JPH10327898A

JPH10327898A - 核酸ベースの診断試験のための試料調製

Info

Publication number: JPH10327898A
Application number: JP13673298A
Authority: JP
Inventors: Luc Henri Perrin; アンリペランリュク
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-05-20
Filing date: 1998-05-19
Publication date: 1998-12-15
Also published as: CA2236613A1

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、核酸ベースの診断試験の感度を上
昇させる、液体生物学的材料のプールした試料のための
新規の試料調製法を提供する。本発明はまた、この方法
を実施するのに特に適したキットを提供する。【解決手段】沈殿剤（例えば、ポリエチレングリコー
ル、デキストラン硫酸、または硫酸アンモニウム）を加
えて核酸を選択的に沈殿させることにより、液体生物学
的材料のプールした試料中の感染性物質の核酸の検出の
ための診断試験の感度を上昇させる。好適な沈殿剤は、
分子量範囲が１，０００〜１０，０００で最終濃度が１
〜５％(w/v) のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であ
る。核酸の沈殿を増強するために１価または２価の塩、
好ましくは１価の塩が加られる。好適な１価の塩はＮａ
ＣｌおよびＫＣｌである。加えられる塩の量は、生物学
的試料中にすでに存在する塩濃度に依存し、これは多く
の場合生理学的塩濃度の約１４５mM塩である。混合物中
の最終塩濃度は、好ましくは２００〜４５０mM、最も好
ましくは２７０〜３２５mMである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、核酸ベースの診断試験の感度を
上昇させる、液体生物学的材料のプールした試料のため
の新規の試料調製法を提供する。本発明はまた、この方
法を実施するのに特に適したキットを提供する。

【０００２】血液銀行製剤の安全性を向上させるため
に、各国の担当局は、このような製剤は患者に投与する
前に、核酸ベースの診断試験により分析するように要請
している。これは、感染性ウイルスに対する抗体は、実
際の感染が起きてから数週間または数ヶ月の間検出され
ないことがしばしばあることを考慮しているためであ
る。一方、しばしば感染性物体の核酸の増幅（例えば、
ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ））を含む核酸ベー
スの診断試験は、感染後非常に早く感染性物体の存在を
検出できる。

【０００３】例えば、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩ
Ｖ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の検出は、酵素
免疫定量法（ＥＩＡ）による抗体のスクリーニングに依
存している。近年ＨＩＶやＨＣＶ抗体検出法の感度は改
善されているが、感染と血清転換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅ
ｒｓｉｏｎ）が検出されるまでとの間のウィンドウ期間
が存在する。ＨＣＶ血清転換の約３分の１が感染後２週
間以内に起きる（リム（Ｌｉｍ）ら、Ｊ．Ｈａｅｍａｔ
ｏｌ．，７８：３９８）が、抗ＨＣＶ抗体は、感染後６
ヶ月経ってからでないと出現しない（バンデルポエル
（ＶａｎｄｅｒＰｏｅｌ）ら、ＶｏｘＳａｎｇ，１
９９２，６２：２０８、およびファルチ（Ｆａｒｃｉ）
ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９１，３２５：９
８）。現在の抗ＨＩＶ−１抗体測定法は、感染後平均し
て２２日目に陽性となる（ブッシュ（Ｂｕｓｃｈ）ら、
Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，１９９５，３５：９１）。従
って、ウィンドウ期間に採取された抗ＨＣＶ抗体および
抗ＨＩＶ抗体が陰性の供与血液は、血液安全性スクリー
ニング法で検出されないことがある。ウイルスの核酸を
標的とする測定法によりウィンドウ期間を短縮すること
ができる。特に、ＰＣＲ測定法はウィンドウ期間を、Ｈ
ＩＶ−１感染については１１日間（ブッシュ（Ｂｕｓｃ
ｈ）ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，１９９５，３５：９
１）、およびＨＣＶ感染については５９日間（アルター
・エィチ・ジェイ（ＡｌｔｅｒＨＪ）、Ｂｌｏｏｄ，
１９９５，８５：１６８１）短縮すると評価されてい
る。

【０００４】抗体をスクリーニングした血液からＨＣＶ
やＨＩＶを伝搬するリスクは、ＨＩＶ−１については４
９３，０００分の１であり、ＨＣＶについては１０３，
０００分の１であると推定されている（シュライバー
（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ）ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅ
ｄ．，１９９６，３３４：１６８５）。この低い発生率
のため、ＰＣＲ測定法による血液の組織的なスクリーニ
ングの費用効果に対して懸念が発生している（アウブチ
ョン（ＡｕＢｕｃｈｏｎ）ら、Ｔａｎｓｆｕｓｉｏｎ，
１９９７，３７：４５）。すなわち、簡便でコストの低
い核酸増幅ベースのスクリーニング測定法に対するニー
ズが存在する。

【０００５】残念ながら、核酸増幅ベースの方法はいま
だに、機械が多数の試験試料を同時に扱うことができる
ように自動化することが容易でないいくつかの工程を利
用する。従って、試料をプールして、このプールした試
料について核酸ベースの診断試験を行うことが提唱され
ている。陽性と判定されたプール試料は、次に例えば、
プールの各試料を個別に試験するかまたは異なる重複試
料のプールを試験してプール中のどの試料が陽性である
かを見つけることにより、さらに分析される。すなわ
ち、陽性試料Ｃは、試料ＡＢ、ＡＣ、およびＢＣのプー
ルを分析して、プールＡＣとＢＣが陽性となるはずであ
るから、容易に陽性であると決定される。もちろん、後
者のプール試験の場合は、試料Ｃを個別に試験して確認
試験を行うことにより安全性が上昇する。

【０００６】プール法の大きな欠点は、プールすると感
度が低下することである。

【０００７】核酸ベースの診断試験の感度を上昇させる
必要性は、感染した個人の治療の追跡にも存在する。薬
物治療の変更または停止のための最適な時期を評価する
ために、ウイルスの核酸が検出レベル以下に下がった時
期を決定することが必要である。ショックメル（Ｓｃｈ
ｏｃｋｍｅｌ）らは、ＨＩＶ−１ＲＮＡの検出のため
の増強測定フォーマットを使用して、この問題を検討し
ており、１mlの血漿当たり２０コピーのＲＮＡを検出で
きるまで感度を上昇させることができた（Ｊ．ｏｆＡ
ｃｑｕｉｒｅｄＩｍｍｕｎｅＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ
ＳｙｎｄｒｏｍｅａｎｄＨｕｍａｎＲｅｔｒｏ
ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７，１４：１４９−１８
３）。

【０００８】核酸ベースの診断試験の感度をさらに上昇
させる問題は、本発明により解決され、この発明の基礎
は、添付の特許請求の範囲で規定される方法である。さ
らに詳しくは本発明は、液体生物学的材料のプールした
試料中の感染性物質の核酸の検出のための診断試験の感
度を上昇させる方法を提供し、この方法は、沈殿剤（例
えば、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸、ま
たは硫酸アンモニウム）を加えることにより核酸を選択
的に沈殿させることを特徴とする。好適な沈殿剤は、分
子量範囲が１，０００〜１０，０００で最終濃度が１〜
５％(w/v) のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であ
る。さらに詳しくは本発明は、沈殿剤は、プールした試
料中で、分子量範囲が７，０００〜９，０００で最終濃
度が２．０〜４．０％(w/v) のポリエチレングリコール
であり、さらに好ましくは最終濃度が２．５〜３．０％
(w/v) 、最も好ましくは最終濃度が約２．８〜２．９％
(w/v) のＰＥＧ６０００であることを特徴とする。本発
明の方法において、核酸の沈殿を増強するために１価ま
たは２価の塩、好ましくは１価の塩が加られる。好適な
１価の塩はＮａＣｌおよびＫＣｌである。加えられる塩
の量は、生物学的試料中にすでに存在する塩濃度に依存
し、これは多くの場合生理学的塩濃度の約１４５mM塩で
ある。混合物中の最終塩濃度は、好ましくは２００〜４
５０mM、最も好ましくは２７０〜３２５mMである。

【０００９】本発明の方法において、沈殿は好ましくは
５℃未満の温度、例えば０〜４℃で行われる。

【００１０】本発明の方法は、複数のタイプのウイル
ス、例えばＨＣＶとＨＩＶ（例えば、同時感染試料）の
同時沈殿を行うのに適している。対照目的のためにも、
例えば組換えＤＮＡ技術により調製された規定されたウ
イルスが、定量目的の内部対照として使用できる。

【００１１】沈殿効率は、担体核酸の添加によりさらに
向上される。このような担体核酸の例は、コウシ胸腺Ｄ
ＮＡまたはサケ精子ＤＮＡである。この担体核酸はま
た、例えば感染性物体の核酸の沈殿の有効性を調節する
ことを可能にする規定された配列でもよい。すなわち、
例えば一定量のファージλＤＮＡをこの目的のために加
えてもよい。本発明の方法（増幅工程および検出工程）
を含む全診断測定法の有効性を調節するために、別の核
酸を内部対照として加えることができる。この別の核酸
は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドで
もよい。感染性物体の核酸がＲＮＡである場合は、内部
対照核酸も好ましくはＲＮＡ分子である。内部対照の核
酸は、好ましくは感染性物体の核酸中で増幅される標的
配列と基本的に同じ長さと塩基組成を有し、フランキン
グ領域中の適切な位置で、標的配列の増幅に使用される
プライマーの配列に相補的な配列を含む。こうして感染
性物体の核酸の標的配列ならびに内部対照核酸配列は、
同じプライマーで増幅され、同じサイズの増幅産物（ア
ンプリコン）を生成する。次に、増幅された材料は、内
部対照核酸の中心領域に特異的なプローブを使用して、
増幅された内部対照核酸の存在について試験される。こ
うして感染性物体からの核酸を含有しない試料中でも、
沈殿および／または増幅反応の効率を追跡することがで
きる。これは陰性試料は陰性であり、すなわち偽の沈殿
および／または不完全な増幅反応により引き起こされて
いないことを確認する。すなわち、検出工程が、操作の
最後に試料中の内部対照核酸の適切な量の存在を示す時
は、操作のすべての工程（すなわち、沈殿、増幅および
検出）がうまく作用したことが確実になる。

【００１２】沈殿剤および必要な場合は塩を加えて得ら
れる沈殿物は、前記のように、液体から分離され、ここ
で好ましくは遠心分離工程が使用される。

【００１３】次の工程は、感染性物体の溶解であり、こ
れは当業者に公知の多くの方法により行われる。好適な
方法は、カオトロピック物質（例えば、チオシアン酸グ
アニジン）、界面活性剤（例えば、ＮＰ４０またはトリ
トンＸ１００）の添加、加熱処理、またはプロテイナー
ゼＫのようなプロテアーゼによる消化（好ましくは界面
活性剤の存在下）である。溶解工程で放出されるＲＮＡ
分子を安定化するために、ＲＮＡ分解のインヒビター
（例えば、ＲＮａｓｉｎ（登録商標）、プロメガ（Prom
ega)、マジソン、ウィスコンシン州、米国、から入手で
きる）を溶解緩衝液に加えてもよい。溶解は、約１５〜
４５℃、好ましくは約３７℃の温度で行われ、好適に
は、沈殿物は、０．５〜５ml、好ましくは約２．５mlの
溶解緩衝液に再懸濁される。好適な溶解緩衝液は、適当
な緩衝液中にチオシアン酸グアニジンのようなカオトロ
ピック物質、および好ましくはジチオスレイトールまた
は類似の物質を含む。最も好適な溶解緩衝液は、６０mM
のトリス／塩酸（ｐＨ７．５）、６８％(w/v) チオシア
ン酸グアニジン、３％(w/v) ジチオスレイトールであ
る。

【００１４】溶解工程の後に、追加の精製工程を行っ
て、核酸からＰＥＧ（ＰＣＲを阻害する可能性がある）
およびタンパク質をさらに除去する。この精製は、多く
の確立された方法で行われ、ここで選択された方法は、
アンプリコア（ＡＭＰＬＩＣＯＲ）（登録商標）試験
（エフ・ホフマン−ラ・ロッシュ社（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａ
ｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅＬｔｄ．）、バーゼル、スイ
ス、により製造されたＰＣＲに基づく試験システムの製
品）について確立された標準的方法の使用に基づく。こ
の試験は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６
２：１５６−１５９に記載のコムクジンスキー・ピー
（ＣｈｏｍｃｚｉｎｓｋｙＰ．）とサッチ・エヌ（Ｓ
ａｃｃｈｉＮ．）の方法に基づく。しかしこの方法
は、増幅に使用される最終核酸産物の純度を上げるため
に修飾されている。すなわち、例えば溶解試薬の容量は
２．５mlに増やされている。

【００１５】溶解後、核酸は沈殿される。これは通常、
等量のイソプロパノールを加えることにより行われる
（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、な
らびにブタノール、ペンタノール、およびヘキサノール
の液体型［室温で］のような他の任意のＣ₁〜Ｃ₆アル
コールも使用できる）。数分後、好ましくは約２分後、
核酸を遠心分離によりペレットにする。次に核酸を好ま
しくは、約７０％(w/v)のエタノール水溶液で再沈殿さ
せる（エタノールの代わりに、メタノール、プロパノー
ル、およびイソプロパノール、ならびにブタノール、ペ
ンタノール、およびヘキサノールの液体型［室温で］の
ような他の任意のＣ₁〜Ｃ₆アルコールも使用でき
る）。

【００１６】遠心分離後ペレットを、増幅方法に適合さ
せた試料希釈緩衝液に再懸濁する。好適な方法におい
て、遠心分離後に得られるペレットは、ＲＴ−ＰＣＲや
ＰＣＲを行うのに適した溶液に直接再懸濁される。最も
好適な方法において、例１に例示するように、ＨＩＶ、
ＨＣＶ、およびＨＢＶの以後の各ＲＴ−ＰＣＲを行うの
に適合させた溶液が使用される。しかし、当業者は、他
の感染性物質の核酸を個別にまたは組合せて測定できる
ように、例１に記載の方法を適合させることができる。
また、溶解緩衝液の容量も、試験される試料のタンパク
質含量の関数で適合させる必要があるかも知れない。

【００１７】本発明の方法の効率は、添付の図面に示す
結果により支持される。

【００１８】図１。減少する量のＨＣＶＲＮＡコピー
を含有するプールした血漿試料中のＨＣＶＲＮＡの検
出限界（２つの別々の実験からのデータ）。ＨＣＶＲ
ＮＡ陽性試料の希釈物を使用して、５mlのプールに加え
た（１０から０．１２コピー／プールまで）。試験した
各プールに、ＨＩＶ−１ＲＮＡも添加した（実験１の
１，０００コピー／プールと実験２の１００コピー／m
l）。

【００１９】図２。減少する量のＨＩＶＲＮＡコピー
を含有するプールした血漿試料中のＨＩＶ−１ＲＮＡ
の検出限界。ＨＩＶＲＮＡ陽性試料の希釈物を使用し
て、５mlのプールに加えた（３００から３３コピー／プ
ールまで）。試験した各プールに、ＨＣＶＲＮＡも添
加した（１００コピー／ml）。

【００２０】本発明の方法は、液体生物学的材料のプー
ルした試料中の感染性物体の核酸の検出のための診断試
験の感度を上昇させるのに使用される。「液体生物学的
材料」という用語は、尿、分泌液、血液（血漿または血
清）および唾液などの任意の体液を意味するが、これら
に限定されない。プールした試料は通常、異なる個体
（例えば、ヒト）から得られる。しかし、本発明の方法
に使用される試料はまた、診断方法の感度を上げるため
に、１つの個体から得られる大量の単一の試料でもよい
という点で、これは必須ではない。「感染性物体の核
酸」という用語は、特定の個体を感染させることができ
る生物の任意の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を
含む。このような生物の例は、真菌、細菌およびウイル
スがある。本発明の方法は、肝炎の原因である肝炎ウイ
ルスの核酸（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス［ＨＢＶ］やＣ
型肝炎ウイルス［ＨＣＶ］のような肝炎ウイルスからの
核酸）またはＡＩＤＳのような免疫不全症の原因である
核酸（例えば、ＨＩＶ−１やＨＩＶ−２のようなヒト免
疫不全症ウイルスからの核酸）の検出の感度を上げるの
に特に有用である。

【００２１】本発明の方法は、好ましくは感染性物体の
精製と濃縮のために１つの共通の精製工程を使用して複
数の感染性物体による感染を検出するのに使用される。
こうして、感染性物体が濃縮され、次に適切な増幅／検
出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはＰＣＲ）を
使用してより高い感度で検出することができる。好適な
方法は、血漿試料のプールからのＨＣＶＲＮＡおよび
ＨＩＶ−１ＲＮＡの同時検出を可能にする。

【００２２】本発明の方法の検出工程は、各感染性物体
の核酸に個別に対するように設計するか、またはいくつ
かの感染性物体の核酸の存在を同時に検出できるように
設計することができる（いわゆるマルチプレックスＲＴ
−ＰＣＲおよび／またはＰＣＲ）。後者の場合、好まし
くはいわゆる逆ドットブロット法（例えば、インニス
（Ｉｎｎｉｓ）ら編、１９９５ＰＣＲＳｔｒａｔｅ
ｇｉｅｓ、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ
ＰｒｅｓｓＩｎｃ．）、サンジエゴ、カリホルニア
州、中、チェハブ（Ｃｈｅｈａｂ）ら、ヨーロッパ特許
ＥＰ−Ａ−２３７３６２、およびヨーロッパ特許公報Ｅ
Ｐ−Ａ−５２９４９３を参照）が使用され、ここでは増
幅された材料（これは好ましくは標識されている）は、
目的の感染性物体の検出に適した配列特異的オリゴヌク
レオチド（ＳＳＯ）プローブを含む固体支持体（例え
ば、膜、フィルターまたはマイクロタイタープレートの
ウェル）に添加される。この方法では、標識されていな
いＳＳＯプローブは、適切な厳密性のあるハイブリダイ
ゼーション条件下でプールした試料の標識され増幅され
た核酸に暴露される。次に、ハイブリダイゼーションし
ていない標識された試料の核酸は、適切な厳密性条件下
で洗浄して除去し、次にプローブ配列に結合した標識の
存在についてフィルターを追跡する。増幅した材料は、
標識された核酸前駆体（ｄＮＴＰ）を使用するかまたは
標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して標
識される。

【００２３】標識された核酸前駆体（ｄＮＴＰ）は市販
されている。本発明に関連して使用されるオリゴヌクレ
オチドは、当該分野で公知の方法に基づき分光学的、光
化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によ
り検出可能な標識を取り込むことにより調製でき、標識
することができる。有用な標識物には、³²Ｐ、蛍光色
素、電子密度の濃い試薬、酵素（ＥＬＩＳＡで普通に使
用されるもの）、ビオチン（例えば、酵素基質と発色原
であるアビジン−酵素結合体とともに有用である）、ま
たは抗原決定基もしくはモノクローナル抗体が入手でき
るハプテンとタンパク質がある。

【００２４】検出工程に多くのオリゴヌクレオチドプロ
ーブが関与する場合、このプローブは好ましくは整列し
ている。このような整列では、複数オリゴヌクレオチド
プローブが、好ましくはシリコーン化ガラスから構成さ
れたいわゆるマイクロチップの表面に固定される。次
に、検出工程において、整列の表面は、プローブに結合
した標識された標的により放出される陽性のシグナルに
ついて走査される。好適な標識物は、適切な条件下で蛍
光シグナルを発することができる分子である。このマイ
クロチップ技術のさらなる詳細については、エム・ジェ
イ・コザール（Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．）ら、Ｎａｔｕｒ
ｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，１９９６，２（７）：７３５−
７３９；リプシュツ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ）ら、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９５，１９（３）：４４２−
４４７およびエム・エガーズ（ＥｇｇｅｒｓＭ）とデ
ィー・アーリッヒ（ＥｈｒｌｉｃｈＤ．）、Ｈｅｍａ
ｔｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９９５，９（１）：１−１
５の刊行物を参照されたい。

【００２５】本発明の方法は、以下の分野の応用に特に
有用である： − 供与血液の試験； − ヒトで使用するための薬物製品の生物学的起源の中
間体と最終調製物の試験； − ヒトが消費するための製品（例えば、ヨーグルト）
の試験； − 獣医学的使用のための薬物製品の生物学的起源の中
間体と最終調製物の試験； − 例えば抗ウイルス治療後の感染性物体の低濃度の可
能性を有するヒトの試料（例えば、髄液または滑液）の
試験。

【００２６】本発明の方法は、少容量中の感染性物体か
ら核酸を濃縮し、適当な検出法でそのような核酸のより
好感度の検出を可能にする核酸の精製された調製物を提
供する。好適な方法は、例１に記載する。所望であれ
ば、この方法は、ＰＥＧの濃度とタイプを変更し、塩
（例えば、ＮａＣｌ）の濃度を適合させて、適合させる
ことができる。好適な方法において、ＰＥＧと塩濃度
は、いくつかの感染性物体を同時に沈殿させることがで
きるように選択される。最も好適な方法の第１段階で、
ＰＥＧと塩は、ＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶの沈殿に適
した濃度で加えられる。ＨＩＶとＨＢＶは塩とＰＥＧの
非存在下でも沈殿させることができることがわかった。
一方ＨＣＶは、塩の存在下でのみ沈殿し、ショックメル
（Ｓｃｈｏｃｋｍｅｌ）ら（前述）が記載したような単
純な遠心分離工程では沈殿しない。上記の３つの感染性
物体についてＰＥＧとＮａＣｌの最適濃度、ならびにこ
れらの物体について使用される最適インキュベーション
時間および遠心分離速度が決定されている（例１を参
照）。これらの種々の因子は、沈殿される感染性物体に
依存して変化する。最初の沈殿工程が、試験試料中の血
清タンパク質の９５％を超える量の除去を可能にするこ
とがわかった。

【００２７】本発明はまた、液体生物学的材料のプール
した試料中の感染性物体の核酸、好ましくは血液試料
（血漿または血清）中のウイルス核酸、の存在を測定す
るためのキットであって、上記で定義した沈殿剤および
核酸の存在を検出するのに必要な他の試薬（例えば、配
列特異的オリゴヌクレオチドプローブ）の溶液を含むキ
ットを提供する。後者のプローブは、好ましくは固体支
持体に結合している。このキットはさらに、１価または
２価の塩、好ましくはＮａＣｌまたはＫＣｌを含む。こ
のキットはさらに、増幅反応を行うのに必要な試薬、例
えば、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼまた
はＴｔｈポリメラーゼのような熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼ）およびプライマー（好ましくはプライマーの対）
を含む。このプライマーは好ましくは標識されている。
上記試薬は好ましくは、１つまたはそれ以上の複数の容
器のユニット中に充填され、このユニットは、本発明の
方法およびおそらくは感染性物体の核酸の増幅と検出を
実施するのに必要なすべての有用な成分を含む。キット
はまた、この方法を実施するための説明書を含有しても
よい。

【００２８】好適な実施態様はＲＴ−ＰＣＲ増幅を含む
が、試料中の標的配列の増幅には、公知の任意の方法、
例えばリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、および自
己（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製、が使用
でき、この各々は、標的配列がＳＳＯプローブに対する
核酸ハイブリダイゼーションにより検出できるように、
充分な増幅を与える。ティー・ホーン（Ｈｏｒｎ
Ｔ．）とエム・エス・ウルデア（ＵｒｄｅａＭ．
Ｓ．）、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９８９，
１７（１７）：６９５９−６９６７、およびジェイ・エ
ー・ランニング（ＲｕｎｎｉｎｇＪ．Ａ．）とエム・
ウルデア（ＵｒｄｅａＭ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅ，１９９０，８（３）：２７６−２７９に記載の分
岐ＤＮＡシグナル増幅法により、本発明の方法により濃
縮された核酸を検出することも適切である。

【００２９】好適な増幅反応は、当該分野で公知であ
り、米国特許第４，６８３，１９５号；４，６８３，２
０２号；および４，９６５，１８８号記載のポリメラー
ゼチェイン反応（ＰＣＲ）増幅法である。市販の業者、
例えばパーキンエルマー（Perkin Elmer）（ノーウォー
ク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット州）がＰＣＲ試薬
を販売し、ＰＣＲプロトコルを公表している。本発明の
利点の理解を容易にするために、ＰＣＲの要約を提供す
る。

【００３０】ＰＣＲ増幅の各サイクルにおいて、２本鎖
標的配列は変性され、プライマーは変性した標的の各鎖
にアニーリングされ、プライマーはＤＮＡポリメラーゼ
（好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、すなわ
ち、熱に対して比較的安定であり、ヌクレオシド三リン
酸の重合を触媒して、標的配列の核酸鎖の１つと相補的
なプライマー伸長産物を形成する）の作用で伸長され
る。ＤＮＡポリメラーゼはプライマーの３’末端で合成
を開始し、合成が停止するまで鋳型の５’末端の方向に
進める。精製された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、パ
ーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）（ノーウ
ォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット州）から販売
されている。典型的なポリメラーゼチェイン反応混合物
に存在するさらなる試薬は、オリゴヌクレオチドプライ
マー、ヌクレオチド三リン酸、および適切な緩衝液であ
る。好適な増幅反応混合物および好適な温度サイクリン
グ条件に関する情報は、当業者に公知であり、エフ・ホ
フマン−ラ・ロッシュ社（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ
ＲｏｃｈｅＬｔｄ．）から販売されているアンプリ
コア（ＡＭＰＬＩＣＯＲ）（登録商標）試験キットの説
明書に記載されている。増幅過程は典型的には、少なく
とも２５回繰り返される。２つのプライマーが標的核酸
配列の反対の末端にアニーリングし、各プライマーの伸
長産物は標的配列の相補的なコピーであるような方向
で、かつその相補体から分離された時、他のプライマー
にハイブリダイズできるように、アニーリングする。各
サイクルが１００％の効率なら、存在する標的配列の数
が２倍に増える。

【００３１】ＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列のいずれか
も、ＰＣＲにより増幅することができる。ＲＮＡ標的
（例えば、ＨＣＶゲノム核酸の増幅）の場合、第１の工
程は標的配列のＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）の合成からな
る。逆転写は別の工程として、または好ましくは逆転写
−ポリメラーゼチェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（ＲＮＡ
を増幅するためのポリメラーゼチェイン反応の変法）の
組合せにおいて実施できる。ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅
は当該分野で公知であり、米国特許第５，３２２，７７
０号と５，３１０，６５２号；マイヤーズ（Ｍｙｅｒ
ｓ）とゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ），１９９１，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０（３１）：７６６１−７
６６６；米国特許第５，５２７，６６９号；ヤング（Ｙ
ｏｕｎｇ）ら，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．３１（４）：８８２−８８６；およびヤング
（Ｙｏｕｎｇ）ら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．３３（３）：６５４−６５７に記載されて
いる。

【００３２】ＰＣＲ法では莫大な増幅が可能なため、高
レベルのＤＮＡを有する試料、陽性対照鋳型、または前
回の増幅物からの低レベルのＤＮＡ混入により、わざわ
ざ鋳型ＤＮＡを加えなくても、ＰＣＲ産物を得ることが
できる。交差汚染を最小にする実験室の装置や方法は、
クウォク（Ｋｗｏｋ）とヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）、１
９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３３９：２３７−２３８、およ
びインニス（Ｉｎｎｉｓ）ら編、１９９５ＰＣＲＰ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏ
ｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、アカデミッ
クプレス社（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎ
ｃ．）、サンジエゴ、カリホルニア州、中のクウォク
（Ｋｗｏｋ）とオレゴ（Ｏｒｒｅｇｏ）に記載されてい
る。前の反応で増幅された核酸によるＰＣＲの汚染の問
題を減少させるための酵素的方法は、米国特許第５，４
１８，１４９号、５，０３５，９９６号、およびヤング
（Ｙｏｕｎｇ）ら，１９９５（前述）に記載されてい
る。

【００３３】増幅反応混合物は典型的には、プライマー
ハイブリダイゼーションの特異性を確保するのに必要な
温度より充分低い温度の室温で集合させる。室温ではプ
ライマーは、他のほんのわずかに相補的な核酸配列に非
特異に結合することがあり、好ましくない核酸配列の合
成を開始するため、非特異増幅が生じる。これらの新た
に合成された好ましくない配列は、増幅反応中に目的の
標的配列と競合し、目的の配列の増幅効率を大きく低下
させることがある。非特異的増幅は、必要なハイブリダ
イゼーションの特異性を得るのに充分なだけ温度が上が
るまでプライマー伸長を阻止できる「ホットスタート」
を使用することにより減少させることができる。

【００３４】あるホットスタート法では、必要なハイブ
リダイゼーションの特異性を得るのに充分なだけ温度が
上がるまで、反応混合物からの１つまたはそれ以上の試
薬が保持される。反応成分を分離または隔離するために
蝋のような熱不安定性材料を使用するホットスタート法
は、米国特許第５，４１１，８７６号、およびチョウ
（Ｃｈｏｕ）ら，１９９２，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲ
ｅｓ．２０（７）：１７１７−１７２３に記載されてい
る。別のホットスタート法では、増幅の前または増幅の
第１工程として、高温のインキュベーションにより活性
化されるまでプライマー伸長を触媒しない逆不活性化Ｄ
ＮＡポリメラーゼが使用される。そのような逆不活性化
ＤＮＡポリメラーゼの例は、アンプリタク（AmpliTaq）
（登録商標）ゴールド（ＧＯＬＤ）（ヨーロッパ特許出
願ＥＰ−Ａ−７７１８７０；総説については、バーチ
（Ｂｉｒｃｈ）ら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ３８１：
４４５−４４６を参照）である。非特異的増幅はまた、
米国特許第５，４１８，１４９号に記載のように、増幅
の最初の高温工程の前に生成した伸長産物を酵素的に分
解することにより、低下させることができる。

【００３５】ＰＣＲ法により感染性物体の核酸の量が検
出できるレベルまで増加する。増幅された核酸を検出す
る方法は当該分野で公知である。例えば、増幅産物の存
在と量は、ゲル電気泳動により、当該分野で公知のプロ
トコル（例えば、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）
ら、１９８９，モレキュラークローニング、実験室マニ
ュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、コールドスプリ
ングハーバーラボラトリー、コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク州、を参照）を使用して、直接測
定できる。

【００３６】本発明の方法に関連して、増幅産物の検出
は好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブを使用して
行われる。好ましくは配列特異的オリゴヌクレオチド
（ＳＳＯ）プローブ、すなわち１つまたはそれ以上のオ
リゴヌクレオチドプローブ（ここで、各プローブは、検
出される配列に完全に相補的な「ハイブリダイズ領域」
と呼ばれる配列を有する）が使用される。典型的にはこ
のようなハイブリダイズ領域は、「配列特異的で、厳密
なハイブリダイゼーション条件」下で、完全に相補的な
標的配列にのみハイブリダイズする。ハイブリダイズ条
件の厳密性を緩和すると、一致しない配列も許容され
る、許容される不一致の程度は、ハイブリダイゼーショ
ン条件を適当に調整することで調節できる。分析される
配列により、１つまたはそれ以上の配列特異的オリゴヌ
クレオチドが使用される。

【００３７】特定の感染性物体、例えばその特定の単離
体に特異的な配列は、その感染性物体またはその単離体
にユニークな配列であり、すなわち、他の感染性物体ま
たはそのような感染性物体の特定の単離体により共有さ
れない配列である。感染性物体に特異的な配列に相補的
なサブ配列を含有するプローブは、厳密な条件下（例え
ば、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで７０℃
で固体支持体を洗浄）で、別の感染性物体のゲノムの対
応部分にハイブリダイズしないであろう。プローブと標
的核酸配列の間で生成したハイブリッドを検出するため
の適切なプロトコルは、当該分野で公知である。そのよ
うなプロトコルの例は、米国特許第５，５２７，６６９
号；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、１９９３、前述；および
ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、１９９５、前述、記載されて
いる。

【００３８】ＰＣＲとともに使用される別の検出法は、
いわゆる５’−ヌクレアーゼ測定法であり、これは米国
特許第５，２１０，０１５号、およびホランド（Ｈｏｌ
ｌａｎｄ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８：７２７６−７２８０に記
載されている。５’−ヌクレアーゼ測定法では、ＰＣＲ
増幅反応混合物中に標識された検出プローブが関与す
る。このプローブは、プローブがＤＮＡ合成のプライマ
ーとして作用することを防ぐように修飾される。合成工
程（すなわち、プライマー伸長）の間、標的ＤＮＡにハ
イブリダイズするプローブは、ＤＮＡポリメラーゼ（ｒ
ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ）の５’−ヌクレアーゼ活
性により分解される。分解したプローブの存在は、プロ
ーブと標的ＤＮＡの間のハイブリダイゼーションが起き
たこと、および増幅が起きたことの両方を示す。プロー
ブ分解を検出するための方法は、米国特許第５，２１
０，０１５号、ＥＰ−Ａ−６９９７６８号およびＥＰ−
Ａ−７１３９２１号に記載されている。

【００３９】ある増幅された核酸の存在を検出するため
のさらなる方法は、ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら、１９
９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：４１３−
４１７；ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら、１９９３、Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１０２６−１０３０；
およびヨーロッパ特許公報ＥＰ−Ａ−４８７，２１８号
およびＥＰ−Ａ−５１２，３３４号に記載されている。
この方法では、反応混合物中の２本鎖ＤＮＡの総量の増
加が追跡される。２本鎖標的ＤＮＡの検出は、２本鎖Ｄ
ＮＡに結合した時の、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）の蛍
光の増加と他の結合標識物に依存する。増幅は２本鎖Ｄ
ＮＡの量を増加させ、蛍光の上昇が検出できるようにな
る。非特異的増幅およびプライマー−ダイマー生成もま
た、２本鎖ＤＮＡが生成するため、この方法では非特異
的増幅とプライマー−ダイマー生成が少量になる適当な
プライマーを使用するべきである。

【００４０】しかし、増幅された核酸はクローニングま
たは配列決定法にも使用できるため（例えば、米国特許
第４，６８３，１９５号を参照）、本発明の方法と増幅
法の組合せは、必ずしも検出測定法に限定されない。

【００４１】分子生物学と核酸化学の従来法のさらなる
情報（これは当該分野で公知である）は、サムブルーク
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９，モレキュラークロ
ーニング、実験室マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コー
ルド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州；オリゴ
ヌクレオチド合成（Ｏｌｙｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（エム・ジェイ・ゲイト（Ｍ．
Ｊ．Ｇａｉｔ）編、１９８４）；核酸ハイブリダイゼー
ション（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚ
ａｔｉｏｎ）（ビー・ディー・ハメス（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍ
ｅｓ）とエス・ジェイ・ヒギンス（Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ）編、１９８４）；および、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（アカデミックプレス社（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．）のシリーズに記
載されている。前述のおよび後述の本明細書に記載のす
べての特許、特許出願、および刊行物は、参考のため本
明細書に組み込まれる。

【００４２】血漿ドナーのプールのＰＣＲベースの分析
は、ユニークな核酸調製物を使用して、ＨＣＶＲＮＡ
やＨＩＶ−１ＲＮＡの同時検出に応用できることの証
拠を以下の例に示す。これは、ＰＣＲ反応物中の精製し
たウイルスＲＮＡの投入量を増やすウイルス粒子の調製
物を含有させることにより行われた。プールの各試料に
ついてのＰＣＲ反応中のＲＮＡの投入量は、市販の測定
法により個々の試験について使用される場合より、本プ
ール法を使用すると２〜１０倍多い理論的血漿容量に匹
敵する。本発明の方法は、５０の供与血液のプール当た
り３．３未満のＨＣＶＲＮＡコピーの検出を可能に
し、３３コピー／ml未満を含有する各陽性血漿試料の検
出に対応する。これは、現在入手できる最も好感度の測
定法（コバス（Ｃｏｂａｓ）アンプリコア（ＡＭＰＬＩ
ＣＯＲ）（登録商標）ＨＣＶ）の感度より低い検出感度
である。従ってＨＩＶ−１ＲＮＡ検出の限界は、５０
供与血液のプール当たり約１００ＨＩＶ−１ＲＮＡ
コピーである。

【００４３】ＨＩＶ−１ＲＮＡ検出の増強測定法の最
近の進展は、高速遠心分離を使用するウイルス粒子の単
純な前精製工程により市販の測定法の感度を１０〜３０
倍上昇させることができる（ジー・ショックメル（Ｓｃ
ｈｏｃｋｍｅｌＧ）ら、Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕ
ｎ．Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎ．，１９９７，１４：１７９）
ことを証明したため、本発明に至る研究の過程で、研究
の焦点はＨＣＶＲＮＡの検出であった。ＨＣＶウイル
ス粒子の高速遠心分離では、ペレット中のウイルス粒子
の回収率は増加しなかった。ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）沈殿によりＨＣＶウイルス粒子を濃縮できる
可能性がまず検討された。３％ＰＥＧ、１４５mM Ｎａ
Ｃｌおよび低速遠心分離を使用して、ペレット中に総ウ
イルスの約５０％が回収されたため、これは部分的に成
功であった。より高濃度のＰＥＧの使用は、ペレット中
のウイルスの回収を上昇させたが、溶解試薬中のペレッ
トの再懸濁は、非常に困難であった。さらに周波数が高
い場合に、ＰＣＲ反応の阻害が観察された。大量の溶解
試薬の使用とエタノールの完全な除去は、ＰＣＲ反応の
阻害を排除するのに重要な因子であった。ＰＥＧ沈殿測
定法を使用すると、ＨＩＶＲＮＡとＨＣＶＲＮＡに
ついて試験した５０の供与血液のうち２０以下のプール
で、ＰＣＲ反応の阻害は観察されなかった。これらの結
果は、残存ＰＥＧはＰＣＲ反応を阻害せず、阻害活性を
有する血漿は、血液ドナーの集団中で低頻度であるか、
またはＰＥＧ沈殿は、血漿成分を排除することで阻害活
性を除去していることを示している（ショックメル（Ｓ
ｃｈｏｃｋｍｅｌ）ら、Ｊ．ｏｆＡｃｑｕｉｒｅｄＩ
ｍｍｕｎｅＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ
ａｎｄＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ，１
９９７，１４：１７９）。さらにプールした試料の試験
はバックグランドレベルを上昇させない。いつも陽性と
陰性結果の間の明瞭なカットオフが観察された。

【００４４】ＰＣＲベースのスクリーニング法の主要な
関心は、特異的抗体が存在しない場合のウイルス核酸を
有する血漿試料の同定である。これらの試料は、主に急
性感染を有する個人からの血清転換前の試料に対応する
（デ・サウスレ（ＤｅＳａｕｓｓｕｒｅ）ら、Ｔｒａ
ｎｓｆｕｓｉｏｎ，１９９３，３３：１６４；エム・ピ
ー・ブッシュ（ＢｕｓｃｈＭＰ）、ＶｏｘＳａｎ
ｇ，１９９４，６７（増刊３）：１３；エム・ピー・ブ
ッシュ（ＢｕｓｃｈＭＰ）とジー・エー・サテン（Ｓ
ａｔｔｅｎＧＡ）、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９７，
１０２：１１７）。８人の個人の血清転換前の試料はＨ
ＣＶＲＮＡ陽性であり、抗ＨＣＶ抗体は検出されなか
った。これらの試料をプールに導入すると、本発明のＰ
ＥＧ測定法は、５，０００コピー／ml未満のＲＮＡを有
する３つのプール試料を含む、これらのすべてを検出し
た。これは、ＨＣＶウイルス粒子への特異的抗体の結合
は、ウイルス粒子のＰＥＧ沈殿の必要条件ではないこと
を示している。ＨＣＶの血清転換前の試料のいくつか
に、予想外に低濃度のＨＣＶＲＮＡが観察された。例
に示す結果は、ＰＣＲベースのプール測定法によるＨＣ
Ｖ血清転換の検出のために非常に好感度の測定法が必要
であることを示している。血清転換前の試料で高レベル
のＨＩＶ−１ＲＮＡが全体に報告されている（エム・
ピー・ブッシュ（ＢｕｓｃｈＭＰ）とジー・エー・サ
テン（ＳａｔｔｅｎＧＡ）、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１
９９７，１０２：１１７；キンロッチ−デ・ロエス（Ｋ
ｉｎｌｏｃｈ−ｄｅＬｏｅｓ）ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．
Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９５，３３３：４０８；バウムバー
ガー（Ｂａｕｍｂｅｒｇｅｒ）ら、ＡＩＤＳ，１９９
３，７（増刊２）：５９）ため、ＨＩＶ−１ＲＮＡ検
出の問題は別であった。血液中のウイルス核酸の最小検
出レベルと最小感染量の関係は決定的に重要な問題であ
ることに注目されたい。

【００４５】別の関心事は、ウイルスのサブタイプの多
様性である。この意味で、ＰＣＲベースの測定法の標的
であるゲノム領域は、多様なウイルス株中で高度に保存
されなければならない。ＨＣＶゲノムの高度に保存され
た５’非翻訳領域に存在するプライマーの選択は、後述
の例に示すように大多数のＨＣＶサブタイプの検出を可
能にする（バック（Ｂｕｃｋ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９：１８
７；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，１９９３，３１：８８２）。ＨＩＶサブ
タイプの検出は、ＨＩＶ−１増幅のためのプライマーが
得られるｇａｇ遺伝子中に高い変動が報告されているた
め、より問題が多い（マイアーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら、理
論生物学と生物物理（ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌＢｉｏ
ｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）、ロスアラ
モス国立研究所（ＬｏｓＡｌａｍｏｓＮａｔｉｏｎ
ａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ロスアラモス、ニューメ
キシコ州、米国、１９９５）。さらに複数のクレードか
ら得られた遺伝子領域を有する組換えＨＩＶウイルス株
が、最近観察されている（ジアズ（Ｄｉａｚ）ら、１９
９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：３２７３）。最近、アン
プリコア（ＡＭＰＬＩＣＯＲ）（登録商標）ＨＩＶモニ
ター試験（ＨＩＶＭｏｎｉｔｏｒＴｅｓｔ）中の大
多数のＨＩＶ−１サブタイプの検出を可能にする新しい
プライマーの実現により、特定のＨＩＶ−１サブタイプ
を見逃すリスクが減少した（ミチェル（Ｍｉｃｈａｅ
ｌ）ら、レトロウイルスと日和見感染についての第４回
会議（ＩＶＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＲｅｔｒｏ
ｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＯｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）、ワシントン・ディー・シー、
（抄録２７９）、１９９７）。しかし、ＨＩＶ−１の遺
伝的進化の絶え間ない世界的評価に注目すべきである。

【００４６】以下に示す本発明の例は、例示目的のみで
あり、決して本発明の範囲を限定するものではない。前
述の説明と以下の例を読んだ後に、例の指針に従えば本
発明の範囲内で本発明の多くの実施態様が可能であるこ
とが当業者には明らかであろう。

【００４７】例１この例では、プールした血漿中のＨＩＶ、ＨＢＶ、およ
びＨＣＶの検出のための好適なプロトコルが記載され
る。変更が添付の請求項の範囲内にある限り、このプロ
トコルの変更が可能性であることを理解すべきである。
そのような変更は特許請求された本発明の範囲内であ
る。

【００４８】プロトコル 1. ＲＮＡを添加したかまたは添加していない５０００
μｌの血漿プール、２７０μｌの３ＭＮａＣｌおよび
３２０μｌの５０％ＰＥＧ６０００（例えば、フルカ
（Ｆｌｕｋａ）８１３０４）水溶液を、１５mlの無菌試
験管（例えば、ファルコンチューブ＃２０９７のような
円錐ポリプロピレン管；ベクトンディッキンソン社（Ｂ
ｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＣｏ．）から入手で
きる）に加える； 2. 混合し、氷上で３０分インキュベートする； 3. ５，０００rpm で４℃で３０分遠心分離する（例え
ば、ヘラエウスミニフュージ（Ｈｅｒａｅｕｓｍｉｎ
ｉｆｕｇｅ）ＧＬ）； 4. 上清を捨てる（例えば、ディスポのパスツールピペ
ットで）； 5. ２．５mlの溶解緩衝液（６０mMトリス／塩酸（ｐＨ
７．５）、６８％(w/v)チオシアン酸グアニジン、３％
(w/v) ジチオスレイトール）に再懸濁する； 6. ３７℃で１０分インキュベートする（例えば、標準
的インキュベーターまたは水浴中で）； 7. ２．６mlのイソプロパノールを加える（メタノー
ル、エタノール、プロパノール、ならびにブタノール、
ペンタノール、およびヘキサノールの液体型［室温で］
のような他アルコールも使用できる）； 8. 室温で２分インキュベートする（約１５〜２５
℃）； 9. ５，０００rpm で室温で１５分遠心分離する（例え
ば、ヘラエウスミニフュージ（Ｈｅｒａｅｕｓｍｉｎ
ｉｆｕｇｅ）ＧＬ）； 10. 上清を捨てる； 11. ７０％(v／v)エタノール水溶液１mlを加える（エタ
ノールの代わりに、メタノール、プロパノール、イソプ
ロパノール、ならびにブタノール、ペンタノール、およ
びヘキサノールの液体型［室温で］のような他アルコー
ルも使用できる）； 12．２mlの試験管に移し（例えば、サルステット（Ｓａ
ｒｓｔｅｄｔ）、Ｎｏ．７２．６９３．１０５のような
キャップのついた無菌試験管）； 13. １５，０００rpm で室温で５分遠心分離する（例え
ば、エッペンドルフ５４１５遠心分離機）； 14. 上清を捨てる； 15. ５５μｌのＨＩＶ試料希釈液［１０mMトリス−塩
酸、０．１mM ＥＤＴＡ、２０μg/ml ｐｏｌｙｒＡ
ＲＮＡ、０．０５％(w/v) アジ化ナトリウム］を加
え、ペレットを再懸濁する； 16. 再懸濁したペレット２５μｌを取り、２５μｌの試
料希釈液を加える； 17. この混合物５０μｌを、ＨＩＶの増幅と検出に使用
する； 18. 工程１５からの再懸濁したペレット２５μｌを取
り、２５μｌの２ｘＨＣＶ試料希釈液（１００mMビシン
（Ｂｉｃｉｎｅ）、２００mM酢酸カリウム、１４mM酢酸
マンガン（II）、０．０５％(w/v) アジ化ナトリウム）
を加える； 19. この混合物５０μｌを、ＨＣＶの増幅と検出に使用
する。

【００４９】上記方法をＨＣＶ、ＨＩＶ、およびＨＢＶ
のためのアンプリコア（ＡＭＰＬＩＣＯＲ）（登録商
標）試験キットを用いる標準的方法と組合せると、プー
ルした試料中のＨＣＶ、ＨＩＶ、およびＨＢＶの特異的
検出が可能になる。

【００５０】工程１に関して、試料投入量は、沈殿によ
ってのみ増幅を阻害する可能性のある物質を除去できる
という意味で重要であることに注意すべきである。この
好適な濃度の塩の添加は、ＨＣＶの沈殿には決定的に重
要である。ＨＣＶ核酸の回収は、ＰＥＧと塩の非存在下
で２５，０００ｘｇで１時間遠心分離後は５０％未満で
あった。異なる濃度の異なるタイプのＰＥＧを使用する
こともできる。しかしＰＥＧの分子量および／またはそ
の濃度を変化させると、沈殿を助けるために加えられる
塩のタイプおよび／または濃度を変化させる必要も生じ
ることに注意すべきである。プールした試料から沈殿さ
れるウイルスが前記のものと異なる場合は、これらのウ
イルスに関してＰＥＧや塩の濃度を最適にすることが必
要になることもある。

【００５１】工程５に関して、大量の溶解緩衝液に再懸
濁することは、これは沈殿剤（ＰＥＧ）を除去すること
を助けるため、決定的に重要なことに注意すべきであ
る。容量が１mlより少ない場合は、ＰＣＲ反応の部分的
または完全な阻害が起きることもある。

【００５２】工程１５に記載の条件は、ＨＣＶを検出す
るのに特に適している。さらにＨＣＶに対する試験を行
う場合は、後者の溶液は、２倍濃度で加えられる。ＨＣ
Ｖのみを試験する場合は、ペレットはＨＣＶ試料希釈液
［５０mMビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、１００mM酢酸カリウ
ム、７mM酢酸マンガン（II）、０．０５％(w/v) アジ化
ナトリウム］に直接再懸濁してもよい。この容量は、標
準的アンプリコア（ＡＭＰＬＩＣＯＲ）（登録商標）モ
ニター法中の容量（１ml／１００μｌ血清）より、投入
試料量（５５μｌ／５ml血清）と比較するとはるかに少
ない。その結果、ＰＣＲを開始するのに５μｌの代わり
に、５mlの出発容量に等しい量が使用される。このた
め、多くの試料のプールではなく、１つの試料を使用す
る時の感度は１０００倍上昇する。もちろん多くの試料
をプールすると、個々の試料に比較して感度は低下す
る。

【００５３】例１の方法は、５mlのプールした血漿中の
約１００コピーのＨＣＶ核酸を再現性良く検出すること
を可能にする。ＨＣＶ核酸の回収率は、７０〜１００％
の間であると計算される（１ml当たり８０００コピーの
ＨＣＶ核酸を含有する出発血漿を、まず標準的ＨＣＶア
ンプリコア（ＡＭＰＬＩＣＯＲ）（登録商標）試験で試
験し、次に試料を４００倍希釈した後再試験した方法に
基づく）。

【００５４】本発明の測定法は、ＨＣＶを検出するため
の任意の方法に特に有用である。高速遠心分離（５０，
０００ｇを６０分）してもペレット中のＨＣＶウイルス
粒子は濃縮されないことが観察された。従って、ウイル
ス粒子を溶解する前に、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）、ＮａＣｌ沈殿法を最初の工程として行った。最大
の回収率と簡便なペレット再懸濁を達成するのに必要な
ＰＥＧとＮａＣｌの最適濃度を評価した。血漿プールへ
の３％ＰＥＧと１４５mM ＮａＣｌの添加が最適である
ことがわかった。５０の選択していない供与血液１００
μｌを含有する１５のプールについて、定量的検出測定
法（アンプリコア（ＡＭＰＬＩＣＯＲ）（登録商標）Ｈ
ＣＶモニター（ＨＣＶＭｏｎｉｔｏｒ））を使用し
て、ＰＣＲ反応の阻害の可能性を評価した。

【００５５】

【表１】

【００５６】表１は、既知のＨＣＶＲＮＡコピー数を
含有する血漿の添加有りおよび無しで試験した１５のプ
ールの結果を示す。表では以下の略語を使用する：ＯＤ
は、光学密度を意味する（アンプリコア（ＡＭＰＬＩＣ
ＯＲ）（登録商標）ＨＩＶモニター（ＨＩＶＭｏｎｉ
ｔｏｒ））、ＩＱＳは、内部定量標準物質を意味し、Ｄ
Ｆは検出法の希釈倍率を意味する。試験した１５のプー
ルのすべては、ＨＣＶＲＮＡが陰性（ＯＤＨＣＶ＜
０．２）であり、既知数のＨＣＶＲＮＡコピーを含有
するすべてプール（５，０００〜４５コピー／５ml）は
陽性であった。７５０の供与血液の血漿試料を含む３０
のＰＣＲ反応で、内部ＨＣＶ定量標準物質（ＩＱＳ）の
ＯＤ値が示すように、ＰＣＲ反応の阻害は観察されなか
った。

【００５７】５mlプール中のＨＣＶＲＮＡ検出のため
のＰＥＧ法の感度限界を、定量検出法を使用して評価し
た（コバス（Ｃｏｂａｓ）アンプリコア（ＡＭＰＬＩＣ
ＯＲ）（登録商標）ＨＣＶ試験（ＨＣＶＴｅｓ
ｔ））。この測定法の感度は約１００ＨＣＶＲＮＡコ
ピー／mlであり、これは定量測定法より少なくとも１０
倍低い。図１は、ＨＣＶＲＮＡコピー／プールの投入
量に従うＨＣＶＲＮＡ陽性プールの割合を示す。２つ
の実験で使用したＨＣＶＲＮＡ陽性血漿は、４つの希
釈で二重測定で定量し、平均ＨＣＶＲＮＡレベルは２
３，３００コピー／mlであった（範囲、１６，３４０〜
３０，２１０）。この患者は、ＨＣＶ遺伝子型４ｈに感
染していた。それぞれ１０および３．３のＨＣＶＲＮ
Ａコピーを含有する５mlプールのすべて多重測定物（１
０／１０および１４／１４）、１．１コピーを含有する
１３／１４多重測定物、および０．３７コピーを含有す
る２／１４多重測定物は陽性であり、０．１２コピーを
有する多重測定物はいずれも陽性ではなかった。試験し
た５８プールにおいて内部対照（ＩＣ）のＯＤ値は３．
０を超えていたため、ＰＣＲ反応の阻害は観察されなか
った。試験した各プールでＨＩＶ−１ＲＮＡも添加し
た（最初の実験については、１，０００コピー／プー
ル、および第２の実験については、１００コピー／プー
ル）。試験したすべての５８プールは陽性であった。１
００のＨＩＶ−１ＲＮＡコピーの投入は、１／１希釈
倍率（ＤＦ）で２．０５６〜０．２１９（１／１２５Ｄ
Ｆ）の範囲のＯＤＨＩＶでいつも明瞭に検出され、Ｐ
ＣＲ反応の阻害は観察されなかった（ＯＤＩＱＳ＞
３．５）。

【００５８】５mlプール中のＨＩＶ−１ＲＮＡ検出の
ためのＰＥＧ法の感度限界を、ＨＩＶ−１ＲＮＡ陽性
血漿の希釈物を使用して評価した（図２）。試料は２つ
の希釈で二重測定で定量し、平均ＨＩＶＲＮＡレベル
は、４０，０００コピー／mlであった（範囲、３５，８
００〜４９，４５０）。３００および１００のＨＩＶＲ
ＮＡコピーを含有する５mlプールのすべて、および３３
のＨＩＶ−１ＲＮＡコピーを含有する２／５多重測定
物は陽性であった。試験した各プールでＨＣＶ−１Ｒ
ＮＡも添加し（１００コピー／プール）、試験したすべ
ての１５プールは陽性であった。ＰＣＲ反応の阻害は観
察されなかった（ＯＤＨＩＶ−１ＩＱＳ＞３．０およ
びＯＤＨＣＶＩＣ＞３．７）。

【００５９】ＰＥＧ沈殿後のペレットと上清の間のＨＣ
ＶＲＮＡの分離を、定量検出測定法を使用して評価し
た（表２）。ＨＣＶ感染が確立している１人の個人
（Ｋ）および３人の血清転換前の個人（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ
４）からの既知のＨＣＶＲＮＡコピー数を有する４つ
の異なる血漿試料を使用して、５０の供与血液の血漿１
００μｌを含有する５mlのプールに加えた。ＰＥＧ沈殿
後の上清中のＨＣＶＲＮＡのＨＣＶＲＮＡの濃度
を、１００μｌの上清を使用して、標準的方法（アンプ
リコア（ＡＭＰＬＩＣＯＲ）（登録商標）ＨＣＶモニタ
ー（ＨＣＶＭｏｎｉｔｏｒ））で評価した。ＨＣＶ
ＲＮＡの総回収率（ペレット＋上清）は、５３〜１３２
％で変動し、ペレット中のＨＣＶＲＮＡの回収率は４
０〜６８％で変動した。確立したＨＣＶ感染と血清転換
前試料についても同様のＨＣＶＲＮＡ回収率が観察さ
れた。試料Ｋで使用したＨＣＶ株の遺伝子型は、１ａで
ある。試料Ｓ１、Ｓ２、Ｓ４のＨＣＶ遺伝子型は、表３
に示す。この実験では、試料Ｓ１は１／１０希釈で使用
した。

【００６０】

【表２】

【００６１】複合体を形成する抗体の存在がウイルスを
沈殿させる能力に影響するかどうかを調べるために、８
人の患者の血清転換前試料（ＨＣＶＲＮＡ陽性、抗Ｈ
ＣＶ抗体陰性）を使用して５mlのプールで分析した。８
つの血清転換前試料の１０倍希釈物を使用して、５mlの
プールに加えた。

【００６２】

【表３】

【００６３】表３は、血清転換前試料の希釈に従う陽性
プールの数を示す。血清転換前試料のＨＣＶＲＮＡレ
ベルを二重測定で測定し、１，２５０〜７６２，０００
コピー／mlで変動した。未希釈血漿試料１００μｌを使
用して、ＨＣＶＲＮＡレベルの最も低い３つの血清転
換前試料（Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５）は二重測定で陽性であ
り、１／２多重測定は１／１０希釈で陽性であった（投
入量１０μｌ／プール）。すべての他の血清転換前試料
は、二重測定で１／１００希釈で絶えず検出された。希
釈分析に基づき、試験した異なるＨＣＶ遺伝子型（１
ａ、２ａ／ｃ、３ａ、３ｃ、４ｃ／ｄ、４ｈ）の間でＨ
ＣＶＲＮＡ検出限界の差は観察されなかった。

【００６４】例２供与血液のプール血液供与志願者から７mlのＥＤＴＡ試験管に全血を採取
し（輸血センター、ジュネーブ大学病院（Ｇｅｎｅｖａ
ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌ））、１，
０００ｇで室温で１０分遠心分離して血漿を分離した。
各血漿２mlを使用して、５０の供与血液のプールを作成
し、このプールを再度１，０００ｇで１０分遠心分離し
た。５mlのプールと各血漿のアリコートを４時間以内に
−７５℃で保存した。試験プロトコルは、地域の倫理委
員会で承認された。既知のＲＮＡコピー数を有するＨＣ
ＶまたはＨＩＶ−１陽性血漿の希釈物をプールに加え
て、ＰＣＲベースのプール測定法の感度を評価した。

【００６５】血清転換患者連続的試料から抗ＨＣＶ抗体陰性（アキシム（Ａｘｓｙ
ｍ）３．０、アボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、アボットパーク（Ａｂｂ
ｏｔｔＰａｒｋ）、イリノイ州）とＨＣＶＲＮＡ陽
性（アンプリコア（ＡＭＰＬＩＣＯＲ）（登録商標）Ｈ
ＣＶ試験（ＨＣＶＴｅｓｔ））の血漿試料を、我々の
−７５℃血漿コレクションから選択した。

【００６６】試料調製ＨＣＶＲＮＡとＨＩＶ−１ＲＮＡの抽出は、製造業
者の説明書（アンプリコア（ＡＭＰＬＩＣＯＲ）（登録
商標）モニター（Ｍｏｎｉｔｏｒ））に従って行ったが
若干の修飾を加え、まずウイルス粒子の溶解の前にポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿工程を、そして第２
にＰＣＲ反応中の抽出ＲＮＡの投入量を上げるために試
薬容量を変化させた。簡単に説明すると、１４５mM Ｎ
ａＣｌと３％ＰＥＧ（ＰＥＧ６０００溶液、フルカ
（Ｆｌｕｋａ）、ブックス（Ｂｕｃｈｓ）、スイス）
を、１５ml試験管（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、ベク
トンディッキンソン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ）、リンカーンパーク（ＬｉｎｃｏｌｎＰａｒ
ｋ）、ニュージャージー州）中の５mlのプールに加え
た。試験管を氷上で３０分インキュベートし、次に１，
５００ｇで４℃で３０分遠心分離した。上清を除去し、
ペレットを再度２．５mlの溶解試薬（コバス（Ｃｏｂａ
ｓ）アンプリコア（ＡＭＰＬＩＣＯＲ）（登録商標）Ｈ
ＣＶ）に再懸濁し、室温で１０分維持した。２．６mlの
イソプロパノールを添加後、試験管を１，５００ｇで室
温で１５分遠心分離した。ペレットを１mlの７０％エタ
ノールに再懸濁し、１．５mlの試験管（サルステット
（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）、セヴェレン（Ｓｅｖｅｌｅ
ｎ）、スイス）に移し、１２，５００rpm で室温で５分
遠心分離した。ディスポのパスツールピペットを使用し
てエタノールを完全に除去し、試験管を１５分オープン
にして微量のエタノールを除去した。ペレットを、５５
μｌのＨＩＶ試料希釈液（アンプリコア（ＡＭＰＬＩＣ
ＯＲ）（登録商標）ＨＩＶモニター（ＨＩＶＭｏｎｉ
ｔｏｒ））に再懸濁した。

【００６７】ＨＣＶＲＮＡとＨＩＶ−１ＲＮＡの増
幅と検出ＨＣＶＰＣＲ反応のために、２５μｌの抽出試料を２
５μｌのＨＣＶ試料希釈液（２Ｘ）（２Ｘの内部対照
（ＩＣ）を含有）と５０μｌのＨＣＶマスターミックス
と混合した。ＨＣＶＲＮＡの増幅サイクルと検出は、
ＰＣＲと検出工程の完全な自動化を提供するコバス（Ｃ
ｏｂａｓ）装置の製造業者の説明書に従って行った。Ｈ
ＩＶ−１ＰＣＲ反応のために、２５μｌの抽出試料を
２５μｌのＨＩＶ試料希釈液と５０μｌのＨＩＶマスタ
ーミックスと混合した。ＰＣＲは、アンプリコア（ＡＭ
ＰＬＩＣＯＲ）（登録商標）ＨＩＶモニター（ＨＩＶ
Ｍｏｎｉｔｏｒ）を使用して、製造業者の説明書に従っ
て行ったが、増幅サイクルの数を３６から４０に増やし
た。内部ＨＩＶ定量標準物質（ＩＱＳ）を溶解試薬に加
えた（試料当たり６．６μｌのＩＱＳ）。これは、精製
工程中のＲＮＡの回収率の調節を可能にする。

【００６８】ＨＣＶ検出の光学密度（ＯＤ）が０．２を
超えＩＣのＯＤが０．２を超え、そしてＨＩＶ検出のＯ
Ｄが０．２を超え、ＩＱＳのＯＤが０．３を超えた時、
試料は陽性であると見なした。

【００６９】各試料のＨＣＶＲＮＡとＨＩＶ−１Ｒ
ＮＡレベルの定量は、アンプリコア（ＡＭＰＬＩＣＯ
Ｒ）（登録商標）モニター（Ｍｏｎｉｔｏｒ）（ロッシ
ュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用して製造業者の説明書に従っ
て行った。

【００７０】ＨＣＶ遺伝子型ＨＣＶ遺伝子型とサブタイプは、アンプリコア（ＡＭＰ
ＬＩＣＯＲ）（登録商標）ＨＣＶシステムで増幅後、市
販のアッセイ（イノ−リパ（ＩＮＮＯ−ＬｉＰＡ）ＨＣ
Ｖ II、イノゲネティクス社（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｓＮ．Ｖ．）、ジンドレヒト（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈ
ｔ）、ベルギー）を使用して評価した。

【図面の簡単な説明】

【図１】減少する量のＨＣＶＲＮＡコピーを含有する
プールした血漿試料中のＨＣＶＲＮＡの検出限界を示
す。

【図２】減少する量のＨＩＶＲＮＡコピーを含有する
プールした血漿試料中のＨＩＶ−１ＲＮＡの検出限界
を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】沈殿剤を加えることにより核酸を選択的
に沈殿させることを特徴とする、液体生物学的材料のプ
ールした試料中の感染性物体の核酸の検出のための診断
試験の感度を上昇させる方法であって、好適な沈殿剤は
分子量範囲が１，０００〜１０，０００で最終濃度が１
〜５％(w/v) のポリエチレングリコールである、上記方
法。
【請求項２】沈殿剤は、プールした試料中で分子量範
囲が７，０００〜９，０００で最終濃度が２．０〜４．
０％(w/v) のポリエチレングリコール、好ましくは最終
濃度が約２．８〜２．９％(w/v) のＰＥＧ６０００であ
る、請求項１記載の方法。
【請求項３】核酸の沈殿を助けるために１価または２
価の塩、好ましくは１価の塩を加える、請求項１記載の
方法。
【請求項４】１価の塩はＮａＣｌまたはＫＣｌであ
り、好ましくは塩は、最終濃度２００〜４５０mM、最も
好ましくは２７０〜３２５mMの塩になるように加えられ
る、請求項３記載の方法。
【請求項５】沈殿は５℃未満の温度で行われる、請求
項１〜４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】複数のタイプのウイルスの同時沈殿を含
む、請求項１〜５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】好ましくはカオトロピック物質による、
感染性物体の溶解が後に続く、請求項１〜６のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項８】好ましくはイソプロパノールまたは別の
Ｃ₁〜Ｃ₆アルコールを使用する沈殿工程である、追加
の精製工程が後に続く、請求項７項に記載の方法。
【請求項９】液体生物学的材料のプールした試料中の
感染性物体の核酸の検出感度を上昇させるための、また
は種々の生物学的試料中の各物体の検出感度を上昇させ
るための、診断試験における、請求項１〜８のいずれか
１項に記載の方法の使用。
【請求項１０】液体生物学的材料のプールした試料中
の感染性物体の核酸、好ましくは血液試料（血漿または
血清）中のウイルス核酸、の存在を測定するためのキッ
トであって、請求項１または２で定義したポリエチレン
グリコールの溶液、および好ましくは核酸の存在を検出
するのに必要な他の試薬（例えば、配列特異的オリゴヌ
クレオチドプローブ）の溶液を含む、上記キット。
【請求項１１】１価または２価の塩、好ましくはＮａ
ＣｌまたはＫＣｌの溶液をさらに含む、請求項１０記載
のキット。
【請求項１２】適切な緩衝液中のチオシアン酸グアニ
ジンの溶液をさらに含む、請求項１０または１１のいず
れか１項に記載のキット。
【請求項１３】増幅反応および好ましくは検出工程を
行うのに必要な試薬をさらに含む、請求項１０〜１２の
いずれか１項に記載のキット。