JPH1033174A - Ｒｎａの熱安定性の改良方法 - Google Patents
Ｒｎａの熱安定性の改良方法Info
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- JPH1033174A JPH1033174A JP19633196A JP19633196A JPH1033174A JP H1033174 A JPH1033174 A JP H1033174A JP 19633196 A JP19633196 A JP 19633196A JP 19633196 A JP19633196 A JP 19633196A JP H1033174 A JPH1033174 A JP H1033174A
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- Japan
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- rna
- chelating agent
- reverse transcriptase
- mrna
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 マグネシウムイオンのような逆転写酵素の活
性化に必要な金属イオンを含有する反応液中、比較的高
い温度下でも、RNA を安定に存在させることができる方
法の提供。 【解決手段】 金属イオンを含有する溶液中でのRNA の
熱安定性の改良方法であって、前記溶液にデオキシヌク
レオチド トリフォスフェートのような金属イオンに対
するキレート剤を含有させる方法。
性化に必要な金属イオンを含有する反応液中、比較的高
い温度下でも、RNA を安定に存在させることができる方
法の提供。 【解決手段】 金属イオンを含有する溶液中でのRNA の
熱安定性の改良方法であって、前記溶液にデオキシヌク
レオチド トリフォスフェートのような金属イオンに対
するキレート剤を含有させる方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、RNA の熱安定性の
改良方法に関する。
改良方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトの遺伝子配列を解明するプロジェク
トが進行されているが、その中で、遺伝子を鋳型として
mRNAを作成し、さらに、作成されたmRNAを鋳型として完
全長cDNAを得ることが試みられている。一方、限られた
条件下では、Superscript IIのような逆転写酵素（RNA
依存性DNA ポリメラーゼ）を用いることで、in vitroで
mRNAからcDNAを得ることができることも知られている。
トが進行されているが、その中で、遺伝子を鋳型として
mRNAを作成し、さらに、作成されたmRNAを鋳型として完
全長cDNAを得ることが試みられている。一方、限られた
条件下では、Superscript IIのような逆転写酵素（RNA
依存性DNA ポリメラーゼ）を用いることで、in vitroで
mRNAからcDNAを得ることができることも知られている。
【０００３】上記mRNAから完全長cDNAを得るために上記
逆転写方法を利用することが考えられるが、従来の逆転
写方法では、mRNAから完全長のcDNAを得ることができな
かった。本発明者の検討によれば、Superscript IIの至
適温度である常温付近では、タンパク質の２次構造と同
様に、長鎖のmRNAは１本のmRNAの鎖内で２次構造を形成
してしまい、２次構造を形成している配列に対しては逆
転写酵素が作用せず、その結果、mRNAの末端まで逆転写
が行われないためである。
逆転写方法を利用することが考えられるが、従来の逆転
写方法では、mRNAから完全長のcDNAを得ることができな
かった。本発明者の検討によれば、Superscript IIの至
適温度である常温付近では、タンパク質の２次構造と同
様に、長鎖のmRNAは１本のmRNAの鎖内で２次構造を形成
してしまい、２次構造を形成している配列に対しては逆
転写酵素が作用せず、その結果、mRNAの末端まで逆転写
が行われないためである。
【０００４】即ち、現在の技術的限界は、mRNAの安定な
２次構造の為、反応が早期に終了し転写単位の5'末端ま
で到達する効率が非常に低いことである。この技術的な
限界はライブラリーの品質に影響を与える。何故なら殆
どのクローンが3'端のみを持ち、完全長を持たない為で
ある。このステップを克服する為、今までにいくつかの
試みがなされてきた。例えば、第一鎖の合成の前に、mR
NAの２次構造を解く為に70℃の前処理をすることが挙げ
られる。また、mRNAの熱処理の代わりに水酸化メチル水
銀で処理することも可能である。これらの方法は第一鎖
合成の効率を上げるのに極めて効果的であるにも拘わら
ず、完全長cDNAを効率良く回収するには十分でなかっ
た。特に数Kbp 以上の長いmRNAを逆転写する場合には、
特に効率が悪い。
２次構造の為、反応が早期に終了し転写単位の5'末端ま
で到達する効率が非常に低いことである。この技術的な
限界はライブラリーの品質に影響を与える。何故なら殆
どのクローンが3'端のみを持ち、完全長を持たない為で
ある。このステップを克服する為、今までにいくつかの
試みがなされてきた。例えば、第一鎖の合成の前に、mR
NAの２次構造を解く為に70℃の前処理をすることが挙げ
られる。また、mRNAの熱処理の代わりに水酸化メチル水
銀で処理することも可能である。これらの方法は第一鎖
合成の効率を上げるのに極めて効果的であるにも拘わら
ず、完全長cDNAを効率良く回収するには十分でなかっ
た。特に数Kbp 以上の長いmRNAを逆転写する場合には、
特に効率が悪い。
【０００５】また、mRNAの２次構造が解ける温度条件で
使用可能な耐熱性の逆転写酵素であるTth ポリメラーゼ
を用い、昇温下でmRNAを逆転写することも試みられた。
しかるに、Tth ポリメラーゼの活性化に必要なマンガン
イオンの存在下かつ昇温下では、mRNAが短時間の内に切
断さてしまい、数Kbp 以上のcDNAを合成することはでき
なかった。
使用可能な耐熱性の逆転写酵素であるTth ポリメラーゼ
を用い、昇温下でmRNAを逆転写することも試みられた。
しかるに、Tth ポリメラーゼの活性化に必要なマンガン
イオンの存在下かつ昇温下では、mRNAが短時間の内に切
断さてしまい、数Kbp 以上のcDNAを合成することはでき
なかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
上記２次構造に起因する問題を解決して完全長cDNAを得
るべく検討し、Superscript IIのような常温使用の酵素
の耐熱性と熱活性化の方法を新たに開発した。その結
果、mRNAが１本鎖の状態（２次構造を形成しない状態）
にある比較的高い温度で逆転写を行うことができるよう
になった。しかるに、比較的高い温度とすると、反応液
中にマグネシウムイオンのような金属イオンが含まれる
場合、前記マンガンイオンの場合と同様にmRNAが切断さ
れてしまい完全長のcDNAを得ることができないことがさ
らに判明した。マグネシウムイオンは逆転写酵素Supers
cript IIの活性化に必須のイオンであり、Superscript
IIによる逆転写のためには必須である。さらに、上記分
解は、SuperscriptIIによる逆転写の緩衝剤として一般
に使用されるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
〔以下、トリスという〕の共存下では顕著であった。
上記２次構造に起因する問題を解決して完全長cDNAを得
るべく検討し、Superscript IIのような常温使用の酵素
の耐熱性と熱活性化の方法を新たに開発した。その結
果、mRNAが１本鎖の状態（２次構造を形成しない状態）
にある比較的高い温度で逆転写を行うことができるよう
になった。しかるに、比較的高い温度とすると、反応液
中にマグネシウムイオンのような金属イオンが含まれる
場合、前記マンガンイオンの場合と同様にmRNAが切断さ
れてしまい完全長のcDNAを得ることができないことがさ
らに判明した。マグネシウムイオンは逆転写酵素Supers
cript IIの活性化に必須のイオンであり、Superscript
IIによる逆転写のためには必須である。さらに、上記分
解は、SuperscriptIIによる逆転写の緩衝剤として一般
に使用されるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
〔以下、トリスという〕の共存下では顕著であった。
【０００７】そこで本発明の目的は、マグネシウムイオ
ンのような逆転写酵素の活性化に必要な金属イオンを含
有する反応液中、比較的高い温度下でも、RNA を安定に
存在させることができる方法を提供することにある。
ンのような逆転写酵素の活性化に必要な金属イオンを含
有する反応液中、比較的高い温度下でも、RNA を安定に
存在させることができる方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、金属イオンを
含有する溶液中でのRNA の熱安定性の改良方法であっ
て、前記溶液に金属イオンに対するキレート剤を含有さ
せることを特徴とする方法に関する。本発明の好ましい
態様の１つは、金属イオンを含有する溶液中でのRNA の
熱安定性の改良方法であって、前記溶液に金属イオンに
対するキレート剤と多価アルコールを含有させる方法で
ある。この方法によれば、RNA の熱安定性がさらに高ま
る。
含有する溶液中でのRNA の熱安定性の改良方法であっ
て、前記溶液に金属イオンに対するキレート剤を含有さ
せることを特徴とする方法に関する。本発明の好ましい
態様の１つは、金属イオンを含有する溶液中でのRNA の
熱安定性の改良方法であって、前記溶液に金属イオンに
対するキレート剤と多価アルコールを含有させる方法で
ある。この方法によれば、RNA の熱安定性がさらに高ま
る。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下本発明について説明する。本
発明の方法は、マグネシウムイオンのような逆転写酵素
の活性化に必要な金属イオンを含有する反応液に前記金
属イオンに対するキレート剤を存在させることを特徴と
する。酵素は活性化のため金属イオンを必要とすること
があり、逆転写酵素であるSuperscript IIは、活性化の
ため、金属イオンとしてマグネシウムイオンを必要とす
る。ところが、マグネシウムイオンを含む溶液中、特に
トリス(Tris)緩衝液中、比較的高い温度条件下で逆転写
反応を行うと、mRNAの切断が進み、完全長のcDNAを得る
ことが困難である。
発明の方法は、マグネシウムイオンのような逆転写酵素
の活性化に必要な金属イオンを含有する反応液に前記金
属イオンに対するキレート剤を存在させることを特徴と
する。酵素は活性化のため金属イオンを必要とすること
があり、逆転写酵素であるSuperscript IIは、活性化の
ため、金属イオンとしてマグネシウムイオンを必要とす
る。ところが、マグネシウムイオンを含む溶液中、特に
トリス(Tris)緩衝液中、比較的高い温度条件下で逆転写
反応を行うと、mRNAの切断が進み、完全長のcDNAを得る
ことが困難である。
【００１０】それに対して、本発明の方法では、金属イ
オンを含み逆転写酵素の活性は維持しながら、かつmRNA
の切断を阻止できる方法として、金属イオンに対するキ
レート剤を存在させる。但し、逆転写酵素の活性化のた
めの金属イオンを完全にキレートしてしまうと逆転写酵
素が活性を示さなくなる。そこで、キレート力の比較的
強い、例えばＥＤＴＡのような強いキレート剤を用いる
場合には、金属イオンに対して当量未満のキレート剤を
用いることが適当である。また、キレート力の比較的弱
いキレート剤を用いる場合には、金属イオンに対してほ
ぼ当モル量またはそれ以上、例えば、２モル倍までのキ
レート剤を用いることが適当である。但し、酵素活性に
必要なマグネシウムやマンガン等の金属イオンの至適濃
度を調節する為、比較的弱いキレート剤を用いることが
好ましい。
オンを含み逆転写酵素の活性は維持しながら、かつmRNA
の切断を阻止できる方法として、金属イオンに対するキ
レート剤を存在させる。但し、逆転写酵素の活性化のた
めの金属イオンを完全にキレートしてしまうと逆転写酵
素が活性を示さなくなる。そこで、キレート力の比較的
強い、例えばＥＤＴＡのような強いキレート剤を用いる
場合には、金属イオンに対して当量未満のキレート剤を
用いることが適当である。また、キレート力の比較的弱
いキレート剤を用いる場合には、金属イオンに対してほ
ぼ当モル量またはそれ以上、例えば、２モル倍までのキ
レート剤を用いることが適当である。但し、酵素活性に
必要なマグネシウムやマンガン等の金属イオンの至適濃
度を調節する為、比較的弱いキレート剤を用いることが
好ましい。
【００１１】キレート力の比較的弱いキレート剤として
は、例えば、デオキシヌクレオチドトリフォスフェート
(dNTP)を挙げることができる。キレート剤としてデオキ
シヌクレオチド トリフォスフェートを使用する場合
は、金属イオンに対して当量を添加することが適当であ
る。従って、キレート剤の添加量は、対象となる金属イ
オンに対するキリート力を考慮して、逆転写酵素活性は
維持でき、かつmRNAの切断も阻止できる量を適宜決定で
きる。尚、デオキシヌクレオチド トリフォスフェート
はdATP、dGTP、dCTP、dTTPのいずれか１種を使用しても
或いは２種以上を併用してもよい。また、dATP、dGTP、
dCTP、dTTPの４種を併用しても良い。
は、例えば、デオキシヌクレオチドトリフォスフェート
(dNTP)を挙げることができる。キレート剤としてデオキ
シヌクレオチド トリフォスフェートを使用する場合
は、金属イオンに対して当量を添加することが適当であ
る。従って、キレート剤の添加量は、対象となる金属イ
オンに対するキリート力を考慮して、逆転写酵素活性は
維持でき、かつmRNAの切断も阻止できる量を適宜決定で
きる。尚、デオキシヌクレオチド トリフォスフェート
はdATP、dGTP、dCTP、dTTPのいずれか１種を使用しても
或いは２種以上を併用してもよい。また、dATP、dGTP、
dCTP、dTTPの４種を併用しても良い。
【００１２】本発明の方法においては、上記のようなキ
レート剤に加えて、多価アルコールを補助剤として添加
することでさらにRNA の安定性を向上させることができ
る。多価アルコールとしては、例えば、グリセロール、
エチレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げ
ることができる。
レート剤に加えて、多価アルコールを補助剤として添加
することでさらにRNA の安定性を向上させることができ
る。多価アルコールとしては、例えば、グリセロール、
エチレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げ
ることができる。
【００１３】以上は、逆転写酵素がSuperscript IIであ
る場合について主に説明したが、他の金属イオンを必要
とする逆転写酵素についても、同様にキレート剤を使用
することで、逆転写酵素の活性を維持しつつRNA を熱安
定化することができる。
る場合について主に説明したが、他の金属イオンを必要
とする逆転写酵素についても、同様にキレート剤を使用
することで、逆転写酵素の活性を維持しつつRNA を熱安
定化することができる。
【００１４】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明について詳細
に説明する。 実施例１金属イオン含有バッファーにおけるmRNAの安定性（dNTP
の付加） バッファー（50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2）に幾つかの
添加剤を添加した場合のRNA の安定性について検討する
ため、65℃でT7 RNAポリメラーゼでin vitro転写された
RNA を用い、下記の組成のバッファー中でインキュベー
ションした。制限酵素Notlによる切断により直線状に開
裂したpBluescript II SK をT7 RNAポリメラーゼでin v
itro転写することによりRNA を調製した。この反応のプ
ライマーにはpBluescript II SK の使用説明に書いてあ
るSKプライマーを用いた。
に説明する。 実施例１金属イオン含有バッファーにおけるmRNAの安定性（dNTP
の付加） バッファー（50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2）に幾つかの
添加剤を添加した場合のRNA の安定性について検討する
ため、65℃でT7 RNAポリメラーゼでin vitro転写された
RNA を用い、下記の組成のバッファー中でインキュベー
ションした。制限酵素Notlによる切断により直線状に開
裂したpBluescript II SK をT7 RNAポリメラーゼでin v
itro転写することによりRNA を調製した。この反応のプ
ライマーにはpBluescript II SK の使用説明に書いてあ
るSKプライマーを用いた。
【００１５】
【表１】
【００１６】インキュベーション後のRNA の切断を見る
為に検体をSambrookらが記載しているRNA アガロースゲ
ル泳動に供した（Molecular Cloning, The second edit
ionpp 7.43-7.45）。ゲルはエチジウムプロマイドで染
め、RNA の切断の程度の評価はリポゾームRNA のバンド
の相対的強度を比較することにより評価した。アガロー
スゲル泳動の結果（レーン１〜７）を図１に示す。
為に検体をSambrookらが記載しているRNA アガロースゲ
ル泳動に供した（Molecular Cloning, The second edit
ionpp 7.43-7.45）。ゲルはエチジウムプロマイドで染
め、RNA の切断の程度の評価はリポゾームRNA のバンド
の相対的強度を比較することにより評価した。アガロー
スゲル泳動の結果（レーン１〜７）を図１に示す。
【００１７】レーン１に示すように、高濃度フリーのマ
グネシウムイオン（フリー Mg2+ )の下、つまりRNA を5
0mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2 15％(v/v) グリセロール
でインキュベーションしたときには、グリセロールはRN
A を切断から守るのに十分働かなかった。事実、切断の
程度は50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2、グリセロール非存
在下で処理したもの（レーン２）と同程度であった。レ
ーン３に示すように、50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2, 2m
M dNTPで処理してもRNA の切断を十分には防ぎ切れなか
った。一方、レーン４に示すように、50mM Tris pH8.3,
3mM MgCl2, 3mM dNTP（NTPとＭｇ2+は同一モル濃度)
の条件下ではRNA の切断を部分的に防止することができ
た。さらに、レーン５に示すように、50mM Tris pH8.3,
3mM MgCl2, 4mM dNTPの存在下、つまりＭｇ2+よりdNTP
が 1mM多く含まれている条件下では、RNA は非常に安定
であったが、逆転写酵素の活性はやや下がった。そこ
で、レーン６に示すように、50mM Tris pH8.3, 3mM MgC
l2, 3mM dNTP (NTP とＭｇ2+は同一モル濃度) に15％グ
リセロールを加えると、逆転写酵素活性は完全に保たれ
たままRNA も切断を受けなかった。レーン６で使用した
条件下ではRNA の安定性は、レーン７に示す滅菌水の安
定性と殆ど変わらなかった。
グネシウムイオン（フリー Mg2+ )の下、つまりRNA を5
0mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2 15％(v/v) グリセロール
でインキュベーションしたときには、グリセロールはRN
A を切断から守るのに十分働かなかった。事実、切断の
程度は50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2、グリセロール非存
在下で処理したもの（レーン２）と同程度であった。レ
ーン３に示すように、50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2, 2m
M dNTPで処理してもRNA の切断を十分には防ぎ切れなか
った。一方、レーン４に示すように、50mM Tris pH8.3,
3mM MgCl2, 3mM dNTP（NTPとＭｇ2+は同一モル濃度)
の条件下ではRNA の切断を部分的に防止することができ
た。さらに、レーン５に示すように、50mM Tris pH8.3,
3mM MgCl2, 4mM dNTPの存在下、つまりＭｇ2+よりdNTP
が 1mM多く含まれている条件下では、RNA は非常に安定
であったが、逆転写酵素の活性はやや下がった。そこ
で、レーン６に示すように、50mM Tris pH8.3, 3mM MgC
l2, 3mM dNTP (NTP とＭｇ2+は同一モル濃度) に15％グ
リセロールを加えると、逆転写酵素活性は完全に保たれ
たままRNA も切断を受けなかった。レーン６で使用した
条件下ではRNA の安定性は、レーン７に示す滅菌水の安
定性と殆ど変わらなかった。
【００１８】以上のように、キレート剤としてdNTPを緩
衝液中では、65℃という高温下でかつマグネシウムイオ
ンの存在下においてもRNA の安定性が維持されている。
衝液中では、65℃という高温下でかつマグネシウムイオ
ンの存在下においてもRNA の安定性が維持されている。
【００１９】実施例2逆転写酵素の耐熱化による逆転写効率の向上 上記レーン６で使用した新しい条件下において、逆転写
活性を見る為、T7 RNAポリメラーゼでin vitro転写され
たRNA を鋳型RNA として用い、それからcDNAを合成し、
その産物に関して評価した。in vitroで転写されたRNA
を鋳型にして変性ゲル電気泳動を用いると、逆転写反応
の効率を各々の検体で比較でき、また、早期の逆転写の
終結や反応効率の減少を示す非特異的転写の終結を評価
できる。
活性を見る為、T7 RNAポリメラーゼでin vitro転写され
たRNA を鋳型RNA として用い、それからcDNAを合成し、
その産物に関して評価した。in vitroで転写されたRNA
を鋳型にして変性ゲル電気泳動を用いると、逆転写反応
の効率を各々の検体で比較でき、また、早期の逆転写の
終結や反応効率の減少を示す非特異的転写の終結を評価
できる。
【００２０】コントロールとして、逆転写の標準バッフ
ァーの条件は次のものを用いた。50mM Tris-HCl pH8.3,
75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mMジチオスレイトール, 各dN
TP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 0.75mM。上記標準バッフ
ァーに 1μg 鋳型RNA, 400ngプライマー(20mer SK プラ
イマー, CGCTCTAGAACTAGTGGATC), とsuperscript II 2
00unitを20μl に調整する。0.2 μl の [α-P32]dGTP
を逆転写産物標識の為に用いた。その他の全ての基質を
入れる前に、RNA とプライマーの混合検体は65℃にイン
キュベートされた。その後の反応は42℃１時間で実行し
た。反応産物は変性アガロース電気泳動法に供され、完
全長cDNAの回収率と、短い不完全伸長による産物との割
合を調べる為にオートラジオグフィで電気泳動パターン
を調べた。結果を図２のレーン１に示す。尚、逆転写酵
素superscript IIは、上記標準バッファー条件下では50
℃以上の温度にすると失活した。
ァーの条件は次のものを用いた。50mM Tris-HCl pH8.3,
75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mMジチオスレイトール, 各dN
TP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 0.75mM。上記標準バッフ
ァーに 1μg 鋳型RNA, 400ngプライマー(20mer SK プラ
イマー, CGCTCTAGAACTAGTGGATC), とsuperscript II 2
00unitを20μl に調整する。0.2 μl の [α-P32]dGTP
を逆転写産物標識の為に用いた。その他の全ての基質を
入れる前に、RNA とプライマーの混合検体は65℃にイン
キュベートされた。その後の反応は42℃１時間で実行し
た。反応産物は変性アガロース電気泳動法に供され、完
全長cDNAの回収率と、短い不完全伸長による産物との割
合を調べる為にオートラジオグフィで電気泳動パターン
を調べた。結果を図２のレーン１に示す。尚、逆転写酵
素superscript IIは、上記標準バッファー条件下では50
℃以上の温度にすると失活した。
【００２１】オリゴ糖類を添加すると酵素反応が安定化
されることを示す為に、逆転写のバッファー条件を次の
ように設定した。50mM Tris-HCl pH8.3, 75mM KCl, 3mM
MgCl2, 10mM ジチオスレイトール, 各dNTP (dATP, dG
TP, dCTP, dTTP) 0.75mM, 20 ％(w/v) トレハロース、
20％(v/v) グリセロール。上記バッファーに 1μg 鋳型
RNA, 400ngプライマー(20mer SK プライマー) と200uni
t のsuperscript IIを24μl の水溶液中で反応させた。
0.2 μl の [α-P32]dGTP を逆転写産物標識の為に用い
た。この条件下では逆転写酵素superscript IIは標準温
度 (42℃) のコントロール反応より高い活性を有した。
酵素活性はプライマーと鋳型RNA を37℃で２分間アニー
ルした後、60℃で測定した。
されることを示す為に、逆転写のバッファー条件を次の
ように設定した。50mM Tris-HCl pH8.3, 75mM KCl, 3mM
MgCl2, 10mM ジチオスレイトール, 各dNTP (dATP, dG
TP, dCTP, dTTP) 0.75mM, 20 ％(w/v) トレハロース、
20％(v/v) グリセロール。上記バッファーに 1μg 鋳型
RNA, 400ngプライマー(20mer SK プライマー) と200uni
t のsuperscript IIを24μl の水溶液中で反応させた。
0.2 μl の [α-P32]dGTP を逆転写産物標識の為に用い
た。この条件下では逆転写酵素superscript IIは標準温
度 (42℃) のコントロール反応より高い活性を有した。
酵素活性はプライマーと鋳型RNA を37℃で２分間アニー
ルした後、60℃で測定した。
【００２２】反応産物は上記と同様に変性アガロース電
気泳動法に供され、完全長cDNAの回収率と、短い不完全
伸長による産物との割合を調べる為にオートラジオグフ
ィで電気泳動パターンを調べた。結果を図２に示す。レ
ーン１に示すように、標準バッファー42℃での条件下で
は、途中の特異的な部分で逆転写が止まった産物や非特
異的に逆転写が停止した産物がみられる。レーン２に示
すように、同じく42℃においては20％トレハロース20％
グリセロールを加えてもこれらの途中で停止した産物は
同様にみられた。レーン３に示すように、60℃に温度を
上げると、途中で合成反応が停止した産物は極めて少な
くなり、完全長が合成されている。レーン５に示すよう
に、レーン３の条件にさらに0.125 μg/μl のＢＳＡを
加えると、更に酵素活性が安定化した。しかし、20％ト
レハロース20％グリセロールを添加せず、ＢＳＡのみで
は酵素の耐熱化は十分ではなかった。レーン４に示すよ
うに、レーン３の条件にさらにtriton X100 を0.05％加
えると、途中で停止した不完全逆転写反応物はさらに減
少した。しかし、逆転写酵素全体の活性がやや低下し
た。
気泳動法に供され、完全長cDNAの回収率と、短い不完全
伸長による産物との割合を調べる為にオートラジオグフ
ィで電気泳動パターンを調べた。結果を図２に示す。レ
ーン１に示すように、標準バッファー42℃での条件下で
は、途中の特異的な部分で逆転写が止まった産物や非特
異的に逆転写が停止した産物がみられる。レーン２に示
すように、同じく42℃においては20％トレハロース20％
グリセロールを加えてもこれらの途中で停止した産物は
同様にみられた。レーン３に示すように、60℃に温度を
上げると、途中で合成反応が停止した産物は極めて少な
くなり、完全長が合成されている。レーン５に示すよう
に、レーン３の条件にさらに0.125 μg/μl のＢＳＡを
加えると、更に酵素活性が安定化した。しかし、20％ト
レハロース20％グリセロールを添加せず、ＢＳＡのみで
は酵素の耐熱化は十分ではなかった。レーン４に示すよ
うに、レーン３の条件にさらにtriton X100 を0.05％加
えると、途中で停止した不完全逆転写反応物はさらに減
少した。しかし、逆転写酵素全体の活性がやや低下し
た。
【図１】 実施例１で得られたアガロースゲル泳動結果
を示す図面に代わる写真。
を示す図面に代わる写真。
【図２】 実施例２で得られたアガロースゲル泳動結果
を示す図面に代わる写真。
を示す図面に代わる写真。
Claims (7)
- 【請求項１】 金属イオンを含有する溶液中でのRNA の
熱安定性の改良方法であって、前記溶液に金属イオンに
対するキレート剤を含有させることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 キレート剤が１種又は２種以上のデオキ
シヌクレオチド トリフォスフェートである請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 金属イオンがマグネシウムイオンまたは
マンガンイオンである請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記溶液がトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタンを含有する請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 45〜90℃の温度反での熱安定性を改善す
る請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 前記溶液がさらに１種又は２種以上の多
価アルコールを含有する請求項１〜５のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項７】 多価アルコールがグリセロールである請
求項６に記載の方法。
Priority Applications (10)
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|---|---|---|---|
| JP19633196A JP3709490B2 (ja) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | Ｒｎａの熱安定性の改良方法 |
| US08/899,392 US6013488A (en) | 1996-07-25 | 1997-07-23 | Method for reverse transcription |
| DE69734913T DE69734913T2 (de) | 1996-07-25 | 1997-07-24 | Verfahren für reverse Transkription |
| EP02013871A EP1243661B1 (en) | 1996-07-25 | 1997-07-24 | The use of certain substances for improving heat stability of RNA |
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| EP97112672A EP0821059B8 (en) | 1996-07-25 | 1997-07-24 | Method for reverse transcription |
| DE69738354T DE69738354D1 (de) | 1996-07-25 | 1997-07-24 | Verwendung bestimmter Substanzen für das Verbessern der Wärmestabilität von RNS |
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1996
- 1996-07-25 JP JP19633196A patent/JP3709490B2/ja not_active Expired - Fee Related
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