ１７５、Ｄ３Ｓ１２８３、Ｍｆｄ２６、Ｍｆｄ２８お
よびＭｆｄ４１があげられる。 −ジヌクレオチドリピートに加えて、さらにリピート配
列がある複合座（以下、クラス２ｂという）。これらの
座としては、Ｍｆｄ１５、Ｄ１０Ｓ１９７、Ｄ１１Ｓ１
３１８、Ｄ１１Ｓ９０４、Ｄ１８Ｓ６９、Ｄ２Ｓ１２
３、Ｄ９Ｓ１７１およびＴＰ５３ＰＣＲがあげられる。
およびジヌクレオチド座が最も頻繁に解析される。これ
に関して、ジヌクレオチドリピート座を２つの異なるク
ラスに分けることができる。 −増幅される領域内にジヌクレオチドリピートから離れ
てさらにリピート因子を持たない非複合座（以下、クラ
ス２ａという）。これらの座としては、ＡＰＣ、Ｄ１３
Ｓ１７５、Ｄ３Ｓ１２８３、Ｍｆｄ２６、Ｍｆｄ２８お
よびＭｆｄ４１があげられる。 −ジヌクレオチドリピートに加えて、さらにリピート配
列がある複合座（以下、クラス２ｂという）。これらの
座としては、Ｍｆｄ１５、Ｄ１０Ｓ１９７、Ｄ１１Ｓ１
３１８、Ｄ１１Ｓ９０４、Ｄ１８Ｓ６９、Ｄ２Ｓ１２
３、Ｄ９Ｓ１７１およびＴＰ５３ＰＣＲがあげられる。
【０００９】さらに、モノヌクレオチドリピート座も、
それらが簡単に増幅され、明確なゲル電気泳動シグナル
を生じるので、数回実験されている〔リュウ(Liu) ら、
(1996)、Nature Med. 、２、169-174 ；アウジェンリヒ
トら、(1996)、オンコジーン、12、1767-1772 ；プラン
マーおよびカゼイ、(1996)、Nat. Med. 、2 、156-158
〕。
それらが簡単に増幅され、明確なゲル電気泳動シグナル
を生じるので、数回実験されている〔リュウ(Liu) ら、
(1996)、Nature Med. 、２、169-174 ；アウジェンリヒ
トら、(1996)、オンコジーン、12、1767-1772 ；プラン
マーおよびカゼイ、(1996)、Nat. Med. 、2 、156-158
〕。
【００１０】したがって、本発明の基礎は、ゲノムの不
安定の一般的な傾向を得るための信頼しうる情報を得る
多型な座の検索であった。これに関連して、現状によ
り、ＭＩＮが見出され異なるミクロサテライトの多型変
化の異なる頻度を検出することが可能である。さらに、
異なる患者において、異なるクラスのミクロサテライト
がゲノムの不安定性の異なる頻度に影響されることが決
定された。従って、ＭＩＳの異なるクラスの分析は、限
られた回数のＰＣＲ反応でのＲＥＲ表現型の信頼できる
決定に必要である。
安定の一般的な傾向を得るための信頼しうる情報を得る
多型な座の検索であった。これに関連して、現状によ
り、ＭＩＮが見出され異なるミクロサテライトの多型変
化の異なる頻度を検出することが可能である。さらに、
異なる患者において、異なるクラスのミクロサテライト
がゲノムの不安定性の異なる頻度に影響されることが決
定された。従って、ＭＩＳの異なるクラスの分析は、限
られた回数のＰＣＲ反応でのＲＥＲ表現型の信頼できる
決定に必要である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来技
術に鑑みてなされたものであり、腫瘍診断のためのミク
ロサテライト不安定性の分析方法を提供することを目的
とする。
術に鑑みてなされたものであり、腫瘍診断のためのミク
ロサテライト不安定性の分析方法を提供することを目的
とする。
【００１２】また、本発明は、腫瘍診断のためのミクロ
サテライトの不安定性によって腫瘍診断の分析をするた
めのキットを提供することを目的とする。
サテライトの不安定性によって腫瘍診断の分析をするた
めのキットを提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の要旨
は、（１） ａ）ヒト生体物質からゲノムＤＮＡを単離
し、 ｂ）５つの異なるプライマー対を用いて前記ＤＮＡの５
つの異なるミクロサテライト座のＤＮＡを増幅し、ここ
で、増幅対象のミクロサテライト座は、２つのモノヌク
レオチドリピート座、クラス２ａの１または２つのジヌ
クレオチドリピート座、クラス２ｂの１または２つのジ
ヌクレオチドリピート座、任意に１つのペンタヌクレオ
チドリピート座から選択され、 ｃ）増幅産物の大きさを決定する工程を含むミクロサテ
ライト座の分析方法、（２） ５つのミクロサテライト
座が、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、
Ｍｆｄ１５、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１８Ｓ６９およびＴＰ５
３Ａｌｕからなる群より選ばれた座である前記（１）記
載のミクロサテライト座の分析方法、（３） 少なくと
も１種のプライマー対が、配列番号：１、２、５、６、
１９、２０、２７、２８、３１、３２、３３、３４、３
５、３６、４５および４６で示されたプライマーからな
る群より選ばれる前記（２）記載のミクロサテライト座
の分析方法、（４） ５つのミクロサテライト座とし
て、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およ
びＤ２Ｓ１２３を解析する前記（２）記載のミクロサテ
ライト座の分析方法、（５） 少なくとも１種のプライ
マー対が、配列番号：１、２、５、６、１９、２０、３
３、３４、３５および３６で示されたプライマーからな
る群より選ばれる前記（３）記載のミクロサテライト座
の分析方法、（６） ５つのミクロサテライト座とし
て、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およ
びＤ２Ｓ１２３を解析する前記（２）記載のミクロサテ
ライト不安定性の分析方法、（７） 少なくとも１種の
プライマー対が、配列番号：１、２、５、６、１９、２
０、３１、３２、３３および３４で示されたプライマー
からなる群より選ばれる前記（３）記載のミクロサテラ
イト座の分析方法、（８） ミクロサテライト不安定性
が５つの試験された座で全く検出されないとき、ＲＥＲ
−表現型であると推定し、ミクロサテライト不安定性が
２種以上の座で検出されるとき、ＲＥＲ＋表現型である
と推定して、ＲＥＲ表現型を決定する、前記（１）〜
（７）いずれか記載のミクロサテライト座の分析方法、
（９） 前記（１）〜（８）いずれか記載の方法を用い
て、腫瘍の予後診断を行なう方法、（１０） 前記
（１）〜（８）いずれか記載の方法を用いて、家族性の
腫瘍疾病素質の診断を行なう方法、（１１） 子宮内膜
および胃腸系の腫瘍を指示するための、前記（９）また
は（１０）記載の方法、（１２） 結腸直腸の腫瘍を指
示するための、前記（１１）記載の方法、（１３） 前
記（１）〜（８）いずれか記載の方法を用いて、転移腫
瘍細胞におけるミクロサテライト不安定性の検出による
腫瘍の早期認識を行なう方法、（１４） 前記（１）〜
（８）いずれか記載の方法を用いて、治療方法のタイプ
を決定する方法、（１５） ２つのモノヌクレオチドリ
ピート座、クラス２ａの１または２つのジヌクレオチド
リピート座、クラス２ｂの１または２つのジヌクレオチ
ドリピート座および１つのペンタヌクレオチドリピート
座より選択されるミクロサテライト座のＤＮＡ増幅に適
する少なくとも５つのプライマー対を含んでなる、ミク
ロサテライト不安定性によって腫瘍診断分析をするため
のキット、（１６） ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ
４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１８Ｓ６
９およびＴＰ５３Ａｌｕからなる群より選ばれた５つの
座のＤＮＡ増幅に適する５つのプライマー対を含んでな
る、ミクロサテライト不安定性によって腫瘍診断分析を
するためのキット、（１７） 少なくとも１種のプライ
マー対が、配列番号：１、２、５、６、１９、２０、２
７、２８、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４５
および４６で示されたプライマーからなる群より選ばれ
た５つのプライマー対を含んでなる、ミクロサテライト
不安定性によって腫瘍診断分析をするためのキット、
（１８） ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１
５およびＤ２Ｓ１２３のＤＮＡ増幅に適する５つのプラ
イマー対を含んでなる、前記（１６）記載のキット、
（１９） 配列番号：１、２、５、６、１９、２０、３
３、３４、３５および３６で示されたプライマーからな
る群より選ばれた少なくとも１種のプライマー対を含ん
でなる、前記（１７）記載のキット、（２０） ＢＡＴ
２５、ＢＡＴ２６、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およびＤ２Ｓ１
２３のＤＮＡ増幅に適する５つのプライマー対を含んで
なる、前記（１６）記載のキット、（２１） 配列番
号：１、２、５、６、１９、２０、３１、３２、３３お
よび３４により示されるプライマーからなる群より選ば
れた少なくとも１種のプライマー対を含んでなる前記
（１７）記載のキット、に関する。
は、（１） ａ）ヒト生体物質からゲノムＤＮＡを単離
し、 ｂ）５つの異なるプライマー対を用いて前記ＤＮＡの５
つの異なるミクロサテライト座のＤＮＡを増幅し、ここ
で、増幅対象のミクロサテライト座は、２つのモノヌク
レオチドリピート座、クラス２ａの１または２つのジヌ
クレオチドリピート座、クラス２ｂの１または２つのジ
ヌクレオチドリピート座、任意に１つのペンタヌクレオ
チドリピート座から選択され、 ｃ）増幅産物の大きさを決定する工程を含むミクロサテ
ライト座の分析方法、（２） ５つのミクロサテライト
座が、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、
Ｍｆｄ１５、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１８Ｓ６９およびＴＰ５
３Ａｌｕからなる群より選ばれた座である前記（１）記
載のミクロサテライト座の分析方法、（３） 少なくと
も１種のプライマー対が、配列番号：１、２、５、６、
１９、２０、２７、２８、３１、３２、３３、３４、３
５、３６、４５および４６で示されたプライマーからな
る群より選ばれる前記（２）記載のミクロサテライト座
の分析方法、（４） ５つのミクロサテライト座とし
て、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およ
びＤ２Ｓ１２３を解析する前記（２）記載のミクロサテ
ライト座の分析方法、（５） 少なくとも１種のプライ
マー対が、配列番号：１、２、５、６、１９、２０、３
３、３４、３５および３６で示されたプライマーからな
る群より選ばれる前記（３）記載のミクロサテライト座
の分析方法、（６） ５つのミクロサテライト座とし
て、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およ
びＤ２Ｓ１２３を解析する前記（２）記載のミクロサテ
ライト不安定性の分析方法、（７） 少なくとも１種の
プライマー対が、配列番号：１、２、５、６、１９、２
０、３１、３２、３３および３４で示されたプライマー
からなる群より選ばれる前記（３）記載のミクロサテラ
イト座の分析方法、（８） ミクロサテライト不安定性
が５つの試験された座で全く検出されないとき、ＲＥＲ
−表現型であると推定し、ミクロサテライト不安定性が
２種以上の座で検出されるとき、ＲＥＲ＋表現型である
と推定して、ＲＥＲ表現型を決定する、前記（１）〜
（７）いずれか記載のミクロサテライト座の分析方法、
（９） 前記（１）〜（８）いずれか記載の方法を用い
て、腫瘍の予後診断を行なう方法、（１０） 前記
（１）〜（８）いずれか記載の方法を用いて、家族性の
腫瘍疾病素質の診断を行なう方法、（１１） 子宮内膜
および胃腸系の腫瘍を指示するための、前記（９）また
は（１０）記載の方法、（１２） 結腸直腸の腫瘍を指
示するための、前記（１１）記載の方法、（１３） 前
記（１）〜（８）いずれか記載の方法を用いて、転移腫
瘍細胞におけるミクロサテライト不安定性の検出による
腫瘍の早期認識を行なう方法、（１４） 前記（１）〜
（８）いずれか記載の方法を用いて、治療方法のタイプ
を決定する方法、（１５） ２つのモノヌクレオチドリ
ピート座、クラス２ａの１または２つのジヌクレオチド
リピート座、クラス２ｂの１または２つのジヌクレオチ
ドリピート座および１つのペンタヌクレオチドリピート
座より選択されるミクロサテライト座のＤＮＡ増幅に適
する少なくとも５つのプライマー対を含んでなる、ミク
ロサテライト不安定性によって腫瘍診断分析をするため
のキット、（１６） ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ
４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１８Ｓ６
９およびＴＰ５３Ａｌｕからなる群より選ばれた５つの
座のＤＮＡ増幅に適する５つのプライマー対を含んでな
る、ミクロサテライト不安定性によって腫瘍診断分析を
するためのキット、（１７） 少なくとも１種のプライ
マー対が、配列番号：１、２、５、６、１９、２０、２
７、２８、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４５
および４６で示されたプライマーからなる群より選ばれ
た５つのプライマー対を含んでなる、ミクロサテライト
不安定性によって腫瘍診断分析をするためのキット、
（１８） ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１
５およびＤ２Ｓ１２３のＤＮＡ増幅に適する５つのプラ
イマー対を含んでなる、前記（１６）記載のキット、
（１９） 配列番号：１、２、５、６、１９、２０、３
３、３４、３５および３６で示されたプライマーからな
る群より選ばれた少なくとも１種のプライマー対を含ん
でなる、前記（１７）記載のキット、（２０） ＢＡＴ
２５、ＢＡＴ２６、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およびＤ２Ｓ１
２３のＤＮＡ増幅に適する５つのプライマー対を含んで
なる、前記（１６）記載のキット、（２１） 配列番
号：１、２、５、６、１９、２０、３１、３２、３３お
よび３４により示されるプライマーからなる群より選ば
れた少なくとも１種のプライマー対を含んでなる前記
（１７）記載のキット、に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】すなわち本発明は、（１）ａ）ヒ
ト生体物質からゲノムＤＮＡを単離し、 ｂ）５つの異なるプライマー対を用いて前記ＤＮＡの５
つの異なるミクロサテライト座のＤＮＡを増幅し、ここ
で、増幅対象のミクロサテライト座は、２つのモノヌク
レオチドリピート座、クラス２ａの１または２つのジヌ
クレオチドリピート座、クラス２ｂの１または２つのジ
ヌクレオチドリピート座、任意に１つのペンタヌクレオ
チドリピート座から選択され、 ｃ）増幅産物の大きさを決定する 工程を含むミクロサテライト座の分析方法による癌の診
断方法に関する。
ト生体物質からゲノムＤＮＡを単離し、 ｂ）５つの異なるプライマー対を用いて前記ＤＮＡの５
つの異なるミクロサテライト座のＤＮＡを増幅し、ここ
で、増幅対象のミクロサテライト座は、２つのモノヌク
レオチドリピート座、クラス２ａの１または２つのジヌ
クレオチドリピート座、クラス２ｂの１または２つのジ
ヌクレオチドリピート座、任意に１つのペンタヌクレオ
チドリピート座から選択され、 ｃ）増幅産物の大きさを決定する 工程を含むミクロサテライト座の分析方法による癌の診
断方法に関する。
【００１５】１つの態様は、分析対象の５つのミクロサ
テライト座がＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０、Ａ
ＰＣ、Ｍｆｄ１５、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１８Ｓ６９および
ＴＰ５３Ａｌｕを含む座からなる群より選ばれるという
特別な利点があることを明らかにする。特別な態様とし
て、プライマー対が、これらの座の５つの分析のための
配列番号：１、２、５、６、１９、２０、２７、２８、
３１、３２、３３、３４、３５、３６、４５および４６
により示されるプライマーからなる群より選ばれるとい
う特別な利点にあることが明らかである。
テライト座がＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０、Ａ
ＰＣ、Ｍｆｄ１５、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１８Ｓ６９および
ＴＰ５３Ａｌｕを含む座からなる群より選ばれるという
特別な利点があることを明らかにする。特別な態様とし
て、プライマー対が、これらの座の５つの分析のための
配列番号：１、２、５、６、１９、２０、２７、２８、
３１、３２、３３、３４、３５、３６、４５および４６
により示されるプライマーからなる群より選ばれるとい
う特別な利点にあることが明らかである。
【００１６】特別な態様において、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ
４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およびＤ２Ｓ１２３の５つの
座が分析される。この場合、配列番号：１、２、５、
６、１９、２０、３３、３４、３５、３６に対応する１
または複数のプライマー対を使うことができる。
４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およびＤ２Ｓ１２３の５つの
座が分析される。この場合、配列番号：１、２、５、
６、１９、２０、３３、３４、３５、３６に対応する１
または複数のプライマー対を使うことができる。
【００１７】さらに特別な態様において、ＢＡＴ２５、
ＢＡＴ２６、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およびＤ２Ｓ１２３を
分析した。この場合、配列番号：１、２、５、６、１
９、２０、３１、３２、３３、３４に対応する１または
複数のプライマー対を使うことができる。
ＢＡＴ２６、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およびＤ２Ｓ１２３を
分析した。この場合、配列番号：１、２、５、６、１
９、２０、３１、３２、３３、３４に対応する１または
複数のプライマー対を使うことができる。
【００１８】本発明のさらなる主題は、ミクロサテライ
ト不安定性が５つの試験された座で全く検出されない場
合、ＲＥＲ−表現型が推定され、ミクロサテライト不安
定性が２種以上の座で検出される場合、ＲＥＲ＋表現型
が推定されることを特徴とするＲＥＲ表現型の決定への
本方法の適用である。
ト不安定性が５つの試験された座で全く検出されない場
合、ＲＥＲ−表現型が推定され、ミクロサテライト不安
定性が２種以上の座で検出される場合、ＲＥＲ＋表現型
が推定されることを特徴とするＲＥＲ表現型の決定への
本方法の適用である。
【００１９】特別な態様は、腫瘍、好ましくは子宮内
膜、胃腸系および、ある種の結腸直腸腫瘍の予後診断へ
の本方法の適用である。
膜、胃腸系および、ある種の結腸直腸腫瘍の予後診断へ
の本方法の適用である。
【００２０】本発明の他の特別の態様は、家族性の腫瘍
疾病素質、好ましくは、子宮内膜、胃腸系、およびある
種の結腸直腸の腫瘍を指示することによる診断への本発
明の適用がある。
疾病素質、好ましくは、子宮内膜、胃腸系、およびある
種の結腸直腸の腫瘍を指示することによる診断への本発
明の適用がある。
【００２１】本発明のさらに特別な態様は転移腫瘍細胞
におけるミクロサテライト不安定性を検出することによ
る腫瘍の早期認識への本方法の適用である。
におけるミクロサテライト不安定性を検出することによ
る腫瘍の早期認識への本方法の適用である。
【００２２】本発明のさらなる態様は、治療方法のタイ
プの決定、例えば、どの化学療法のタイプを患者に使用
すべきかを決定する前の本方法の適用である。このこと
は、化学療法がしばしば望まれない副作用に関連し、特
別なタイプの腫瘍の治療などの効果的でない使用は可能
であれば避けられるべきであるので、重要である。
プの決定、例えば、どの化学療法のタイプを患者に使用
すべきかを決定する前の本方法の適用である。このこと
は、化学療法がしばしば望まれない副作用に関連し、特
別なタイプの腫瘍の治療などの効果的でない使用は可能
であれば避けられるべきであるので、重要である。
【００２３】本発明のさらなる主題は、２つのモノヌク
レオチドリピート座、クラス２ａの１または２つのジヌ
クレオチドリピート座、クラス２ｂの１または２つのジ
ヌクレオチドリピート座および任意に１つのペンタヌク
レオチドリピート座のＤＮＡ増幅に適する少なくとも５
つのプライマー対を含んでなる、ミクロサテライト不安
定性によって腫瘍診断の分析をするためのキットであ
る。
レオチドリピート座、クラス２ａの１または２つのジヌ
クレオチドリピート座、クラス２ｂの１または２つのジ
ヌクレオチドリピート座および任意に１つのペンタヌク
レオチドリピート座のＤＮＡ増幅に適する少なくとも５
つのプライマー対を含んでなる、ミクロサテライト不安
定性によって腫瘍診断の分析をするためのキットであ
る。
【００２４】前記キットの特に好ましい態様は、ＢＡＴ
２５、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５、
Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１８Ｓ６９およびＴＰ５３Ａｌｕから
なる群より選ばれた５つの座のＤＮＡ増幅に適する少な
くとも５つのプライマー対を含む。これらのプライマー
は、好ましくは、配列番号：１、２、５、６、１９、２
０、２７、２８、３１、３２、３３、３４、３５、３
６、４５および４６の配列を有する。
２５、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５、
Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１８Ｓ６９およびＴＰ５３Ａｌｕから
なる群より選ばれた５つの座のＤＮＡ増幅に適する少な
くとも５つのプライマー対を含む。これらのプライマー
は、好ましくは、配列番号：１、２、５、６、１９、２
０、２７、２８、３１、３２、３３、３４、３５、３
６、４５および４６の配列を有する。
【００２５】特に好ましいキットの態様は、ＢＡＴ２
６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およびＤ２Ｓ１２
３の分析のための少なくとも５つのプライマー対を含
む。この場合、１または複数のプライマー対は、配列番
号：１、２、５、６、１９、２０、３３、３４、３５、
３６．．．などに対応する配列を有する。
６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およびＤ２Ｓ１２
３の分析のための少なくとも５つのプライマー対を含
む。この場合、１または複数のプライマー対は、配列番
号：１、２、５、６、１９、２０、３３、３４、３５、
３６．．．などに対応する配列を有する。
【００２６】該５つのプライマー対に加えて、これらの
キットは、さらに、プライマー対、分子生物学的試薬お
よび本発明のＭＩＮ分析を行なうために役に立つ試薬を
含む。
キットは、さらに、プライマー対、分子生物学的試薬お
よび本発明のＭＩＮ分析を行なうために役に立つ試薬を
含む。
【００２７】種々の生物学的物質は、目的に応じてゲノ
ムＤＮＡを単離するための源として、分析することがで
きる。患者から取られた腫瘍組織が予後診断ならびに家
族性の疾病素質の診断に使用される。本発明の方法が、
転移腫瘍細胞におけるＭＩＮの検出による癌の早期認識
に使用される場合、ＤＮＡを、例えば、血液、血清、血
漿、尿または糞便などの細胞構成物を含む体液または体
分泌物から単離する。
ムＤＮＡを単離するための源として、分析することがで
きる。患者から取られた腫瘍組織が予後診断ならびに家
族性の疾病素質の診断に使用される。本発明の方法が、
転移腫瘍細胞におけるＭＩＮの検出による癌の早期認識
に使用される場合、ＤＮＡを、例えば、血液、血清、血
漿、尿または糞便などの細胞構成物を含む体液または体
分泌物から単離する。
【００２８】規定どおりに、対照反応として、分析対象
のミクロサテライト座の『健康な』野生型に相当する配
列のＤＮＡでを行なう。同一個体の健康な、非腫瘍化組
織から単離されたゲノムＤＮＡが特に好適である。
のミクロサテライト座の『健康な』野生型に相当する配
列のＤＮＡでを行なう。同一個体の健康な、非腫瘍化組
織から単離されたゲノムＤＮＡが特に好適である。
【００２９】ゲノムＤＮＡは、下記のように、パラフィ
ンで包埋したホルマリン染色組織から単離される。 −マイクロトームで５μｍ切片を調製し、顕微鏡スライ
ド上にマウントする。 −脱パラフィン化：６５℃で１時間顕微鏡用スライドを
インキュベートする。
ンで包埋したホルマリン染色組織から単離される。 −マイクロトームで５μｍ切片を調製し、顕微鏡スライ
ド上にマウントする。 −脱パラフィン化：６５℃で１時間顕微鏡用スライドを
インキュベートする。
【００３０】 アルコールシリーズに『かける』：キシロールで２×１５分間 エタノール（無水）中で２×１５分間 エタノール（９６％）で２×１５分間 エタノール（７０％）で２×１５分間 （７０％エタノール中で数週間保存できる。） −顕微鏡スライドから水へ移す。 −スカルペル、ガラスキャピラリーなどで湿潤下、組織
を引っかき（顕微解剖）、０．５ｍｌ反応容器に移す。 −２０〜５０μｌ消化緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５ ５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ １ｍＭ ＥＤＴＡ を添加する。 −７〜１５μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）
を添加する（与えられた体積の３０−５０％に相当） −溶液が透明になるまで、ヒートカバーを有するサーモ
ブロック中５０℃でインキュベートする（一夜） −プロテイナーゼＫを不活性化する：９４℃で１５分間
を引っかき（顕微解剖）、０．５ｍｌ反応容器に移す。 −２０〜５０μｌ消化緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５ ５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ １ｍＭ ＥＤＴＡ を添加する。 −７〜１５μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）
を添加する（与えられた体積の３０−５０％に相当） −溶液が透明になるまで、ヒートカバーを有するサーモ
ブロック中５０℃でインキュベートする（一夜） −プロテイナーゼＫを不活性化する：９４℃で１５分間
【００３１】任意に、ＤＮＡをさらにキアジェン（Quia
gen)社製キアジェンティッシュＤＮＡキットで精製して
もよい。
gen)社製キアジェンティッシュＤＮＡキットで精製して
もよい。
【００３２】生物学的物質の分析のために、ＰＣＲ混合
物を表１に示すスキームに従ってピペットする。
物を表１に示すスキームに従ってピペットする。
【００３３】
【表１】
【００３４】もし互いにかなり異なる断片長が期待され
る場合、二者択一するように、２または数個の座を１反
応溶液中、二重または多重の分析で共に分析した。この
ため、２または数個のプライマー対を０．３μＭ／プラ
イマーの同じ最終濃度で使用された。
る場合、二者択一するように、２または数個の座を１反
応溶液中、二重または多重の分析で共に分析した。この
ため、２または数個のプライマー対を０．３μＭ／プラ
イマーの同じ最終濃度で使用された。
【００３５】ＰＣＲ増幅物をＭＪリサーチサーモサイク
ラー（ＰＴＣ１００、ＭＪリサーチ、ウォータータウ
ン、マサチューセッツ州）中１００ｎｇ精製ゲノムＤＮ
Ａと標準条件下で表２に示すサイクルで行なった。
ラー（ＰＴＣ１００、ＭＪリサーチ、ウォータータウ
ン、マサチューセッツ州）中１００ｎｇ精製ゲノムＤＮ
Ａと標準条件下で表２に示すサイクルで行なった。
【００３６】
【表２】
【００３７】ＰＣＲ産物をＳｅｑｕｉＧｅｎシークエン
スゲルチャンバー（バイオラッド社製、ヘルクレス、カ
リフォルニア州）で、５０％尿素を含む変性６．７％ポ
リアクリルアミドゲル上１８００ボルト、５５℃で約１
時間、分離し、改変染色バス〔ベンダー(Bender)ら、(1
994)、Biotechniques 、16、204-206 〕〔シュレグル(S
chlegl) ら、(1995)、Virchows Archiv 、426 、223-22
7 〕中で、硝酸銀染色した(Budowleら、(1991)、Am. J.
Hum. Genet.、48、137-144)。
スゲルチャンバー（バイオラッド社製、ヘルクレス、カ
リフォルニア州）で、５０％尿素を含む変性６．７％ポ
リアクリルアミドゲル上１８００ボルト、５５℃で約１
時間、分離し、改変染色バス〔ベンダー(Bender)ら、(1
994)、Biotechniques 、16、204-206 〕〔シュレグル(S
chlegl) ら、(1995)、Virchows Archiv 、426 、223-22
7 〕中で、硝酸銀染色した(Budowleら、(1991)、Am. J.
Hum. Genet.、48、137-144)。
【００３８】ＰＣＲバンドを分離するためのポリアクリルアミドゲル電気泳動 （６．７％ ＰＡ−６Ｍ尿素ゲル、直立した装置、Ｓｅｑｕｉ−ＧｅｎＧＴ、バ イオラッド社製） −３μｌＰＣＲ産物。 −３μｌローディング緩衝液（１０ｍｌホルムアミド １０ｍｇキシレンシアノール １０ｍｇブロモフェノールブルー ２００μｌＥＤＴＡ、０．５Ｍ） −変性、９４℃、５分間 −１５分間ＰＡ開始ゲルのプレラン２３００Ｖ（５５℃に達するまで） −ＰＡゲルにローディング −４５〜７５分間のランニングタイム１８００Ｖ、５５℃
【００３９】銀染色による分離されたＰＣＲ産物の検出 −ＰＡゲルからの熱交換プレートの除去し（熱交換プレ
ートとガラスプレートの間）、ＰＡゲルにプレキシグラ
ス(Plexiglas) 染色フレームを設置し（ガラスプレート
に接着させる）、クリップで固定する。 −下記溶液を添加する。
ートとガラスプレートの間）、ＰＡゲルにプレキシグラ
ス(Plexiglas) 染色フレームを設置し（ガラスプレート
に接着させる）、クリップで固定する。 −下記溶液を添加する。
【００４０】 Ｈ2 Ｏ さっと洗浄する。
【００４１】 １０％エタノール １０分間 １％硝酸 ３分間 Ｈ2 Ｏ 洗浄する。
【００４２】 ０．０１２Ｍ硝酸銀 ２０分間 Ｈ2 Ｏ 洗浄する。
【００４３】 ０．２８Ｍ ＮａＣＯ3 ／０．０１９％ホルマリン 洗浄する。
【００４４】 ０．２８Ｍ ＮａＣＯ3 ／０．０１９％ホルマリン ３〜６分間（バンド が見えるまで） １０％酢酸 ３分間 Ｈ2 Ｏ ３分間 −染色フレームを除去する。 −ＰＡゲルにワットマン(Whatmann)３ＭＭペーパーを設
置し、ガラスプレートから該ＰＡゲルを除去するために
これを使用する。 −クリングフィルムでＰＡゲルを覆い、ゲルドライヤー
(GelDrying System 、バイオラッド社製) で１時間乾燥
する（本方法で処理されたゲルは、ほぼ無限保存するこ
とができる）。
置し、ガラスプレートから該ＰＡゲルを除去するために
これを使用する。 −クリングフィルムでＰＡゲルを覆い、ゲルドライヤー
(GelDrying System 、バイオラッド社製) で１時間乾燥
する（本方法で処理されたゲルは、ほぼ無限保存するこ
とができる）。
【００４５】結腸直腸癌を有する２７人の患者由来のＤ
ＮＡ上の２５の異なるＭＩＳ座がＭＩＮを試験された。
選択された患者群は、５つのＭＩＳ座が早期予期研究で
分析された２００人の患者の群から予め選択された（Ａ
ＰＣ、Ｄ９Ｓ１７１、ＴＰ５３、Ｄ１３Ｓ１７５、Ｄ１
１Ｓ９０４）。これらの２７人の患者において、ＭＩＮ
は５つのケースで少なくとも２つの座で検出され、さら
に５つのケースが１つの座で不安定性を発現し、したが
って『低ＭＩＮ＋』として分類された。
ＮＡ上の２５の異なるＭＩＳ座がＭＩＮを試験された。
選択された患者群は、５つのＭＩＳ座が早期予期研究で
分析された２００人の患者の群から予め選択された（Ａ
ＰＣ、Ｄ９Ｓ１７１、ＴＰ５３、Ｄ１３Ｓ１７５、Ｄ１
１Ｓ９０４）。これらの２７人の患者において、ＭＩＮ
は５つのケースで少なくとも２つの座で検出され、さら
に５つのケースが１つの座で不安定性を発現し、したが
って『低ＭＩＮ＋』として分類された。
【００４６】１７のケースでは不安定性が検出すること
ができなかった。さらに、ＭＩＳ安定細胞株（ＳＷ４８
０）およびｈＭＳＨ２ミスマッチ修復遺伝子における欠
損を有するＲＥＲ＋表現型を有する細胞株（ＨＣＴ１１
６）が腫瘍試料と比較された。
ができなかった。さらに、ＭＩＳ安定細胞株（ＳＷ４８
０）およびｈＭＳＨ２ミスマッチ修復遺伝子における欠
損を有するＲＥＲ＋表現型を有する細胞株（ＨＣＴ１１
６）が腫瘍試料と比較された。
【００４７】ＭＩＳ分析はこれらの腫瘍のＭＩＮの状態
の詳細な分析の２５ＭＩＳ座の全体に拡張された。６つ
の異なるリピート型の全ての見本が分析された：３つの
モノヌクレオチドリピート座（ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２
６、ＢＡＴ４０）、クラス２ａの６つのＣＡジヌクレオ
チドリピート（ＡＰＣ、Ｄ１３Ｓ１７５、Ｄ３Ｓ１２８
３、Ｍｆｄ２６、Ｍｆｄ２８およびＭｆｄ４１）、クラ
ス２ｂの８つのジヌクレオチドリピート（Ｍｆｄ１５、
Ｄ１０Ｓ１９７、Ｄ１１Ｓ１３１８、Ｄ１１Ｓ９０４、
Ｄ１８Ｓ６９、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ９Ｓ１７１、ＴＰ５３
ＰＣＲ）、トリヌクレオチドリピートを有する２つの座
（ＡＲ、ＴＢＰ）、テトラヌクレオチドリピートを有す
る３つの座（ＨＰＲＴ、ＭＹＣＬ１、ＲＢ）およびペン
タヌクレオチドリピートを有する２つの座（ＦＭＲ２、
ＴＰ５３ａｌｕ）。これらのリピートの確定した配列は
遺伝子ライブラリデーターベースから得られたか、ＰＣ
Ｒ産物を直接シークエンスすることによりチェックされ
た。図１は、分析された座ならびに配列番号：１〜５０
に示される配列の各々の増幅物に使用されるプライマー
を与える。図２ａは、２５の全ての試験された遺伝子座
の異なるアレルの増幅の例を示す。図２ｂは、座ＢＡＴ
４０およびＤ２Ｓ１２８３の２連分析の例を示す。ヘテ
ロ接合の腫瘍依存性の欠損〔ヘテロ接合の欠損、ＬＯＨ
（リマオ(Limao) ら、(1996)、サイエンス、271 、659-
662 〕によりアレルの欠損を生じた場合には、各々のＰ
ＣＲの結果は、本研究において考慮に入れなかった。
の詳細な分析の２５ＭＩＳ座の全体に拡張された。６つ
の異なるリピート型の全ての見本が分析された：３つの
モノヌクレオチドリピート座（ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２
６、ＢＡＴ４０）、クラス２ａの６つのＣＡジヌクレオ
チドリピート（ＡＰＣ、Ｄ１３Ｓ１７５、Ｄ３Ｓ１２８
３、Ｍｆｄ２６、Ｍｆｄ２８およびＭｆｄ４１）、クラ
ス２ｂの８つのジヌクレオチドリピート（Ｍｆｄ１５、
Ｄ１０Ｓ１９７、Ｄ１１Ｓ１３１８、Ｄ１１Ｓ９０４、
Ｄ１８Ｓ６９、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ９Ｓ１７１、ＴＰ５３
ＰＣＲ）、トリヌクレオチドリピートを有する２つの座
（ＡＲ、ＴＢＰ）、テトラヌクレオチドリピートを有す
る３つの座（ＨＰＲＴ、ＭＹＣＬ１、ＲＢ）およびペン
タヌクレオチドリピートを有する２つの座（ＦＭＲ２、
ＴＰ５３ａｌｕ）。これらのリピートの確定した配列は
遺伝子ライブラリデーターベースから得られたか、ＰＣ
Ｒ産物を直接シークエンスすることによりチェックされ
た。図１は、分析された座ならびに配列番号：１〜５０
に示される配列の各々の増幅物に使用されるプライマー
を与える。図２ａは、２５の全ての試験された遺伝子座
の異なるアレルの増幅の例を示す。図２ｂは、座ＢＡＴ
４０およびＤ２Ｓ１２８３の２連分析の例を示す。ヘテ
ロ接合の腫瘍依存性の欠損〔ヘテロ接合の欠損、ＬＯＨ
（リマオ(Limao) ら、(1996)、サイエンス、271 、659-
662 〕によりアレルの欠損を生じた場合には、各々のＰ
ＣＲの結果は、本研究において考慮に入れなかった。
【００４８】ＲＥＲ＋腫瘍の同定 どの腫瘍がＲＥＲ＋として明確に分類されるかを明らか
にし、ある腫瘍が『弱いＲＥＲ＋』として分類されるか
を試験するために、種々の腫瘍を他の腫瘍と比較した。
現状によると、ＲＥＲ＋またはＲＥＲ−の腫瘍の明白な
分類の法則による二者択一の簡単な方法はない。当初そ
の１７人がＲＥＲ−、５人がＲＥＲ＋、５人が『低ＭＩ
Ｎ＋』として診断された２７人の結腸直腸腫瘍患者の予
め選択された群は、さらなる座の分析後のＭＩＮの分布
によって明らかに、より区別化された図を生じる。
にし、ある腫瘍が『弱いＲＥＲ＋』として分類されるか
を試験するために、種々の腫瘍を他の腫瘍と比較した。
現状によると、ＲＥＲ＋またはＲＥＲ−の腫瘍の明白な
分類の法則による二者択一の簡単な方法はない。当初そ
の１７人がＲＥＲ−、５人がＲＥＲ＋、５人が『低ＭＩ
Ｎ＋』として診断された２７人の結腸直腸腫瘍患者の予
め選択された群は、さらなる座の分析後のＭＩＮの分布
によって明らかに、より区別化された図を生じる。
【００４９】図３及び図４ａに示すように、５０％を超
えるＭＩＮの割合を生じる３つの腫瘍（１４ＭＩＮ／２
４座、配列番号：１、８および１６）、４２％の１つの
腫瘍（１０ＭＩＮ／２４座、配列番号：５）、３８％の
１つの癌（９ＭＩＮ／２４座、配列番号：２）および２
９％の１つの座（７ＭＩＮ／２４座、配列番号：１３）
を検出することができる。このように、これらの全ての
腫瘍が解析された座の２５％を超える不安定性頻度の共
通の特徴を持つ。この全ての６／２７腫瘍は明白なＲＥ
Ｒ＋として分類された。
えるＭＩＮの割合を生じる３つの腫瘍（１４ＭＩＮ／２
４座、配列番号：１、８および１６）、４２％の１つの
腫瘍（１０ＭＩＮ／２４座、配列番号：５）、３８％の
１つの癌（９ＭＩＮ／２４座、配列番号：２）および２
９％の１つの座（７ＭＩＮ／２４座、配列番号：１３）
を検出することができる。このように、これらの全ての
腫瘍が解析された座の２５％を超える不安定性頻度の共
通の特徴を持つ。この全ての６／２７腫瘍は明白なＲＥ
Ｒ＋として分類された。
【００５０】さらに８つの付け加えられた腫瘍が１〜２
のＭＩＮ事象を有すること（ｎ＝８、ＭＩＮ頻度８％以
下）が同定され、それゆえに『低ＭＩＮ＋』として分類
された。２５のＭＩＳ座のかわりに５つのみが分析され
た早期研究と比較して、新たな研究は、ＲＥＲ−として
分類される以外の１７のケースの代わりに１３を可能に
する。このように、分析を２５のＭＩＳ座に広げること
によって達せられたこの結果は、現状による早期研究と
根本的に異なり、少数のＭＩＳ座がかかる分類のために
任意に選択されるとき、信頼できないＲＥＲ分類の問題
を示す。しかしながら、これに関しては、ＲＥＲ＋分類
が２５％を超えるＭＩＮの割合で明白な作ることができ
るような１０〜２５％のパーセンテージに相当する３〜
６の座の平均不安定性を有するいかなる腫瘍をも検出す
ることができなかったことは、特に重要なことである。
のＭＩＮ事象を有すること（ｎ＝８、ＭＩＮ頻度８％以
下）が同定され、それゆえに『低ＭＩＮ＋』として分類
された。２５のＭＩＳ座のかわりに５つのみが分析され
た早期研究と比較して、新たな研究は、ＲＥＲ−として
分類される以外の１７のケースの代わりに１３を可能に
する。このように、分析を２５のＭＩＳ座に広げること
によって達せられたこの結果は、現状による早期研究と
根本的に異なり、少数のＭＩＳ座がかかる分類のために
任意に選択されるとき、信頼できないＲＥＲ分類の問題
を示す。しかしながら、これに関しては、ＲＥＲ＋分類
が２５％を超えるＭＩＮの割合で明白な作ることができ
るような１０〜２５％のパーセンテージに相当する３〜
６の座の平均不安定性を有するいかなる腫瘍をも検出す
ることができなかったことは、特に重要なことである。
【００５１】異なるＭＩＳ座は異なるＭＩＮ頻度を持つ ミクロサテライト全体は、２７の試験された癌の１４に
おける不安定性により影響された。予期されたように、
ＭＩＮはある腫瘍においては、より頻繁に生じた。しか
しながら、個々のＭＩＮ事象は、さらに、他の腫瘍にお
いても検出された。ＭＩＮ頻度がリピート型に依存する
かどうかを決定するために、該ＭＩＮ頻度を各々のリピ
ート型に分けて検出し、試験されたミクロサテライトの
全体の平均ＭＩＮ頻度と比較した。患者あたりの試験さ
れた全ての座に関連する平均ＭＩＮ割合は、１１．４％
であった（７８ＭＩＮ／２５座＝３．１ＭＩＮ／座；平
均ＭＩＮ割合＝３．１／２７患者＝１１．４％）。対照
的に、個々のリピート型の範囲内の平均頻度が異なって
いた。全モノヌクレオチドリピートが、平均（５．０Ｍ
ＩＮ／２７患者＝１８．５％＝＋７．１％）よりさらに
頻繁に変化した。全ての他のリピート型がモノヌクレオ
チドリピートよりも少ない頻度で影響された。複合体ジ
ヌクレオチド座ならびに非複合体ジヌクレオチド座のＭ
ＩＮ割合は、すべての座の全体で決定された平均と顕著
に異ならなかった（０．３および０．９％）。これは、
しかしながら個々の座それぞれに関しては、明白なヘテ
ロ接合を有するテトラヌクレオチドリピート（＋１．４
％）にも同様に適用される。増加したＭＩＮ頻度は、両
方のトリヌクレオチドリピートにおいて決定された（＋
３．４％）。対照的に、ペンタヌクレオチドリピートは
前記平均ＭＩＮ頻度を有していた（−４．０％）。この
タイプの１つの座においては、ＭＩＮが全く検出されな
かった（ＦＭＲ２）。ＭＩＮ事象の頻度の決定が分析さ
れた座の選抜への劇的な依存であることを示す。
おける不安定性により影響された。予期されたように、
ＭＩＮはある腫瘍においては、より頻繁に生じた。しか
しながら、個々のＭＩＮ事象は、さらに、他の腫瘍にお
いても検出された。ＭＩＮ頻度がリピート型に依存する
かどうかを決定するために、該ＭＩＮ頻度を各々のリピ
ート型に分けて検出し、試験されたミクロサテライトの
全体の平均ＭＩＮ頻度と比較した。患者あたりの試験さ
れた全ての座に関連する平均ＭＩＮ割合は、１１．４％
であった（７８ＭＩＮ／２５座＝３．１ＭＩＮ／座；平
均ＭＩＮ割合＝３．１／２７患者＝１１．４％）。対照
的に、個々のリピート型の範囲内の平均頻度が異なって
いた。全モノヌクレオチドリピートが、平均（５．０Ｍ
ＩＮ／２７患者＝１８．５％＝＋７．１％）よりさらに
頻繁に変化した。全ての他のリピート型がモノヌクレオ
チドリピートよりも少ない頻度で影響された。複合体ジ
ヌクレオチド座ならびに非複合体ジヌクレオチド座のＭ
ＩＮ割合は、すべての座の全体で決定された平均と顕著
に異ならなかった（０．３および０．９％）。これは、
しかしながら個々の座それぞれに関しては、明白なヘテ
ロ接合を有するテトラヌクレオチドリピート（＋１．４
％）にも同様に適用される。増加したＭＩＮ頻度は、両
方のトリヌクレオチドリピートにおいて決定された（＋
３．４％）。対照的に、ペンタヌクレオチドリピートは
前記平均ＭＩＮ頻度を有していた（−４．０％）。この
タイプの１つの座においては、ＭＩＮが全く検出されな
かった（ＦＭＲ２）。ＭＩＮ事象の頻度の決定が分析さ
れた座の選抜への劇的な依存であることを示す。
【００５２】あるＭＩＳ座はＲＥＲ＋腫瘍においてより
頻繁に特異的に変化した したがって、ＭＩＮの状態の分析のために、ＲＥＲ＋腫
瘍におけるＭＩＮによって特異的に規則正しく影響され
るある座があるかどうかが重要である。この点で、ＭＩ
Ｓの決まった結果はモノヌクレオチドリピートに達せら
れた（ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０）。これら
の座のそれぞれは、同じ５つのＲＥＲ＋癌で変化したが
（配列番号：１、２、８、１３、１６）、ＲＥＲ−腫瘍
または『低ＭＩＮ』腫瘍においては、ＭＩＮを持たなか
った。対照的に、Ｍｆｄ１５を除く他のすべての試験さ
れた座はＲＥＲ＋腫瘍においてはほとんど変異されてい
ないか、または『低ＭＩＮ』腫瘍においては、さらに変
化しているかのいずれかである。例えば、ＡＰＣ座の場
合、全てのＲＥＲ＋癌だけでなく腫瘍番号：２０におい
てもＭＩＳを検出することができた。５つの座が４／６
ＲＥＲ＋腫瘍においてＭＩＮを発現したが、Ｄ２Ｓ１２
３のみは非ＲＥＲ＋腫瘍において変化しなかった。対照
的に、４／６ＲＥＲ＋腫瘍においても変化した座ＭＹＣ
Ｌ１は、この座がマーカーとして不適切な例であるよう
な、３つの『低ＭＩＮ』癌でのさらなる不安定性を発現
させた。
頻繁に特異的に変化した したがって、ＭＩＮの状態の分析のために、ＲＥＲ＋腫
瘍におけるＭＩＮによって特異的に規則正しく影響され
るある座があるかどうかが重要である。この点で、ＭＩ
Ｓの決まった結果はモノヌクレオチドリピートに達せら
れた（ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０）。これら
の座のそれぞれは、同じ５つのＲＥＲ＋癌で変化したが
（配列番号：１、２、８、１３、１６）、ＲＥＲ−腫瘍
または『低ＭＩＮ』腫瘍においては、ＭＩＮを持たなか
った。対照的に、Ｍｆｄ１５を除く他のすべての試験さ
れた座はＲＥＲ＋腫瘍においてはほとんど変異されてい
ないか、または『低ＭＩＮ』腫瘍においては、さらに変
化しているかのいずれかである。例えば、ＡＰＣ座の場
合、全てのＲＥＲ＋癌だけでなく腫瘍番号：２０におい
てもＭＩＳを検出することができた。５つの座が４／６
ＲＥＲ＋腫瘍においてＭＩＮを発現したが、Ｄ２Ｓ１２
３のみは非ＲＥＲ＋腫瘍において変化しなかった。対照
的に、４／６ＲＥＲ＋腫瘍においても変化した座ＭＹＣ
Ｌ１は、この座がマーカーとして不適切な例であるよう
な、３つの『低ＭＩＮ』癌でのさらなる不安定性を発現
させた。
【００５３】したがってミクロサテライト不安定性の分
析のための５つのマーカーへの限定は、明白に分類でき
ない低ＭＩＮ＋の場合の数を最小化し、全てのＲＥＲ＋
キャリアーが、最も高い確実性の可能な程度で同定しう
ることをそれでもなお確実にしうるような座の特異的な
選抜を要求する。
析のための５つのマーカーへの限定は、明白に分類でき
ない低ＭＩＮ＋の場合の数を最小化し、全てのＲＥＲ＋
キャリアーが、最も高い確実性の可能な程度で同定しう
ることをそれでもなお確実にしうるような座の特異的な
選抜を要求する。
【００５４】
【実施例】以下に本発明の実施例を示し、本発明をさら
に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例などによ
って限定されるものではない。
に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例などによ
って限定されるものではない。
【００５５】実施例１２つのモノヌクレオチドリピート座、クラス２ａの１つ
のジヌクレオチドリピート座、クラス２ｂの１つのジヌ
クレオチドリピート座および１つのペンタヌクレオチド
リピート座 本研究に示すように、これらの座の分析が、特に好適で
あることを明らかにするようにＲＥＲ＋表現型を決定す
るために、モノヌクレオチドリピート座を用いた場合、
擬陽性の結果がない。一方、モノヌクレオチドリピート
座を分析することによって全ＲＥＲ＋腫瘍を検出するこ
とはできなかった。このように、例えば、他のリピート
型を有する９の座でＭＩＮを検出することができたが、
腫瘍Ｎｏ．５が明白にＲＥＲ＋であり、座ＢＡＴ２５、
ＢＡＴ２６およびＢＡＴ４０に関して不安定ではなかっ
た。したがって、５つの解析された座の限定された数を
有するＲＥＲ表現型の最も確実で可能な決定の多種のリ
ピート型の組み合わせを選択することが必要であった。
これは、分析された座の少ない数にもかかわらず、一方
で全ＲＥＲ＋保持者が最も高い可能性の程度の確実性で
同定することができ、もう一方は明白に分類できない低
ＭＩＮ＋の数の場合は可能な限り最小化される。
のジヌクレオチドリピート座、クラス２ｂの１つのジヌ
クレオチドリピート座および１つのペンタヌクレオチド
リピート座 本研究に示すように、これらの座の分析が、特に好適で
あることを明らかにするようにＲＥＲ＋表現型を決定す
るために、モノヌクレオチドリピート座を用いた場合、
擬陽性の結果がない。一方、モノヌクレオチドリピート
座を分析することによって全ＲＥＲ＋腫瘍を検出するこ
とはできなかった。このように、例えば、他のリピート
型を有する９の座でＭＩＮを検出することができたが、
腫瘍Ｎｏ．５が明白にＲＥＲ＋であり、座ＢＡＴ２５、
ＢＡＴ２６およびＢＡＴ４０に関して不安定ではなかっ
た。したがって、５つの解析された座の限定された数を
有するＲＥＲ表現型の最も確実で可能な決定の多種のリ
ピート型の組み合わせを選択することが必要であった。
これは、分析された座の少ない数にもかかわらず、一方
で全ＲＥＲ＋保持者が最も高い可能性の程度の確実性で
同定することができ、もう一方は明白に分類できない低
ＭＩＮ＋の数の場合は可能な限り最小化される。
【００５６】２７の腫瘍での研究により決定された頻度
に基づいて、下記の基準が表現型の決定を主張する。少
なくとも２つのＭＩＳ−陽性の座の場合、ＲＥＲ＋表現
型が推定され、ＭＩＳの陽性検出がない場合、ＲＥＲ−
表現型が推定されるであろう。確実な１つのＭＩＮ事象
の検出は『低ＭＩＮ＋』と定義された（不明瞭な場合、
後者は、さらにＭＩＳ座の解析を要求する）。
に基づいて、下記の基準が表現型の決定を主張する。少
なくとも２つのＭＩＳ−陽性の座の場合、ＲＥＲ＋表現
型が推定され、ＭＩＳの陽性検出がない場合、ＲＥＲ−
表現型が推定されるであろう。確実な１つのＭＩＮ事象
の検出は『低ＭＩＮ＋』と定義された（不明瞭な場合、
後者は、さらにＭＩＳ座の解析を要求する）。
【００５７】本発明によって選択された座ＢＡＴ２６、
ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５、ＴＰ５３Ａｌｕにつ
いて本方法による２７の腫瘍の評価は、図４ｂに示す結
果を導いた。少なくとも３つのＭＩＮ事象の頻度が、２
５の座の分析によりＲＥＲ＋として分類された全６つの
腫瘍を決定した。これらの腫瘍は５つの選択された座の
分析によりＲＥＲ＋としても分類された。２つの腫瘍の
み（番号７、番号２０）が本方法によって、『低ＭＩＮ
＋』として分類され、したがって、明白に解釈すること
ができない。
ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５、ＴＰ５３Ａｌｕにつ
いて本方法による２７の腫瘍の評価は、図４ｂに示す結
果を導いた。少なくとも３つのＭＩＮ事象の頻度が、２
５の座の分析によりＲＥＲ＋として分類された全６つの
腫瘍を決定した。これらの腫瘍は５つの選択された座の
分析によりＲＥＲ＋としても分類された。２つの腫瘍の
み（番号７、番号２０）が本方法によって、『低ＭＩＮ
＋』として分類され、したがって、明白に解釈すること
ができない。
【００５８】実施例２２つのモノヌクレオチドリピート座、クラス２ａの１つ
のジヌクレオチドリピート座およびクラス２ｂの２つの
ジヌクレオチド座の選抜 ２７の腫瘍が、本発明の改変ＭＩＳ選抜を用いて、実施
例１と同様の方法により評価された（ＢＡＴ２６、ＢＡ
Ｔ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およびＤ１８Ｓ６９）。結
果を図４ｃに示す。少なくとも３つの選択された座がＲ
ＥＲ＋表現型を有する全ての腫瘍において変化された。
この座の選抜は、知られた全６つの公知のＲＥＲ＋腫瘍
が明白にＲＥＲ＋として同定することを可能にした。こ
の場合、１つの腫瘍のみが『低ＭＩＮ＋』として分類さ
れ、したがって明白に解釈されることができなかった。
のジヌクレオチドリピート座およびクラス２ｂの２つの
ジヌクレオチド座の選抜 ２７の腫瘍が、本発明の改変ＭＩＳ選抜を用いて、実施
例１と同様の方法により評価された（ＢＡＴ２６、ＢＡ
Ｔ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およびＤ１８Ｓ６９）。結
果を図４ｃに示す。少なくとも３つの選択された座がＲ
ＥＲ＋表現型を有する全ての腫瘍において変化された。
この座の選抜は、知られた全６つの公知のＲＥＲ＋腫瘍
が明白にＲＥＲ＋として同定することを可能にした。こ
の場合、１つの腫瘍のみが『低ＭＩＮ＋』として分類さ
れ、したがって明白に解釈されることができなかった。
【００５９】実施例３診断指標としてのＲＥＲ表現型の決定 本発明のＲＥＲ表現型を決定するための５つの座の選抜
の適性を試験するために、図５において表にされた臨床
データを実施例１由来のＭＩＮ分析の結果と比較した。
本実施例において開示されているように、試験された座
の分析が２７人の試験された腫瘍患者の全体の６人にＲ
ＥＲ＋の検出が導かれた。これらのＲＥＲ＋患者の６人
のうちの２人のみ（３３％）が本研究の結末で死去し
た。両者ともがこの時点で８０歳を超えていた。対照的
に、実施例１においてＲＥＲ−として分類された患者の
１９人のうち８人（４２％）が死去した。本研究の時点
でのかれらの平均年齢６４歳であった。本発明の５つの
ミクロサテライト座の分析は、腫瘍疾病の進行について
の予後診断を可能にしたことが明らかである。
の適性を試験するために、図５において表にされた臨床
データを実施例１由来のＭＩＮ分析の結果と比較した。
本実施例において開示されているように、試験された座
の分析が２７人の試験された腫瘍患者の全体の６人にＲ
ＥＲ＋の検出が導かれた。これらのＲＥＲ＋患者の６人
のうちの２人のみ（３３％）が本研究の結末で死去し
た。両者ともがこの時点で８０歳を超えていた。対照的
に、実施例１においてＲＥＲ−として分類された患者の
１９人のうち８人（４２％）が死去した。本研究の時点
でのかれらの平均年齢６４歳であった。本発明の５つの
ミクロサテライト座の分析は、腫瘍疾病の進行について
の予後診断を可能にしたことが明らかである。
【００６０】
【発明の効果】本発明のミクロサテライト不安定性の分
析方法によれば、胃腸系の腫瘍、好ましくは結腸直腸の
腫瘍の予後診断、疾病素質診断および早期認識をするこ
とができるという優れた効果を奏する。
析方法によれば、胃腸系の腫瘍、好ましくは結腸直腸の
腫瘍の予後診断、疾病素質診断および早期認識をするこ
とができるという優れた効果を奏する。
【００６１】また、本発明のミクロサテライト不安定性
によって腫瘍診断の分析をするためのキットによれば、
胃腸系の腫瘍、好ましくは結腸直腸の腫瘍の予後診断、
疾病素質診断および早期認識を簡便に行なうことができ
るという優れた効果を奏する。
によって腫瘍診断の分析をするためのキットによれば、
胃腸系の腫瘍、好ましくは結腸直腸の腫瘍の予後診断、
疾病素質診断および早期認識を簡便に行なうことができ
るという優れた効果を奏する。
【００６２】
配列番号：１ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： AAACAGGATG CCTGCCTTTA 20
【００６３】配列番号：２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GGACTTTCCA CCTATGGGAC 20
【００６４】配列番号：３ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GGCAGTACCA CCTGTAGAAA TG 22
【００６５】配列番号：４ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GAGTAACAGA GGCATCGTGT ATTC 24
【００６６】配列番号：５ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： ACTCACTCTA GTGATAAATC G 21
【００６７】配列番号：６ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： AGCAGATAAG ACAGTATTAC TAGTT 25
【００６８】配列番号：７ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： AGCTAAGTGA ACCTCATCTC TGTCT 25
【００６９】配列番号：８ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： ACCCTAGCAC TGATGGTATA GTCT 24
【００７０】配列番号：９ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： AACACTAGTG ACATTATTTT C 21
【００７１】配列番号：10 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： AGCTAGGCCT GAAGGCTTCT 20
【００７２】配列番号：11 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： ACCACTGCAC TTCAGGTGAC 20
【００７３】配列番号：12 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GTGATACTGT CCTCAGGTCT CC 22
【００７４】配列番号：13 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： ATGACAAGCA ATCCTTGAGC 20
【００７５】配列番号：14 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： CTGTGTTATA TCCCTAAAGT GGTGA 25
【００７６】配列番号：15 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： CCCGTATGGC AACAGG 16
【００７７】配列番号：16 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： TGTGCATGTC ATGAGTG 17
【００７８】配列番号：17 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： TATTGGATAC TTGAATCTGC TG 22
【００７９】配列番号：18 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： TGCATCACCT CACATAGGTT A 21
【００８０】配列番号：19 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GGAAGAATCA AATAGACAAT 20
【００８１】配列番号：20 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GCTGGCCATA TATATATTTA AACC 24
【００８２】配列番号：21 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： CAGGTTCTGT CATAGGACTA 20
【００８３】配列番号：22 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： TTCTGGAAAC CTACTCCTGA 20
【００８４】配列番号：23 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： CAGAAAATTC TCTCTGGCTA 20
【００８５】配列番号：24 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： CTCATGTTCC TGGCAAGAAT 20
【００８６】配列番号：25 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GCTCCCGGCT GGTTTT 16
【００８７】配列番号：26 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GCAGGAAATC GCAGGAACTT 20
【００８８】配列番号：27 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： CTCTTTCTCT GACTCTGACC 20
【００８９】配列番号：28 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GACTTTCTAA GTTCTTGCCA G 21
【００９０】配列番号：29 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： AGCGCAGCAC CTCCCGGCGC CAGTTT 26
【００９１】配列番号：30 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GCTGCTGCTG CCTGGGGCTA GTCTCTT 27
【００９２】配列番号：31 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： TCGCCTCCAA GAATGTAAGT 20
【００９３】配列番号：32 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： TCTGCATTTT AACTATGGCT C 21
【００９４】配列番号：33 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： TGACTACTTT TGACTTCAGC C 21
【００９５】配列番号：34 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： AACCATTCAA CATTTTTAAC CC 22
【００９６】配列番号：35 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： ATTAACTTCC TACACCACAA C 21
【００９７】配列番号：36 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GTAGAGCAAG ACCACCTTG 19
【００９８】配列番号：37 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： CGGTTATCCC AGTTCGGCCT CTCTGGGAT 29
【００９９】配列番号：38 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： TCCACCTCCC GCTCAGTCAG ACTGCGCT 28
【０１００】配列番号：39 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GCAGCTATAA TGACTAGAAT GAAGTCCTAC TG 32
【０１０１】配列番号：40 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： TTGAATTAAA GACTTGTTTA AACACAAAAT TTAGAC 36
【０１０２】配列番号：41 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： TGGCGAGACT CCATCAAAG 19
【０１０３】配列番号：42 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： CTTTTTAAGC TGCAACAATT TC 22
【０１０４】配列番号：43 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： CTCCTCCCTA CTTACTTGT 19
【０１０５】配列番号：44 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： AATTAACAAG GTGTGGTGG 19
【０１０６】配列番号：45 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GCACTTTCCT CAACTCTACA 20
【０１０７】配列番号：46 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： AACAGCTCCT TTAATGGCAG 20
【０１０８】配列番号：47 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： AGGGATACTA TTCAGCCCGA GGTG 24
【０１０９】配列番号：48 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： ACTGCCACTC CTTGCCCCAT TC 22
【０１１０】配列番号：49 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： CCCACAGCCT ATTCAGAACA C 21
【０１１１】配列番号：50 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： GTTGACTGCT GAACGGCTGC 20
【図１】図１は、分析されたＭＩＳ座の最も重要な特徴
（座シンボル、マーカー名、染色体局在、リピート型）
および個々のＰＣＲ増幅のパラメーター（ＰＣＲ−Ｔ
ｍ：ハイブリダイゼーション温度）の表を示す。
（座シンボル、マーカー名、染色体局在、リピート型）
および個々のＰＣＲ増幅のパラメーター（ＰＣＲ−Ｔ
ｍ：ハイブリダイゼーション温度）の表を示す。
【図２】図２ａは、２５の試験されたミクロサテライト
座のゲル電気泳動分析を示す。本発明の解析対象のＢＡ
Ｔ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、ＭｆＤ１５、Ｄ２Ｓ１２
３およびＴＰ５３Ａｌｕの種々のアレルは、明らかに他
と区別されることができる。図２ｂは、１つの反応混合
物における座ＢＡＴ４０およびＤ３Ｓ１２８３の二重の
分析の例示を示す。
座のゲル電気泳動分析を示す。本発明の解析対象のＢＡ
Ｔ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、ＭｆＤ１５、Ｄ２Ｓ１２
３およびＴＰ５３Ａｌｕの種々のアレルは、明らかに他
と区別されることができる。図２ｂは、１つの反応混合
物における座ＢＡＴ４０およびＤ３Ｓ１２８３の二重の
分析の例示を示す。
【図３】図３は、行なわれた研究の結果の概略を示す。
結腸直腸腫瘍を有する２７人の患者がＭＩＮの２５の異
なるアレルにおいて試験された。結果は、（ｉ）異なる
ＭＩＳが異なる頻度での多型変化により影響をうけるこ
と、および（ii）異なる患者において、ミクロサテライ
トの異なる分類がゲノムの不安定性の異なる頻度で影響
されることを示す。
結腸直腸腫瘍を有する２７人の患者がＭＩＮの２５の異
なるアレルにおいて試験された。結果は、（ｉ）異なる
ＭＩＳが異なる頻度での多型変化により影響をうけるこ
と、および（ii）異なる患者において、ミクロサテライ
トの異なる分類がゲノムの不安定性の異なる頻度で影響
されることを示す。
【図４】図４は、決定したＭＩＮ事象の数による２７人
の試験された患者群由来の腫瘍の分類を示す。図４ａ
は、全２５ＭＩＳの評価を示す。分布は、このクラス
が、表現型ＲＥＲ＋として明白に分類することができる
ような、ＭＩＮが７回を超える頻度で生じる６人の患者
の１つの群があることを示す。さらに、１または２つの
ＭＩＮが検出され、『低ＭＩＮ＋』として分類すること
ができる８人の患者の群がある。図４ｂは、実施例１に
記載されたように５つの選択されたＭＩＳの本発明の分
析を示す。この分析は、さらにＲＥＲ＋表現型について
の明白な決定をすることを可能にする基本への分布をも
導く。２人の患者のみ（番号７、ＴＰ５３Ａｌｕ座およ
び番号２０、ＡＰＣ座）が本方法によって低ＭＩＮ＋と
して分類された。図４ｃは、１つを除き（ＡＰＣ、患者
２０）ＲＥＲ表現型の明白な分類を可能にする実施例２
記載の５つのＭＩＳの本発明の別の選抜の分析を示す。
の試験された患者群由来の腫瘍の分類を示す。図４ａ
は、全２５ＭＩＳの評価を示す。分布は、このクラス
が、表現型ＲＥＲ＋として明白に分類することができる
ような、ＭＩＮが７回を超える頻度で生じる６人の患者
の１つの群があることを示す。さらに、１または２つの
ＭＩＮが検出され、『低ＭＩＮ＋』として分類すること
ができる８人の患者の群がある。図４ｂは、実施例１に
記載されたように５つの選択されたＭＩＳの本発明の分
析を示す。この分析は、さらにＲＥＲ＋表現型について
の明白な決定をすることを可能にする基本への分布をも
導く。２人の患者のみ（番号７、ＴＰ５３Ａｌｕ座およ
び番号２０、ＡＰＣ座）が本方法によって低ＭＩＮ＋と
して分類された。図４ｃは、１つを除き（ＡＰＣ、患者
２０）ＲＥＲ表現型の明白な分類を可能にする実施例２
記載の５つのＭＩＳの本発明の別の選抜の分析を示す。
【図５】図５は、１９９４年８月時点での、検査した患
者群の生年月日、年齢および臨床データを示す(T、N 、
M ：腫瘍分類、G ：段階、LOC ：腫瘍局在、ri：大腸
右、le：大腸左、R ：直腸）。
者群の生年月日、年齢および臨床データを示す(T、N 、
M ：腫瘍分類、G ：段階、LOC ：腫瘍局在、ri：大腸
右、le：大腸左、R ：直腸）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フィッシェル，リチャード アメリカ合衆国 ペンシルヴァニア 19072 ペン バレー，スプラグー ロー ド 575
Claims (21)
- 【請求項１】 ａ）ヒト生体物質からゲノムＤＮＡを単
離し、 ｂ）５つの異なるプライマー対を用いて前記ＤＮＡの５
つの異なるミクロサテライト座のＤＮＡを増幅し、ここ
で、増幅対象のミクロサテライト座は、２つのモノヌク
レオチドリピート座、クラス２ａの１または２つのジヌ
クレオチドリピート座、クラス２ｂの１または２つのジ
ヌクレオチドリピート座、任意に１つのペンタヌクレオ
チドリピート座から選択され、 ｃ）増幅産物の大きさを決定する 工程を含むミクロサテライト座の分析方法。 - 【請求項２】 ５つのミクロサテライト座が、ＢＡＴ２
５、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５、Ｄ
２Ｓ１２３、Ｄ１８Ｓ６９およびＴＰ５３Ａｌｕからな
る群より選ばれた座である請求項１記載のミクロサテラ
イト座の分析方法。 - 【請求項３】 少なくとも１種のプライマー対が、配列
番号：１、２、５、６、１９、２０、２７、２８、３
１、３２、３３、３４、３５、３６、４５および４６で
示されたプライマーからなる群より選ばれる請求項２記
載のミクロサテライト座の分析方法。 - 【請求項４】 ５つのミクロサテライト座として、ＢＡ
Ｔ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およびＤ２Ｓ
１２３を解析する請求項２記載のミクロサテライト座の
分析方法。 - 【請求項５】 少なくとも１種のプライマー対が、配列
番号：１、２、５、６、１９、２０、３３、３４、３５
および３６で示されたプライマーからなる群より選ばれ
る請求項３記載のミクロサテライト座の分析方法。 - 【請求項６】 ５つのミクロサテライト座として、ＢＡ
Ｔ２５、ＢＡＴ２６、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５およびＤ２Ｓ
１２３を解析する請求項２記載のミクロサテライト不安
定性の分析方法。 - 【請求項７】 少なくとも１種のプライマー対が、配列
番号：１、２、５、６、１９、２０、３１、３２、３３
および３４で示されたプライマーからなる群より選ばれ
る請求項３記載のミクロサテライト座の分析方法。 - 【請求項８】 ミクロサテライト不安定性が５つの試験
された座で全く検出されないとき、ＲＥＲ−表現型であ
ると推定し、ミクロサテライト不安定性が２種以上の座
で検出されるとき、ＲＥＲ＋表現型であると推定して、
ＲＥＲ表現型を決定する、請求項１〜７いずれか記載の
ミクロサテライト座の分析方法。 - 【請求項９】 請求項１〜８いずれか記載の方法を用い
て、腫瘍の予後診断を行なう方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜８いずれか記載の方法を用
いて、家族性の腫瘍疾病素質の診断を行なう方法。 - 【請求項１１】 子宮内膜および胃腸系の腫瘍を指示す
るための、請求項９または１０記載の方法。 - 【請求項１２】 結腸直腸の腫瘍を指示するための、請
求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 請求項１〜８いずれか記載の方法を用
いて、転移腫瘍細胞におけるミクロサテライト不安定性
の検出による腫瘍の早期認識を行なう方法。 - 【請求項１４】 請求項１〜８いずれか記載の方法を用
いて、治療方法のタイプを決定する方法。 - 【請求項１５】 ２つのモノヌクレオチドリピート座、
クラス２ａの１または２つのジヌクレオチドリピート
座、クラス２ｂの１または２つのジヌクレオチドリピー
ト座および１つのペンタヌクレオチドリピート座より選
択されるミクロサテライト座のＤＮＡ増幅に適する少な
くとも５つのプライマー対を含んでなる、ミクロサテラ
イト不安定性によって腫瘍診断分析をするためのキッ
ト。 - 【請求項１６】 ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４
０、ＡＰＣ、Ｍｆｄ１５、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１８Ｓ６９
およびＴＰ５３Ａｌｕからなる群より選ばれた５つの座
のＤＮＡ増幅に適する５つのプライマー対を含んでな
る、ミクロサテライト不安定性によって腫瘍診断分析を
するためのキット。 - 【請求項１７】 少なくとも１種のプライマー対が、配
列番号：１、２、５、６、１９、２０、２７、２８、３
１、３２、３３、３４、３５、３６、４５および４６で
示されたプライマーからなる群より選ばれた５つのプラ
イマー対を含んでなる、ミクロサテライト不安定性によ
って腫瘍診断分析をするためのキット。 - 【請求項１８】 ＢＡＴ２６、ＢＡＴ４０、ＡＰＣ、Ｍ
ｆｄ１５およびＤ２Ｓ１２３のＤＮＡ増幅に適する５つ
のプライマー対を含んでなる、請求項１６記載のキッ
ト。 - 【請求項１９】 配列番号：１、２、５、６、１９、２
０、３３、３４、３５および３６で示されたプライマー
からなる群より選ばれた少なくとも１種のプライマー対
を含んでなる、請求項１７記載のキット。 - 【請求項２０】 ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＡＰＣ、Ｍ
ｆｄ１５およびＤ２Ｓ１２３のＤＮＡ増幅に適する５つ
のプライマー対を含んでなる、請求項１６記載のキッ
ト。 - 【請求項２１】 配列番号：１、２、５、６、１９、２
０、３１、３２、３３および３４により示されるプライ
マーからなる群より選ばれた少なくとも１種のプライマ
ー対を含んでなる請求項１７記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19712332:5 | 1997-03-25 | ||
| DE19712332A DE19712332A1 (de) | 1997-03-25 | 1997-03-25 | Verfahren zum Nachweis von Mikrosatelliten-Instabilität zur Tumordiagnostik |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10323199A true JPH10323199A (ja) | 1998-12-08 |
Family
ID=7824455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10076321A Withdrawn JPH10323199A (ja) | 1997-03-25 | 1998-03-24 | 腫瘍診断のためのミクロサテライト不安定性の検出方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6150100A (ja) |
| EP (1) | EP0869188A3 (ja) |
| JP (1) | JPH10323199A (ja) |
| DE (1) | DE19712332A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003516138A (ja) * | 1999-12-07 | 2003-05-13 | エグザクト サイエンシーズ コーポレイション | 結腸上好気性消化新生物の検出 |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6235470B1 (en) * | 1993-11-12 | 2001-05-22 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Detection of neoplasia by analysis of saliva |
| DE19747748A1 (de) * | 1997-10-29 | 1999-05-06 | Manfred Dr Dr Gross | Testverfahren zur Identifizierung von Personen mit defektem Mismatch-Reparatursystem |
| EP1169479B1 (en) | 1999-04-09 | 2006-06-28 | EXACT Sciences Corporation | Methods for detecting nucleic acids indicative of cancer |
| US6849403B1 (en) | 1999-09-08 | 2005-02-01 | Exact Sciences Corporation | Apparatus and method for drug screening |
| US6586177B1 (en) | 1999-09-08 | 2003-07-01 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
| US6919174B1 (en) | 1999-12-07 | 2005-07-19 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
| US6844152B1 (en) | 2000-09-15 | 2005-01-18 | Promega Corporation | Detection of microsatellite instability and its use in diagnosis of tumors |
| US20020058265A1 (en) | 2000-09-15 | 2002-05-16 | Promega Corporation | Detection of microsatellite instability and its use in diagnosis of tumors |
| KR20020086078A (ko) * | 2001-05-11 | 2002-11-18 | 김호근 | 미세부수체 불안정성 측정용 진단 킷트 |
| US7776524B2 (en) | 2002-02-15 | 2010-08-17 | Genzyme Corporation | Methods for analysis of molecular events |
| EP1340819A1 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-03 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Microsatellite markers |
| KR100998272B1 (ko) * | 2002-07-15 | 2010-12-08 | 연세대학교 산학협력단 | 단백질 지령부위내 단반복 염기서열을 갖는 신규 유전자 |
| CA2584741A1 (en) * | 2004-10-22 | 2006-05-04 | Marijo Kent-First | Methods and kits for detecting germ cell genomic instability |
| US20090023138A1 (en) * | 2007-07-17 | 2009-01-22 | Zila Biotechnology, Inc. | Oral cancer markers and their detection |
| US20120094288A1 (en) * | 2009-02-17 | 2012-04-19 | Murdoch Childrens Research Institute | Assay for determining epigenetic profiles of markers of fragile x alleles |
| US20130210007A1 (en) | 2010-08-11 | 2013-08-15 | Murdoch Childrens Research Institute | Treatment and diagnosis of epigenetic disorders and conditions |
| GB2497510A (en) * | 2011-11-10 | 2013-06-19 | Harry Cuppens | Methods for determining mononucleotide sequence repeats |
| US20160040254A1 (en) * | 2014-07-31 | 2016-02-11 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Prognostic and diagnostic methods based on quantification of somatic microsatellite variability |
| WO2019074963A1 (en) | 2017-10-09 | 2019-04-18 | Strata Oncology, Inc. | CHARACTERIZATION OF THE INSTABILITY OF MICROSATELLITES |
| CN111225985A (zh) * | 2017-10-19 | 2020-06-02 | 南托米克斯有限责任公司 | 来自液体活检的msi |
| WO2020091944A1 (en) * | 2018-10-31 | 2020-05-07 | Nantomics, Llc | Genomic and immune infiltration differences between msi and mss gi tumors |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5582979A (en) * | 1989-04-21 | 1996-12-10 | Marshfield Clinic | Length polymorphisms in (dC-dA)n.(dG-dT)n sequences and method of using the same |
| CA2156920A1 (en) * | 1993-02-24 | 1994-09-01 | Stephen N. Thibodeau | Tumor-specific genomic instability as a prognostic indicator |
| US5492808A (en) * | 1993-05-05 | 1996-02-20 | The Johns Hopkins University | Means for detecting familial colon cancer (FCC) |
| US5702886A (en) * | 1994-10-05 | 1997-12-30 | The Johns Hopkins University | Chromosome I8Q loss and prognosis in colorectal cancer |
-
1997
- 1997-03-25 DE DE19712332A patent/DE19712332A1/de not_active Withdrawn
-
1998
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003516138A (ja) * | 1999-12-07 | 2003-05-13 | エグザクト サイエンシーズ コーポレイション | 結腸上好気性消化新生物の検出 |
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| DE19712332A1 (de) | 1998-10-01 |
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