JPH1033176A - 植物由来のｎａｄｐｈオキシダーゼ、その遺伝子及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】植物の生育を人為的に制御する新型技術の提
供。 【解決手段】１．特定のアミノ酸配列を有するNADPH オ
キシダーゼ、２．該アミノ酸配列をコードする塩基配列
を有するNADPH オキシダーゼ遺伝子、３．該NADPH オキ
シダーゼ遺伝子を含有するプラスミド、４．該プラスミ
ドを宿主細胞内に導入することにより形質転換させた形
質転換体、５．（１）植物細胞内で機能可能なプロモー
ター、（２）該アミノ酸配列をコードする塩基配列を有
するNADPH オキシダーゼ遺伝子、及び（３）植物細胞内
で機能可能なターミネーターを機能可能な形で前記の順
序に結合させる発現プラスミドの構築方法、６．前記
５．により得られる発現プラスミド、７．前記６．の発
現プラスミドを宿主細胞内に導入し、該宿主細胞を形質
転換させることにより形質転換体の成長を制御する方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物由来のNADPH
オキシダーゼ、その遺伝子及びその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物は発芽、成長、受精、種子形成とい
う生活環を有し、その各々の発生ステージに要する期間
は基本的に植物種により規定されている。この植物の生
活環の一部を人為的な方法によって制御することによ
り、植物の生育を産業としての農業に適するように改良
し、該技術は産業としての農業の発展に大きく寄与し
た。具体的には、従来から、例えば、早生品種や晩生品
種の有する早生形質や晩生形質を交配育種により目的と
する植物に導入し、該植物の生育を人為的に制御し、農
業生産の経済性を高めたり、また近年では、例えば、植
物生長調節剤を使用することにより目的とする植物の品
質面からみた商品性の向上、出荷時期の調整および栽培
など諸作業の省力化が行われている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ところが、上記の交配
育種の場合は、膨大な繰り返し交配を要するために多大
な時間と努力が必要であると共に、極めて非効率的な方
法であった。また、植物生長調節剤を使用する場合に
は、例えば、その薬剤の開発、例えば、活性化合物の選
抜、効果評価、及び毒性評価の研究等、に莫大な費用と
多大な時間がかかってしまうという問題があった。この
ため、植物の生育を人為的に制御する新たな技術が望ま
れている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討を行った結果、ある種の酵素遺伝子を
植物細胞内に導入し、該植物細胞を形質転換させること
により、形質転換体の生育を制御することができる新し
いタイプの技術を見出し、本発明に至った。即ち、本発
明は、 １）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有することを
特徴とするNADPH オキシダーゼ（以下、本発明タンパク
質と記す。）、 ２）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有することを特徴とするNADPH オキシダーゼ遺
伝子（以下、本発明遺伝子と記す。）、 ３）配列番号２で示される塩基配列（ＣＤＳの存在位置
１．．２８３２）を有することを特徴とする前項２記載
のNADPH オキシダーゼ遺伝子、 ４）前項２記載のNADPH オキシダーゼ遺伝子を含有する
ことを特徴とするプラスミド（以下、本発明プラスミド
と記す。）、 ５）前項４記載のプラスミドを宿主細胞内に導入するこ
とにより形質転換させた形質転換体（以下、本発明形質
転換体と記す。）、 ６）宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項５記
載の形質転換体、 ７）宿主細胞が植物であることを特徴とする前項５記載
の形質転換体、 ８）（１）植物細胞内で機能可能なプロモーター、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有することを特徴とするNADPH オキシダーゼ
遺伝子、及び（３）植物細胞内で機能可能なターミネー
ターを機能可能な形で前記の順序に結合させることを特
徴とする発現プラスミドの構築方法（以下、本発明構築
方法と記す。）、 ９）（１）植物細胞内で機能可能なプロモーター、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有することを特徴とするNADPH オキシダーゼ
遺伝子、及び（３）植物細胞内で機能可能なターミネー
ターを機能可能な形で前記の順序に結合させてなること
を特徴とする発現プラスミド（以下、本発明発現プラス
ミドと記す。）、 １０）（１）宿主細胞内で機能可能なプロモーター、
（２）NADPH オキシダーゼ遺伝子、及び（３）宿主細胞
内で機能可能なターミネーターを機能可能な形で前記の
順序に結合させてなることを特徴とする発現プラスミド
を宿主細胞内に導入し、該宿主細胞を形質転換させるこ
とにより形質転換体の成長を制御する方法（以下、本発
明制御方法と記す。）、 １１）NADPH オキシダーゼ遺伝子が植物由来であり、か
つ宿主細胞が植物であることを特徴とする前項１０記載
の方法、 １２）発現プラスミドが前項９記載の発現プラスミドで
あることを特徴とする前項１０記載の方法、を提供する
ものである。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、詳細に本発明について説明
する。

【０００６】本発明タンパク質は、配列番号１で示され
るアミノ酸配列を有することを特徴とするNADPH オキシ
ダーゼであり、例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis t
haliana)等のアブラナ科植物から調製することができる
分子量１０８ＫＤａ、アミノ酸９４３個からなるタンパ
ク質である。NADPH オキシダーゼは、酸素分子（O ₂ ）
を電子受容体としてＮＡＤＰＨを酸化する酵素であり、
スーパーオキシド（O ₂ ^- ）等の活性酸素の生成に関与
している。その活性は、例えば、Segal,A.W.,J.Clin.In
vest.,83,1785-1793(1989)等に記載される方法により測
定することができる。

【０００７】本発明遺伝子は、配列番号１で示されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴と
するNADPH オキシダーゼ遺伝子であり、例えば、シロイ
ヌナズナ(Arabidopsis thaliana)等のアブラナ科植物か
ら調製することができる。具体的な塩基配列としては、
例えば、配列番号２で示される塩基配列（ＣＤＳの存在
位置１．．２８３２）を有するNADPH オキシダーゼ遺伝
子等をあげることができる。尚、本発明遺伝子は、配列
番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を
有することを特徴とするNADPH オキシダーゼ遺伝子の同
効物をも含むものである。ここで「・・・の同効物」と
は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有することを特徴とするNADPH オキシダーゼ遺
伝子における１若しくは複数の塩基が付加、欠失又は置
換された塩基配列からなるNADPH オキシダーゼ遺伝子を
意味し、同一の機能を有する類似体であるＤＮＡのこと
である。

【０００８】本発明遺伝子をシロイヌナズナ(Arabidops
is thaliana)等のアブラナ科植物から調製するには、例
えば、シロイヌナズナにトウモロコシ由来のAc/Ds 転移
系（トウモロコシ由来のトランスポゾンdAc-RS因子をＴ
ーDNA 上に有する）を導入して作製したトランスポゾン
タギングラインをスクリーニング（細胞工学・別冊・植
物工学シリーズ４ モデル植物の実験プロトコール、p1
57-p164 、町田千代子他記載）し、成長が遅くなり、胚
形成異常を示す表現型を有するslow growth(slw-) 変異
型を分離する。その後、インバースPCR 法（Ochman,H.
Gerber,A.S. and Hartl,D.L.,Genetic application of
an inverse polymerase chain reaction,Genetics 120,
p621-p625(1988) 記載）によって増幅したＡｃ部位を含
むゲノムDNA 断片を単離する。このDNA 断片をプローブ
として用いて、以下に述べるcDNAライブラリーのスクリ
ーニングを行う。発芽後、２週間目の幼苗全体からmRNA
を調製し逆転写酵素によってcDNAを合成し、これをラム
ダZAPII などのファージベクターあるいはPUC などのプ
ラスミドベクターへ組み込んだcDNAライブラリーを作製
する。このライブラリーをさきに述べたプローブでスク
リ−ニングし、NADPH オキシダーゼ遺伝子cDNAを選抜す
る。選抜したcDNAの塩基配列を決定することにより、選
抜したcDNAがNADPH オキシダーゼ遺伝子（本発明タンパ
ク質のcDNA）であることを確認することができる。

【０００９】このようにして選抜されたcDNAからゲノム
DNA の塩基配列を決定するには、例えば、葉部、茎部、
根部等の植物組織を液体窒素で瞬時に凍結した後、乳鉢
と乳棒あるいはワーリングブレンダー等を用いて十分に
摩砕して得られた摩砕物から、例えば、渡辺格監修、杉
浦昌弘編集：「クローニングトシークエンス「植物バイ
オテクノロジー実験マニュアル）」、農村文化社、東京
（１９８９）等に記載の通常の方法に準じて、ゲノムDN
A を抽出する。得られたゲノムDNA は適当な制限酵素で
切断した後、ショ糖密度勾配遠心法や塩化セシウム平衡
遠心法等の公知の方法でDNA 断片を分画する。この分画
されたDNA 断片に対して、選抜されたcDNA（本発明タン
パク質のcDNA）をプローブとした通常のサザンブロット
ハイブリダイゼーション法（ゲノミックサザン）を行
い、目的とする情報をコードする遺伝子領域を決定す
る。さらに、この遺伝子領域を、市販のプラスミド、フ
ァージ、コスミド等の適当なベクターにライゲイション
することによりゲノムDNA ライブラリーを作製する。こ
のライブラリーに対して、本発明タンパク質のcDNAをプ
ローブとして、ハイブリダイゼイションによる通常のス
クリーニングを行い、本発明タンパク質のアミノ酸配列
をコードする領域を含むゲノムDNA クローンを取得す
る。得られたゲノムDNA クローンは遺伝子配列の解析に
適当なベクター、例えばプラスミド等にサブクローニン
グした後、通常の方法に準じて塩基配列を解析すること
により、本発明タンパク質のアミノ酸配列をコードする
領域を含むゲノムDNA 塩基配列を決定することができ
る。

【００１０】さらに、Bina-Stem, Met et al. Pro, Nat
h. Acad. Sci. USA, 76, 731(1979)やSollner-Webb and
Reeder, R.H., Cell, 18,485(1979) 等に記載されるプ
ライマーエクステンション法またはBerk, A.J. and Sh
arp,P.A.,Cell, 12, 721(1977)や Berk, A .J. and Sh
arp,P.A., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 75,1274(1978)
等に記載されるS1マッピング法等により、本発明タンパ
ク質のゲノムDNA の転写開始点を決定することができ
る。このようにして決定された転写開始点の上流には、
転写開始に必要なTATA配列が存在する。通常この転写開
始点の上流約１kbから約１０kbに遺伝子発現の制御を担
うプロモーター配列がある。本発明遺伝子のプロモータ
ー部位は、たとえば、あらかじめ種々の長さのプロモー
ター領域を有する遺伝子断片をGUS 等のレポーター遺伝
子に接続し、これを導入したトランスジェニック植物を
作製し、作製された植物の各組織におけるレポーター遺
伝子の発現の有無を調べることにより最終的に決定する
ことができる。一方、ターミネーター配列は、終止コド
ンの下流の３’末端非翻訳領域に存在するpoly(A) 付加
シグナル（AATAAAをコンセンサス配列とする）のさらに
下流に通常存在するpolyA 配列に相当するゲノムDNA 領
域に存在し、効率的な転写終結の機能を有している。

【００１１】ところで、病原性微生物がヒトや動物等の
高等生物体内に侵入する際には、該被生物体内で様々な
防御機構が働き出すことが知られている。例えば、防御
反応で重要な働きを担う好中球は、スーパーオキサイド
（O ₂ ^- ) をはじめとする過酸化水素（H ₂ O ₂ ) やハ
イドロラジカル（.OH ）などの活性酸素を生成させる。
特にO ₂ ^- は、膜結合NADPH オキシダーゼ系の活性化に
より始めて生成することが知られている。生成されたO
₂ ^- は抗菌活性を有しており、侵入病原性微生物を攻撃
することにより高等生物は外敵からの防御を行ってい
る。従って、本発明遺伝子を用いて遺伝子工学的技術に
より本発明タンパク質を宿主細胞内において効果的に発
現させることができれば、病原性微生物の有効な防除手
段にもなりえる。

【００１２】本発明プラスミドは、配列番号１で示され
るアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特
徴とするNADPH オキシダーゼ遺伝子を含有している。好
ましい具体的なプラスミドとしては、例えば、配列番号
１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有す
ることを特徴とするNADPH オキシダーゼ遺伝子をpSK-(S
trategene)にクローニングし作製したプラスミドがあ
り、ベクター部分が小さく、大腸菌でのコピー数が多い
という特徴を有しており、ＤＮＡ調製やＤＮＡ構造解析
を行うのに適している。

【００１３】本発明発現プラスミドは、（１）植物細胞
内で機能可能なプロモーター、（２）配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを
特徴とするNADPH オキシダーゼ遺伝子、及び（３）植物
細胞内で機能可能なターミネーターを機能可能な形で前
記の順序に結合させることにより構築することができ
る。ここで「機能可能な形で」とは、構築されたプラス
ミドを宿主細胞内に導入し形質転換させた場合に、該宿
主細胞内において導入されたNADPH オキシダーゼ遺伝子
が正常に転写・翻訳され、前記宿主細胞内で本発明タン
パク質を発現させる機能を有するように、プロモーター
の制御下に目的とする遺伝子を組み込んだ状態になるこ
とを意味するものである。植物細胞内で機能可能なプロ
モーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子
（NOS ）プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子（OC
S ）プロモーター等のT-DNA 由来の構成型プロモータ
ー、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）由来の19S
及び35S プロモーター等の植物ウィルス由来のプロモー
ター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL ）遺
伝子プロモーター、カルコンシンターゼ（CHS ）遺伝子
プロモーター、pathogen-related(PP)遺伝子プロモータ
ー等の誘導型プロモーター等をあげることができる。さ
らにこれらに限定されない公知の植物プロモーターもあ
げられる。また、植物細胞内で機能可能なターミネータ
ーとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子（NOS ）
ターミネーター等のT-DNA 由来の構成型ターミネータ
ー、ニンニクウィルスGV1,GV2 のターミネーター等の植
物ウィルス由来のターミネーター等をあげることができ
る。さらにこれらに限定されない公知の植物ターミネー
ターもあげられる。

【００１４】このようなプラスミド（本発明（発現）プ
ラスミド）を宿主細胞内に導入することにより該宿主細
胞を形質転換するには、例えば、宿主細胞が植物の場
合、本発明プラスミドをアグロバクテリウム感染方法
（特公平2-58917 及び特開昭60-70080）、プロトプラス
トへのエレクトロポーレーション方法（特開昭60-25188
7及び特開平5-68575 ）、又はパーティクルガン方法
（特表平5-508316及び特開昭63-258525 ）等の公知の手
段により植物細胞内に導入し、本発明遺伝子が導入され
た植物細胞を選抜することによって形質転換植物細胞を
得ることができる。得られた形質転換植物細胞から、例
えば、内宮著、植物遺伝子操作マニュアル（トランスジ
ェニック植物の作り方）1990年、講談社サイエンティフ
ィク（ISBN4-06- 153515-7 C3045）、27-55 頁等に記載
の通常の植物細胞培養方法により植物体を再生すること
によって形質転換された植物体を得る。

【００１５】さらに本発明は、（１）宿主細胞内で機能
可能なプロモーター、（２）NADPHオキシダーゼ遺伝
子、及び（３）宿主細胞内で機能可能なターミネーター
を機能可能な形で前記の順序に結合させてなることを特
徴とする発現プラスミドを宿主細胞内に導入し、該宿主
細胞を形質転換させることにより形質転換体の成長を制
御する方法を提供する。宿主細胞内で機能可能なプロモ
ーターとしては、例えば、大腸菌のラクトースオペロン
のlacZ遺伝子プロモーター、酵母のアルコール脱水素酵
素遺伝子（ADH）プロモーター、アデノバイラス・メジ
ャーレート（Ad.ML ）プロモーター、SV40の初期プロモ
ーター及びBaculo virus プロモーター等をあげること
ができる。宿主細胞が植物である場合には、前述の如き
の植物細胞内で機能可能なプロモーター等があげられ
る。また、宿主細胞内で機能可能なターミネーターとし
ては、例えば、酵母のHISterminator sequence 、ADH1
ターミネター、SV40のearly splicing resion 等をあげ
ることができる。宿主細胞が植物である場合には、前述
の如きの植物細胞内で機能可能なターミネーター等があ
げられる。NADPH オキシダーゼ遺伝子としては、例え
ば、植物由来のNADPH オキシダーゼ遺伝子であり、より
好ましくは本発明遺伝子をあげることができる。

【００１６】

【実施例】以下、実施例により詳細に説明するが、本発
明はこれに限定されるものではない。

【００１７】実施例１ （変異体コレクション−トラン
スポゾンタギングライン−の作製方法） トウモロコシ由来のトランスポゾンdAc-RS因子をＴーDN
A 上に有するアグロバクテリウム菌（Max-plank Instit
ut fur Zuchtungsforschung,5000 Koln 30,FRGに保管さ
れており、Jeff Schell 教授より分譲入手可能である）
をValvekens etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,85,5536-5540
(1988) 記載の方法に従ってシロイヌナズナの根部に感
染させ、形質転換植物体を得る。次世代（Ｆ１植物）の
うちハイグロマイシン耐性を示す個体（RS/dAc-RS/T-DN
A を有する）にトウモロコシのトランスポゼース（Ac転
移酵素）を発現している個体を交配し、その次世代種子
（Ｆ２種子）のうちカナマイシン耐性を示すものをトラ
ンスポゾンによる突然変異体のコレクションとした。よ
り詳細には以下の通りである。交配によって得られた７
２個体のＦ１植物を自殖して得たＦ２種子それぞれ数百
個ずつをカナマイシンを含む培地で発芽させ、dAc-RS因
子の切り出しが起きた個体を選抜した。その結果、７２
のＦ１系統のうち２４系統からカナマイシン耐性個体が
得られた。サザンブロット解析の結果、２４系統のうち
１５系統で再挿入がみられた。最終的にＦ２世代で１６
種類の独立に転移再挿入したしたdAc-RS因子を有する植
物体が得られた。Ｆ２個体の自殖によって得られたＦ３
種子についても同様に選抜を行い、８７種類の独立に転
移再挿入したdAc-RS因子を有する植物体が得られた。こ
のようにして、合計１０３種類の独立に転移再挿入した
dAC-RS因子を有する植物体（変異体コレクション）を作
製した〔Machida,Y., Onouchi,H., Torikai,S et al. :
Use of site-specific recombination systems for is
olation of mutants of Arabidopsis thaliana : The t
agging / deletionstrategy, in Modification of Gene
Expression and Non-mendelian Inheritance. (ed. by
Oono, K, and Takaiwa,F) published by NIAR and STA
(Tsukuba, Japan), pp, 199-222 (1995).参照〕。

【００１８】実施例２ （変異体コレクションからの生
育遅延変異株の単離方法） 実施例１で作製されたdAC-RS因子を有する植物体（変異
体コレクション−トランスポゾンタギングライン−）の
種子バンクを播種し、植物体を育成、受粉後、胚形成過
程を顕微鏡下で観察した。その中から、著しく胚形成に
異常のある変異個体を数種単離した。その中から特に、
シロイヌナズナの生活環のほとんどすべての過程の進行
が遅くなった突然変異株（slw-) を単離した。尚、シロ
イヌナズナには、late floweringという花形成が遅くな
った突然変異体が知られているが、この場合は、開花前
のステージのみが遅くなったものであり、上記突然変異
株（slw-) とは表現型が異なる。突然変異株（slw-) で
は、開花時期のみならず他の生活環のすべての生長スピ
ードが遅くなっていた。この突然変異株（slw-) は、Ｔ
ーDNA が、シロイヌナズナの第一染色体地図位置８０付
近に挿入された系統を出発材料として、A ｃエレメント
の転移を誘導して得られたものであった。Ａｃエレメン
トの転移距離測定法（細胞工学 :別冊、植物細胞工学シ
リーズ４、モデル植物の実験プロトコール、ｐ１５７ー
１６４、参照）によると突然変異株（slw-) の場合、オ
リジナルの位置から約850 kb転移していたことが明らか
となった。

【００１９】実施例３ （本発明タンパク質のcDNAクロ
ーニング用プローブの単離方法） 通常、トランスポゾンタギングラインでは、導入された
外来DNA(トランスポゾン）因子が、目的とする遺伝子を
破壊し、その結果、野性型と異なる表現型が観察され
る。そこで導入されたトランスポゾンの塩基配列部分を
利用してその隣接する目的遺伝子をクローン化した。詳
細は以下の通りである。得られた突然変異株（slw-) の
ゲノムDNA を前述の方法で調製し、制限酵素EcoRI で切
断後、ライゲイション反応を行い、環状DNA を調製し
た。次に、dAc-RSの内部にある、お互い逆向きの２つの
プライマNo1,No2(No1:5'-CCGTATTTATCCCGTTCGTT-3', No
2: 5'-AAGCTGCGCCGGGAGGTTGA-3')を用いてＰＣＲ反応を
行い、増幅した1.9 ｋｂのDNA 断片をBluescript pSK-
ベクターにクローニングした。塩基配列をJ.Sambrook,
E.F. Fritsch, T.Maniati s 著：「Molecular Cloning
Second Edition」、Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess(1989) 等に記載される通常の方法で決定し、最終的
に1.9kb のBamHI-EcoRI 断片をcDNAクローニングのため
のプローブとした。

【００２０】実施例４ （シロイヌナズナのcDNAライブ
ラリーの作製） 播種後２週間目のシロイヌナズナの幼苗１０g 新鮮重を
液体窒素１０ml中で凍結させた後、木鎚で組織をあらか
じめ砕き、ワーリングブレンダー（日本精機製）を用
い、液体窒素を少しずつ追加しながら、1,500 rpm, 25
分間破砕し、細かい粉末にした。液体窒素を気化させた
後、市販のRNA 抽出キット（Extra-A-PLANT,TM, RNA IS
OLATION KIT(Clontech))を用いてRNA 抽出を行い、この
抽出液からエタノール沈澱により全RNA を回収し、220
μg の全ＲＮＡを得た。得られた全ＲＮＡを市販のOlig
o dTカラムで分画し、4.8 μugのポリA RNA を得た。該
ポリA RNA １μg から市販のcDNA合成キット（アマーシ
ャム製）を用いてcDNA合成を行い、63μg のcDNAを得
た。該cDNAをEcoRI 消化ラムダ ZAPII(strategene 製）
にライゲイションした後、さらに市販のin vitro packa
ging kit(RI 消化ラムダZAPII(strategene 製）を用い
てcDNAライブラリーを作製した。

【００２１】実施例５ （本発明タンパク質のcDNAクロ
ーンのスクリーニング） 実施例２で作製されたプローブを市販の放射性標識キッ
ト（MEGALABEL, TAKARA)を用いて放射性標識し、本発明
タンパク質のcDNAクローニング用プローブDNAを調製し
た。宿主あるEscherichia coli XL-1 BlueにファージcD
NAライブラリー約 5.0 x 10 ⁴ p.f.u.を加え、37℃, 15
分間インキュベートした後、NZY プレート（1%NZアミ
ン、0.5% Yeast Extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar) にプ
レートして、37℃, 7 時間インキュベートした。市販の
ナイロンフィルター、Hybond-N( アマ- シャム製）にプ
ラークを移した。フィルターを風乾後、アルカリ変性液
(0.5M NaOH, 1.5M NaCl) 2 分間、中和液(0.5M Tris-H
Cl, pH8.0, 1.5M NaCl) 2分、３ｘSCC(0.45M NaCl,
0.105 M クエン酸ナトリウム）２分間の順でフィルター
を変性させ、風乾した後、UV光を照射してフィルターの
DNA を固定した。次に、プレハブリダイゼイションバッ
ファー〔6xSSC(0.9M NaCl, 0.21Mクエン酸ナトリウ
ム）、５ｘDenhardt's溶液(0.1% フィコール400, 0.1%
ポリビニルピロリドン、0.1% BSA), 0.1% SDS, 100μg/
ml salmon sperm DNA 〕中で、45℃, 2 時間プレハイブ
リダイゼーションを行った。さらに、前記方法で得られ
たRI標識したプローブDNA を約10⁷ cpm 加え、45℃、一
晩インキュベートした。さらに、6xSSC, 6xSSC-10 % SD
S で洗浄後、陽性プラークをピックアップした。得られ
た陽性プラークをさらにNZプレートにまき、プラークを
形成させ、上記と同様の方法でプラークハイブリダイゼ
ーションを行い、本発明タンパク質のｃＤＮＡクローン
を単離した。

【００２２】実施例６ （本発明タンパク質をコードす
る塩基配列とアミノ酸配列の決定） 実施例５で得られた本発明タンパク質のcDNAクローン
は、J.Sambrook, E.F. Fritsch, T.Maniati s 著：「Mo
lecular Cloning Second Edition」、Cold Spring Harb
or Laboratory Press(1989) に記載されている通常の方
法により、プラスミドベクターpBluescript SK(-) にサ
ブクローニングし、プラスミドcDNAクローンを得た。そ
して該cDNAクローンのインサートの塩基配列をTaq Dye
Primer Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems製）
を用いて、Applied Biosystems製の３７３Ａ DNA Seque
ncer により決定した。その塩基配列（配列番号２参
照）から該タンパク質の全アミノ酸配列を決定した（配
列番号１参照）。本発明タンパク質は943 個のアミノ酸
からなり、分子量は108,207 と計算された。

【００２３】実施例７ （本発明タンパク質の相同性） 実施例６で決定された本発明タンパク質が有するアミノ
酸配列（配列番号１参照）と相同性の高いアミノ酸配列
を、データーベースＥＭＢＬおよびＮＢＲＦで検索した
結果、本発明タンパク質は、数種のNADPH オキシダーゼ
と相同性を示した。特に、本発明タンパク質のカルボキ
シル末端側はヒトgp91-phox,マウスgp91-phox と高い相
同性を有する領域を含んでいた。

【００２４】実施例８ （根の生長速度の比較） シロイヌナズナにおける生長速度の指標として、主根の
伸長速度について調査した。寒天培地上に、シロイヌナ
ズナの種子を播種して発芽させた。対照区として野性株
を、また本発明区として単離した突然変異株（slw-) を
用いた。各々、3 個体の植物体を準備して、それらの主
根の伸長を経時的に測定した( 表１参照）。この結果、
本発明区である突然変異株（slw-) における主根の伸長
速度は、対照区である野性株における主根の伸長速度と
比較して約１／２倍程度になり、本発明遺伝子は明らか
に形質転換体の生育を制御していた。

【００２５】

【表１】 ────────────────────────────────── 発芽後の日数 主根の長さ（ｍｍ） 相対比 対照区 本発明区 （本発明区／対照区） ────────────────────────────────── ３ ８０００ ４７００ ０．５９ ４ １４７００ ７６００ ０．５２ ５ ２１０００ １０２００ ０．４９ ６ ２７０００ １３５００ ０．５０ ７ ３３９００ １６６００ ０．４９ ８ ４０５００ １９７００ ０．４９ ──────────────────────────────────

【００２６】

【発明の効果】本発明により、植物の生育を人為的に制
御する新しいタイプの技術を提供可能にする。

【００２７】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：９４３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 1 5 10 15 Met Lys Pro Phe Ser Lys Asn Asp Arg Arg Arg Trp Ser Phe Asp Ser 20 25 30 Val Ser Ala Gly Lys Thr Ala Val Gly Ser Ala Ser Thr Ser Pro Gly 35 40 45 Thr Glu Tyr Ser Ile Asn Gly Asp Gln Glu Phe Val Glu Val Thr Ile 50 55 60 Asp Leu Gln Asp Asp Asp Thr Ile Val Leu Arg Ser Val Glu Pro Ala 65 70 75 80 Thr Ala Ile Asn Val Ile Gly Asp Ile Ser Asp Asp Asn Thr Gly Ile 85 90 95 Met Thr Pro Val Ser Ile Ser Arg Ser Pro Thr Met Lys Arg Thr Ser 100 105 110 Ser Asn Arg Phe Arg Gln Phe Ser Gln Glu Leu Lys Ala Glu Ala Val 115 120 125 Ala Lys Ala Thr Gln Leu Ser Gln Glu Leu Lys Arg Phe Ser Trp Ser 130 135 140 Arg Ser Phe Ser Gly Asn Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Ala Asn Gln 145 150 155 160 Ser Gly Gly Ala Gly Gly Gly Leu Val Asn Ser Ala Leu Glu Ala Arg 165 170 175 Xaa Cys Glu Ser Xaa Ala Gln Leu Asp Arg Thr Arg Ser Ser Ala Gln 180 185 190 Arg Ala Leu Arg Gly Leu Arg Phe Ile Ser Asn Lys Gln Lys Asn Val 195 200 205 Asp Gly Trp Asn Asp Val Gln Ser Asn Phe Glu Lys Phe Glu Lys Asn 210 215 220 Gly Tyr Ile Tyr Arg Ser Asp Phe Ala Gln Cys Ile Gly Met Lys Asp 225 230 235 240 Ser Lys Glu Phe Ala Leu Glu Leu Phe Asp Ala Leu Ser Arg Arg Arg 245 250 255 Arg Leu Lys Val Glu Lys Ile Asn His Asp Glu Leu Tyr Glu Tyr Trp 260 265 270 Ser Gln Ile Asn Asp Glu Ser Phe Asp Ser Arg Leu Gln Ile Phe Phe 275 280 285 Asp Ile Val Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Ile Thr Glu Glu Glu Val 290 295 300 Lys Glu Ile Ile Met Leu Ser Ala Ser Ala Asn Lys Leu Ser Arg Leu 305 310 315 320 Lys Glu Gln Ala Glu Glu Tyr Ala Ala Leu Ile Met Glu Glu Leu Asp 325 330 335 Pro Glu Arg Leu Gly Tyr Ile Glu Leu Trp Gln Leu Glu Thr Leu Leu 340 345 350 Leu Gln Lys Asp Thr Tyr Leu Asn Tyr Ser Gln Ala Leu Ser Tyr Thr 355 360 365 Ser Gln Ala Leu Ser Gln Asn Leu Gln Gly Leu Arg Gly Lys Ser Arg 370 375 380 Ile His Arg Met Ser Ser Asp Phe Val Tyr Ile Met Gln Glu Asn Trp 385 390 395 400 Lys Arg Ile Trp Val Leu Ser Leu Trp Ile Met Ile Met Ile Gly Leu 405 410 415 Phe Leu Trp Lys Phe Phe Gln Tyr Lys Gln Lys Asp Ala Phe His Val 420 425 430 Met Gly Tyr Cys Leu Leu Thr Ala Lys Gly Ala Ala Glu Thr Leu Lys 435 440 445 Phe Asn Met Ala Leu Arg Leu Phe Pro Val Cys Arg Asn Thr Ile Thr 450 455 460 Trp Leu Arg Ser Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Val Pro Phe Asp Asp Asn 465 470 475 480 Ile Asn Phe His Lys Thr Ile Ala Gly Ala Ile Val Val Ala Val Ile 485 490 495 Leu His Ile Gly Asp His Leu Ala Cys Asp Phe Pro Arg Ile Val Arg 500 505 510 Ala Thr Glu Tyr Asp Tyr Asn Arg Tyr Leu Phe His Tyr Phe Gln Thr 515 520 525 Lys Gln Pro Thr Tyr Phe Asp Leu Val Lys Gly Pro Glu Gly Ile Thr 530 535 540 Gly Ile Leu Met Val Ile Leu Met Ile Ile Ser Phe Thr Leu Ala Thr 545 550 555 560 Arg Trp Phe Arg Arg Asn Leu Val Lys Leu Pro Lys Pro Phe Asp Arg 565 570 575 Leu Thr Gly Phe Asn Ala Phe Trp Tyr Ser His His Leu Phe Val Ile 580 585 590 Val Tyr Ile Leu Leu Ile Leu His Gly Ile Phe Leu Tyr Phe Ala Lys 595 600 605 Pro Trp Tyr Val Arg Thr Thr Trp Met Tyr Leu Ala Val Pro Val Leu 610 615 620 Leu Tyr Gly Gly Glu Arg Thr Leu Arg Tyr Phe Arg Ser Gly Ser Tyr 625 630 635 640 Ser Val Arg Leu Leu Lys Val Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Val Leu Thr 645 650 655 Leu Gln Met Ser Lys Pro Thr Gln Phe Arg Tyr Lys Ser Gly Gln Tyr 660 665 670 Met Phe Val Gln Cys Pro Ala Val Ser Pro Phe Glu Trp His Pro Phe 675 680 685 Ser Ile Thr Ser Ala Pro Glu Asp Asp Tyr Ile Ser Ile His Ile Arg 690 695 700 Gln Leu Gly Asp Trp Thr Gln Glu Leu Lys Arg Val Phe Ser Glu Val 705 710 715 720 Cys Glu Pro Pro Val Gly Gly Lys Ser Gly Leu Leu Arg Ala Asp Glu 725 730 735 Thr Thr Lys Lys Ser Leu Pro Lys Leu Leu Ile Asp Gly Pro Tyr Gly 740 745 750 Ala Pro Ala Gln Asp Tyr Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu Leu Val Gly 755 760 765 Leu Gly Ile Gly Ala Thr Pro Phe Ile Ser Ile Leu Lys Asp Leu Leu 770 775 780 Asn Asn Ile Val Lys Met Glu Glu His Ala Asp Ser Ile Ser Asp Phe 785 790 795 800 Ser Arg Ser Ser Glu Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Gly Asp Thr Pro Arg 805 810 815 Arg Lys Arg Ile Leu Lys Thr Thr Asn Ala Tyr Phe Tyr Trp Val Thr 820 825 830 Arg Glu Gln Gly Ser Phe Asp Trp Phe Lys Gly Val Met Asn Glu Val 835 840 845 Ala Glu Leu Asp Gln Arg Gly Val Ile Glu Met His Asn Tyr Leu Thr 850 855 860 Ser Val Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Arg Ser Ala Leu Ile Thr Met Val 865 870 875 880 Gln Ala Leu Asn His Ala Lys Asn Gly Val Asp Ile Val Ser Gly Thr 885 890 895 Arg Val Arg Thr His Phe Ala Arg Pro Asn Trp Lys Lys Val Leu Thr 900 905 910 Lys Leu Ser Ser Lys His Cys Asn Ala Arg Thr Gly Val Phe Tyr Cys 915 920 925 Gly Val Pro Val Leu Gly Lys Glu Leu Ser Lys Leu Cys Asn Thr Phe 930 935 940 Asn Gln Lys Gly Ser Thr Lys Phe Glu Phe His Lys Glu His Phe

【００２８】配列番号：２ 配列の長さ：3077 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表わす記号：ＣＤＳ 存在位置：1..2832 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG AAA CCG TTC TCA AAG AAC GAT CGG CGA CGG TGG TCA TTT GAT TCA 48 GTT TCC GCC GGA AAA ACC GCC GTC GGA AGT GCA TCA ACT TCA CCG GGA 96 ACT GAA TAC TCC ATT AAC GGT GAT CAA GAG TTC GTT GAA GTC ACA ATC 144 GAT CTT CAA GAC GAT GAC ACA ATC GTT CTT CGT AGC GTC GAG CCA GCA 192 ACC GCC ATT AAT GTC ATC GGA GAT ATC TCC GAC GAC AAC ACC GGA ATA 240 ATG ACT CCG GTT TCG ATT TCG AGA TCT CCG ACG ATG AAA CGA ACT TCA 288 TCT AAT CGG TTC CGA CAA TTC TCA CAA GAG CTT AAA GCC GAA GCT GTG 336 GCG AAA GCG ACA CAG TTA TCT CAG GAG TTG AAA CGA TTC TCA TGG TCT 384 CGT TCT TTC TCA GGT AAC TTA ACC ACT ACT AGT ACC GCC GCT AAT CAA 432 AGC GGC GGT GCT GGT GGT GGT TTG GTG AAC TCG GCT TTA GAA GCG CGA 480 NAN TGC GAA AGC ANT GCT CAG TTA GAT CGG ACT CGG TCT AGT GCT CAA 528 AGA GCT CTT CGT GGT TTG AGA TTC ATT AGC AAT AAG CAA AAG AAC GTT 576 GAT GGT TGG AAC GAT GTT CAA TCA AAT TTC GAA AAA TTC GAA AAA AAT 624 GGT TAC ATC TAT CGC TCC GAT TTC GCT CAA TGC ATA GGA ATG AAA GAT 672 TCG AAA GAA TTT GCA TTG GAA CTG TTC GAT GCA TTG AGT AGA AGA AGA 720 AGA TTA AAA GTA GAG AAA ATC AAT CAC GAT GAG CTT TAT GAG TAT TGG 768 TCA CAA ATC AAC GAC GAG AGT TTT GAT TCT CGT CTC CAG ATC TTC TTC 816 GAC ATA GTG GAC AAG AAT GAA GAT GGG AGA ATT ACA GAA GAG GAA GTA 864 AAA GAG ATA ATA ATG TTG AGT GCA TCT GCA AAT AAG CTA TCA AGA TTA 912 AAG GAA CAA GCA GAG GAA TAT GCA GCT TTG ATT ATG GAA GAG TTA GAT 960 CCT GAA AGA CTT GGC TAC ATA GAG CTA TGG CAA CTA GAG ACT TTG CTT 1008 CTA CAA AAA GAC ACA TAC CTC AAT TAC AGT CAA GCA TTG AGC TAT ACG 1056 AGC CAA GCA TTG AGC CAA AAC CTT CAA GGG TTA AGG GGA AAG AGT CGA 1104 ATA CAT AGA ATG AGT TCG GAT TTC GTC TAC ATT ATG CAA GAG AAT TGG 1152 AAA AGG ATA TGG GTT TTA TCC TTA TGG ATC ATG ATC ATG ATC GGA TTA 1200 TTC TTG TGG AAA TTC TTC CAA TAC AAG CAA AAA GAT GCA TTT CAT GTG 1248 ATG GGA TAT TGT TTA CTC ACA GCC AAA GGA GCA GCT GAA ACA CTT AAA 1296 TTC AAC ATG GCT CTA AGG CTT TTC CCA GTT TGC AGA AAC ACC ATT ACT 1344 TGG CTT AGA TCC ACA AGA CTC TCT TAC TTC GTT CCT TTT GAT GAT AAT 1392 ATC AAC TTC CAC AAG ACA ATT GCT GGA GCC ATT GTA GTA GCT GTG ATC 1440 CTT CAT ATT GGA GAC CAT CTT GCT TGT GAT TTC CCT AGA ATT GTT AGA 1488 GCC ACC GAA TAC GAT TAC AAT CGG TAT CTG TTT CAT TAC TTT CAA ACA 1536 AAA CAG CCA ACA TAC TTC GAC CTC GTT AAG GGA CCT GAA GGA ATC ACT 1584 GGG ATT TTA ATG GTC ATT TTG ATG ATT ATT TCA TTC ACA TTA GCA ACA 1632 AGA TGG TTT AGG CGT AAC CTA GTC AAG CTT CCT AAG CCA TTT GAT CGA 1680 CTA ACC GGT TTT AAC GCC TTT TGG TAT TCG CAT CAT TTG TTC GTC ATT 1728 GTT TAT ATC TTG CTT ATT CTT CAT GGT ATC TTC CTC TAT TTC GCC AAG 1776 CCT TGG TAT GTT CGT ACG ACA TGG ATG TAT CTT GCA GTA CCA GTT TTA 1824 CTC TAT GGT GGA GAA AGA ACA CTT AGG TAC TTC CGT TCT GGT TCT TAT 1872 TCG GTT CGA CTG CTT AAG GTT GCT ATA TAT CCT GGT AAT GTT CTA ACG 1920 CTA CAA ATG TCG AAA CCA ACT CAA TTT CGT TAC AAA AGC GGA CAA TAC 1968 ATG TTT GTC CAA TGT CCT GCG GTT TCG CCA TTC GAG TGG CAT CCA TTC 2016 TCA ATT ACT TCC GCA CCT GAA GAT GAT TAT ATC AGC ATT CAC ATT AGA 2064 CAA CTT GGT GAT TGG ACT CAA GAA CTC AAA AGA GTA TTC TCT GAA GTT 2112 TGT GAG CCA CCG GTT GGC GGT AAA AGC GGA CTT CTC AGA GCC GAC GAA 2160 ACA ACA AAG AAA AGT TTG CCA AAG CTA TTG ATA GAT GGA CCG TAC GGT 2208 GCA CCA GCA CAA GAT TAT AGG AAA TAT GAT GTT CTC TTA TTA GTT GGT 2256 CTT GGC ATT GGT GCA ACT CCA TTT ATC AGT ATC TTG AAA GAT TTG CTT 2304 AAC AAC ATT GTT AAA ATG GAA GAG CAT GCG GAT TCG ATC TCG GAT TTC 2352 AGT AGA TCA TCA GAA TAC AGC ACA GGA AGC AAC GGT GAC ACG CCA AGA 2400 CGA AAG AGA ATA CTA AAA ACC ACA AAT GCT TAT TTC TAC TGG GTC ACA 2448 AGA GAA CAA GGC TCT TTT GAT TGG TTC AAA GGT GTC ATG AAC GAA GTT 2496 GCA GAA CTT GAC CAA CGG GGT GTG ATA GAG ATG CAT AAC TAT TTA ACA 2544 AGT GTG TAT GAA GAA GGT GAT GCT CGT TCT GCT CTC ATT ACA ATG GTT 2592 CAA GCT CTT AAT CAT GCC AAA AAT GGT GTC GAC ATT GTC TCT GGC ACT 2640 AGG GTC AGA ACA CAC TTT GCA AGA CCT AAT TGG AAG AAG GTT CTC ACA 2688 AAG CTA AGT TCC AAG CAT TGC AAT GCA AGA ACA GGA GTG TTT TAT TGC 2736 GGA GTA CCG GTT TTA GGG AAG GAG CTT AGC AAA CTA TGC AAC ACA TTC 2784 AAT CAA AAA GGT TCA ACC AAG TTT GAA TTT CAC AAG GAG CAT TTC TAA 2832 AAGACAAGAA GGAAGAAGCC AAAAGCCCTC TAGATTCTTT AATATCTCAA ATTTAGCCAC 2892 TTATAGTATA AAGGCAATCT CTTCACTATT TAATTCAAAG TGATTAAACG TTAACACACT 2952 GTCAAAAGTG AGTGTGTTAA CGTTTAGCTC CACACGTTCT AGGTTTATAT ACACCGAGGC 3012 ATACGTGTAA ATATACGAGA CAGAAGAAAT TCAAGGGGGT TTGATAGAAG CGTCGACGCG 3072 GCCGC 3077

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１で示されるアミノ酸配列を有す
   ることを特徴とするNADPH オキシダーゼ。
2. 【請求項２】配列番号１で示されるアミノ酸配列をコー
   ドする塩基配列を有することを特徴とするNADPH オキシ
   ダーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】配列番号２で示される塩基配列（ＣＤＳの
   存在位置１．．２８３２）を有することを特徴とする請
   求項２記載のNADPH オキシダーゼ遺伝子。
4. 【請求項４】請求項２記載のNADPH オキシダーゼ遺伝子
   を含有することを特徴とするプラスミド。
5. 【請求項５】請求項４記載のプラスミドを宿主細胞内に
   導入することにより形質転換させた形質転換体。
6. 【請求項６】宿主細胞が微生物であることを特徴とする
   請求項５記載の形質転換体。
7. 【請求項７】宿主細胞が植物であることを特徴とする請
   求項５記載の形質転換体。
8. 【請求項８】（１）植物細胞内で機能可能なプロモータ
   ー、（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコード
   する塩基配列を有することを特徴とするNADPH オキシダ
   ーゼ遺伝子、及び（３）植物細胞内で機能可能なターミ
   ネーターを機能可能な形で前記の順序に結合させること
   を特徴とする発現プラスミドの構築方法。
9. 【請求項９】（１）植物細胞内で機能可能なプロモータ
   ー、（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコード
   する塩基配列を有することを特徴とするNADPH オキシダ
   ーゼ遺伝子、及び（３）植物細胞内で機能可能なターミ
   ネーターを機能可能な形で前記の順序に結合させてなる
   ことを特徴とする発現プラスミド。
10. 【請求項１０】（１）宿主細胞内で機能可能なプロモー
    ター、（２）NADPH オキシダーゼ遺伝子、及び（３）宿
    主細胞内で機能可能なターミネーターを機能可能な形で
    前記の順序に結合させてなることを特徴とする発現プラ
    スミドを宿主細胞内に導入し、該宿主細胞を形質転換さ
    せることにより形質転換体の成長を制御する方法。
11. 【請求項１１】NADPH オキシダーゼ遺伝子が植物由来で
    あり、かつ宿主細胞が植物であることを特徴とする請求
    項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】発現プラスミドが請求項９記載の発現プ
    ラスミドであることを特徴とする請求項１０記載の方
    法。