JPH1033177A - フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡ組換え技術によるフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼの製造。 【解決手段】 酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化し
てα−ケトアルデヒド、アミン誘導体及び過酸化水素を
生成する反応を触媒する酵素活性を有し；ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより測定したとき、分子量約４８,０００ダルト
ンの同一サブユニット２個より成り；そのＮ末端に配列
表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を、また、中間
に配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し；かつＡsp
ergillus由来の他のタンパク質を実質上含有しない酵素
又はそのフラグメント。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ組換え技術
によるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、ＦＡ
ＯＤ−Ｌと称する）の製造に関し、より詳しくは、アス
ペルギルス属（Ａspergillus)由来のＦＡＯＤ−Ｌをコ
ードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該
発現ベクターにより形質転換された微生物、該形質転換
体を培養することによる組換えＦＡＯＤ−Ｌの製造、そ
のようにして得られる組換えＦＡＯＤ−Ｌ、該組換えＦ
ＡＯＤ−Ｌを用いるアマドリ化合物の分析法及び該分析
法に有用な試薬に関する。

【０００２】

【従来技術】アマドリ化合物は、タンパク質、ペプチド
及びアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、アルド
ースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基とア
ルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ
転移することにより生成される物質であり、醤油等の食
品、及び血液等の体液に含有されている。その生成速度
は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数であ
ることから、生成量を測定することにより、それら反応
性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることが
できる。例えば、生体内では、グルコースとアミノ酸が
結合したアマドリ化合物であるフルクトシルアミン誘導
体が生成しており、血液中のヘモグロビンが糖化された
フルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビン、アル
ブミンが糖化された誘導体はグリコアルブミン、血液中
のタンパクが糖化された誘導体はフルクトサミンと呼ば
れる。これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖
値を反映しており、その測定値は、糖尿病の症状の重要
な指標となり得るために、測定手段の確立は臨床上、極
めて有用である。また、食品中のアマドリ化合物を定量
することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を
知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。この
ように、アマドリ化合物の定量分析は医学及び食品を含
む広範な分野で有用である。

【０００３】従来、アマドリ化合物を含有する試料に酸
化還元酵素を作用させ、酸素の消費量又は過酸化水素の
発生量を測定することにより、定量する分析法が提案さ
れている（例えば、特公平５−３３９９７号公報、特開
昭６１ー２６８１７８号公報、特開平２−１９５９００
号公報、特開平３−１５５７８０号公報）。さらに、糖
尿病の診断のための糖化タンパクの定量法も開示されて
いる（特開平２−１９５８９９号公報、特開平２−１９
５９００号公報）。

【０００４】アマドリ化合物の酸化還元酵素による分解
反応は下記の一般式で表すことができる。 Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ² ＋ Ｏ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ→ Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ²−ＮＨ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ₂ （式中、Ｒ¹はアルドース残基、Ｒ²はアミノ酸、タンパ
ク質又はペプチド残基を表す） 本出願人は、上記の目的に適う酵素として、フサリウム
属（Fusa rium）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダー
ゼ（ＦＡＯＤ−Ｌ及びＦＡＯＤ−Ｓ）を精製し、その有
用性を明らかにした（特開平８−１５４６７２、特開平
７−２８９２５３）。また、アスペルギルス属（Ａsper
gillus）がフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯ
Ｄ−Ｌ）を生産することも明らかにした。

【０００５】

【発明が解決すべき課題】しかしながら、微生物を培養
し、培地から該酵素を抽出して製造する方法は、多くの
労力と時間を必要とし、非効率的である。また、精製法
で得られる酵素には、フサリウム属またはアスペルギル
ス属の菌株固有のタンパク質等の不純物が付随する確立
が高く、そのような不純物には、ＦＡＯＤ−Ｌ活性に悪
影響を及ぼす物質が混在する可能性があり、測定の信頼
性が十分に確保できない恐れがあった。従って、フサリ
ウム属またはアスペルギルス属の菌に由来する不純物を
伴わないＦＡＯＤ−Ｌを効率よく製造する方法の開発が
求められていた。そのためには、フサリウム属又はアス
ペルギルス属由来のＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡを
クローニングし、該ＤＮＡを含有する適当な発現ベクタ
ーを構築し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、
該形質転換体を適当な培地で培養することにより、解決
することができる。しかしながら、フサリウム属または
アスペルギルス属由来のＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮ
Ａがクローニングされた例はなく、まず、そのようなＤ
ＮＡのクローニングが必要であった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、アスペルギル
ス・テレウスＧＰ１（Ａsper gillus terreus ＧＰ１；
ＦＥＲＭ Ｐ−１５６６４）が産生するＦＡＯＤ−Ｌを
コードするＤＮＡをクローニングし、該ＤＮＡを含有す
る発現ベクターを構築し、該発現ベクターで宿主細胞を
形質転換し、得られた形質転換体を培養することによ
り、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有する組
換えＦＡＯＤ−Ｌを製造することに成功した。

【０００７】即ち、本発明は、以下の特性： （１）酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化して、α−
ケトアルデヒド、アミン誘導体及び過酸化水素を生成す
る反応を触媒する酵素活性を有し； （２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したとき、分子量約
４８,０００ダルトンの同一サブユニット２個より成
り； （３）そのＮ末端に配列表の配列番号２で示されるアミ
ノ酸配列を、また、中間に配列番号３で示されるアミノ
酸配列を有し；かつ （４）アスペルギルス属（Ａspergill us)由来の菌由来
の他のタンパク質を実質上含有しない；を有するフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ−Ｌ）又はその
酵素活性を有するフラグメントを提供するものである。

【０００８】本発明のＦＡＯＤ−Ｌ又はそのフラグメン
トは、配列番号１記載のアミノ酸配列又はその部分配列
を含有することが好ましい。本発明はまた、上記ＦＡＯ
Ｄ−ＬをコードするＤＮＡを提供するものである。該Ｄ
ＮＡは、相補ＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。本
発明のＤＮＡは、１つの実施態様として、配列番号１記
載の塩基配列又はその部分配列で示すことができる。さ
らに、本発明は該ＤＮＡを含有する発現ベクターを提供
するものである。本発明はまた、該発現ベクターによっ
て形質転換された宿主細胞を提供するものである。さら
に、本発明は、このようにして得られた形質転換体を培
地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼを回収することを特徴とするＦＡＯＤ−Ｌの製造法
を提供するものである。さらに、本発明は、アマドリ化
合物を含有する試料と、上記培養で得られた培養物又は
その処理物を接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の
発生量を測定することを特徴とする、試料中のアマドリ
化合物の分析法を提供するものである。また、本発明は
上記培養で得られた培養物又はその処理物を含有するア
マドリ化合物の分析試薬又はキットを提供するものであ
る。

【０００９】本明細書中、培養物の「処理物」とは培養物
から得られる物質であって、上記式(Ｉ)で示される反応
を触媒する酵素活性を高め、及び／又は酵素活性の利用
をより容易にするために、当該技術分野で通常の方法に
より処理された物質を指す。ＦＡＯＤ−Ｌ活性が形質転
換体細胞内に止まっている場合、処理物の例として以下
のものを挙げることができる。 （１）生の細胞：ろ過又は遠心等の通常の方法で培養物
から分離された細胞。 （２）乾燥細胞：(１)の生細胞を凍結乾燥又は真空乾燥
したもの。 （３）細胞抽出物：(１)又は(２)の細胞を通常の方法
（例えば有機溶媒中での自己溶菌、アルミナや海砂と混
合しての摩砕、又は超音波処理）して得られる。 （４）酵素溶液：細胞抽出物を常法通り精製するか部分
精製することにより得られる。 （５）精製酵素：（４）に記載の酵素溶液をさらに精製
し、不純物を含まないもの。 （６）酵素活性を有するフラグメント；精製酵素等を適
当な方法で断片化処理することにより得られるペプチド
フラグメント。 （７）固定化細胞又は酵素：細胞又は酵素を通常の方法
で固定化（例えばポリアクリルアミド、ガラスビーズ、
イオン交換樹脂等に固定化)したもの。培地に分泌され
る場合は、培養物そのもの及びそれから精製される酵素
（溶液、凍結乾燥品、断片化したフラグメント等）及び
固定化酵素が培養物又は処理物の例として挙げられる。
また、「酵素活性を有するフラグメント」は、（６）に
記載のごとく、ＦＡＯＤ−Ｌ活性を有し、本発明の目的
に有用なペプチドフラグメントを指す。そのようなフラ
グメントは、例えば、上記（５）の精製酵素を、適当な
方法で断片化処理することにより得ることができ、培養
物の処理物の１つである。なお、本明細書で、単にＦＡ
ＯＤ−Ｌというときにも、上記の培養物の処理物の１つ
を表す場合がある。

【００１０】

【発明の実施の形態】ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡ
のクローニングは、当該技術分野で既知の方法に従って
行うことができる。まず、Ａ.ter reus ＧＰ１の培養物
からＦＡＯＤ−Ｌを精製し、それよりＮ末端アミノ酸を
決定した。次いでＦＡＯＤ−Ｌを限定分解することによ
り得られたペプチド断片より、中間部分のアミノ酸配列
を決定し、該アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチ
ドプライマーを設計した。決定されたＮ−末端アミノ酸
配列を配列表の配列番号２に、中間部分のアミノ酸配列
を配列番号３に示す。また、オリゴヌクレオチドプライ
マー１及び２のヌクレオチド配列を配列番号４及び５に
示す。更に、これら配列番号２及び３のペプチド断片
と、プライマー１及び２との関係を図１に示す。

【００１１】一方、褐変化培地で培養してＦＡＯＤ−Ｌ
を誘導したＡ.terreus ＧＰ１株の菌体のtotalＲＮＡか
らｍＲＮＡ Ｐurification Ｋit（ファルマシア社）を
用いて、ｍＲＮＡを得、該ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮ
Ａを得、λＺＡＰIIベクターを用いてｃＤＮＡライブラ
リーを構築した。又、total ＲＮＡと上記プライマーを
用いてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼチェーン反
応）を行い、約４００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。このＰ
ＣＲ産物をサブクローニングし、該断片をプローブとし
て用いて上記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
たところ、７つのポジティブプラークが得られた。これ
らが含有するｃＤＮＡ断片をプラスミドｐＢluescriptI
IＳＫ^-にサブクローニングし、発現ベクターを構築し
た。次に該発現ベクターを用いて大腸菌宿主（Escheric
hi a coli ＪＭ１０９；Ｅ.coli ＪＭ１０９ Ｃompetent
Ｃells，宝酒造株式会社）を形質転換し、得られた形
質転換体を培養し、その培養物の内、ＦＡＯＤ−ＬのＮ
−末端アミノ酸配列に相当する塩基配列を持つプラスミ
ドｐＦＡＬ２を有するクローンE.coli ＪＭ１０９／ｐ
ＦＡＬ２を得た。さらに、プラスミドｐＦＡＬ２を導入
した他の大腸菌、E.coli ＳＯＬＲ／ｐＦＡＬ２も得
た。Ｅ. coliＳＯＬＲはSTRATAGENE社RETRIEVAL OF TOX
IC CLONESの中に含まれていたものを使用した。次い
で、得られたクローンの塩基配列を決定し、ＦＡＯＤ−
Ｌのアミノ酸配列を推定した。これらを配列番号１に示
す。既述のごとく、本発明の目的には、配列番号１に示
した全アミノ酸配列を有するＦＡＯＤ−Ｌのみならず、
所望の酵素活性を有するそのフラグメントも同様に有用
であり、そのようなフラグメントの配列も配列番号１に
示されている。

【００１２】本発明の、大腸菌宿主内で複製可能なＦＡ
ＯＤ−Ｌ発現ベクターｐＦＡＬ２は、lacプロモーター
とＳＤ配列、並びにアンピシリン耐性を付与するＤＮＡ
配列を含有しているが、このプラスミドｐＦＡＬ２に含
有されているＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡを、他の
適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入するこ
とにより、様々な宿主内でＦＡＯＤ−Ｌを発現するＦＡ
ＯＤ−Ｌ発現ベクターを構築することができる。なお、
上記の発現ベクター及び宿主細胞は、本発明のＦＡＯＤ
−ＬをコードするＤＮＡの発現に適した多くのベクター
及び宿主細胞の１例にすぎず、当業者ならば、当該技術
分野で通常の方法により、任意の宿主細胞内で機能的な
ＦＡＯＤ−Ｌ発現ベクターを構築することができる。そ
のようなベクターに用い得るプロモーターは既知のもの
から適宜選択するか、あるいは新たに調製したもののい
ずれでもよい。このように、本発明の発現ベクターは本
明細書記載の例示のプラスミドに限定されず、これらを
通常の技術を用いて修飾(例えば、プロモーターを交換
する)することによって、異なる種類の微生物、また他
の細胞内で機能的であり、及び／又はＦＡＯＤ−Ｌを高
レベルに産生させることができる発現ベクターを構築す
ることができる。

【００１３】本発明のＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡ
を担持する発現ベクターで形質転換するために用いられ
る宿主細胞は、大腸菌等の原核性細胞、酵母等の真核性
細胞のいずれでもよく、さらには一般的に利用されてい
る高等生物の細胞も適する。宿主細胞としては、微生物
［原核生物（細菌、例えば大腸菌や枯草菌等）、真核生
物（例えば酵母）］、動物細胞又は培養植物細胞が挙げ
られる。微生物の好ましい例は、原核生物、とくにEsch
erichia属に属する菌株(例えば、Ｅ.coli等）、酵母、
特にＳ accharomyces属に属する株（例えば、Ｓ.cerevis
iae)やＣandida属に属する株（例えば、Ｃ.boidinii）
である。好ましい動物細胞株は例えば、マウスＬ９２９
細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などで
ある。

【００１４】宿主細胞として細菌、特に大腸菌を使用す
るのに適した、発現ベクターは既知であり、例えば、ｌ
ａｃプロモーターやｔａｃプロモーター等の慣用のプロ
モーターを有するものを挙げることができる。酵母での
ＦＡＯＤ−Ｌの発現のための発現ベクターとしては、Ｇ
ＡＬプロモーターやＡＯＤプロモーター等のプロモータ
ーを含有するものが好ましい。又、哺乳動物細胞でのＦ
ＡＯＤ−Ｌ発現のための発現ベクターとしては、ＳＶ４
０プロモーター等のプロモーターを有するものが挙げら
れる。しかしながら、操作及び入手の容易さを考慮し
て、宿主細胞としては原核性宿主が好ましく、特に大腸
菌が好ましい。原核性宿主−ベクター系については、多
くの成書（例えばＭolecular Ｃloning：Ａ ＬＡＢＯＬ
ＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌa
boratory Ｐress）があり、当該技術分野で既知である
が、以下に簡単に説明する。

【００１５】例えば、ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡ
を大腸菌に発現させるには、該ＤＮＡを大腸菌の形質転
換に適した発現プラスミドのプロモーターの下流に挿入
する。通常、発現には菌体内発現と分泌発現の２種類が
あるが、各々について適当な発現系が存在する。発現産
物は通常、大腸菌宿主内に蓄積されるが、細胞外に分泌
させる必要があれば、ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡ
のＮ末端に大腸菌由来の分泌蛋白質のシグナル配列の遺
伝子を連結させて、発現産物をペリプラスムに分泌させ
るよう、発現系を構築する。後述する実施例では、大腸
菌での１つの態様の発現が記載されているが、他の態様
での発現は、例えば、E.coli ＪＭ１０９／pＦＡＬ２に
挿入されているＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡを適当
な酵素（例えば制限酵素、アルカリホスファターゼ、ポ
リヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼなど）で処理することによりＦＡＯＤ−Ｌの酵
素活性をコードするＤＮＡ断片を得、これを適当なベク
ターに組み込むことにより様々な宿主でＦＡＯＤ−Ｌ活
性を有するペプチドを発現させることができ、これらの
ＦＡＯＤ−Ｌも本発明の範囲に含まれる。

【００１６】発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は
既知であり、Ｍolecular Ｃloning：Ａ ＬＡＢＯＬＡＴ
ＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌabora
tory Ｐressに記載の方法で行うことができる。例え
ば、原核性宿主の場合は、コンピテントセル作製法、エ
レクトロポレーション法、真核性宿主の場合は、コンピ
テントセル作製法、エレクトロポレーション法、哺乳動
物細胞の場合はトランスフェクション法、エレクトロポ
レーション法により行うことができる。次いで、得られ
た形質転換体を適当な培地に培養する。該培地は、炭素
源（例えばグルコース、メタノール、ガラクトース、フ
ルクトース等）及び無機また有機窒素源（例えば硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプ
トン、カザミノ酸等）を含有していてよい。所望によ
り、培地に他の栄養源（例えば無機塩類（塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム）、ビタミン類（例えばビタミン
Ｂ₁）、抗生物質（例えばアンピシリン、テトラサイク
リン、カナマイシン等)）を加えてもよい。哺乳動物細
胞の培養には、イーグル培地が適当である。

【００１７】形質転換体の培養は、通常、pＨ６.０〜
８.０、好ましくはpＨ７.０、２５〜４０℃（好ましく
は３０〜３７℃）で８〜４８時間行えばよい。生産され
たＦＡＯＤ−Ｌが培養溶液、培養濾液(上澄み)中に存在
しているときは、培養物を濾過又は遠心分離する。培養
濾液から、ＦＡＯＤ−Ｌを天然又は合成のタンパク質の
精製、単離に一般的に用いられる常法（例えば透析、ゲ
ル濾過、抗ＦＡＯＤ−Ｌモノクロナール抗体を用いての
アフィニティカラムクロマトグラフィー、適当な吸着剤
を用いてのカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマ
トグラフィー等）によって精製できる。生産されたＦＡ
ＯＤ−Ｌが培養形質転換体のペリプラズム及び細胞質中
に存在するときは、濾過や遠心分離によって細胞を集
め、それらの細胞壁及び／又は細胞膜を、たとえば超音
波及び／又はリゾチーム処理によって、破壊して、デブ
リス（細胞破砕物）を得る。デブリスを適当な水溶液
（例えばトリス−塩酸緩衝液）に溶解させる。この溶液
から、常法によって、ＦＡＯＤ−Ｌを精製することがで
きる。

【００１８】大腸菌中で生産されたＦＡＯＤ−Ｌを再生
（リフォールディング）する必要があるときは、これを
常法によって行なうことができる。本発明方法で得られ
る形質転換体を適当な培地で培養して得られる培養物は
ＦＡＯＤ−Ｌ活性を示すが、このものを上記のごとく当
業者既知の通常の方法でさらに処理して酵素溶液等の処
理物を調製することができる。また、所望により精製し
てもよい。例えば、培養物を遠心してＦＡＯＤ−Ｌ産生
−形質転換体を収穫し、りん酸緩衝液に懸濁し、超音波
処理等によって細胞を破壊する。次いで、上清を遠心分
離することにより、酵素標品を得る。さらに、上清を透
折し、クロマトグラフィー等でさらに精製すれば精製酵
素が得られる。次いで、制限酵素処理やエキソヌクレア
ーゼ処理等により、酵素活性を有するフラグメントを得
ることができる。

【００１９】上記の培養物、その処理物（精製酵素標品
及び酵素活性を有するフラグメントを含む）は、ＦＡＯ
Ｄ−Ｌ酵素活性を有し、アマドリ化合物の定量分析に適
しており、例えば、糖尿病の診断に有用である。本発明
によりＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡがクローニング
されたので、それに基づき、通常の遺伝子組換え技術を
用いて、アミノ酸の付加、欠失、挿入、置換等により、
ＦＡＯＤ−Ｌ活性を保持している誘導体を得ることは当
業者にとって容易である。故に、そのような常套手段で
得られるＦＡＯＤ−Ｌの活性な誘導体も本発明の範囲に
包含されるものである。

【００２０】既述のごとく、本発明の形質転換体を培養
して得られる培養物及びその処理物は以下の反応式：

【化２】 Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ² ＋ Ｏ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ→ Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ²−ＮＨ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ₂ （式中、Ｒ¹はアルドース残基、Ｒ²はアミノ酸、タンパ
ク質又はペプチド残基を表す）で示されるアマドリ化合
物の酸化還元反応を触媒する。上記式において、Ｒ¹が
−ＯＨ、−（ＣＨ₂）_n−、又は−［ＣＨ（ＯＨ）］_n−
ＣＨ₂ＯＨ（式中、ｎは０−６の整数）であり、Ｒ²が−
ＣＨＲ³−［ＣＯＮＨＲ³］_mＣＯＯＨ（式中、Ｒ³はα−
アミノ酸側鎖残基、ｍは１−４８０の整数を表す）で示
されるアマドリ化合物が基質として好ましい。中でも、
Ｒ³がリジン、ポリリジン、バリン、アスパラギンなど
から選択されるアミノ酸の側鎖残基であり、またｎが５
〜６、ｍが５５以下である化合物が好ましい。

【００２１】本発明の分析法を行うには、アマドリ化合
物を含有すると考えられる試料と本発明のＦＡＯＤ−Ｌ
を発現する形質転換体の培養物又はその処理物を、水又
は緩衝液中で接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の
発生量を測定することにより、試料中のアマドリ化合物
を分析する。本発明の分析法は、生体成分中の、糖化タ
ンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクト
サミンの定量に基づいて行われる。例えばアマドリ化合
物を含有する緩衝液中の試料に、培養物又はその処理物
の水又は緩衝液中懸濁液(溶液)を加える。pＨ、温度及
び反応時間等の反応条件は特に限定されるものでなく、
同様の酵素反応に通常用いられる条件から適宜選択する
とよい。しかしながら、約ｐＨ４.０〜１２.０、好まし
くはｐＨ７.０〜９.０であり、より好ましくはｐＨ約
８.０、温度２５〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃、
より好ましくは３５℃で反応させる。

【００２２】本発明方法に用いる被検液としては、アマ
ドリ化合物を含有する任意の試料溶液を用いることがで
き、例えば、血液（全血、血漿又は血清）、尿等の生体
由来の試料の外、醤油等の食品が挙げられる。緩衝液と
してはトリス−塩酸緩衝液等を用いる。ＦＡＯＤ−Ｌ、
ＦＡＯＤ−Ｌを発現する形質転換体の培養物又はその処
理物の使用量は、終点分析法においては通常、０.１単
位／ml以上、好ましくは１〜１００単位／mlである。本
発明の分析法では、下記のいずれかのアマドリ化合物の
定量法を用いる。 （１）過酸化水素発生量に基づく方法 当該技術分野で既知の過酸化水素の定量法、例えば、発
色法、過酸化水素電極を用いる方法等で測定し、過酸化
水素及びアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲線
と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定量
する。具体的には、後述の力価の測定法に準じる。ただ
し、ＦＡＯＤ−Ｌ量は１ユニット／ｍｌとし適当に希釈
した試料を添加し、生成する過酸化水素量を測定する。
過酸化水素発色系としては、４−アミノアンチピリン／
フェノール系のかわりに４−アミノアンチピリン／Ｎ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−ｍ−トルイジン，４−アミノアンチピリン／Ｎ,Ｎ−
ジメチルアニリン，４−アミノアンチピリン／Ｎ,Ｎ−
ジエチルアニリン，ＭＢＴＨ／Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリ
ン，４−アミノアンチピリン／２，４−ジクロロフェノ
ール等の組み合わせが可能である。

【００２３】（２）酸素の消費量に基づく方法 反応開始時の酸素量から反応終了時の酸素量を差し引い
た値（酸素消費量）を測定し、酸素消費量とアマドリ化
合物の量に関して作成した標準曲線と比較することによ
り、試料中のアマドリ化合物を定量する。具合的には、
後述の力価の測定法に準じて行う。但し用いるＦＡＯＤ
−Ｌ量は１ユニット／mlとし、適当に希釈した試料を添
加し吸収される酸素量を求める。

【００２４】本発明方法は試料溶液をそのまま用いて行
うこともできるが、対象によっては、あらかじめ糖が結
合したリジン残基を遊離させてから行うことが好まし
い。そのような目的には、タンパク質分解酵素を用いる
場合（酵素法）と、塩酸等の化学物質を用いる場合（化
学法）があるが、前者が好ましい。本発明方法に用いる
ことができるタンパク質分解酵素は、当業者に既知であ
り、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、パパイ
ン、アミノペプチダーゼ、キモトリプシン、サーモリシ
ン、ズブシリシン、プロティナーゼＫ、プロナーゼ等を
挙げることができる。酵素処理の方法も既知であり、例
えばプロテアーゼ処理は、下記実施例に記載の方法で行
うことができる。

【００２５】上記のごとく、本発明のＦＡＯＤ−Ｌを発
現する形質転換体の培養物又はその処理物は、糖化タン
パクに含まれるフルクトシルリジンに高い基質特異性を
有するものであることから、血液試料中の糖化タンパク
を測定することを含む、糖尿病の診断などに有用であ
る。また、フルクトシルバリンにも特異性を有すること
から、糖化ヘモグロビンの測定にも有用である。なお、
検体として血液試料（全血、血漿又は血清）を用いる場
合、採血した試料をそのまま、あるいは透折等の処理を
した後用いる。さらに、本発明方法に用いるＦＡＯＤ−
Ｌを発現する形質転換体の培養物又はその処理物、ある
いはパーオキシダーゼ等の酵素は、溶液状態で用いても
よいが、適当な固体支持体に固定化してもよい。例え
ば、ビーズに固定化した酵素をカラムに充填し、自動化
装置に組み込むことにより、臨床検査など、多数の検体
の日常的な分析を効率的に行うことができる。しかも、
固定化酵素は再使用が可能であることから、経済効率の
点でも好ましい。さらには、酵素と発色色素とを適宜組
み合わせ、臨床分析のみならず、食品分析にも有用なア
マドリ化合物の分析のためのキットを得ることができ
る。

【００２６】酵素の固定化は当該技術分野で既知の方法
により行うことができる。例えば、担体結合法、架橋化
法、包括法、複合法等によって行う。担体としては、高
分子ゲル、マイクロカプセル、アガロース、アルギン
酸、カラギーナンなどがある。結合は共有結合、イオン
結合、物理吸着法、生化学的親和力を利用し、当業者既
知の方法で行う。固定化酵素を用いる場合、分析はカラ
ム又はバッチ方式のいずれでもよい。上記のごとく、固
定化酵素は、血液試料中の糖化タンパクの日常的な分析
（臨床検査）に特に有用である。臨床検査が糖尿病診断
を目的とする場合、診断の基準としては、結果を糖化タ
ンパク濃度として表すか、試料中の全タンパク質濃度に
対する糖化タンパク質の濃度の比率で表される。全タン
パク質濃度は、通常の方法（２８０nmの吸光度、Lowry
法あるいは、アルブミンの自然蛍光など)で測定するこ
とができる。

【００２７】本発明のアマドリ化合物の定量のための試
薬は、本発明のＦＡＯＤ−Ｌを発現する形質転換体の培
養物又はその処理物、及び好ましくはｐＨ７.０〜９.
０、より好ましくはｐＨ８.０の緩衝液からなる。該培
養物又はその処理物が固定化されている場合、固体支持
体は高分子ゲルなどから選択され、好ましくはアルギン
酸である。試薬中の培養物又はその処理物の量は、終点
分析を行う場合、試料あたり、通常１〜１００単位／m
l、バッファーはトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）が好
ましい。過酸化水素の生成量に基づいてアマドリ化合物
を定量する場合、発色系としては、上記の各種の組み合
わせを利用することが可能である。本発明のアマドリ化
合物の分析試薬と、適当な発色剤ならびに比較のための
色基準あるいは標準物質を組み合わせてキットとするこ
ともできる。そのようなキットは、予備的な診断、検査
に有用であると考えられる。

【００２８】

【実施例】次下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明す
るが、これらは本発明を制限するものではない。以下の
実施例において用いたプラスミド類、様々な制限酵素や
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵素類は、市販品から入
手し、供給者の指示に従って使用した。また、ＤＮＡの
クローニング、各プラスミドの構築、宿主の形質転換、
形質転換体の培養及び培養物からの酵素の回収は、当業
者既知の方法、あるいは文献記載の方法に準じて行なっ
た。また、酵素活性は以下の力価の測定法に従って測定
した。力価測定法 （１）生成する過酸化水素を比色法により測定する方
法。 Ａ.速度法 １００ｍＭ ＦＺＬ溶液はあらかじめ得られたＦＺＬを
蒸留水で溶解することによって調製した。４５mＭ ４−
アミノアンチピリン、６０ユニット／ｍｌパーオキシダ
ーゼ溶液、及び６０ｍＭ フェノール溶液それぞれ１０
０μｌと、０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）
１ｍｌ、及び酵素溶液５０μｌを混合し、全量を蒸留水
で３.０ｍｌとする。３０℃で平衡化した後、１００ｍ
Ｍ ＦＺＬ溶液５０μｌを添加し、５０５ｎｍにおける
吸光度を経時的に測定した。生成するキノン色素の分子
吸光係数（５.１６×１０³Ｍ^-1cm^-1）から、１分間に生
成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を
酵素活性単位とする。

【００２９】Ｂ.終末法 上記Ａ法と同様に処理し、基質添加後、２０分間３０℃
でインキュベートした後の５０５ｎｍにおける吸光度を
測定し、別にあらかじめ標準過酸化水素溶液を用いて作
成した検量線から生成した過酸化水素量を算出すること
により、酵素活性を測定する。 （２）酵素反応による酸素吸収を測定する方法 ０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液1ｍｌと酵素溶液５０μｌ
を混合し、蒸留水で全量を３.０ｍｌとし、ランク ブラ
ザーズ社の酸素電極のセルに入れる。３０℃で攪拌し、
溶存酸素と温度を平衡化した後、５０ｍＭ ＦＺＬ １０
０μｌを添加し、酸素吸収を記録計で連続的に計測し、
初速度を得る。標準曲線から１分間に吸収された酸素量
を求め、これを酵素単位とする。

【００３０】実施例１ ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮ
Ａのクローニング １．アスペルギルス・テレウスＧＰ１(Ａsper gillus te
rreus ＧＰ１；ＦＥＲＭＰ−１５６６４）のＦＡＯＤ−
Ｌの部分アミノ酸配列の決定 １）Ａ. terreus ＧＰ１の培養及びＦＡＯＤ−Ｌの精製Ａspergillus terreus ＧＰ１；Ｐ−１５６６４）をＦ
ＺＬ ０.５％、グルコース １.０％、リン酸二カリウム
０.１％、リン酸一ナトリウム ０.１％、硫酸マグネシ
ウム ０.０５％、塩化カルシウム ０.０１％, イースト
エキス ０.２％を含有した培地（ｐＨ６.０)１０Ｌに植
菌し、ジャーファーメンターを用いて通気量２Ｌ／分、
攪拌速度４００ｒｐｍの条件で２８℃、２４時間攪拌培
養した。培養物は瀘過して集めた。菌糸体２５９ｇ（湿
重量）を、２ｍＭのＤＴＴを含む、０.１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８.５)８００mlに懸濁し、ダイノ・ミル
により菌糸体を破砕した。破砕液を９,５００ｒｐｍで
２０分間遠心分離し、得られた液を粗酵素液とし、以下
の方法で精製した。

【００３１】粗酵素液に４０％飽和になるように硫酸ア
ンモニウム（以下、硫安と略す）を加え、攪拌し、１
２,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上
清に７５％飽和になるように硫安を加え、撹拌し、１
２,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿を２ｍ
ＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８.５）（以下、緩衝液Ａと略す）に溶解した。
その溶液に硫安４０％を含む緩衝液Ａを等量加え、次い
で、約２００mlのブチル−トヨパール（butyl-ＴＯＹＯ
ＰＥＡＲＬ）樹脂を加え、穏やかに撹拌した。同緩衝液
で洗浄後、緩衝液Ａを用い、バッチ法で溶出した。溶出
液を硫安濃縮し、２５％飽和硫安を含む緩衝液Ａで平衡
化したフェニル−トヨパール（phenyl-ＴＯＹＯＰＥＡ
ＲＬ）カラムに吸着した。同緩衝液にて洗浄した後、硫
安濃度２５−０％飽和の直線勾配で溶出した。活性画分
を集め、硫安濃縮後、４０％飽和硫安を緩衝液Ａで平衡
化したブチル−トヨパールカラムに吸着した。同緩衝液
にて洗浄した後、硫安濃度４０−０％飽和の直線濃度勾
配にて溶出した。活性画分を統合し、緩衝液Ａで平衡化
したＤＥＡＥ−トヨパールカラムに供した。活性画分は
同緩衝液による洗浄画分に認められたので、これを集
め、硫安濃縮した。続いて得られた酵素溶液を０.１Ｍ
ＮａＣl、２mＭ ＤＴＴを含む０.１Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８.５）にて平衡化したセファクリルＳ−３０
０カラムによりゲル瀘過を行い、７０〜１００ユニット
の精製酵素を得た。

【００３２】得られた精製酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電
気泳動）において、標準タンパクとしてホスホリラーゼ
Ｂ、牛血清アルブミン、オボアルブミン、カルボニック
アンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターを用い、
デービスの方法に従って分子量を測定した。即ち、１０
％ゲルを用いて、４０ｍＡで３時間泳動し、クーマシー
ブリリアントブルーＧ−２５０でタンパク染色を行っ
た。分子量既知の数種のタンパクについて同様に泳動
し、検量線から分子量を求めた結果、サブユニットの分
子量は約４８,０００ダルトンであることが示された
（図６）。また、スーパーデックス２００ｐｇによるゲ
ルろ過による分子量測定では、図７の検量線図から明ら
かなように、約９４,０００ダルトンであった。

【００３３】２）部分アミノ酸配列の決定 上記の方法で精製した酵素標品をＶ８プロテアーゼ（シ
グマ社製）により断片化し、クリーブランド法［D.W.Cl
eaveland, S.G.Fisher, M.W. Kirschner and U.K. Laem
mli, J.Biol.Chem., 252, 1102 (1977)］によりさらに
断片化した。次いで、ＰＶＤＦ（ポリビニリデン フル
オリド、ミリポア社製、商品名，イモピロン−ＰＳＱ）
膜にトランスファー（１４Ｖで一晩（１２時間））し、
プロテインシーケンサー４７６Ａ（アプライドバイオシ
ステムズ社）を用い、エドマン分解法によりアミノ酸配
列を決定した。その結果、Ｎ−末端及び内部ペプチドの
２断片からそれぞれ、配列番号２及び３に示す１７及び
１６残基のアミノ酸配列が決定された。

【００３４】２．ＲＴ−ＰＣＲによる部分ｃＤＮＡ断片
の増幅 １）オリゴヌクレオチドプライマーの調製 上記１．２）で得たアミノ酸配列から推定される塩基配
列を基に、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）に用い
るためのプライマーを、図１に示すように設計した。こ
のプライマーの設計に際して、アスペルギルス属のコド
ン使用率を考慮に入れ、またサブクローニングを容易に
するために、プライマーの端にＢamＨＩ認識配列を付加
した。これらプライマー１及び２の塩基配列をそれぞ
れ、配列番号４及び５に示す。なお、プライマー２は、
プライマー１が付着するＤＮＡに相補なＤＮＡに付着す
るよう、図１に記載の配列に基づき、そのＣ末端側から
合成されている。

【００３５】２）totalＲＮＡの調製 上記１．１）の方法で培養したＡ. terreus ＧＰ１株の
菌糸体１ｇからグアニジン／フェノール／クロロホルム
法(Chomczynski,P. and Sacchi,N. (1987) Single-step
method of RNA isolation by acid guanidinium thioc
yanate-PhOH-chloroform extraction, Anal. Biochem.
162, 156-159）に従って、totalＲＮＡ５mgを得た。

【００３６】３）ＲＴ−ＰＣＲ 上記１．２）で設計したプライマーと、２．２）で調製
したtotalＲＮＡを用い、以下の手順で逆転写ポリメラ
ーゼチェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。 ａ）totalＲＮＡ（５μg／μl）２μlに滅菌水３６μl
を加え、６５℃、５分加温した後、氷上で急冷する。 ｂ）ａ）の溶液に以下の溶液を加える。 ５×buffer ２０μl ｄＮＴＰmix（各２０mＭ） ５μl ＲＮase inhibitor（１１５Ｕ／ml） ２μl Ｏligo dt （０.４２μg／μl） ２４μl ＲＴase (ＭＬＶ）（２００Ｕ／μl） １μl ＤＴＴ（０.１Ｍ） １０μl ｃ）ａ）＋ｂ）の溶液を２５℃、１０分放置した後、４
２℃で一夜反応させる。そして、９５℃で５分加熱した
後、氷上で急冷するとｃＤＮＡが得られる。 ｄ）ｃ）で合成したｃＤＮＡ２μlに以下の溶液を加え
る。 １０×ＰＣＲ buffer ２.５μl ｄＮＴＰ ｍｉｘ １.８μｌ プライマー１ １ μｌ プライマー２ １ μｌ 減菌水 １６.５７５μｌ ｅ）ｄ）の溶液を９５℃で５分加熱した後、氷上で急冷
した後、Ｔaq ＤＮＡＰolymerase（５Ｕ／ｍｌ）を０．
１２５μｌ加える。 ｆ）ｅ）にミネラルオイルを重層して以下の条件でＰＣ
Ｒ反応を行う。（９４℃，１分；６０℃，２分；７２
℃，２分）からなる一連の処理を３０サイクル行った
後、７２℃で３分処理する。 ｇ）次いで、アガロースゲル電気泳動にかける。 その結果、プライマー１と２を用いたとき、図３に示す
ように約４００bpの断片の増幅が確認できた。図３は、
アガロース電気泳動の結果を示す模写図である。図中、
レーン１はφＸ１７４／ＨincII（マーカー）、レーン
２はプライマー１及び２を用いた電気泳動パターンであ
る。マーカーはＰＣＲにより増幅した断片のサイズを判
断するために泳動を行った。

【００３７】３．ＰＣＲ断片のサブクローニング 上記２．で得た約４００bpのＰＣＲ断片をアガロースゲ
ルから切り出し、ＤＮＡ回収用フィルター付遠心チュー
ブ（孔径０.２２μｍ、宝酒造社製Ｃode Ｎo.９０４
０）を用いて、１０,０００ｒｐｍ．４℃、１時間の遠
心の後、エタノール沈殿を行うことで精製した。次い
で、ＰＣＲ断片（１μl）、Ｋ buffer（１μl）、Ｂam
ＨＩ（１μl）及び減菌水（７μl）を混合し、３７℃で
４時間の消化を行った。得られたＢamＨＩ消化断片を、
同じくＢamＨＩで消化したpBluescreipt II SK+（STRAT
AGENE社製：ｌａｃプロモータ−を有する大腸菌用発現
ベクター）に、ライゲーション（１６℃・３０分）し、
得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌ＪＭ１０
９株を形質転換した。形質転換は、ＴａＫａＲａ Ｌiga
tion Ｋit Ｖer. ２.０（宝酒造）を使用し、Ｈanahan
法（Ｈanahan，Ｄ，Ｔechniques for Ｔransformation
of Ｅ.coli. Ｉn：ＤＮＡ Ｃloning, vol Ｉ, Ｇlover,
Ｄ.Ｍ.(ed), pp109-136, ＩＲＬ Ｐress, 1985）に従
って行った。その結果、図４に示すように、約４００bp
のＰＣＲ断片がpBluescreipt II SK⁺のＢamＨＩサイト
に挿入されたプラスミドｐＦＬＰを得た。図４におい
て、レーン１はλ／ＥcoＴ１４１（マーカー）を、レー
ン２はｐＦＬＰ／ＢamＨＩを表す。その塩基配列をジデ
オキシ法により決定したところ、ＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮ
Ａの部分配列であることが確認された。

【００３８】４．ｃＤＮＡライブラリーの作成及びプラ
ークハイブリダイゼーション 上記の２．２）の方法で得たtotal ＲＮＡからｍＲＮＡ
Ｐurification Ｋit（ファルマシア社）を用いてｍＲ
ＮＡを得た。該ｍＲＮＡ ５μgから、ＺＡＰ-cＤＮＡ
Ｓynthesis Ｋit（STRATAGENE社製）を用いてｃＤＮＡ
ライブラリーを作成した。即ちｍＲＮＡ５μgから逆転
写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、λＺＡＰ ＩＩベク
ター（STRATAGENE社製）に連結し、Gigapack III Gold
（STRATAGENE社製）を用いてインビトロでパッケージン
グしてｃＤＮＡライブラリーを得た。（条件等はマニュ
アルに従った。） 次いで、ｃＤＮＡのタイターを測定した結果、１.０×
１０⁵pfu/μgベクターであった。このファージライブラ
リーを大腸菌ＸＬＩ−Ｂlue ＭＲＦ株に感染させ、３
７℃で１２時間培養することによりプラークを形成させ
た。次いで、３.でサブクローニングしたＰＣＲ断片を
³²Ｐで標識してプローブとして用い、プラークハイブリ
ダイゼーションによりスクリーニングした。即ち、得ら
れたプラークをニトロセルロースフィルターに転写し、
アルカリ変性後、４２℃で³²Ｐで標識したプローブと１
２時間ハイブリダイズさせた。洗浄後、Ｘ線フィルムに
１２時間露光させた。その結果、約２０,０００プラー
クから７つの陽性プラークを得た。

【００３９】５. ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡの
サブクローニング ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡのプラスミドへのサブ
クローニングはインビトロ切除法で行った。７個の陽性
プラークからExAssistヘルパーファージ（STRATAGENE社
製）を用いて添付のマニュアルに従い、大腸菌ＪＭ１０
９（Ｅ.coli ＪＭ１０９ Ｃompetent Ｃell．宝酒造株
式会社）に形質転換した。得られた形質転換体からプラ
スミドを抽出し塩基配列を決定した。その結果、ＦＡＯ
Ｄ−ＬのＮ末端アミノ酸配列に相当する塩基配列を有す
る約１.５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐ
ＦＡＬ２を保持するクローンを１株得た（大腸菌形質転
換体（Ｅ.coli ＪＭ１０９／ｐＦＡＬ２))。このｐＦＡ
Ｌ２の制限地図を図２に示す。該クローンの塩基配列及
び推定のアミノ酸配列を配列番号１に示す。又、該プラ
スミドｐＦＡＬ２を用いて大腸菌ＳＯＬＲ（STRATAGENE
社）を形質転換して大腸菌形質転換体（Ｅ.coli ＳＯＬ
Ｒ／ｐＦＡＬ２)を得た。

【００４０】実施例２ 大腸菌形質転換体（Ｅ.c oli Ｊ
Ｍ１０９／ｐＦＡＬ２）のＦＡＯＤ−Ｌの活性 実施例１で形質転換した大腸菌（Ｅ.coli ＪＭ１０９／
ｐＦＡＬ２）を０.１ｍＭ ＩＰＴＧ(イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシッド)を含むＬＢ培地（1％
Bacto-Trypton, 0.5％ Bacto-yeast extract, 1％ NaC
l, pH7.2)５０mlで培養した。ＩＰＴＧは大腸菌を接種
した後、２時間後に加えた。培養後、遠心分離（１０,
０００ｒｐｍ、４℃、１分）により集菌し、ペレットを
０.８５％ＫＣｌで洗浄し、０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝
液 (pH 8.0)に懸濁した。MINI-BEAT BEATER（ジャパン
ラムダ社）で菌体を３,８００ｒｐｍ、３０秒で氷冷を
はさみながら６回ビーズ破砕し、遠心分離（１,４００
ｒｐｍ、４℃、５分）して無細胞抽出液を調製した。次
いで、前記の力価測定法のＡ．速度法によりＦＡＯＤ−
Ｌ活性を測定した。対照として、プラスミドpBluescrei
pt II SKで形質転換した大腸菌を同様に培養して得られ
た無細胞抽出液を用いた。結果を、Ａ.terreus ＧＰ１
の培養物から検出される活性と共に表１に示す。

【００４１】

【表１】 表 １ プラスミドｐＦＡＬ２で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９による ＦＡＯＤ−Ｌの発現 株 比活性（Ｕ／mg) ＋ＩＰＴＧ −ＩＰＴＧ ＪＭ１０９／ｐＦＡＬ２ ０.１７８ ０.０２１２ＪＭ１０９／pBluesc reipt II SK Ｎ．Ｄ． − Ａ .terreus ＧＰ１ ０.１３５ 表から明らかに、ｐＦＡＬ２はＦＡＯＤ−Ｌをコードし
ているｃＤＮＡを含有しており、該プラスミドで形質転
換された大腸菌形質転換体は、ＦＡＯＤ−Ｌを産生する
ことが分かる。大腸菌形質転換体によるＦＡＯＤ−Ｌの
生産は、ＩＰＴＧ添加後８時間で最大となり、親株であ
るＡspergillus terreus ＧＰ１株と同様の生産性を示
した（図５参照）。図５において、横軸はＩＰＴＧによ
る誘導後の時間、縦軸は増殖の程度（ＯＤ₆₀₀測定
値）、黒丸は全活性（Ｕ／１培養）、そして白丸は比活
性（Ｕ／mg）を表す。

【００４２】実施例３ 大腸菌形質転換体（Ｅ.c oli Ｓ
ＯＬＲ／ｐＦＡＬ２）のＦＡＯＤ−Ｌの活性 実施例１で形質転換した大腸菌（Ｅ.coli ＳＯＬＲ／ｐ
ＦＡＬ２）を０.１ｍＭ ＩＰＴＧ(イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシッド)を含むＬＢ培地（1% Ba
cto-Trypton, 0.5％ Bacto-yeast extract, 1％ NaCl,
pH7.2)５０mlで培養した。ＩＰＴＧは大腸菌を接種した
後、２時間後に加えた。培養後、遠心分離（１０,００
０ｒｐｍ、４℃、１分）により集菌し、ペレットを０.
８５％ＫＣｌで洗浄し、０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液
(pH 8.0)に懸濁した。MINI-BEAT BEATER（ジャパンラム
ダ社）で菌体を３,８００ｒｐｍ、３０秒で氷冷をはさ
みながら６回ビーズ破砕し、遠心分離（１,４００ｒｐ
ｍ、４℃、５分）して無細胞抽出液を調製した。次い
で、前記の力価測定法のＡ．速度法によりＦＡＯＤ−Ｌ
活性を測定した。対照として、プラスミドpBluescreipt
II SKで形質転換した大腸菌を同様に培養して得られた
無細胞抽出液を用いた。結果を、Ａ. terreus ＧＰ１の
培養物から検出される活性と共に表２に示す。

【００４３】

【表２】 表 ２ プラスミドｐＦＡＬ２で形質転換された大腸菌ＳＯＬＲによる ＦＡＯＤ−Ｌの発現 株 比活性（Ｕ／mg) ＋ＩＰＴＧ −ＩＰＴＧ ＳＯＬＲ／ｐＦＡＬ２ ０.１７２ ０.０４２９ＳＯＬＲ／pＢlues creipt II SK Ｎ．Ｄ． − Ａ . terreus ＧＰ１ ０.１３５ 表から明らかに、ｐＦＡＬ２はＦＡＯＤ−Ｌをコードし
ているｃＤＮＡを含有しており、該プラスミドで形質転
換された大腸菌形質転換体は、ＦＡＯＤ−Ｌを産生する
ことが分かる。

【００４４】実施例４ 糖化ヒト血清アルブミン濃度の
測定 糖化ヒト血清アルブミン（シグマ社）を０.９％塩化ナ
トリウム水溶液で溶解させ、０〜１.０％の範囲で濃度
の異なる糖化ヒト血清アルブミン溶液を調製した。これ
らの溶液を用いて以下の操作を行った。 １）プロテアーゼ処理 糖化アルブミン溶液 ６０μl １２.５mg/ml プロテアーゼXIV（シグマ社）溶液 ６０μl この混合液を３７℃で３０分間インキュベートし、その
後、約９０℃で５分間、加熱して反応を停止させた。

【００４５】２）活性測定 ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。 ４５mＭ ４−アミノアンチピリン溶液 ３０μｌ ６０mＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ− ３−スルホプロピル）−m−トルイジン溶液 ３０μｌ ６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 ３０μｌ ０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０） ３００μｌ ６ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液 ５０μｌ 蒸留水で全量を１mlとした。６ユニット／ml ＦＡＯＤ
−Ｌ溶液は、実施例２の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを６ユ
ニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（p
Ｈ８.０）で希釈して調製した。ＦＡＯＤ反応液を３０
℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアー
ゼ処理溶液を１００μl加え、３０分後の５５５nmにお
ける吸光度を測定した。この方法で得られる糖化アルブ
ミンの濃度と吸光度との関係を図８に示す。図中の縦軸
は５５５nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸は
糖化アルブミンの濃度を表す。図は、糖化アルブミンの
濃度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示して
いる。

【００４６】実施例５ ヒト血清アルブミンの糖化率の
測定 ０.９％塩化ナトリウム水溶液３mlに、糖化ヒト血清ア
ルブミン（シグマ社）１５０mg、ヒト血清アルブミン
（シグマ社）１５０mgをそれぞれ溶解した。これらの溶
液を混合することにより、糖化率の異なる溶液を作製
し、自動グリコアルブミン測定装置（京都第一科学）を
用いて検定したところ、その糖化率は、２４.６％〜６
１.１％であった。これらの溶液を用いて以下の操作を
行った。 １）プロテアーゼ処理 糖化アルブミン溶液 ６０μl １２.５mg/ml プロテアーゼXIV（シグマ社）溶液 ６０μl この溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、その
後、約９０℃で５分間加熱して反応を停止させた。

【００４７】２）活性測定 ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。 ４５mＭ ４−アミノアンチピリン溶液 ３０μｌ ６０mＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ− ３−スルホプロピル）−m−トルイジン溶液 ３０μｌ ６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 ３０μｌ ０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０） ３００μｌ ６ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液 ５０μｌ 蒸留水で全量を１mlとした。６ユニット／ml ＦＡＯＤ
−Ｌ溶液は、実施例２の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを６ユ
ニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（p
Ｈ８.０）で希釈して調製した。ＦＡＯＤ反応液を３０
℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアー
ゼ処理溶液を１００μl加え、３０分後の５５５nmにお
ける吸光度を測定した。この方法で得られるアルブミン
の糖化率と吸光度との関係を図９に示す。図中の縦軸は
５５５nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸はア
ルブミンの糖化率を表す。図は、アルブミンの糖化率と
過酸化水素発生量が相関関係にあることを示している。

【００４８】実施例６ 糖化ヘモグロビン濃度の測定 グリコヘモグロビンコントロール（シグマ社）を蒸留水
で溶解させ、０〜３０％の範囲で濃度の異なる糖化ヘモ
グロビン溶液を調製した。これらの溶液を用いて以下の
操作を行った。 １）プロテアーゼ処理 糖化ヘモグロビン溶液 ２５μl ５００ユニット／ml アミノペプチダーゼ溶液 ５μl ０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０） ２０μl この混合液を３０℃で３０分間インキュベートした。そ
の後、１０％トリクロロ酢酸を５０μl加えて撹拌し、
０℃で３０分間静置した後１２０００回転で１０分間遠
心分離を行った。得られた上清に２Ｍ ＮaＯＨを約５
０μl加え中性溶液にした。

【００４９】２）活性測定 ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。 ３ｍＭ Ｎ−カルボメチルアミノ−２−フェニルアミン溶液 ３０μl ６０ユニット/ml パーオキシダーゼ溶液 ３０μl ０.１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０） ３００μl ４ユニット/ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液 １０μl 蒸留水で全量を１mlとした。４ユニット／ml ＦＡＯＤ
−Ｌ溶液は、実施例２の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを４ユ
ニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（p
Ｈ８.０）で希釈して調製した。ＦＡＯＤ反応液を３０
℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアー
ゼ処理溶液を８０μl加え、３０分後の７２７nmにおけ
る吸光度を測定した。この方法で得られる糖化ヘモグロ
ビンの濃度と吸光度との関係を図１０に示す。図中の縦
軸は７２７nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸
は糖化ヘモグロビンの濃度を表す。図は、糖化ヘモグロ
ビンの濃度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを
示している。

【００５０】

【発明の効果】本発明により、アスペルギルス属の菌由
来の不純物を含有しないＦＡＯＤ−Ｌを大量に製造する
ことが可能となり、糖化タンパクの定量の実用化の促進
に寄与することができる。

【００５１】

【配列表】

【００５２】配列番号：１ 配列の長さ：１３１４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：Ａspergillus terreus ＧＰ１ 配列 ATG CCA GTC ACC AAG TCT TCG TCG ATA TTG ATC ATC GGG GCG GGC 45 Met Pro Val Thr Lys Ser Ser Ser Ile Leu Ile Ile Gly Ala Gly 1 5 10 15 ACC TGG GGT TGC TCA ACT GCC CTG CAT CTT GCC CGC AGA GGA TAC 90 Thr Trp Gly Cys Ser Thr Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly Tyr 20 25 30 ACC AAT GTC ACT GTC CTT GAC CCG TAC CCG GTT CCA TCA GCC ATT 135 Thr Asn Val Thr Val Leu Asp Pro Tyr Pro Val Pro Ser Ala Ile 35 40 45 TCG GCC GGC AAC GAC GTC AAC AAG ATC ATC TCG TCC GGC CAG TAC 180 Ser Ala Gly Asn Asp Val Asn Lys Ile Ile Ser Ser Gly Gln Tyr 50 55 60 AGC AGC AAG AAG GAC GAG GTC GAA GTC AAT GAG ATT ATC GCC GAA 225 Ser Ser Lys Lys Asp Glu Val Glu Val Asn Glu Ile Ile Ala Glu 65 70 75 CAG GCC TTC AAT GGC TGG AAA AAT GAC CCC ATC TTC AAG CCG TAC 270 Gln Ala Phe Asn Gly Trp Lys Asn Asp Pro Ile Phe Lys Pro Tyr 80 85 90 TAC CAC GAC ACC GGC GTC GTG ATG TCC GCC ACC ACA CAG GAA GGA 315 Tyr His Asp Thr Gly Val Val Met Ser Ala Thr Thr Gln Glu Gly 95 100 105 TTG GAG CGT CTG GGG GTC CGC GTG CGA CCT GAA GAT GAA CCC GAT 360 Leu Glu Arg Leu Gly Val Arg Val Arg Pro Glu Asp Glu Pro Asp 110 115 120 GTA GCC GAA TTG ACT CGG CCG GAG CAG TTC CGC CAG CTG GCC CCC 405 Val Ala Glu Leu Thr Arg Pro Glu Gln Phe Arg Gln Leu Ala Pro 125 130 135 GGC GTC TTG AAG GGT AAC TTC CCC GGT TGG AGG GGG TAC CAC ATT 450 Gly Val Leu Lys Gly Asn Phe Pro Gly Trp Arg Gly Tyr His Ile 140 145 150 CGC TCA AAC GCG GGC TGG GCG CAT GCG CGC AAC GCC CTG GTC GCC 495 Arg Ser Asn Ala Gly Trp Ala His Ala Arg Asn Ala Leu Val Ala 155 160 165 GCG GCG CGG GAG GCA CAG CGC CTG GGT GTG CGC TTC GTC GCG GGA 540 Ala Ala Arg Glu Ala Gln Arg Leu Gly Val Arg Phe Val Ala Gly 170 175 180 TCG CCG CAG GGC AGA GTC ATC ACG TTG ATT TTT GAG AAC AAC GAT 585 Ser Pro Gln Gly Arg Val Ile Thr Leu Ile Phe Glu Asn Asn Asp 185 190 195 GTG AAG GGT GCC GTC ACG GCG GAC GGC AAG ATC TGG CGG GCC GAG 630 Val Lys Gly Ala Val Thr Ala Asp Gly Lys Ile Trp Arg Ala Glu 200 205 210 CAG ACT ATC CTC TGC GCT GGT GCG GCC GCC GGC CAG TTT CTG GAT 675 Gln Thr Ile Leu Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gln Phe Leu Asp 215 220 225 TTC AAG GAC CAA CTG CGT CCC ACT GCG TGG ACT CTG GTC CAC ATC 720 Phe Lys Asp Gln Leu Arg Pro Thr Ala Trp Thr Leu Val His Ile 230 235 240 CAG TTG AAG CCG GAA GAG CGT GCC CAG TAT AAA AAC ATG CCG GTG 765 Gln Leu Lys Pro Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Lys Asn Met Pro Val 245 250 255 GTC TTC AAC ATC GAG AAG GGG TTC TTC TTC GAG CCG GAT GAG GAG 810 Val Phe Asn Ile Glu Lys Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp Glu Glu 260 265 270 CGT GGT GAA ATC AAG ATC TGC GAC GAA CAC CCC GGG TAC ACG AAT 855 Arg Gly Glu Ile Lys Ile Cys Asp Glu His Pro Gly Tyr Thr Asn 275 280 285 ATG ACC ACG GGG GCC GAC GGC CGC GTG AGG AGC ATT CCC TTC GAG 900 Met Thr Thr Gly Ala Asp Gly Arg Val Arg Ser Ile Pro Phe Glu 290 295 300 AAG ACG CAG GTT CCT CGA GAA GCG GAG ATG CGC GTC CGC AAG CTT 945 Lys Thr Gln Val Pro Arg Glu Ala Glu Met Arg Val Arg Lys Leu 305 310 315 CTG TCT GAA ACG ATG CCT CAG CTT GCG GAC CGG CCG TTC AGT TTC 990 Leu Ser Glu Thr Met Pro Gln Leu Ala Asp Arg Pro Phe Ser Phe 320 325 330 GCA AGG ATC TGC TGG TGT GCG GAT ACC CCC AAT CGC GAG TTT ATC 1035 Ala Arg Ile Cys Trp Cys Ala Asp Thr Pro Asn Arg Glu Phe Ile 335 340 345 ATT GAC CGT CAT CCC GAA TAC CCG TCG CTT GTT CTT GGG TGT GGT 1080 Ile Asp Arg His Pro Glu Tyr Pro Ser Leu Val Leu Gly Cys Gly 350 355 360 GCT TCA GGA CGA GGC TTC AAA TAT CTT CCC TCG ATC GGA AGC ATC 1125 Ala Ser Gly Arg Gly Phe Lys Tyr Leu Pro Ser Ile Gly Ser Ile 365 370 375 ATC GCA GAC GCC ATG GAG GAC AAA ACC CCG GCA AAA ATC CAC AAG 1170 Ile Ala Asp Ala Met Glu Asp Lys Thr Pro Ala Lys Ile His Lys 380 385 390 CTG ATC CGC TGG AGC CCG GAA ATC GCG ATC AAC CGT AAC TGG GGG 1215 Leu Ile Arg Trp Ser Pro Glu Ile Ala Ile Asn Arg Asn Trp Gly 395 400 405 GAC AGA TTA GGT CGA TTT GGA GGG CCC AAC CGG GTC ATG GAT TTC 1260 Asp Arg Leu Gly Arg Phe Gly Gly Pro Asn Arg Val Met Asp Phe 410 415 420 AAT GAA GTG AAG GAG TGG ACT AAT GTC ACC CAA AGG GAC ATC TCG 1305 Asn Glu Val Lys Glu Trp Thr Asn Val Thr Gln Arg Asp Ile Ser 425 430 435 AAG TTA TAG 1314 Lys Leu 437

【００５３】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ａspergillus terreus ＧＰ１ 配列 Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｉｌｅ Ｉｋｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｒｐ １ ５
１０ １５ Ｇｌｙ １７

【００５４】配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ａspergillus terreus ＧＰ１ 配列 Leu Thr Arg Pro Glu Gln Phe Arg Gln Leu Ala Pro Gly Val Leu Lys 1 5 10 16

【００５５】配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 YTNATHATHG GNGCNGGNAC NTGG 24

【００５６】配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＮＧＧＮＧＣＮＡ ＲＹＴＧＮＣＫＲＡＡ ＹＴＧＹＴＣ
２６

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＰＣＲに用いるためのプライマーの、ＦＡＯ
Ｄ−Ｌの部分アミノ酸配列との関係を示す説明図。

【図２】 ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡを含むプラ
スミドｐＦＡＬ２の制限地図。

【図３】 ＲＴ−ＰＣＲにおけるアガロース電気泳動の
結果を示す模写図であって、図中、レーン１はφＸ１７
４／ＨｉｎｃＩＩ；レーン２はプライマー１及び２を用
いた電気泳動パターンを表す。

【図４】 図３の約４００bpのＰＣＲ断片のサブクロー
ニングにおける電気泳動の結果を示す模写図であって、
図中、レーン１はλ／ＥcoＴ１４１、レーン２はｐＦＬ
Ｐ／ＢamＨＩの泳動パターンを表す。

【図５】 プラスミドｐＦＡＬ２で形質転換された大腸
菌形質転換体によるＦＡＯＤ−Ｌの生産の経時変化を示
すグラフ。横軸はＩＰＴＧによる誘導後の時間、縦軸は
増殖の程度（ＯＤ₆₀₀測定値）、黒丸は全活性（Ｕ／１
培養）、そして白丸は比活性（Ｕ／mg）を表す。

【図６】 アスペルギルス・テレウス ＧＰ１（Ａsper
gillus terreus ＧＰ１；ＦＥＲＭ Ｐ−１５６６４）
由来の精製ＦＡＯＤ−ＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル
硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に
かけて得た移動パターンを示す写真。

【図７】 図６と同様のＦＡＯＤ−Ｌの、スーパーデッ
クス２００pgを用いたゲルろ過による分子量測定の結果
を示すグラフ。

【図８】 糖化ヒト血清アルブミンの濃度とＦＡＯＤ作
用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラ
フ。

【図９】 ヒト血清アルブミンの糖化率とＦＡＯＤ作用
により生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。

【図１０】 糖化ヘモグロビンの濃度とＦＡＯＤ作用に
より生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/26 9452−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/26 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 福家 博司 京都府京都市南区東九条西明田町57番地 株式会社京都第一科学内

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の特性： （１）酵素の存在下でアマドリ化合物を酸化して、α−
   ケトアルデヒド、アミン誘導体及び過酸化水素を生成す
   る反応を触媒する酵素活性を有し； （２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したとき、分子量約
   ４８,０００ダルトンの同一サブユニット２個より成
   り； （３）そのＮ末端に配列表の配列番号２で示されるアミ
   ノ酸配列を、また、中間に配列番号３で示されるアミノ
   酸配列を有し；かつ （４）アスペルギルス属（Aspergill us）の菌由来の他
   のタンパク質を実質上含有しない；を有するフルクトシ
   ルアミノ酸オキシダーゼ又はその酵素活性を有するフラ
   グメント。
2. 【請求項２】 配列番号１記載のアミノ酸配列又はその
   部分配列を含有する請求項１に記載のフルクトシルアミ
   ノ酸オキシダーゼ又はそのフラグメント。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のフルクトシルア
   ミノ酸オキシダーゼ又はそのフラグメントをコードする
   ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号１に記載の全塩基配列又はその
   部分配列を含有する請求項３記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 ｍＲＮＡから逆転写酵素により合成され
   たものである請求項３又は４記載ＤＮＡ。
6. 【請求項６】 ＲＴ−ＰＣＲにより合成されたものであ
   る請求項３又は４記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項３〜６のいずれかに記載のＤＮＡ
   を含有する発現ベクター。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の発現ベクターによって
   形質転換された宿主細胞。
9. 【請求項９】 原核性宿主である請求項８に記載の宿主
   細胞。
10. 【請求項１０】 大腸菌である請求項９に記載の宿主細
    胞。
11. 【請求項１１】 請求項８〜１０のいずれかに記載の宿
    主細胞を培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ
    酸オキシダーゼを回収することを特徴とするフルクトシ
    ルアミノ酸オキシダーゼの製造法。
12. 【請求項１２】 アマドリ化合物を含有する試料と、請
    求項８〜１０のいずれかに記載の宿主細胞の培養物又は
    その処理物を接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の
    発生量を測定することを特徴とする、試料中のアマドリ
    化合物の分析法。
13. 【請求項１３】 試料が生体成分であり、アマドリ化合
    物の分析が、該生体成分中の糖化タンパクの量及び／又
    は糖化率の測定、あるいはフルクトサミンの定量により
    なされることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 請求項８〜１０のいずれかに記載の宿
    主細胞の培養物またはその処理物を含有するアマドリ化
    合物の分析のための試薬又はキット。
15. 【請求項１５】 生体成分中の糖化タンパクの量及び／
    又は糖化率の測定、あるいはフルクトサミンの定量のた
    めに用いられることを特徴とする請求項１４に記載の分
    析試薬又はキット。